CN101896611A - 由糖蜜生产发酵产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜i)用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理并ii)使用一种或多种发酵生物以107-1010个细胞/mL发酵培养基范围内的细胞计数发酵。
Description
发明领域
本发明涉及自糖蜜生产发酵产物(如乙醇)的方法。
发明背景
自糖蜜大规模商业性生产燃料乙醇是本领域已知的。糖蜜是甘蔗或甜菜精炼的副产物。糖蜜是含有约50％蔗糖的深褐色甜浆。在蒸发自甘蔗或甜菜提取的汁液时，除水促进糖以结晶形态分离。当此糖结晶过程达到其极限并取出糖晶体时，剩余的深褐色稠浆称作糖蜜。
WO 96/13600披露了一种为了改进发酵过程(如乙醇的发酵性生产)中的原料利用，自液化和/或糖化淀粉、甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜中存在的不可发酵的糖类生产可发酵单糖的方法。
US 4,769,324涉及在能够在含有糖蜜的培养基中生长和产生淀粉酶的酵母的存在下通过糖蜜发酵来生产乙醇。
BR-PI-990252-8-A披露了一种生产乙醇的工艺，其中通过蛋白酶或如葡聚糖酶、纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶、和酸性或碱性昆布多糖酶(laminarinase)等酶的酶法作用来使发酵酵母抗絮凝。
需要进一步改进发酵产物(如乙醇)制造工艺。
发明概述
本发明涉及使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜
i)用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理，并
ii)使用一种或多种发酵生物以107-1010个细胞/mL发酵培养基的细胞计数发酵。
依照本发明，原料(feedstock)是糖蜜，即例如甘蔗或甜菜精炼的副产物。
附图简述
图1显示了糖蜜发酵期间的发酵期间的°Bx发展。
图2为同时糖化和发酵期间添加的含有α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的两种酶混合物显示了糖蜜发酵期间的pH发展。
图3为同时糖化和发酵期间添加的含有α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的酶混合物显示了°Bx线性趋势线。
图4为同时糖化和发酵期间添加的含有α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物显示了pH发展。
图5为同时糖化和发酵期间添加的含有α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物显示了糖蜜发酵期间的°Bx发展。
图6为同时糖化和发酵期间添加的含有α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的两种酶混合物显示了°Bx线性趋势线。
图7显示了酶法预处理糖蜜30小时接着发酵6小时后的乙醇产量。
图8显示了酶法预处理糖蜜30小时接着发酵10小时后的乙醇产量。
图9显示了酶法预处理接着发酵6小时后的总还原糖(TRS)衰减作为生产率增益。
图10显示了酶法预处理接着发酵10小时后的总还原糖(TRS)衰减作为生产率增益。
图11显示了用酶混合物进行的同时糖化和发酵期间的粘度。
发明详述
本发明提供了使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物(尤其是乙醇)的方法。
发明人发现，当糖蜜经受α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理时，生产率得到提高。这是有利的，因为发酵时间能得以缩短。不受任何理论限制，认为α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理导致发酵培养基中的粘度和/或密度降低。这样，发酵生物的细胞膜上发酵培养基中可发酵糖的流入得到促进。这可导致糖变成发酵产物的转化率增加，导致发酵时间缩短因而生成率更高。一种备选的或额外的理论是细胞浓度和/或细胞存活力升高。发明人还发现在进行发酵之前预处理糖蜜时，可获得产量改进。
本发明涉及使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜
i)用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理，并
ii)使用一种或多种发酵生物以107-1010个细胞/mL发酵培养基的细胞计数发酵。
在一个优选的实施方案中，所述细胞计数为108-1010个细胞/mL发酵培养基，尤其是约109个细胞/mL发酵培养基。
浓缩的糖蜜具有约80％的°Bx。在发酵培养基中，在水中稀释糖蜜，使得本发明方法期间的糖蜜具有约1-35％、优选16-25％、优选约18-22％范围内的°Bx。在高重力方法中，°Bx在25-35、优选27-32°Br范围内。
Brix(°Bx)是液体(例如水)中溶解的固体(例如蔗糖)对水的质量比的量度。它可以用测量液体比重的装置(例如糖量计)来测量。例如，25°Bx的溶液为25％(w/w)，25克蔗糖每100克液体，即100克溶液中有25克蔗糖和75克水。
步骤i)中的酶处理和步骤ii)中的发酵可以依次或同时进行。在一个优选的实施方案中，在各步骤依次进行的情况中，酶处理步骤i)是作为预处理步骤进行的，优选在对所述酶合适的条件下进行。在一个实施方案中，步骤i)是在20-70℃、优选40-60℃、优选45-55℃范围内的温度进行的。处理期间的pH优选在4-6范围内。步骤i)中的预处理可以进行1-10天，接着发酵1-80小时、优选1-70小时或1-15小时、如1-10小时。
在一个实施方案中，糖蜜(°Br为80％左右)在中间罐(surge tank)中于40-60℃在4-6范围内的pH预处理1-10天。此后将预处理后的糖蜜以16-24％范围内的°Br、pH 3-6、在30-36℃的温度发酵1-18小时或1-15小时。
当本发明的方法作为同时步骤i)和步骤ii)方法进行时，所使用的温度范围对于发酵生物是合适的，优选最佳的。所述温度取决于所讨论的发酵生物。在一个优选的实施方案中，所述温度在25-60℃范围内。本领域技术人员能容易地确定合适的或最佳的温度。在一个实施方案中，处理时间在约1-96小时、优选5-72小时的范围内。
在一个实施方案中，糖蜜(°Br为16-24％)于30-36℃范围内的温度、pH 3-6发酵6-96小时。
如果本发明的方法是使用酵母(如酵母属(Saccharomyces)的菌株，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株)作为发酵生物的乙醇生产方法，那么该方法可优选在25-40℃、优选28-36℃、尤其是30-34℃范围内的、如32℃左右的温度进行。
在又一个实施方案中，本发明的方法期间还存在蛋白酶。在一个实施方案中，在步骤i)中的酶处理期间或在同时酶处理和发酵期间添加所述蛋白酶。添加所述蛋白酶可以是为了在发酵期间使发酵生物(尤其是酵母)抗絮凝。
发酵
术语“发酵生物”指任何适合于在期望的发酵方法中使用的生物体。合适的发酵生物依照本发明能够发酵，即将优选DP1-3糖(如尤其是葡萄糖、果糖和麦芽糖)直接或间接转化成期望的发酵产物(如乙醇)。通常将发酵生物添加至醪液(mash)。
发酵生物的例子包括真菌生物体，如酵母或丝状真菌。优选的酵母包括酵母属菌种，特别是酿酒酵母的菌株。商业上可得到的酵母包括例如RED
/Lesaffre Ethanol Red(可由Red Star/Lesaffre，USA得到)、FALI(可由Fleischmann’s Yeast，USA得到)、SUPERSTART(可由Alltech得到)、GERTSTRAND(可由Gert Strand AB，Sweden得到)和FERMIOL(可由DSMSpecialties得到)。
优选用于乙醇生产的酵母包括例如毕赤酵母属(Pichia)和酵母属。依照本发明优选的酵母是酵母属菌种，特别是酿酒酵母或面包酵母(bakers yeast)。
回收
本发明的方法可任选包括回收发酵产物(如乙醇)；从此，可以将发酵产物(例如乙醇)与发酵材料分开并纯化。发酵后，可以蒸馏醪液以提取例如乙醇。通过本发明的方法能获得纯度高至例如约96vol.％的乙醇。
如此，在一个实施方案中，步骤ii)中的发酵和蒸馏步骤可以同时和/或分开/依次进行；任选然后是一个或多个加工步骤以进一步精炼发酵产物(例如乙醇)。
酶
α-淀粉酶
依照本发明，在本发明的方法中可使用任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是微生物的，如细菌或真菌来源的。在一个实施方案中，优选的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”指如下的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在本发明的方法中使用时在3-7、优选3.5-6、或更优选4-5范围内的pH具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
在一个实施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢杆菌属(Bacillus)来源的。芽孢杆菌属α-淀粉酶可优选源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是也可以源自其它芽孢杆菌属菌株。所涵盖的α-淀粉酶的具体例子包括WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中SEQ ID NO：5所示解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和WO99/19467中SEQ ID NO：3所示嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(通过提述将所有序列并入本文)。在本发明的一个实施方案中，所述α-淀粉酶可以是与WO99/19467中SEQ ID NO：1、2或3所示任何序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合物，尤其是WO 96/23873；WO 96/23874；WO 97/41213；WO 99/19467；WO 00/60059；和WO 02/10355任一中所记载的(通过提述将所有文件并入本文)。具体涵盖的α-淀粉酶变体是美国专利No.6,093,562；6,297,038；或6,187,576中所披露的(通过提述并入本文)，而且包括在位置R179至G182中删除一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873中披露的双重删除-参见例如第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选对应于与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO：3所示野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比的Δ(181-182)或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO：3的编号删除氨基酸R179和G180(通过提述将该参考文献并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO：3所示野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，其具有与Δ(181-182)对应的双重删除且进一步包含N193F取代(也称作I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶
具体涵盖的杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C端氨基酸残基(WO 99/19467的SEQ ID NO：4所示)和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N端氨基酸残基(WO 99/19467的SEQ ID NO：5所示)，其中具有下列取代中的一个或多个(尤其所有)：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选具有一个或多个下列突变(或其它芽孢杆菌属α-淀粉酶主链中的相应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间缺失两个残基、优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：5编号方式)的变体。
可以以本领域公知的浓度添加细菌α-淀粉酶。当以KNU单位(在下文“材料和方法”部分中描述)测量时，α-淀粉酶活性优选在0.5-50KNU/L发酵培养基、如1-25KNU/L发酵培养基、或更优选2-10KNU/L发酵培养基的范围内。真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属(Aspergillus)的菌株，如源自米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株的α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶包括Fungamyl样α-淀粉酶，其是源自曲霉属、优选米曲霉的菌株。依照本发明，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指与WO 96/23874中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的成熟部分展现出高度同一性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、甚至至少99％或甚至100％同一性的α-淀粉酶。
其它优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选的实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的，在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主登录号P56271下披露为“AMYA ASPNG”且记载于WO 89/01969(实施例3)。一种源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括那些源自根毛霉属(Rhizomucor)和亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(WO 2004/055178，通过提述并入)或大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)的菌株。
在一个优选的实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉且披露于Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81：292-298(1996)“Molecular-cloning and determinationof the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii″；并进一步作为EMBL：#AB008370披露。
所述真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选的实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选例子包括WO 2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请号60/638,614(Novozymes)中所披露的，通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)(如淀粉结合域)，和任选的接头。
所涵盖的杂合α-淀粉酶的具体例子包括美国专利申请号60/638,614中实施例的表1至5中所披露的，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中SEQ ID NO：100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(在美国申请号11/316,535表5中作为SEQ ID NO：20SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：96氨基酸序列的组合披露且进一步作为本文中SEQ ID NO：13披露)或作为WO2006/069290表5中的V039、和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它具体涵盖的杂合α-淀粉酶是WO 2006/069290和美国申请号11/316,535(通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5、和6所列任一。
所涵盖的杂合α-淀粉酶的其它具体例子包括美国专利公开号2005/0054071中所披露的，包括第15页表3中所披露的，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
还涵盖与任何上述α-淀粉酶展现出高度同一性，即与成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的α-淀粉酶。
酸性α-淀粉酶可以以0.1-250FAU(F)/L发酵培养基、优选1-100FAU(F)/L发酵培养基的量添加。
商业上可得到的α-淀粉酶产品
包含α-淀粉酶的优选的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA、和SPEZYMETM DELTA AA(GenencorInt.)、和以商品名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。
葡糖淀粉酶
依照本发明方法使用的葡糖淀粉酶可以是自任何合适来源得到的，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381，WO 00/04136和WO 01/04273中所披露的(Novozymes，Denmark)；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括热稳定性增强的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Eng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)；和在位置A435和S436中引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Eng.10，1199-1204)。
其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前称作罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026及Nagasaka，Y.等(1998)“Purification andproperties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，ApplMicrobiol Biotechnol 50：323-330)、踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利号Re.32，153)、Talaromyces duponti、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)或WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)(通过提述并入本文)。
所涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135，138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)(通过提述并入本文)的葡糖淀粉酶。
依照本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的例子披露于WO2005/045018。具体例子包括实施例1表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(通过提述将杂合物并入本文)。
还涵盖与任何上述葡糖淀粉酶展现出高度同一性，即与成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。
包含葡糖淀粉酶的商业上可得到的组合物包括AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300(Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(Genencor Int.)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以以1-5,000AGU/L发酵培养基、优选10-1,000AGU/L发酵培养基的量添加。
蛋白酶
所述蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选的实施方案中，所述蛋白酶是微生物来源、优选真菌或细菌来源的蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可使用其它蛋白酶。
在本发明方法中使用蛋白酶通常降低发酵生物细胞、尤其是酵母细胞的絮凝，而且还导致FAN(游离氨基氮)水平升高，这导致发酵生物的代谢增加。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即以在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力为特征的蛋白酶。
所涵盖的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、疫病霉属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。尤其涵盖的是源自黑曲霉(参见例如Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见例如Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)、或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
还涵盖中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。本发明特别涵盖的一种蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌且具有自Swissprot以编号P06832可获得的序列。还涵盖与自Swissprot以编号P06832可获得的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还涵盖与WO 2003/048353中以SEQ.ID.NO：1披露的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)、EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶)、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶)内的蛋白酶。
在一个实施方案中，所述蛋白酶是源自曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，所述蛋白酶是源自根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor mehei)的蛋白酶。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶是蛋白酶制备物，优选为源自曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白水解制备物和和源自根毛霉属，优选曼赫根毛霉的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶记载于例如Hand-book of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，Aca-demic Press，San Diego，1998，Chapter 270。天冬氨酸蛋白酶的合适例子包括例如R.M.Berka等Gene，96，313(1990)；R.M.Berka等Gene，125，195-198(1993)；及Gomi等Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)(通过提述并入本文)中记载的那些。
商业上可得到的产品包括
ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、PROMIXTM、NOVOZYMTM FM 2.0L、和NOVOZYMTM 50006(可购自Novozymes A/S，Denmark)及GC106TM和SPEZYMETM FAN(Genencor Int.，Inc.，USA)。
蛋白酶可以以0.001-1AU/L发酵培养基、优选0.005-0.5AU/L发酵培养基、尤其是0.05-0.1AU/L发酵培养基的量存在。
本文中所描述的和要求保护的发明，其范围不受本文中所公开的具体实施方案的限制，因为这些实施方案意图作为本发明数个方面的例示。任何等同实施方案意图在本发明的范围内。确实，根据上文描述，在本文中所显示的和描述的那些实施方案之外对本发明的各种修改对于本领域技术人员会是显而易见的。此类修改也意图在所附权利要求的范围内。若有冲突，以本公开文本(包括定义)为准。本文中引用了多种参考文献，通过提述完整收录其公开内容。下文实施例进一步描述了本发明，它们不应当解释为限制本发明的范围。
材料和方法
酶：
蛋白酶ALC：源自地衣芽孢杆菌的、可由Novozymes A/S，Denmark得到的野生型碱性蛋白酶。
葡糖淀粉酶SF：源自埃默森踝节菌的且在WO 99/28448中以SEQ ID NO：7披露的葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶TC：源自瓣环栓菌的、在WO 2006/069289中以SEQ ID NO：2披露的且可由Novozymes A/S，Denmark得到的葡糖淀粉酶。
α-淀粉酶SC：美国专利号6,187,576中披露的且根据请求可由NovozymesA/S，Denmark得到的，具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体。
α-淀粉酶JA：WO 2006/069290(Novozymes A/S)表5中作为V039披露的，由微小根毛霉α-淀粉酶及黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD组成的杂合α-淀粉酶。
-保存的糖蜜：自City of Aracatuba，San Paolo State，Brazil获得的，自2006年起保存的甘蔗糖蜜。
-新鲜的糖蜜：自City of Lencoes Paulista，Sao Paolo State，Brazil获得的，在2007年中生产的甘蔗糖蜜。
同一性的确定
术语“同一性”指两条氨基酸序列之间的同一性的程度。可以通过本领域已知的计算机程序合适地确定同源性，如GCG程序包中提供的GAP(ProgramManual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics ComputerGroup，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Joumal of Molecular Biology，48，443-453)。为多肽序列比较使用如下设置：GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉分解活性。此方法基于酶对改性马铃薯淀粉的分解，而且通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪反应。最初，形成蓝黑色，但是在淀粉分解期间，蓝色变弱并逐渐变成红褐色，将其与有色玻璃标准比较。
一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6)下将5260mg淀粉干物质Merck Amylum solubile转化成糊精的酶量。
更加详细地描述此分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01根据请求可由Novozymes A/S，Denmark得到，通过提述将此文件夹并入本文。
FAU(F)的测定
FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)是相对于具有标称强度的酶标准品测量的。
更加详细地描述此方法的文件夹(EB-SM-0216.02)根据请求可由Novozymes A/S，Denmark得到，通过提述将此文件夹并入本文。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件(37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟)下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加至葡萄糖脱氢酶试剂，使得存在的任何α-D-葡萄糖被转化成β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与上文所述反应体系中的β-D-葡萄糖起反应，形成NADH，其使用光度计于340nm测定，作为初始葡萄糖浓度的量度。
| AMG温育： | |
| 底物： | 麦芽糖23.2mM |
| 缓冲液： | 乙酸盐(acetate)0.1M |
| pH： | 4.30±0.05 |
| 温育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 酶工作范围： | 0.5-4.0AGU/mL |
| 颜色反应： | |
| GlucDH： | 430U/L |
| 变旋酶： | 9U/L |
| NAD： | 0.21mM |
| 缓冲液： | 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl |
| pH： | 7.60±0.05 |
| 温育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 波长： | 340nm |
更加详细地描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)根据请求可由Novozymes A/S，Denmark得到，通过提述将其文件夹并入本文。
蛋白酶测定法-AU(RH)
可以用变性血红蛋白作为底物来测定蛋白水解活性。在用于测定蛋白水解活性的Anson血红蛋白法中，消化变性血红蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂(其对酪氨酸和色氨酸产生蓝色)测定TCA可溶性产物的量。
一个Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件(即25℃，pH 5.5和10min反应时间)下以如下的初始速率消化血红蛋白的酶量，该初始速率使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂一起产生与一个毫当量的酪氨酸相同的颜色。
AU(RH)法记载于EAL-SM-0350且根据请求可由Novozymes A/SDenmark得到。
实施例
实施例1：甘蔗糖蜜的同时糖化和发酵
此实施例研究α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶在使用甘蔗糖蜜作为原料的乙醇发酵工艺中的效果。
将保存的甘蔗糖蜜在自来水中稀释至°Bx为18-20％。将pH用硫酸调至4.7-4.9。将稀释的糖蜜装入带盖的大约25mL管中。发酵培养基不补充氮、磷酸盐、维生素或抗生素。
在°Bx 5-7％糖蜜溶液中制备酵母接种体。将酿酒酵母(RED STARTM)接种体添加至发酵培养基，直至悬浮液含有约40-50％固体(对应于108-109个细胞/mL发酵培养基)，其使用离心机(2500rpm，20℃，10min)测量。将酵母悬浮液于室温(18-25℃)温育约12小时。
将酶在自来水中稀释，转移入管中并均质化。
所使用的剂量和酶：
α-淀粉酶SC：9.6KNU/L发酵培养基
葡糖淀粉酶SF：60AGU/L发酵培养基
蛋白酶ALC：0.048AU/L发酵培养基
通过将2mL酵母悬浮液添加入管中来启动发酵。将所有管在32±0.5℃水浴中温育24小时。为每种处理(一式两份)用5个管建立实验。
进行了下列分析：pH(电位差计)，％Brix(折光计)，粘度(粘度计：ANTOPAAR、DMA 5000和微量粘度计AMVn)和HPLC(AMINEX HPX-87H，0.005M硫酸，65℃温度，10mL注射体积和30min运行时间)。
将空白(不添加酶)与用9.6KNU/L+60AGU/L+0.048AU/L发酵培养基的酶法处理进行比较。所得结果显示于图1和2。
一般而言，°Bx衰减可测量酵母对可发酵糖的消耗。
pH给出污染的指示。在正常情况中，污染物产生酸，其降低pH。pH升高可意味着因营养物缺乏而发生的酵母饥饿。
当°Bx稳定至少1小时时，认为发酵完成。试验显示酶法处理的糖蜜的发酵在空白(对照)之前完成。生成率增益估算为约6％，如图3所示°Bx线性趋势线所证明的。
实施例2：甘蔗糖蜜的同时糖化和发酵
此实施例是在与实施例1中相同的实验条件进行的。使用如下的剂量和酶混合物。
-α-淀粉酶SC(19KNU/L)+葡糖淀粉酶SF(120AGU/L)；
-α-淀粉酶JA(26FAU(F)/L)+葡糖淀粉酶TC(160AGU/L)；
图4和5分别为上述混合物显示了pH和°Bx衰减曲线。生成率增益估算为约6％，如图6所示°Bx线性趋势线所证明的。
实施例3：甘蔗糖蜜的酶法预处理
此实施例研究甘蔗糖蜜酶法预处理对乙醇产量(yield)的影响。
使用如下的酶混合物：
混合物：α-淀粉酶JA(26FAU(F)/L)、葡糖淀粉酶TC(160AGU/L和蛋白酶ALC；
混合物：α-淀粉酶SC(18KNU/L)、葡糖淀粉酶SF(112AGU/L)和蛋白酶ALC(0.048AU/L发酵培养基)。
将新鲜的甘蔗糖蜜(°Bx为约80％)于50℃预处理30小时，然后在与实施例1所述相同的实验条件，使用RED STARTM酵母分别进行发酵6和10小时。
结果：
6和10小时发酵后，采集样品供HPLC分析用。图7和8分别显示了乙醇产量。当发酵前于50℃酶法预处理30小时时发现显著的乙醇产量升高(置信区间＝95％)。
通过总还原糖(TRS)衰减来估算生成率。TRS指通过HPLC分析得到的右旋糖和果糖的总和。图9和10分别显示了6小时和10小时发酵后的TRS衰减。
生成率增益对应于实施例1中也发现的约4％的估算增益。
总之，于50℃酶法预处理糖蜜30小时导致产量增加和生成率改进。
实施例4：甘蔗糖蜜的同时糖化和发酵期间的粘度
此实施例研究使用下述酶混合物的同时糖化和发酵期间糖蜜的粘度。在与实施例1相同的条件下且使用与实施例1相同的糖蜜进行试验。
酶混合物：
-α-淀粉酶JA(26FAU(F)/L)+葡糖淀粉酶TC(160AGU/L)；
-α-淀粉酶SC(9.6KNU/L)+葡糖淀粉酶SF(60AGU/L)+蛋白酶ALC(0.048AU/L)
-α-淀粉酶SC(19KNU/L)+葡糖淀粉酶SF(120AGU/L)+蛋白酶ALC(0.048AU/L)
-α-淀粉酶JA(13FAU(F))+葡糖淀粉酶TC(80AGU/L)
使用粘度计(ANTO PAAR，DMA 5000)测定粘度。试验结果显示于图11。
实施例5：工业规模试验中甘蔗糖蜜的同时糖化和发酵
此实施例研究α-淀粉酶和葡糖淀粉酶在使用甘蔗糖蜜作为原料的大规模乙醇发酵工艺中的效果。
以工业生产规模进行了14个测试批次，其中添加酶混合物。在相同生产规模进行了22个空白批次。测试和空白批次加载相同的工作体积(320m3)以及相同的抗生素和微量营养物剂量。
通过再循环细胞方法学获得酵母接种体，其中使全部发酵罐培养液通过离心机，分离液体部分(乙醇和水)-固体部分(含有至少30％固体(对应于107-109个细胞/mL发酵培养基)的酵母细胞或酵母膏(yeast cream))，其使用离心机(2500rpm，室温，10min)测量。
将酵母膏或接种体用硫酸预处理、浓缩至2.5-3.0pH，并在轻微搅动下保持30分钟。之后，将酵母膏泵入发酵罐。接种体体积为约25％总发酵罐工作体积。
通过如下获得发酵培养液或洗过的糖蜜：将Bx为75-80％的甘蔗糖蜜贮存物在自来水中稀释至Bx为18-22％，达到13-16％还原糖，将其以填充速率40m3/h连续泵入发酵罐，在大约6小时里完成操作。
就在将发酵培养液泵入发酵罐之前或就在发酵罐中添加接种体后，测试批次接受9.6KNPU/L α-淀粉酶SC和60AGU/L葡糖淀粉酶SF。空白批次中不添加酶。
所有批次(包括空白和测试)的发酵温度为32±1.0℃。不进行pH调节。然而，发酵培养液的样品据测量在4.5-5.0pH内。
当Bx测量稳定在6-8％和/或总还原残糖低于1％(通常在装料(filling ramp)开始后8-10小时内)时发酵批次完成。
进行了下列分析：pH(电位差计)，％Brix(折光计)，乙醇浓度(蒸馏和密度测定)和还原糖(Fehling滴定)。发酵产量表述成发酵培养液中由总固体在发酵期间形成的乙醇(排除接种体携带的乙醇)之间的转化率，以Bx表述。结果显示于表2和3。
表1汇总了产量性能：
Claims (21)
1.一种使用发酵生物自糖蜜生产发酵产物的方法，其中将糖蜜
i)用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合处理，并
ii)使用一种或多种发酵生物以107-1010个细胞/mL发酵培养基的细胞计数发酵。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞计数为108-1010个细胞/mL发酵培养基，尤其是约109个细胞/mL发酵培养基。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤i)中的酶处理和步骤ii)中的发酵是依次或同时进行的。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤i)是在对所述酶合适的条件作为预处理步骤进行的。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中步骤i)是在20-70℃、优选40-60℃、优选45-55℃的温度进行的。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤i)中的处理期间的pH在4-6范围内。
7.权利要求1-6的方法，其中步骤i)是通过将糖蜜进行酶处理1-10天来进行的。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中步骤ii)或同时步骤i)和ii)中的发酵进行1-96小时、优选5-48小时。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中步骤i)中的酶处理和步骤ii)中的发酵是同时进行的。
10.权利要求8的方法，其中同时步骤i)和步骤ii)期间的温度对于所述发酵生物，优选酵母是最佳的。
11.权利要求10的方法，其中所述温度在25-60℃范围内。
12.权利要求11的方法，其中当所述发酵生物是酵母时，同时步骤i)和步骤ii)是在25-40℃、优选28-36℃、尤其是30-34℃范围内、如约32℃的温度进行的。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶，优选源自曲霉属(Aspergillus)，优选黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、川地曲霉(Aspergillus kawachii)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株；或根毛霉属(Rhizomucor)，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株；或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)的菌株。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述葡糖淀粉酶选自下组：源自曲霉属，优选黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉的菌株；或阿太菌属(Athelia)，优选罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株；踝节菌属(Talaromyces)，优选埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的菌株；或根霉属(Rhizopus)，如雪白根霉(Rhizopus nivius)的菌株；或腐质霉属(Humicola)，优选灰色腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)的菌株；或栓菌属(Trametes)，优选瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株的葡糖淀粉酶。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母且在步骤ii)或同时酶处理和发酵中的发酵期间经受一种或多种蛋白酶处理。
17.权利要求16的方法，其中所述蛋白酶是真菌或细菌来源的。
18.权利要求17的方法，其中所述真菌蛋白酶源自曲霉属，优选米曲霉的菌株；或根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。
19.权利要求17的方法，其中所述蛋白酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)，优选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中含有淀粉的材料是甘蔗糖蜜。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母，如酵母属(Saccharomyces)，尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
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