CN105339500A - 具有减少的发泡的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，其中在将可易于发酵的糖材料进料至发酵池期间或之后或在将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物期间添加蛋白酶。本发明还涉及蛋白酶用于在发酵可易于发酵的糖材料期间，减少由发酵有机体在发酵池中产生的发泡的用途。

Description

具有减少的发泡的发酵工艺
发明领域
本发明涉及减少用于从可易于发酵的糖材料生产发酵产物、例如乙醇的发酵工艺中的发泡。
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明背景
可以从各式各样的可再生的原料生产发酵产物，例如乙醇。这些可以被分类为三个主要组：(1)可易于发酵的糖材料，例如甘蔗(即甘蔗汁汁和糖蜜)、甜菜、甜高粱；(2)淀粉性材料，例如玉米、马铃薯、稻、小麦、龙舌兰；以及(3)纤维素材料，例如秸秆、草类、玉米芯、木头和甘蔗渣。可易于发酵的糖材料包含可以容易地被酵母发酵的单糖，例如蔗糖、葡萄糖和果糖。与淀粉性和纤维素原料相反，不需要多糖类，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素的预先水解。
可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜，被用作例如巴西乙醇生产中的底物。酵母，例如尤其是酿酒酵母，被用作发酵有机体。通常使用酵母再循环系统，其中高达90％-95％的酵母被从一个发酵循环再用于下一个发酵循环。这导致发酵池内非常高的细胞密度(例如8％-17％w/v，湿量基准)并且导致非常短的发酵时间。在约32℃，在6-11小时的时段内，达到8％-11％(v/v)的乙醇浓度。在每一次分批发酵后，通过离心收集酵母细胞，酸洗(例如在pH1.5-3.0用硫酸洗涤1-2小时)并且发送回发酵池。现今，在每一循环后，在酸洗期间按固定剂量添加化学消泡剂(分散剂)，并且将另一种化学消泡剂(止泡剂)直接自动地(当泡沫达到料位探测器时)或手动地添加至发酵池，直至完全控制泡沫。
US3,959,175披露了包含液体聚丁烯的水性消泡剂组合物。消泡剂组合物可以进一步包括部分地疏水性二氧化硅和硅酮油。
US5,288,789披露了已经被聚烷氧基化的烷基酚和醛的缩合物用来减少发酵液中的泡沫的用途。
US6,083,998用于醇发酵的消泡剂组合物，该组合物是水基的并且包括聚二甲基硅氧烷油、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物和硅酮/二氧化硅掺合物。
当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜生产乙醇时，由发酵有机体产生的泡沫是严重问题。
即使可以使用化学消泡剂，但是仍希望并且需要提供用于生产发酵产物，例如乙醇的工艺，在这些工艺中泡沫产生是被减少/控制的。
发明概述
当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时，由发酵有机体产生的泡沫是严重问题。因此，本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体产生的泡沫。诸位发明人令人惊讶地发现蛋白酶可以用于有效地解决发泡问题。
本发明涉及使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括
i)将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中在以下时刻添加蛋白酶
a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或
b)在步骤ii)中的发酵期间。
在一个实施例中，将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。蛋白酶可以与可易于发酵的糖材料的进料流混合。在一个优选实施例中，在进料步骤i)之前，将蛋白酶与进料流混合。
在步骤ii)中的发酵之后，例如通过离心，收集/分离(用过的)发酵有机体。然后酸洗收集的发酵有机体，例如使用硫酸，在pH1.5-3.0，例如2.0-2.5，酸洗1-2小时。此后使发酵有机体返回发酵池，并且在一个或多个随后的发酵循环中(重新)用于发酵。因此，在一个实施例中，可以通过在水中再悬浮酸处理的酵母生物质，来制备发酵有机体的浆料，例如酵母浆料。在本发明的一个实施例中，在进料至步骤i)中的发酵有机体的浆料中之前，可以将蛋白酶添加至以下项或与以下项混合：可易于发酵的糖材料，例如甘蔗糖蜜。在另一实施例中，在将可易于发酵的糖材料进料至步骤i)中的发酵有机体的浆料期间，可以将蛋白酶添加至发酵有机体的浆料。在另一实施例中，可以在步骤ii)的发酵期间添加蛋白酶。在一个优选实施例中，作为一个分批工艺或分批进料工艺来进行发酵。然而，还可以作为半连续的或连续的工艺来进行发酵。
在一个优选实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，例如细菌丝氨酸蛋白酶，例如源自火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株的细菌丝氨酸蛋白酶，尤其是在此的SEQIDNO:2中示出的蛋白酶，或具有与US6,358,726中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:2具有至少60％，例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
在另一优选实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如肽酶家族S53蛋白酶。肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶包括两种不同类型的肽酶：三肽氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993，生物化学杂志(Biochem.)J.290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.，2010，“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:thepeptidasedatabase)”，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)38:D227-D233中。在一个优选实施例中，蛋白酶是源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的肽酶家族S53蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶是WO2014/037438中的实例2中涉及的并且示出为在此的SEQIDNO:7的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3(肽酶家族S53蛋白酶)的成熟序列。在一个实施例中，蛋白酶是示出为在此的SEQIDNO:6和WO2014/037438中的SEQIDNO:5的、来自大型亚灰树花菌的成熟蛋白酶3序列。在一个实施例中，蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶)能够切割在发酵有机体(例如酵母，具体地是酿酒酵母)的表面上的细胞壁蛋白，在步骤ii)中，发酵可易于发酵的糖材料为希望的发酵产物，具体地是乙醇。在一个实施例中，蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，能够切割在发酵有机体的表面上的细胞壁蛋白，例如甘露糖蛋白。在一个实施例中，蛋白酶，例如丝氨酸蛋白，能够降解释放自发酵有机体的蛋白，例如甘露糖蛋白。在一个实施例中，蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，能够水解发酵的可易于发酵的糖材料，例如发酵的糖蜜(酒)中的蛋白。本发明还涉及当从可易于发酵的糖，例如，如权利要求书中所限定，生产希望的发酵产物时，蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。在一个优选实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，具体地是强烈火球菌蛋白酶或家族S53蛋白酶，尤其是大型亚灰树花菌蛋白酶3。
附图简述
图1示出了伴随9个循环的发酵，对照(无酶添加)中的平均生物质和蛋白酶处理的样品的平均生物质之间的比较(对于循环9和10，2.5、5和10ppm；1.9、3.7和7.5ppm)。在最后一个发酵批次后，取点10。
图2示出了伴随9个循环的发酵，对照(无酶添加)样品中的平均生存力和经处理的样品的平均生存力之间的比较(对于循环9和10，2.5、5和10ppm；1.9、3.7和7.5ppm)。
图3示出了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶(PfuS)的平均乙醇生产量[gEtOH]之间的比较。
图4示出了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶PfuS的平均酵母细胞生存力[％]之间的比较。
图5示出了用不同蛋白酶处理，来自发泡酵母(BRT)的和非发泡酵母(CAT-1)的发酵上清液(酒)的蛋白片段的SDS-PAGE分析。标记示出为Kda，并且用箭头指示了一些蛋白片段。泳道如下：
发明详述
本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，尤其例如是甘蔗糖蜜生产希望的发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体，尤其是发泡酵母，例如是酵母属的酵母，具体地是酿酒酵母产生的发泡。在一个优选实施例中，本发明涉及巴西型乙醇发酵工艺，例如，如由巴索(Basso)等人，在(2011)年，在“巴西乙醇生产：工业工艺及其对酵母发酵、生物燃料生产近期发展和前景的影响(EthanolProductioninBrazil:TheIndustrialProcessandItsImpactonYeastFermentation,BiofuelProduction-RecentDevelopmentsandProspects)，马尔科奥雷利奥多斯桑托斯柏纳德斯博士(MarcoAurelioDosSantosBernardes)(编辑)，ISBN:978-953-307-478-8，印天科技(InTech)”中。总体上巴西乙醇工艺包括再循环发酵有机体，尤其是发泡发酵酵母，例如酿酒酵母，并且是作为一个分批工艺或分批进料工艺进行的。然而，一些工厂进行半连续的或连续的发酵工艺。
诸位发明人已经发现根据本发明，添加蛋白酶的多个令人惊讶的优点。
通过添加来自强烈火球菌的丝氨酸蛋白酶，减少了当从甘蔗糖蜜生产乙醇时，发酵期间由某一发泡酵母(即发泡酿酒酵母)产生的泡沫的量。(蛋白酶PfuS)。这描述于实例1和2中。
诸位发明人还发现，与使用商业化学消泡剂相比，当根据本发明使用蛋白酶作为消泡剂时，增加了乙醇产量。实例3和图3比较了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶PfuS的平均乙醇生产量。当与两种商业止泡剂产品相比较时，对于在本发明的工艺中再循环的酿酒酵母而言，乙醇产量更高。
图4比较了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶PfuS的平均酵母细胞生存力。当与两种商业止泡剂产品相比较时，对于在本发明的工艺中再循环的酿酒酵母而言，酵母的生存力更高。当与对照和根据本发明用蛋白酶处理相比较时，用工业止泡剂处理的样品示出生存力方面的增加的下降。诸位发明人还发现，当在甘蔗糖蜜发酵中添加蛋白酶PfuS和Mg蛋白酶3时，没有产生泡沫。实例4示出由发酵培养基中的酵母细胞释放的某些蛋白(像甘露糖蛋白)降解。当在合成甘蔗糖蜜中添加Snapalysin蛋白酶和蛋白酶时，产生了发酵泡沫，并且同一蛋白(像甘露糖蛋白)并不水解。更确切地，本发明涉及使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料，尤其是甘蔗糖蜜生产发酵产物的工艺，该工艺包括：
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中在以下时刻添加蛋白酶
a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或
b)在步骤ii)中的发酵期间。
使用发泡发酵有机体，例如发泡酵母，例如酵母属的发泡菌株，例如酿酒酵母的发泡菌株，来进行发酵。在一个实施例中，将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。可以将蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，尤其是强烈火球菌蛋白酶或家族S53蛋白酶，尤其是大型亚灰树花菌蛋白酶3，与可易于发酵的糖材料的进料流混合。在一个优选实施例中，在进料步骤i)之前，将蛋白酶与进料流混合。
根据本发明，术语“可易于发酵的糖材料”是指待转化/发酵为希望的发酵产物，尤其例如是乙醇的含糖起始材料，该含糖起始材料是属于包含可以容易地被发酵有机体，尤其例如是源自酿酒酵母的酵母菌株发酵的单糖，例如蔗糖、葡萄糖和果糖的一类。
根据本发明，术语“发酵池”是指并且包括其中进行发酵的任何类型的发酵池、发酵容器、发酵罐、或发酵器皿、或类似物。
根据本发明，可以同时或相继地进行步骤i)和ii)。可以在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选地约32℃的一个温度下进行发酵。在一个实施例中，发酵进行2至120小时，具体地4至96小时。在一个实施例中，发酵可以进行小于24小时、例如小于12小时、例如在6和12小时之间。
与含淀粉原料，例如玉米、小麦、黑麦、蜀黍、高粱等，和纤维素原料，例如玉米芯、玉米秸秆、甘蔗渣、麦秸、木头等相反，不需要发酵前的预处理和/或(预先)水解。在一个优选实施例中，可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。然而，根据本发明，发酵培养基还可以进一步包括甘蔗的其他副产物，具体地是来自甘蔗渣的水解产物。在一个实施例中，发酵培养基可以包括分开的流，这些流包含例如C5汁、等。根据本发明，可易于发酵的糖材料(底物)并不包括多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素的实质内容物。
在一个优选实施例中，用于本发明的工艺的发酵有机体可以是发泡发酵有机体，该发泡发酵有机体能够将可易于发酵的材料发酵为希望的发酵产物，尤其例如是乙醇。现今商业上使用(例如在巴西)的很多商业酵母菌株，尤其包括酿酒酵母的菌株，例如用于从甘蔗糖蜜生产乙醇，在发酵期间产生泡沫。在一个实施例中，该发酵有机体是酵母，例如来自酵母属的菌株，例如酿酒酵母的菌株。因此，在一个优选实施例中，发酵有机体是发泡发酵有机体，例如酵母属的发泡菌株，尤其例如是在发酵期间产生泡沫的酿酒酵母的菌株。根据本发明，发酵培养基中的酵母的密度是高的，例如是从8％-17％w/v(发酵培养基的湿量基准)。在一个实施例中，在非无菌条件下发生发酵，例如，还可以将具有发泡表型的野生酵母菌株引入发酵池，并且并入酵母群体。
在本发明的一个优选实施例中，在步骤ii)中的发酵之后，将发酵有机体再循环。根据本发明，将从50％-100％、例如70％-95％、例如约90％的发酵有机体再循环。在步骤ii)中的发酵之后，收集发酵有机体，例如酵母，酸洗，并且再循环至发酵池。然后用硫酸来酸洗发酵有机体，例如，在pH1.5-3.0，如2.0-2.5下，酸洗例如1-2小时。可以作为一个分批发酵或分批进料发酵进行本发明的工艺。然而，还作为半连续的或连续的工艺来进行本发明的工艺。
术语“发酵产物”和“希望的发酵产物”是指通过使用发酵有机体的发酵生产的产物。根据本发明，考虑的发酵产物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
在一个优选实施例中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如啤酒和酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。根据本发明，优选发酵产物是乙醇。根据本发明获得的希望的发酵产物，例如乙醇，优选可以用作燃料，例如用于车辆，例如汽车。燃料乙醇可以与汽油掺合。乙醇它还可以用作可饮用乙醇。
在步骤ii)中的发酵之后，可以例如通过蒸馏，或另一分离技术，从发酵培养基分离希望的发酵产物，例如乙醇。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物。
发酵期间的酶添加
如以上限定，本发明的工艺包括添加蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶能够切割在发泡发酵酵母的表面上的蛋白，例如甘露糖蛋白。
在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶能够切割在发酵有机体，具体地是发泡酿酒酵母的表面上的细胞壁蛋白，例如甘露糖蛋白，和/或能够水解发酵的可易于发酵的糖材料，例如发酵的糖蜜(酒)中的蛋白，例如甘露糖蛋白。
根据本发明的一个实施例，可以例如按从0.2至25mg酶蛋白(EP)/L发酵培养基的剂量添加蛋白酶。
在一个实施例中，可以按从0.01-100ppmEP(酶蛋白)蛋白酶、例如0.1-50ppm、例如1-25ppm的剂量添加蛋白酶。
用于本发明的工艺的蛋白酶优选可以选自下组：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶可以是唯一添加的酶(即不添加其他酶)。在一个优选实施例中，蛋白酶是细菌来源的，例如丝氨酸蛋白酶，如源自火球菌属的菌株、优选来自强烈火球菌的菌株的细菌丝氨酸蛋白酶，尤其是US6,358,726中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:2中示出的蛋白酶。
蛋白酶可以是与US6,358,726中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:2具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
在另一实施例中，以上限定的用于本发明的工艺的蛋白酶是真菌来源的。
在另一实施例中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一个优选实施例中，金属蛋白酶可以源自嗜热子嚢菌属的菌株、优选是橙色嗜热子囊菌(尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC编号0670)的菌株，例如WO2003/048353中披露的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1的成熟部分，或其变体。
在一个实施例中，蛋白酶或其变体与SEQIDNO:1的多肽的成熟部分具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。
在另一优选实施例中，蛋白酶是真菌丝氨酸蛋白酶，例如丝氨酸肽酶家族S53蛋白酶(“S53蛋白酶”)，如源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的家族S53蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶是WO2014/037438中的实例2中涉及的并且示出为在此的SEQIDNO:7的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。在一个实施例中，蛋白酶是示出为在此的SEQIDNO:7的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。
在一个实施例中，蛋白酶是与在此的SEQIDNO:7具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶是与在此的SEQID:6具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
合适蛋白酶的实例可在以下的“蛋白酶”部分中找到。
在一个实施例中，可以与选自下组的一种或多种酶一起(同时地)添加蛋白酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、氧化酶、过氧化酶、过氧化氢酶、漆酶、β-葡糖苷酶、其他糖酶、以及氧化酶。
在一个实施例中，在其他酶之前和/或之后添加蛋白酶。
与不存在蛋白酶或不添加蛋白酶的相应工艺相比，根据本发明的工艺，添加蛋白酶导致增加的产量，例如乙醇产量。本发明的工艺还减少了在发酵培养基中存在的残余糖。然而，与不添加蛋白酶的相应工艺相比，发酵池中最重要地发泡得以减少。
根据本发明，可以与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是微生物来源的，例如真菌的或细菌的来源的。在一个实施例中，α-淀粉酶是真菌来源的。在一个实施例中，真菌α-淀粉酶是源自根毛霉属的菌株，例如微小根毛霉的菌株，例如在此的SEQIDNO:3中示出的微小根毛霉α-淀粉酶的杂合体，该杂合体进一步包括淀粉结合模块，例如CBM20淀粉结合模块，例如在此的SEQIDNO:4中示出的序列。
在另一实施例中，α-淀粉酶可以是细菌来源的。在一个优选实施例中，细菌α-淀粉酶可以源自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌物种的菌株或其变体。α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，例如在此的SEQIDNO:5中示出的α-淀粉酶的成熟部分，或成熟α-淀粉酶，或与在此的SEQIDNO:5具有至少60％、例如70％、例如80％一致性、例如至少90％一致性、例如至少95％一致性、例如至少96％一致性、例如至少97％一致性、例如至少99％一致性的相应成熟α-淀粉酶。在一个实施例中，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体被截短，优选至具有约485-496个氨基酸，例如约491个氨基酸。在一个实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在I181+G182位置具有双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(在此使用SEQIDNO:5进行编号)。
合适α-淀粉酶的实例可在以下“α-淀粉酶”部分中找到。
根据本发明，可以与蛋白酶一起添加葡糖淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。在一个实施例中,葡糖淀粉酶可以来自曲霉属的菌株，优选来自黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选来自里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，例如瓣环栓菌；或来自密孔菌属的菌株，或来自褐褶菌属的菌株，或来自黑层孔属的菌株。
合适葡糖淀粉酶的实例可在以下的“葡糖淀粉酶”部分中找到。
在本发明的工艺的一个实施例中，希望的发酵产物，尤其例如是乙醇是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，该工艺包括在进料前添加蛋白酶至可易于发酵的糖材料；将含蛋白酶的、可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
在一个优选实施例中，在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵或分批进料发酵工艺生产乙醇，包括在进料前添加蛋白酶至甘蔗糖蜜；将含蛋白酶的甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
在另一实施例中，希望的发酵产物，尤其例如是乙醇是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；在发酵前，将蛋白酶进料至包含可易于发酵的糖和发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
在一个优选实施例中，在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵或分批进料发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在发酵前，将蛋白酶进料至包含酿酒酵母和甘蔗糖蜜的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
在本发明的一个另外的实施例中，希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；在将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物期间，添加蛋白酶至发酵池中。
在一个优选实施例中，在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵或分批进料发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵为乙醇期间，添加蛋白酶至发酵池中。
在一个优选的特定实施例中，本发明的工艺包括
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中
-在步骤i)之前，将蛋白酶与该进料流混合；或
-在进料后，将蛋白酶添加至发酵池中。
在一个优选实施例中，蛋白酶是如上所述的强烈火球菌蛋白酶。在一个优选实施例中，蛋白酶是如上所述的大型亚灰树花菌蛋白酶3。
使用发泡发酵有机体，例如发泡酵母，例如酵母属的发泡菌株，例如酿酒酵母的发泡菌株，来进行发酵。
蛋白酶用于泡沫减少的用途
在此方面，本发明还涉及当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。在一个优选实施例中，根据本发明的工艺生产希望的发酵产物。
酶
可以根据本发明使用以下酶添加剂中的一种或多种。
蛋白酶
如以上限定，本发明的工艺包括添加蛋白酶。
所述蛋白酶可以是任何来源。在一个实施例中，蛋白酶是真菌来源的。在一个实施例中，蛋白酶是细菌来源的。
蛋白酶可以是选自下组的蛋白酶：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶能够切割在发泡发酵有机体，优选是发泡酵母，例如发泡酿酒酵母的细胞壁表面上的蛋白，例如甘露糖蛋白。在一个优选实施例中，蛋白酶能够水解发酵的可易于发酵的糖材料，例如发酵的糖蜜(酒)中的蛋白，具体地是甘露糖蛋白。
真菌蛋白酶
在一个实施例中，蛋白酶是真菌来源的。
在一个优选实施例中，蛋白酶是金属蛋白酶，例如源自嗜热子嚢菌属的菌株、优选是源自橙色嗜热子囊菌(尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC编号0670)的菌株的蛋白酶，或其变体。
在一个实施例中，蛋白酶或蛋白酶变体是被披露为在WO2003/048353中披露的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1的成熟部分的金属蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶与在WO2003/048353中披露的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1的多肽的成熟部分具有至少60％、例如至少70％、例如至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少100％的一致性。
在一个实施例中，蛋白酶变体与在WO2003/048353中披露的SEQIDNO:2或在此的SEQIDNO:1的多肽的成熟部分具有至少70％、例如至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但是小于100％的一致性。
蛋白酶可以是在此的SEQIDNO:1中示出的蛋白酶的蛋白酶变体，具有以下取代：
D79L+S87P+A112P+D142L
D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L
S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L
D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L
A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L
S49P+D79L+S87P+A112P+D142L
S50P+D79L+S87P+A112P+D142L
D79L+S87P+D104P+A112P+D142L
D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L
S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L
D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L
S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L
D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L
D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L
Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L
Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L
A27KY82FS87GD104PA112PA126VD142L
A27KD79LY82FD104PA112PA126VD142L
A27KY82FD104PA112PA126VD142L
在一个优选实施例中，蛋白酶是在此的SEQIDNO:1中示出的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体，具有选自下组的突变，该组由以下各项组成：
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个另外的实施例中，蛋白酶可以是丝状真菌蛋白酶，例如源自根毛霉属，例如米黑根毛霉的菌株，例如是在此的SEQIDNO:3中示出的蛋白酶，或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的蛋白酶。
在一个优选实施例中，蛋白酶是真菌丝氨酸蛋白酶，例如丝氨酸肽酶家族S53蛋白酶(“S53蛋白酶”)，例如源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的家族S53蛋白酶。在一个实施例中，家族S53蛋白酶是WO2014/037438中的实例2中涉及的并且示出为在此的SEQIDNO:7的来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。在一个实施例中，蛋白酶是示出为在此的SEQIDNO:6的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列。
在一个实施例中，S53蛋白酶是与在此的SEQIDNO:7具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
在一个实施例中，S53蛋白酶是与在此的SEQIDNO:6具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。
细菌蛋白酶
在一个实施例中，蛋白酶是细菌来源的。
在一个优选实施例中，蛋白酶是源自火球菌属的菌株，优选是强烈火球菌的菌株。
在一个优选实施例中，蛋白酶是US6,258,726中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:2中示出的蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶与US6,258,726中的SEQIDNO:1具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列一致性。
在一个实施例中，蛋白酶与在此的SEQIDNO:2具有至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的序列一致性。
根据本发明的一个实施例，可以按从0.2至25mg酶蛋白(EP)/L发酵培养基的剂量添加蛋白酶。在一个实施例中，可以按范围从0.01-100ppmEP(酶蛋白)蛋白酶，例如0.1-50ppm，例如1-25ppm的剂量添加蛋白酶。
α-淀粉酶
根据本发明，可以与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是例如细菌来源或真菌来源的。
细菌α-淀粉酶
合适的细菌α-淀粉酶的实例包括以下提到的。优选的细菌α-淀粉酶可以源自芽胞杆菌属(有时称为土芽孢杆菌属)的菌株，包括地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌的菌株。其他细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的α-淀粉酶，所有的这些在WO95/26397中进行了详细描述；以及由冢本(Tsukamoto)等人，生物化学和生物物理研究通讯(BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications)，151(1988),pp.25-31(通过引用结合在此)中描述的α-淀粉酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂合体：WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059、以及WO02/10355(所有文件都通过引用结合在此)。确切考虑的α-淀粉酶变体被披露在美国专利号6,093,562、美国专利号6,297,038或美国专利号6,187,576(通过引用结合在此)中，并且包括具有以下的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179至G182中具有一个或两个氨基酸的缺失、优选披露在WO1996/023873(参见，例如，第20页，第1至10行)(通过引用结合在此)中的一种双缺失(优选与WO99/19467披露的SEQIDNO:3中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失)、或者使用WO99/19467(该参考文献通过引用结合在此)的SEQIDNO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO99/19467中的SEQIDNO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于δ(181-182)的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。
在一个实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是在WO2011/082425中披露的蛋白酶或在此的SEQIDNO:5，例如选自下组的蛋白酶：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-
I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQIDNO:5进行编号)。
在一个实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有以下突变：181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(SEQIDNO:5)。
典型地将截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶自然地截短为约从485-495个氨基酸长，例如491个氨基酸。在一个优选实施例中，截短是在C末端。确切考虑的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(在WO99/19467的SEQIDNO:4中示出)的445C末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(在WO99/19467的SEQIDNO:5中示出)的37N末端氨基酸残基，具有以下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467中的SEQIDNO:4进行编号)。尤其优选的是具有一种或多种以下突变的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在位置176和179之间缺失两种残基，优选缺失E178和G179(使用WO99/19467的SEQIDNO:5进行编号)。
可商购细菌α-淀粉酶产品和含α-淀粉酶产品包括TERMAMYLSC、LIQUOZYMESC、BAN(诺维信公司，丹麦)SPEZYMEXTRA、SPEZYMEAA、SPEZYMEFRED-L、SPEZYMEALPHA、GC358、SPEZYMERSL、SPEZYMEHPA和SPEZYMEDELTAAA(来自杜邦(DuPont)公司，美国)、FUELZYME(范恩尼姆(Verenium)公司，美国)。
可以按本领域熟知的浓度添加细菌α-淀粉酶。当以KNU单位测量(描述于以下“材料与方法”部分中)时，α-淀粉酶活性优选地以范围从0.5-50KNU/L发酵培养基，例如1-25KNU/L发酵培养基，或更优选以2-10KNU/L发酵培养基的量存在。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶(EC3.2.1.1)优选具有丝状真菌来源。真菌α-淀粉酶可以是真菌酸性α-淀粉酶。
真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属的菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。
优选真菌α-淀粉酶是真菌淀粉样(Fungamyl-like)α-淀粉酶，该α-淀粉酶优选源自米曲霉的菌株。在本披露中，术语“真菌淀粉样α-淀粉酶”指与WO96/23874中SEQIDNO:10中示出的氨基酸序列的成熟部分呈现高一致性的α-淀粉酶，即多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％或甚至100％的一致性。
另一种优选的酸性α-淀粉酶是来源于黑曲霉菌株。在一个优选实施例中，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且在WO89/01969(实例3)中进行更详细描述的黑曲霉的α-淀粉酶。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在WO2004/080923(诺维信)中示出为SEQIDNO:1，将其通过引用结合在此。还考虑了与WO2004/080923中的SEQIDNO:1具有至少70％一致性、例如至少80％或甚至至少90％一致性、例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。合适的可商购的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可获得自诺维信公司，丹麦)。
真菌酸性α-淀粉酶还可以是野生型酶，其包含碳水化合物结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化结构域(即，非杂合)，或其变体。在一个实施例中，野生型酸性真菌α-淀粉酶是源自白曲霉的菌株。
可商购的包含真菌α-淀粉酶的组合物包括和在商品名SP288下销售的酸性真菌α-淀粉酶(可获得自诺维信公司，丹麦)。
在一个实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括通过引用结合在此的WO2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(诺维信公司)或美国专利申请号60/638,614(诺维信公司)中披露的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域和任选的接头。
考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括披露于共同未决的美国专利申请号60/638,614中实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的真菌淀粉变体(在此的SEQIDNO:2和US60/638,614中的SEQIDNO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(在此的SEQIDNO:3和US60/638,614中的SEQIDNO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQIDNO:20、SEQIDNO:72和SEQIDNO:96的组合并且进一步披露为在此的SEQIDNO:13)、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(在此的SEQIDNO:4和US60/638,614中的SEQIDNO:102)。其他确切考虑的杂合α-淀粉酶是列于美国申请号11/316,535或(WO2006/069290)(将其通过引用而结合在此)的实例4的表3、4、5和6中的任何α-淀粉酶。考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括披露于美国专利申请号2005/0054071中的那些，包括披露于15页表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
可以按0.1至250FAU(F)/L发酵培养基、优选1至100FAU(F)/L发酵培养基的量添加酸性α-淀粉酶。
葡糖淀粉酶
根据本发明，可以与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是例如细菌来源或真菌来源的。
考虑的葡糖淀粉酶包括选自下组的那些，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO92/00381、WO00/04136和WO01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)(1991)，55(4),p.941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，(1996)，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，(1995)，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，(1994)，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，(1996)，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，(1997)，蛋白质工程(ProteinEng.)10:1199-1204)。
其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自阿太菌属的菌株，优选是源自罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)的菌株的葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，(1998)，“来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性”(“Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii”)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，具体地源自埃默森篮状菌(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利登记号32,153)、Talaromycesduponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。还考虑的是披露为WO2006/060062中的SEQIDNO:4的里氏木霉葡糖淀粉酶，和与其具有至少80％或至少90％一致性的葡糖淀粉酶，并且另外还有披露为US7,262,041-B2(US10/992,187)(将其通过引用而结合在此)中的SEQIDNO:3的灰腐质霉的葡糖淀粉酶，或与其具有至少80％或至少90％一致性的序列。
在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株、优选埃默森篮状菌。
其他考虑的葡糖淀粉酶包括源自栓菌属的菌株，优选是披露于WO2006/069289(将其通过引用而结合在此)中的瓣环栓菌的菌株的葡糖淀粉酶。根据本发明还考虑了杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶实例披露于WO2005/045018中。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用而特此结合)。
考虑到的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，特别是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG200L；AMG300L；SANSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEFUEL、SPIRIZYMEULTRA、SPIRIZYMEEXCEL、SPIRIZYMEB4U和AMGE(来自诺维信公司)；OPTIDEX300(来自杰能科国际公司)；和AMIGASEPLUS(来自DSM公司)；G-ZYMEG900、和G990ZR(来自杰能科公司)。
在一个实施例中，可以按1-5,000AGU/L发酵培养基、优选10-1,000AGU/L发酵培养基的量添加葡糖淀粉酶。
材料与方法
材料：
蛋白酶PfuS：在此的SEQIDNO:2中示出的源自激烈热球菌的蛋白酶。
Mg蛋白酶3：来自在WO2014/037438中的实例2中涉及的大型亚灰树花菌的菌株的丝氨酸肽酶家族S53蛋白酶。
蛋白酶Z5S17：Snapalysin的纯化样品(实例4)。
蛋白酶Z6Z6A：(可获得自诺维信公司的蛋白酶)(实例4)
化学止泡剂(实例1和2)：AD5520GA(来自乙烯氧化物和丙烯氧化物的缩合共聚物)，来自Alcolina公司，巴西。
止泡剂1：止泡剂ARTDISP904S和分散剂ARTDISP8000，AratropIndustrial公司，巴西(实例3)
止泡剂2：止泡剂AD4415和分散剂AD5520GA，Alcolina公司，巴西(实例3)
酵母(BRT)：巴西发泡酿酒酵母菌株
酵母CAT-1：购买自LNF公司，巴西(www.lnf.com.br)并且描述于巴布拉扎德(Babrzadeh)等人，2012，“有效的工业燃料乙醇发酵酿酒酵母菌株CAT-1的全基因组测序(Whole-genomesequencingoftheefficientindustrialfuel-ethanolfermentativeSaccharomycescerevisiaestrainCAT-1)”，分子遗传学和基因组学(Moleculargeneticsandgenomics)：MGG287(6),485-494。
底物：甘蔗糖蜜(80°糖蜜含糖量)，获得自SantaHelenamill公司(皮拉西卡巴，圣保罗州，巴西)(实例1和2)。
甘蔗糖蜜样品来自Josémill公司，巴西(实例3)
方法
一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“一致性”描述。
出于本发明的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的一致性程度以及两个核苷酸序列之间的一致性程度，所述程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunschalignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，使用缺省一致性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口的第一个残基的罚分为-12，对核苷酸而言该罚分为-16。对多肽而言，缺口更远残基的罚分为-2，对核苷酸而言该罚分为-4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见皮尔逊(W.R.Pearson)和利普曼(D.J.Lipman)(1988)，用于生物序列分析的改进的工具(“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis”)，PNAS85:2444-2448，和皮尔逊(1990)使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较(“RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA”)酶学方法(MethodsinEnzymology)183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Watermanalgorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见史密斯-沃特曼算法(“Smith-Watermanalgorithm”)，史密斯(T.F.Smith)和沃特曼(M.S.Waterman)(1981)分子与生物学杂志(J.Mol.Biol.)147:195-197)。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物来确定淀粉分解活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个KiloNovoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003MCa2+；和pH5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(MerckAmylumsolubile)的酶量。
更详细描述这种分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件结合在此。
酸性淀粉分解活性(FAU)的确定
一真菌α-淀粉酶单位(1FAU)是指基于下列标准条件下，按照用于确定α-淀粉酶的诺维信标准方法，每小时分解5.26g淀粉(MerckAmylum的可溶性Erg.B.6，批号9947275)所需要的酶的量：
用于确定KNU和FAU的诺维信方法的详细描述可作为标准方法EB-SM-0009.02/01索取得到。
酸性α-淀粉酶活性的确定(AFAU)
以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。
使用的标准是AMG300L(由诺维信公司销售的野生型黑曲霉G1AMG)。这种AMG中的中性α-淀粉酶在储存于室温3周后从约1FAU/mL下降至0.05FAU/mL以下。
根据AF91/3(用于确定真菌α-淀粉酶的诺维信方法)来确定这种AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉一起形成蓝色复合物，但不与其降解产品形成蓝色复合物。因此颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法在指定分析条件下确定淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。
蓝色/紫色t＝23秒脱色
标准条件/反应条件：(每分钟)
底物：淀粉，大约0.17g/L
缓冲液：柠檬酸盐，大约0.03M
碘(I2)：0.03g/L
CaCl2：1.85mM
pH：2.50+/-0.05
孵育温度：40℃
反应时间：23秒
波长：λ＝590nm
酶浓度：0.025AFAU/mL
酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL
进一步细节可以发现于可从诺维信公司索取得到的标准方法文件EB-SM-0259.02/01中，通过引用将该文件结合在此。
FAU(F)确定
相对于具有声明强度的酶标准品测量FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(芬加密尔(Fungamyl))。
更详细地描述这种标准方法的文件(EB-SM-0216.02)可从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件结合在此。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，由此使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计确定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细描述这种分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件结合在此。
蛋白酶测定法-AU(RH)
可以用变性的血红蛋白作为底物确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。
将一个安森(Anson)单位(AU-RH)定义为在标准条件(即，25℃，pH5.5和10min反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。
AU(RH)法描述于EAL-SM-0350中并且可从丹麦的诺维信公司索取得到。
蛋白酶测定
AZCL-酪蛋白测定
边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH9的Borax/NaH2PO4缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(EppendorfThermomixer)中在45℃和600rpm下孵育30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸20min)用作空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃下以3000rpm离心5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRadMicroplateReader)测量在595nm处的吸光度。
pNA测定
将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mMpNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH9.0的Borax/NaH2PO4缓冲液稀释至10mL)开始该测定。OD405在室温下的增加被监测为蛋白酶活性的一个量度。
本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。在此引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。
实例
实例1
在甘蔗糖蜜发酵中，在化学止泡剂和PfuS之间，对泡沫控制进行比较
在32℃，在50mL离心瓶(TPP)中进行发酵实验，模拟如在巴西国内进行的工业乙醇发酵工艺。使用了发泡巴西酵母菌株。将含22°糖蜜含糖量的发酵底物(由稀糖蜜组成)进料至酵母浆料(通过在水中再悬浮酸处理的酵母生物质制备)中。酵母浆料代表总发酵体积的30％，类似于工业条件。在发酵约6小时后，通过离心(4000rpm持续10min)收集酵母细胞，称重，用发酵的糖蜜(酒)和水稀释(至35％w/v酵母湿重)，并且用硫酸处理(pH从2.0至2.5持续1小时)，并且再用于随后的9个发酵循环中。在每一条件下，一式三份运行样品。在样品的离心(4000rpm持续10min)后，通过重量分析法确定湿重酵母生物质。通过记录管中的泡沫重量和/或通过代表性50mL管的拍照，在进料后，每小时登记泡沫。条件是：
对照-无酶。在酸洗期间不添加化学止泡剂。
化学止泡剂添加。在酸洗期间添加化学止泡剂，在每一循环后具有不断增加的剂量，直至控制了泡沫。
蛋白酶PfuS添加。在添加新的糖蜜后，添加蛋白酶PfuS。在酸洗期间不添加化学止泡剂。
根据表1使用剂量。将止泡剂添加进酵母浆料中。在用新鲜糖蜜进料发酵池后，添加蛋白酶PfuS。
表1：用于控制发泡的止泡剂油和PfuS的剂量
产物 浓度(mg/L)
化学止泡剂 10至30
PfuS蛋白酶 3.7和7.5
泡沫测量生成以下数据，示出更显著的结果，总结于表2中：
表2：来自每一处理的泡沫控制结果。由于泡沫形成，与培养基体积相比，数据呈现为总体积增加。
在已经停止化学止泡剂和蛋白酶PfuS添加后，在接下来的三个随后的发酵循环中，测量泡沫高度。在最后一次蛋白酶PfuS添加后，其中已经添加蛋白酶PfuS的管呈现对两个随后批次的残余止泡效果。以总体积增加呈现的泡沫形成总结在表3中：
表3：在已经停止止泡剂油和蛋白酶PfuS添加后，在两个批次(循环1和循环2)中的泡沫形成。由于泡沫形成，与培养基体积相比，数据呈现为总体积增加。
*将单剂量的蛋白酶PfuS(3.7ppm)添加至此管，并且在单剂量添加后，对其泡沫测量多达三个循环。
实例2
在甘蔗糖蜜发酵中，使用细胞再循环系统，蛋白酶PfuS对酵母生物质生产 和生存力维持的影响
在32℃，在50mL离心瓶(TPP)中进行发酵实验，模拟如在巴西国内进行的工业乙醇发酵工艺。使用实例1中使用的相同天然发泡巴西酵母菌株。将含22°糖蜜含糖量的发酵底物(稀糖蜜)进料至酵母浆料(通过在水中再悬浮酸处理的酵母生物质制备)中。酵母浆料代表总发酵体积的30％，类似于工业条件。在发酵后，通过离心(4000rpm持续10min)收集酵母细胞，称重，用发酵的糖蜜(酒)和水稀释(至35％w/v酵母湿重)，并且用硫酸处理(pH从2.0至2.5持续1小时)，并且再用于随后的9个发酵循环中。在每一条件下，一式三份运行样品。在样品的离心(4000rpm持续10min)后，通过重量分析法确定湿重酵母生物质。在酵母生物质离心后，酒具有在每个循环结束时确定的pH。用赤藓红染色，通过显微细胞计数来测定酵母生存力。
条件是：
对照-无酶；在酸洗期间不添加化学止泡剂。
蛋白酶PfuS添加。在添加新的糖蜜后，添加蛋白酶PfuS。在酸洗期间不添加化学止泡剂。
剂量根据表1。在用新鲜糖蜜进料发酵池后，添加蛋白酶PfuS。
表1：用于每次处理的蛋白酶剂量添加。
处理 蛋白酶剂量(mg/L)
对照 0
蛋白酶PfuS 2.5ppm 2.5至1.9
蛋白酶PfuS 5ppm 5至3.7
蛋白酶PfuS 10ppm 10至7.5
在实验期间，如图1所描绘，对每次处理的酵母生物质(湿量基准)测量示出，当与对照相比较时，在处理的样品中的显著增加：
图1示出了经9个循环的发酵，对照(无酶添加)的平均酵母生物质和经处理的样品的平均酵母生物质之间的比较(对于循环9和10中，2.5ppm、5ppm和10ppm；1.9ppm、3.7ppm和7.5ppm)。在最后一个发酵批次后，取点10。如从图1中可见，当与对照相比较时，对于处理的样品，酵母生物质的平均增加是约12％。生存力结果呈现于表2中。
图2示出了经9个发酵循环，对照(无酶添加)的平均酵母生存力和经处理的样品的平均酵母生存力之间的比较(在循环9和10中，2.5ppm、5ppm和10ppm；1.9ppm、3.7ppm和7.5ppm)。用更高蛋白酶剂量(即3.7ppm至10ppm)处理的样品导致在9个随后的发酵循环后，与对照相比，平均多5％的活细胞。
实例3
化学止泡剂和蛋白酶的乙醇产量和生存力效果
在50mLFalcon管中，进行分批进料发酵，模拟如在巴西国内进行的工业燃料乙醇发酵工艺。使用非发泡酵母菌株CAT-1(酿酒酵母)。对于第一个循环，按对应于8％(w/v)的最终体积的量，将来自繁殖培养物的酵母细胞添加至每个管。伴随25mL甘蔗果汁(在(巴西)自来水中将甘蔗糖蜜稀释至20糖蜜含糖量，离心以除去固体，并且热压处理)，按三个相等大小的部分，以1.5小时间隔，进料细胞。将培养物在32℃孵育7小时，不搅拌，并且留在室温下过夜。第二天，通过离心(3220rcf，5min)从发酵酒中分离细胞，并且再悬浮于酒中[30％(湿w/w)]，以模拟工业离心效率。在添加1M硫酸至2.5的最终pH之前，在脱矿质水(1:1)中进一步稀释细胞。在室温下，在酸中孵育1小时后，启动进料，重新开始该工艺。
在工业中，给予工业止泡剂1(止泡剂ARTDISP904S和分散剂ARTDISP8000，AratropIndustrial公司，巴西)和止泡剂2(止泡剂AD4415和分散剂AD5520GA，Alcolina公司，巴西)，其中在酸洗期间添加分散剂，并且在发酵1小时后，添加止泡剂。按5ppmEp(酶蛋白)的浓度将PfuS直接添加至维持培养基。
在milliQ水中将来自甘蔗发酵的样品稀释1000倍，至大约500个细胞/mL的最终浓度。根据制造商的建议，用碘化丙锭(PI)(215nmol/mL)染色细胞，并且在黑暗中孵育5-10min，之后施加样品至流式细胞仪(BDaccuriC6)上。FSC-H门的阈值设置在200,000，以避免大颗粒。通过分离产生自PI荧光团探测器FL3-H的直方图的两个群体，完成生存力的量化。还通过每小时称取管重量，监测发酵动力学。考虑到在摩尔方面，按大约1:1的比率，累积的CO2演化正比于乙醇形成，所以可能推断乙醇累积演化，它直接关系到乙醇产量(g乙醇.L-1.h-1)。
贯穿所有发酵循环监测乙醇产量，并且用作代谢活动和乙醇形成的度量。图3示出了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶PfuS的平均乙醇生产量之间的比较。与对照和用蛋白酶处理相比，用工业止泡剂处理的样品示出更少的乙醇产量。
发酵的另一重要参数是在每个循环后监测的生存力。图4示出了经5个循环的发酵，对照(既无止泡剂添加也无酶添加)、两种工业止泡剂(止泡剂1和止泡剂2)、以及蛋白酶(PfuS)的平均酵母细胞生存力之间的比较。当与对照和用蛋白酶处理相比较时，用工业止泡剂处理的样品示出生存力方面的增加的下降。
实例4
蛋白酶添加对发泡酵母发酵中蛋白水平的影响
在50mLFalcon管中，进行分批进料发酵，模拟如在巴西国内进行的工业燃料乙醇发酵工艺。使用发泡巴西酵母菌株(BRT)(酿酒酵母)并且与非发泡酵母(CAT-1)相比较。按对应于10％(w/v)的最终体积的量，将酵母细胞添加至每个管。伴随充足体积的化学上定义的培养基(无氨基酸的YNB培养基和10mM柠檬酸盐缓冲剂pH5.5；西格玛奥瑞奇集团(Sigma-Aldrich))进料细胞，以葡萄糖作为唯一碳源(16％w/v)。将培养物在32℃孵育7小时，不搅拌，并且留在室温下过夜。第二天，通过离心(3220rcf，10min)从发酵酒中分离细胞，并且再悬浮于酒中[30％(湿w/w)]，以模拟工业离心效率。在脱矿质水(1:1)中进一步稀释细胞。在该稀释后，将新鲜培养基添加至浆料并且再一次开始该工艺。按10ppm(10mgEP/L)的浓度，将蛋白酶添加至处理管。对照管不接受酶。
用TCA溶液进行的蛋白沉淀
首先将来自以上发酵设置的酒收集在一起，并且在0.22μm中过滤。收集来自每个池的样品，并且添加0.11体积的冰冷的100％TCA溶液，用于蛋白沉淀。将管放置在冰上10min，此后将0.500mL的冰冷的10％TCA添加至样品。将管再放置在冰上20min，并且在20,000g下离心30min。除去上清液并且将0.500mL丙酮添加至沉淀物。轻轻摇动管，并且在20,000g下离心10min。除去上清液。将沉淀物静置15分钟，以便干燥。
SDS-PAGE凝胶电泳
将来自TCA沉淀的蛋白沉淀物直接再悬浮于利姆里(Laemmli)上样缓冲液中(根据制造商的说明书)用于SDS-PAGE分析。然后在加热块上在100℃加热样品5分钟。将45μl的每一样品注入凝胶的分开的孔(标准无染色TGX(CriterionTGXStain-Free)4％-20％，12孔)。将0.010mL的标记(Bio-Rad精度加上蛋白未染色的标准(Bio-RadPrecisionPlusProteinUnstainedStandard))添加至分开的孔。在120V(恒电压)跑胶持续大约1小时。将凝胶转移至Bio-Rad无染色样品盘并且在GelDocEZ图像仪上，使用ImageLab软件进行分析。
SDS-Page凝胶的照片示出于图5中。
结论
-当与非发泡菌株(CAT-1)相比较时，发泡酵母菌株(BRT)释放显著更多的蛋白片段进入发酵培养基(酒)中。
-蛋白酶PfuS和MgProt3降解了这些蛋白带之一(由图5中的箭头指示)，同时并不控制泡沫的其他两种蛋白酶(蛋白酶Z5S17和蛋白酶Z6Z6A)不能降解这一条带(参见范围25-50KDa中的条带)。
参考文献：
冷泉港实验方案(ColdSpringHarbProtoc)；2011；doi:10.1101/pdb.prot5651
由安德鲁J.林克(AndrewJ.Link)和约书亚拉巴厄(JoshuaLaBaer)改编自蛋白质组学：冷泉港实验室课程手册(Proteomics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual)，CSHL出版社，冷泉港，纽约州，美国，2009。
概述段落
在权利要求书和所附说明书中限定了本发明。为了方便，通过编号段落，将本发明的其他方面呈现在此：
1.使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的一种工艺，该工艺包括
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中在以下时刻添加蛋白酶
a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或
b)在步骤ii)中的发酵期间。
2.如段落1所述的工艺，其中将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。
3.如段落2所述的工艺，其中蛋白酶与可易于发酵的糖材料的进料流混合。
4.如段落3所述的工艺，其中在进料步骤i)之前，蛋白酶与可易于发酵的糖材料的进料流混合。
5.如段落1-4中任一项所述的工艺，其中可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。
6.如段落1-5中任一项所述的工艺，其中发酵培养基进一步包括甘蔗的其他副产物，具体地是来自甘蔗渣及其流的水解产物。
7.如段落1-6中任一项所述的工艺，其中发酵有机体是酵母、发泡酵母，例如来自酵母属的菌株，如来自酿酒酵母的菌株，尤其是来自当发酵时产生泡沫的酿酒酵母的菌株。
8.如段落1-7中任一项所述的工艺，其中在步骤ii)中的发酵之后，将发酵有机体再循环。
9.如段落8所述的工艺，将从50％-100％、例如70％-95％、例如约90％的发酵有机体再循环。
10.如段落1-9中任一项所述的工艺，其中在发酵期间，发酵有机体细胞密度是8％-17％w/v(湿量基准)。
11.如段落9或10中任一项所述的工艺，其中在步骤ii)中的发酵之后，收集发酵有机体，例如酵母，酸洗，并且再循环至发酵池。
12.如段落11所述的工艺，其中在步骤ii)中的发酵之后，收集发酵有机体，例如酵母，并且用硫酸来酸洗，例如在pH1.5-3.0，如2.0-2.5，例如酸洗1-2小时。
13.如段落1-12中任一项所述的工艺，其中按分批发酵、分批进料发酵或连续发酵来进行发酵。
14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
15.如段落1-14中任一项所述的工艺，其中按0.2至25mg酶蛋白/L发酵培养基或0.01-100ppmEP(酶蛋白)、如0.1-50ppmEP、具体地是1-25ppmEP的剂量添加蛋白酶。
16.如段落1-15中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是唯一添加的酶。
17.如段落1-16中任一项所述的工艺，其中可以与选自下组的一种或多种酶一起添加蛋白酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、氧化酶、过氧化酶、过氧化氢酶、漆酶、β-葡糖苷酶、其他糖酶、以及氧化酶。
18.如段落1-17中任一项所述的工艺，其中与不添加蛋白酶的相应工艺相比，发酵池中的发泡减少。
19.如段落18所述的工艺，其中在其他酶、优选是段落17中的一种或多种酶之后添加蛋白酶。
20.如段落1-19中任一项所述的工艺，其中与不存在蛋白酶或不添加蛋白酶的相应工艺相比，添加蛋白酶导致增加的产量，例如乙醇产量。
21.如段落1-20中任一项所述的工艺，其中在发酵培养基中存在的残余糖减少。
22.如段落1-21中任一项所述的工艺，其中步骤i)和ii)同时或相继地进行。
23.如段落1-22中任一项所述的工艺，其中发酵在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选约32℃左右的温度下进行。
24.如段落1-23中任一项所述的工艺，其中发酵持续2至120小时，具体地是4至96小时，例如在6和12小时之间。
25.如段落1-24中任一项所述的工艺，其中发酵产物是在发酵之后，例如通过蒸馏回收的。
26.如段落1-25中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶选自下组：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。
27.如段落1-26中任一项所述的工艺，其中蛋白酶能够切割在发酵有机体，具体地是酿酒酵母的表面上的细胞壁蛋白，具体地是甘露糖蛋白，和/或能够水解在发酵的可易于发酵的糖材料，例如发酵的糖蜜(酒)中的蛋白，具体地是甘露糖蛋白。
28.如段落1-27中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是微生物来源的，例如真菌或细菌来源的。
29.如段落1-28中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是真菌来源的。
30.如段落1-29中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是金属蛋白酶，例如源自嗜热子嚢菌属的菌株、优选是橙色嗜热子囊菌(尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC编号0670)的菌株的金属蛋白酶，例如WO2003/048353中披露的SEQIDNO:2的成熟部分或WO2010/008841中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:1的成熟部分，或其变体。
31.如段落1-30中任一项所述的工艺，其中蛋白酶或其变体与SEQIDNO:1的多肽的成熟部分具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。
32.如段落1-31中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是细菌来源的。
33.如段落1-32中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如源自热球菌属的菌株、优选是激烈热球菌的菌株的蛋白酶。
34.如段落1-33中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是在US6,358,726中的SEQIDNO:1、或在此的SEQIDNO:2中示出的蛋白酶。
35.如段落1-34中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是与US6,358,726中的SEQIDNO:1或在此的SEQIDNO:2具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的蛋白酶。
36.如段落1-35中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶家族S53蛋白酶、例如源自亚灰树花菌属的菌株、优选是大型亚灰树花菌的菌株的S53蛋白酶。
37.如段落1-36中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是来自WO2014/037438中的实例2的大型亚灰树花菌蛋白酶3的成熟序列或在此的SEQIDNO:6或在此的SEQIDNO:7。
38.如段落1-37中任一项所述的工艺，其中蛋白酶是与在此的SEQIDNO:6或在此的SEQIDNO:7具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的蛋白酶。
39.如段落1-38中任一项所述的工艺，进一步地其中可以与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。
40.如段落39所述的工艺，其中α-淀粉酶是微生物来源的，例如真菌或细菌来源的。
41.如段落40所述的工艺，其中α-淀粉酶是真菌来源的。
42.如段落41所述的工艺，其中真菌α-淀粉酶是源自根毛霉属的菌株，例如微小根毛霉的菌株，例如SEQIDNO:3中示出的微小根毛霉α-淀粉酶的杂合体，该杂合体进一步包括淀粉结合模块，例如CBM20淀粉结合模块，例如SEQIDNO:4中示出的序列。
43.如段落42所述的工艺，其中α-淀粉酶是细菌来源的。
44.如段落43所述的工艺，其中细菌α-淀粉酶是源自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌物种的菌株、或其变体。
45.如段落44所述的工艺，其中α-淀粉酶是与在此的SEQIDNO:5具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％一致性，例如至少90％一致性，例如至少95％一致性，例如至少96％一致性，例如至少97％一致性，例如至少99％一致性的成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或相应的成熟α-淀粉酶。
46.如段落44或45所述的工艺，其中成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体被截短，优选被截短至具有约485-496个氨基酸，例如约491个氨基酸。
47.如段落44-46中任一项所述的工艺，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在I181+G182位置具有双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用在此的SEQIDNO:5进行编号)。
48.如段落1-47中任一项所述的工艺，进一步地其中与蛋白酶一起添加葡糖淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。
49.如段落48所述的工艺，其中葡糖淀粉酶是曲霉属的菌株,优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌，或栓菌属的菌株，例如瓣环栓菌，或密孔菌属的菌株，或褐褶菌属的菌株，或黑层孔属的菌株。
50.如段落1-49中任一项所述的工艺，其中可易于发酵的糖材料底物并不包含多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素。
51.如段落1-50中任一项所述的工艺，其中希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，该工艺包括在进料前添加蛋白酶至可易于发酵的糖材料；将含蛋白酶的可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
52.如段落1-51中任一项所述的工艺，其中是在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵、分批进料发酵、半连续发酵或连续发酵工艺生产乙醇，包括在进料前添加蛋白酶至甘蔗糖蜜；将含蛋白酶的甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
53.如段落1-52中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，该工艺包括在进料前添加强烈火球菌蛋白酶至甘蔗糖蜜；将含强烈火球菌蛋白酶的甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
54.如段落1-53中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，该工艺包括在进料前添加肽酶家族S53蛋白酶、具体地是大型亚灰树花菌蛋白酶3至甘蔗糖蜜；将含甘蔗糖蜜的肽酶家族S53蛋白酶、具体地是大型亚灰树花菌蛋白酶3进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
55.如段落1-54中任一项所述的工艺，其中希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；在发酵前，将蛋白酶进料至包含可易于发酵的糖和发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
56.如段落1-55中任一项所述的工艺，其中是在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵或分批进料发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在发酵前，将蛋白酶、优选丝氨酸蛋白酶进料至包含酿酒酵母和甘蔗糖蜜的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
57.如段落1-56中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；在发酵前，将强烈火球菌蛋白酶进料至包含甘蔗糖蜜和酿酒酵母的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
58.如段落1-57中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；在发酵前，将肽酶家族S53蛋白酶、具体地是大型亚灰树花菌蛋白酶3进料至包含甘蔗糖蜜和酿酒酵母的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
59.如段落1-58中任一项所述的工艺，其中希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；在将该可易于发酵的糖材料发酵为该希望的发酵产物期间，添加蛋白酶至该发酵池中。
60.如段落1-59中任一项所述的工艺，其中在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵、分批进料发酵、半连续发酵或连续发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在将这些甘蔗糖蜜发酵为乙醇期间，添加蛋白酶、具体地是丝氨酸蛋白酶至该发酵池中。
61.如段落1-60中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵为乙醇期间，添加强烈火球菌蛋白酶至发酵池中。
62.如段落1-61中任一项所述的工艺，其中乙醇是通过在发酵池中发酵而产自甘蔗糖蜜，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵为乙醇期间，添加肽酶家族S53蛋白酶、具体地是大型亚灰树花菌蛋白酶3至发酵池中。
63.如段落1-62中任一项所述的工艺，该工艺包括
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中
-在步骤i)之前，将蛋白酶与该进料流混合；或
-在进料后，将蛋白酶添加至发酵池中。
64.如段落63所述的工艺，其中蛋白酶是强烈火球菌蛋白酶。
65.如段落63所述的工艺，其中蛋白酶是大型亚灰树花菌蛋白酶3。
66.当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。
67.根据段落66所述的用途，其中如段落1-65中任一项中所限定而生产希望的发酵产物。

Claims (23)

1.使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的一种工艺，该工艺包括
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中在以下时刻添加蛋白酶
a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或
b)在步骤ii)中的发酵期间。
2.如权利要求1所述的工艺，其中将该可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至该发酵池中。
3.如权利要求2所述的工艺，其中将该蛋白酶与该可易于发酵的糖材料的进料流混合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中在进料步骤i)之前，将该蛋白酶与该可易于发酵的糖材料的进料流混合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工艺，其中该可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工艺，其中该发酵有机体是酵母，如发泡酵母，例如来自酵母属的菌株，如来自酿酒酵母的菌株，尤其是来自当发酵时产生泡沫的酿酒酵母的菌株。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中在步骤ii)中的发酵之后，将该发酵有机体再循环。
8.如权利要求6-7中任一项所述的工艺，其中在步骤ii)中的发酵之后，收集该发酵有机体，例如发泡酵母，酸洗，并且再循环至该发酵池。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶选自下组：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶能够切割在该发酵有机体，例如发泡酵母，具体地是酿酒酵母的表面上的细胞壁蛋白，具体地是甘露糖蛋白，和/或能够水解在发酵的可易于发酵的糖材料，例如发酵的糖蜜(酒)中的蛋白，具体地是甘露糖蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如源自热球菌属的菌株、优选是激烈热球菌的菌株的蛋白酶。
12.如权利要求1-10中任一项所述的工艺，其中该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶家族S53蛋白酶，例如源自亚灰树花菌属的菌株，优选是大型亚灰树花菌的菌株的S53蛋白酶，例如大型亚灰树花菌蛋白酶3。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工艺，其中该可易于发酵的糖材料底物不包含多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工艺，其中希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，该工艺包括在进料前添加蛋白酶至该可易于发酵的糖材料；将含蛋白酶的可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工艺，其中在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵、分批进料发酵、半连续发酵或连续发酵工艺生产乙醇，该工艺包括在进料前添加蛋白酶至甘蔗糖蜜；将含蛋白酶的甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工艺，其中该希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；在发酵前，将蛋白酶进料至包含可易于发酵的糖和发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工艺，其中在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵或分批进料发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的发酵池中；在发酵前，将蛋白酶、优选丝氨酸蛋白酶进料至包含酿酒酵母和甘蔗糖蜜的浆料的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵为乙醇。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工艺，其中该希望的发酵产物是通过在发酵池中发酵而产自可易于发酵的糖材料，其中该工艺包括：将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；在将该可易于发酵的糖材料发酵为该希望的发酵产物期间，添加蛋白酶至该发酵池中。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工艺，其中在包含甘蔗糖蜜的发酵池中，按分批发酵、分批进料发酵、半连续发酵或连续发酵工艺生产乙醇，其中该工艺包括：将甘蔗糖蜜进料至包含酿酒酵母的浆料的该发酵池中；在将这些甘蔗糖蜜发酵为乙醇期间，添加蛋白酶、具体地是丝氨酸蛋白酶至该发酵池中。
20.如权利要求1-19中任一项所述的工艺，该工艺包括
i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体的浆料的该发酵池中；
ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，
其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中
-在步骤i)之前，将蛋白酶与该进料流混合；或
-在进料后，将蛋白酶添加至发酵池中。
21.如权利要求63所述的工艺，其中该蛋白酶是强烈火球菌蛋白酶或大型亚灰树花菌蛋白酶3。
22.当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中如权利要求1-21中任一项中所限定而生产希望的发酵产物。
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