CN102405283A - 用于不进行pH调整的谷物加工的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

描述了涉及不进行植酸酶预处理步骤和不进行浆液pH调整的淀粉加工的组合物和方法。

Description

用于不进行pH调整的谷物加工的组合物和方法

交叉参考

本申请要求2009年4月17日提交的美国临时专利申请号61/170,531的优先权，将其完整并入本文。

技术领域

本组合物和方法涉及在不添加用于pH调整的碱或酸的情况下，将谷类/谷物淀粉加工成可溶性糊精和乙醇。

背景

干磨乙醇生产方法主要使用全磨谷物，例如，玉米或买罗高粱，或分级的玉米。在一般的干磨方法中，首先将整个玉米粒或其他淀粉谷物碾碎成特定的颗粒大小(＜1.0mm)，并然后加工，而不进一步分离谷物的多种组分。将研磨的谷物用热蒸煮水(＞90℃)制作成浆液(25-40％不溶的固体(DS)谷物)，并在混合箱中混合均匀。在将浆液转移到初级液化罐前，将初始剂量的热稳定性液化α淀粉酶加入到混合箱中的浆液。

然后，使用氨将部分凝胶化的淀粉浆液的pH常规地调整到大于pH5.8，并然后用热稳定性α淀粉酶在85-86℃温育15-20分钟后将其送至维持在105-108℃的喷射蒸煮器维持3-5分钟的时间。喷射蒸煮后，将凝胶化的淀粉浆液高压维持在蒸煮管中8至10分钟以完全凝胶化，并然后快速转换至大气压并维持在85℃的温度。

在浆液维持在升高的温度90-120分钟期间，一般加入第二剂量的热稳定性α淀粉酶以完成淀粉的液化，并因此在发酵前，将所述浆液送至用于降低温度至32℃的一系列热交换器中。高温也降低了微生物污染醪液的高风险。液化后，使用稀释的硫酸将醪液的pH降低至小于pH5.2，并然后在发酵前冷却至32℃。该方法图示于图1中，其标出了必须进行pH调整的步骤。

在干磨乙醇方法中，一般将全磨谷物与淡水、冷凝水和稀釜馏物(一般称为蒸煮水或逆流物)以10-50％混合，以产生具有25％-45％的DS含量的醪液。全磨谷物，例如玉米或买罗高粱/高粱在水中的天然pH为5.5至6.2，这取决于谷物贮藏的长度和微生物感染的程度。然而，当碾磨的谷物与不同量的稀釜馏物混合时，pH降低到pH4.8至pH5.2。取决于特定的加工工厂，稀釜馏物的pH也显著地变化，具有的典型pH值为3.8至4.5。一些乙醇生产者加入酸，例如以降低啤酒中的pH和降低蒸馏前微生物污染的风险，因此降低了pH。

为了说明这点，在Monroe，WI，美国的乙醇生产工厂，最近研究了在加入全磨玉米浆液的补偿水中，以不同的比率加入来自商业乙醇工厂的稀釜馏物对最终pH的影响。如表1中所示，用作补偿水的稀釜馏物越多，浆液的最终pH就越低。

表1.稀釜馏物浓度对全磨玉米浆液(32％DS玉米)的最终pH的影响，在32℃(155°F)搅拌2小时。

稀釜馏物，(％w/w)	32％DS全磨玉米浆液的最终pH
		0	5.52
20	5.29
		40	5.16
50	5.09
		60	5.05
80	4.98
		100	4.94

一般对于乙醇生产工厂，重要的是将浆液槽中的蒸煮水用作为补偿水以保存水，因此，不应当阻碍该实践。然而，目前用于在初级液化期间将全磨谷物中的颗粒淀粉转变成可溶性糊精的市售热稳定性α淀粉酶在该方法中使用的升高的温度下，在低于pH5.6是不稳定的。因此，为了给α淀粉酶提供合适的环境，必须使用合适的碱试剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或氨，将pH调整至pH5.8至pH6.0。该pH调整不仅仅是附加的步骤，因为它一般将显著量的离子，例如，钠加入到了发酵培养基中，其可能在后续的加工步骤期间影响微生物的生长，例如，发酵期间酵母的生长。

由于添加了碱性试剂，在更高的pH开始酵母发酵增加了微生物污染的风险。结果，醇生产者一般使用稀释的硫酸将液化后的pH降低至小于pH5.0(例如，pH4.2至4.5)。除又加入了另一pH调整步骤外，添加硫酸导致浆液具有更高的硫含量，其可能导致废物处理问题并引起了环境保护问题。与使用硫酸用于pH调整相关的另一问题是产生了DDGS，一种具有高硫含量的动物饲料组分。

显而易见，将浆液或醪液的pH调整到推荐的市售酶制剂的需求增加了谷物加工所需的步骤数目，并将离子和其他化学物质引入到了浆液或醪液中，其可能不利地影响微生物生长、副产品的质量，以及处理加工废料的容易程度。

用常规谷物加工方法的另一问题涉及植酸(即，植酸盐、肌醇六磷酸或者IP6)。植酸盐是谷物/谷类和油籽中磷酸的主要储存形式(参见，例如，Graf，E.(编辑)“Phytic acid Chemistry and Applications”(1986)Pilatus Press，Minneapolis，美国)。植酸盐由肌醇环和六个对称分布的磷酸基团组成。一般认为植酸盐是用于饲料制剂的谷物和谷类的不需要组分，因为由于其有限的可消化性，磷酸对于单胃动物是不可利用的。也已知植酸盐结合必需的矿物质，例如锌、铁、钙、镁和蛋白质，导致降低了它们的生物利用率(Maenz D等人(1997)Anim.Feed.Sci.72：664-68；Ritter，M.等人(1987)J.Food Sci.52，325-41)。也已经显示，对于淀粉的水解，植酸盐和其他肌酸磷酸酯表现出α淀粉酶抑制作用(Knuckles B.和Betschart，A.(1987)J.Food Sci.52，719-21)。

植酸盐水解酶(即，植酸酶；肌醇六磷酸磷酸水解酶，E.C.3.1.3.8)将植酸水解成无机磷酸盐和肌醇单-至-五磷酸盐。该酶在植物、微生物和动物组织中广泛分布(Wodzinski，R.和Ullah，A.(1996)Advances inApplied Microbiology 42：264-303；Dvorakova J.(1998)Folia Microbiol43：323-338)。植物植酸酶一般在pH4.5至6.5之间表现出活性，具有55℃的温度最适值。因此，动物饲料制剂的加工条件一般导致了内源植酸酶的完全失活。结果，通常将微生物植酸酶用于饲料制剂。市售的微生物植酸酶包括来自Genencor的Phyzyme^TM XP 5000、来自AB Enzymes的Finase^TM、来自Godo Shusei Japan的GODO PHY^TM、来自Altech的Allzyme^TM植酸酶、来自BASF的Natuphos^TM、来自DSM/Novozyme的Ronozyme^TM。

也已经报道，用植酸酶预处理谷物和谷类以降低植酸含量。例如，美国专利号4,914,029描述了在存在二氧化硫的情况下，在浸渍条件下，用植酸酶处理玉米或高粱谷粒以消除或极大地降低玉米浆中植酸钙镁含量的方法。在欧洲专利申请公开号EP 380 343中描述了使用植酸酶产生无植酸盐的或低植酸盐的大豆蛋白质分离物/浓缩物的酶促方法。美国专利号5,756,714进一步描述了通过用植酸酶预处理淀粉浆液，在液化条件下，通过α淀粉酶增强的水解淀粉。国际专利公开号WO 98/11788描述了通过在至少两个连续循环中进行组合的湿浸渍(wet steeping)和干浸渍(drysteeping)，因此活化用于水解植酸的内源植酸酶来降低谷物产物的植酸钙镁含量。最后，美国专利公开号2005/0272137描述了改进的发酵方法，其中在存在植酸酶的情况下发酵含植酸的材料。

在谷物中植酸的存在通过增加废物处理的费用、降低可回收利用的稀釜馏物的量、结合对微生物的生长必需的痕量金属、降低蛋白水解酶的活性，以及通过抑制α淀粉酶降低淀粉水解的速率和效率，影响乙醇生产方法。

因此，显而易见，存在降低在谷类和谷物衍生产物中存在的植酸盐的量的需求。

概述

描述了涉及将谷类/谷物淀粉加工成可溶性糊精和糖的组合物和方法。该组合物和方法以热稳定性植酸酶为特征，其避免了需要调整谷类/谷物浆液的pH，排除了低温植酸酶预处理的需求，并允许在意料外的高温进行液化。在一些实施方案中，组合物和方法允许在不进行单独的pH调整的情况下，进行从淀粉液化到发酵的整个乙醇生产方法。

在一个方面，提供了用于在包含淀粉和植酸盐的浆液中进行淀粉液化的方法，该方法包括在初级液化或次级液化条件下，将浆液与热稳定性植酸酶和α淀粉酶接触，其中存在热稳定性植酸酶与不存在植酸酶的等同方法比较，增加了淀粉液化的量。

在一些实施方案中，在初级液化、次级液化、或者二者前或后都不调整浆液的pH。在一些实施方案中，α淀粉酶可以在比不存在植酸酶的情况下其具有活性的pH更低的pH下使用。

在一些实施方案中，在初级液化前，浆液不需要植酸酶预处理步骤，例如，温度低于70℃的预处理步骤。在一些实施方案中，在不低于约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或甚至85℃的温度加入植酸酶。

在一些实施方案中，初级液化和次级液化的温度是75℃或更高，例如80℃或更高、81℃或更高、82℃或更高、83℃或更高、85℃或更高或者甚至90℃或更高。在一些实施方案中，初级液化和次级液化的温度是85℃或更高。在一些实施方案中，次级液化的温度是90℃或更高。在一些实施方案中，浆液不需要添加抗氧化剂。

在一些实施方案中，植酸酶获自布丘氏菌属(Buttiauxiella spp.)。在一些实施方案中，植酸酶是来源于布丘氏菌属植酸酶的重组热稳定性植酸酶。在一些实施方案中，植酸酶选自BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ IDNO：4)和BP-112(SEQ ID NO：5)。在特定的实施方案中，植酸酶是BP-111(SEQ ID NO：4)。

在一些实施方案中，α淀粉酶是热稳定性α淀粉酶。在特定的实施方案中，α淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，或者其是来自这些生物的α淀粉酶的组合。

在另一方面，提供了用于在包含颗粒淀粉和植酸酶的浆液中进行液化的方法，该方法包括：

(a)制备包含颗粒淀粉和稀釜馏物的浆液，

(b)将浆液与热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶接触，

(c)进行初级液化和次级液化，并

(d)使用在步骤(c)中产生的糊精用于发酵，

其中在步骤(a)-(d)的任一步中都不调整浆液的pH。

在一些实施方案中，在初级液化前，浆液不需要植酸酶预处理。在一些实施方案中，在75℃或更高，例如，80℃或更高、81℃或更高、82℃或更高、83℃或更高、或者甚至85℃或更高的温度一起或分别地加入热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶。在一些实施方案中，浆液不需要添加抗氧化剂。

在一些实施方案中，植酸酶是来源于布丘氏菌属植酸酶的重组热稳定性植酸酶。在一些实施方案中，植酸酶选自BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ ID NO：4)和BP-112(SEQ ID NO：5)。在特定的实施方案中，植酸酶是BP-111(SEQ ID NO：4)。

在一些实施方案中，α淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌，或者其是来自这些生物的α淀粉酶的组合。

组合物和方法的这些和其他方面和实施方案从本发明的说明书和附图是显而易见的。

附图简述

图1是说明在pH调整的情况下，在常规液化方法中使用全磨谷物产生乙醇的步骤的示意图。

图2是显示将植酸酶添加到全磨玉米中导致示例性α淀粉酶增加的低pH稳定性和高温度稳定性的图。

图3是显示在液化全磨玉米期间植酸酶添加对DDGS中植酸含量的影响的图。

图4显示并比对了示例性布丘氏菌属热稳定性植酸酶BP-17(SEQ IDNO：2)、BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ ID NO：4)和BP-112(SEQID NO：5)与野生型布丘氏菌属植酸酶(SEQ ID NO：1)。

图5和6显示在液化条件下，通过热稳定性植酸酶水解植酸盐。

详述

I.定义

在描述本发明的组合物和方法前，明确定义了以下术语。其他定义也可以出现在全文中。在“实施例”部分的开头列出了常见缩写。

如本文中所用，术语“液化”指将淀粉转化成较短链或较低粘性的糊精的方法。该方法可以包括一个以上的步骤。

如本文中所用，术语“糊精”指葡萄糖的短链多聚体(例如，2至10个单位)。

如本文中所用，术语“淀粉”通常指植物的复杂多糖糖类，其由通过糖苷键结合在一起的多个葡萄糖单位组成，并具有通式(C₆H₁₀O₅)_x，其中x可以是任一数字。淀粉包括直链淀粉和支链淀粉。

如本文中所用，术语“颗粒淀粉”指还没有经历凝胶化的温度的天然淀粉。

如本文中所用，术语“糖化酶”指能催化从淀粉和相关的寡糖和多糖的非还原端释放D-葡萄糖的酶。糖化酶包括葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。

如本文中所用，术语“寡糖”指具有以糖苷键连接的2至10个单糖的化合物。这些简单糖的短链多聚体包括糊精。

如本文中所用，术语“葡萄糖当量”(或“DE”)指用于测量全部还原糖的浓度的工业标准，计算为基于干重存在的D-葡萄糖的量。未水解的颗粒淀粉具有基本上为0的DE，且D-葡萄糖具有100的DE。

如本文中所用，术语“葡萄糖浆”指含有葡萄糖固体的含水组合物。葡萄糖浆具有至少20的DE。葡萄糖浆可以含有不多于21％的水和不少于25％的计算为葡萄糖的还原糖。葡萄糖浆可以包含至少90％的D-葡萄糖或者甚至至少95％的D-葡萄糖。除非文中另外指明，术语葡萄糖和葡萄糖浆可以互换使用。

如本文中所用，术语“总糖含量”指在淀粉组合物中存在的总糖含量。

如本文中所用，术语“干固体”(或“DS”)指表达为基于干重量(wt/wt)的％在浆液中存在的全部固体物质。

如本文中所用，术语“发酵”指通过微生物酶促地和厌氧地分解有机物质，以产生更简单的有机化合物。尽管在厌氧条件下发生发酵，但并不意为该术语仅限于严格的厌氧条件，因为发酵液可以发生在氧存在的情况下。

如本文中所用，短语“同时糖化和发酵”(或“SSF”)指产生终产物的方法，其中发酵生物，例如产乙醇微生物，和至少一种酶，例如糖化酶组合在同一容器中同一方法步骤中。

如本文中所用，术语“终产物”指可以从发酵底物酶促地转变的碳源衍生产物。终产物可以是醇，例如乙醇。

如本文中所用，术语“衍生”包括术语“源自”、“获自”、“可获自”和“分离自”，以意图描述特定的目标之间的关系。

如本文中所用，术语“发酵生物”指适合于用于发酵以直接或间接产生终产物的微生物或细胞。

如本文中所用，术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能从单糖或寡糖产生乙醇的发酵生物。

如本文中所用，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”，与蛋白质、细胞、核酸或氨基酸有关时，指蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相关的至少一种组分除去。

如本文中所用，术语“接触”指如通过混合时实现接近。接触可以在溶液中通过混合两种液体试剂或者一种液体试剂和一种固体物质发生。

如本文中所用，互换使用的术语“蛋白质”和“多肽”指通过肽键连接的氨基酸残基的链。除非另外指明，氨基酸序列使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子以氨基端至羧基端方向书写。应当理解，由于遗传密码的简并性，相同的多肽可以由一种以上的核苷酸序列编码。

如本文中所用，术语“稀釜馏物”指通过筛选或离心，从固体中分离的釜馏物的流体部分。稀釜馏物含有悬浮的细颗粒和不溶解物质。通常将其送至蒸发器以浓缩至浓浆液，并然后干燥固体部分以产生具有可溶物的酒糟(DDGS)。

如本文中所用，术语“逆流物”指回收的稀釜馏物。可以将逆流物加入到浆液或发酵罐中，以用作为酵母营养物的来源和/或以减少淀粉糖化所需的水的量。

如本文中所用，术语“冷凝物”指例如，在冷凝器或热交换器设备中冷凝自蒸汽的液体，可以将所述冷凝器或热交换器设备与柱的蒸汽排水管连接，以允许蒸汽冷却并凝结成液体。

如本文中所用，术语“蒸煮水”指在乙醇工业中用作为补偿水，用于产生谷物浆液的水。其通常是稀釜馏、冷凝水和淡水的混合物。

如本文中所用，术语“初级液化”指在喷射蒸煮前，用酶(例如，α淀粉酶和植酸酶)温育含有稀釜馏物固体的全磨谷物浆液。初级液化一般在80-90℃进行。

如本文中所用，术语“次级液化”指在喷射蒸煮后，用第二剂量的酶水解凝胶化的淀粉。

如本文中所用，术语“水解植酸”指将肌醇六磷酸磷酸水解酶(IP6)水解成含有少于六个磷酸的分子，例如，IP5、IP4、IP3等。优选地，水解至少50％存在的植酸盐。

除非另外清楚指明，单数形式“一个”、“一”和“所述”(“a”、“an”和“the”)包括其复数指代。当给出数值的范围时，应当理解，每个居间值(除文中清楚地另作说明外，直至下限单位的十分之一)也是明确公开的。在所述范围内的任意所述值或居间值之间的每个较小范围和在该所述范围内的任意其他所述值或居间值也包含于本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含或排除于该范围，并且每个范围(其中两个极限之一包含于较小范围内、两个极限都不包含于较小范围内或两个极限都包含于较小范围内)也包含于本发明中，受到该所述范围内的任意明确排除的极限。在所述的范围包含一个或两个极限时，也包括排除那些所包含的极限之一或二者的范围。在本文中引用的全部参考文献都明确地引入作为参考。

II.组合物和方法的概述

本发明的组合物和方法涉及热稳定性植酸酶在淀粉液化方法中的用途。不被理论所束缚，认为植酸盐(即，IP6)作用为α淀粉酶的非竞争性抑制剂(例如，通过与酶的表面上的氨基和其他正电荷残基相互作用和螯合钙)和竞争性抑制剂(例如，通过与活性位点相互作用)。在浆液或醪液中，植酸盐的存在降低了α淀粉酶的稳定性，其反映为降低的活性、降低的热稳定性和降低的低pH稳定性。将植酸酶加入到浆液或醪液中成功地将植酸盐水解成了IP5、IP4、IP3、IP2等，其对α淀粉酶的稳定性的不利减少。增加的α淀粉酶的稳定性允许在更低的pH条件和更高的温度进行液化。

尽管已经描述了在液化或发酵期间添加植酸酶，但该方法需要在低于约70℃的温度进行植酸酶预处理步骤，以避免植酸酶的失活(参见，例如，WO 2008/097619)。因此，在没有任一方法修饰(例如，更低的温度预处理步骤)的情况下，在液化条件下，不可能将植酸酶加入到全磨谷物中，以避免失活植酸酶。在初级和/或次级液化条件下，热稳定性植酸酶的使用排除了在70℃以下植酸酶预处理的需求，并允许在80℃或更高的温度进行整个液化方法。

使用热稳定性植酸酶实现的植酸的有效去除允许可以在不需要调整上述浆液或醪液的pH的情况下，例如，约pH5.6进行初级和次级液化。该pH调整在常规淀粉液化中是关键步骤。pH调整不仅仅将额外的步骤引入了液化方法，其也添加了可以干扰后续生物生长、终产物的特性、和/或废物处理成本的盐和/或其他化学物质。因此，在高温蒸煮前，在不调整浆液的pH和没有较低温度植酸酶预处理步骤的情况下进行液化的能力，提供了乙醇工业中未满足的需求的解决办法，导致许多的加工优点。

热稳定性植酸酶的用途也表现出扩大了热稳定性淀粉酶能起作用的温度范围。例如，通常认为85℃(185°F)以上的次级液化温度由于α淀粉酶的失活导致降低的糊精化。然而，支持本发明的组合物和方法产生的数据显示，在不进行任何pH调整的情况下，在初级液化(在85℃(185°F)进行)中使用热稳定性植酸酶，允许次级液化步骤在约87.7℃(190°F)进行，而没有性能损失。

在较低pH和高温液化全磨玉米的另一优点是降低了由于氨基酸和还原糖之间的美拉反应(Mailard reaction)导致的可发酵糖的损失。美拉反应在碱性环境中加速，通过维持浆液在较低的pH避免了该反应。

本发明组合物和方法的这些和其他特点和优点从以下描述将是显而易见的。

III.适合于在组合物和方法中使用的酶类

多种植酸酶和α淀粉酶都适合于在本发明的组合物和方法中使用。示例性酶类描述如下。

A.植酸酶

适合于在本发明的组合物和方法中使用的植酸酶可以来自任一微生物来源，包括但不限制真菌或细菌来源。植酸酶应当能在初级和次级液化条件下水解植酸。优选的植酸酶是能在初级和次级液化条件下，水解在浆液或醪液中存在的至少50％的植酸盐。优选的植酸酶是热稳定的，意为它们能在至少80℃和甚至在至少81℃、至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的温度，在约20分钟内水解在含淀粉的谷物浆液或醪液(例如，包含约32％的DS)中存在的至少50％的植酸盐。

示例性热稳定性植酸酶可以获自布丘氏菌属，例如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属的菌株可从DSMZ(德国生物材料国家资源中心)得到。示例性菌株是以检索号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29。通过在WO06/043178中描述的方法，包括但不限于杂交技术，可以鉴定来自布丘氏菌属的植酸酶。植酸酶可以是重组的多肽，包括工程化的变体多肽。

示例性重组热稳定性变体布丘氏菌属植酸酶是BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ ID NO：4)和BP-112(SEQ ID NO：5)。这些植酸酶的热稳定性详细描述于实施例5-11中。与野生型植酸酶(SEQ ID NO：1)和BP-17(中等热稳定性变体；SEQ ID NO：2；参见，例如WO 2008/097619)比较，在这些变体中导致它们有利的热稳定性特性的替换，从显示于表4中的氨基酸序列比对和从实施例看是显而易见的。期望包括在BP-110、BP-111或BP-112中替换的不同组合或除一个或多个这些替换外的其他突变的其他变体都具有类似的特性。

B.α淀粉酶

适合于在本发明的组合物和方法中使用的α淀粉酶可以来自任一来源，包括微生物来源，例如真菌或细菌，或者植物来源。在一些实施方案中，α淀粉酶是酸稳定的α淀粉酶，其在3.0-7.0的pH范围，和优选地在3.5至6.5的pH范围有活性。

示例性α淀粉酶可以获自细菌菌株，包括芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(以前叫芽孢杆菌(Bacillus))、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)。尤其良好表征了来自地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶。合适的细菌α淀粉酶描述于例如，美国专利号5,093,257、5,763,385、5,824,532、5,958,739、6,008,026、6,093,563、6,187,576、6,361,809、6,939,703、6,080,568、5,736,499、4,717,662、6,218,164、6,008,026、6,211,134、6,432,689、6,100,073和5,364,782；美国专利公开号2006/0014265、2005/0112237和2007/0141693；国际专利公开号WO 96/23874、WO 96/39528、WO 97/141213、WO 99/19467、WO05/001064、WO 94/183314、WO 95/35382、WO 99/09183、WO 98/26078、WO 99/02702、WO 97/43424、WO 99/29876、WO 97/10342、WO 96/02633、WO 91/00353、WO 05/111203、WO 05/007867、WO 07/007053、WO06/089107和WO 08/021050；和欧洲专利公开EP 0 942 994和EP 1 848 735中。

适合于在组合物和方法中使用的市售α淀粉酶包括SPEZYME^TM AA，SPEZYME^TM FRED，SPEZYME^TM XTRA，GZYME^TM 997，和GC 358，以及来自地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌的α淀粉酶的混合物，包括和TERMAMYL^TM 120-L、LC、SC和SUPRA(都来自Genencor International公司)。其他α淀粉酶是LIQUOZYME^TM X(Novozymes A/S)和Fuelzyme^TM LF(Verenium LLC)。

在支持组合物和方法进行的实验中使用的示例性α淀粉酶是SPEZYME^TM FRED，其包含具有替换M15T，H133Y，N188S，和A209V的变体地衣芽孢杆菌α淀粉酶(参见，例如，2008年11月3日提交的美国专利申请系列号No.12/263,886)；GC358，其包含具有替换S242Q的变体嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶(参见，例如，美国专利号5,958,739)；和SPEZYME^TM XTRA，其包含截短的嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶。应当注意，可以将任一上述α淀粉酶组合使用。

C.葡糖淀粉酶

本发明的组合物和方法可以任选地包括用作为糖化酶的葡糖淀粉酶(GA；E.C.3.2.1.3.)。葡糖淀粉酶可以来源于细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达。优选的葡糖淀粉酶由丝状真菌和酵母的菌株产生。分泌自曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)的菌株的葡糖淀粉酶可通过商业途径得到。合适的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶及变体和基因工程突变的葡糖淀粉酶。合适的葡糖淀粉酶的实例是黑曲霉(Aspergillus niger)G1和G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBOJ.3：1097-1102；WO 92/00381、WO 00/04136和美国专利号6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉(Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-49)；和Aspergillus shirousami葡糖淀粉酶(例如，Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等人(1995)Prot.Eng.8：575-82和Chen等人(1994)Biochem J.302：275-81)。葡糖淀粉酶也可以获自篮状菌属(Talaromyces)的菌株，例如来源于埃默森篮状菌(T.emersonii)、T.leycettanus，T.duponti和T.thermophilus的那些葡糖淀粉酶(WO99/28488；美国专利号RE：32,153和4,587,215)、木霉属(Trichoderma)的菌株，例如里氏木霉(T.reesei)、和具有与在美国专利公开号2006/0094080中公开的SEQ ID NO：4有至少80％、90％和95％序列同一性的特定葡糖淀粉酶、根霉属(Rhizopus)的菌株，例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属(Mucor)的菌株和腐质霉属(Humicola)的菌株，例如灰色腐质霉(H.grisea)(例如，Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等人(1978)Carbohydrate Res.61：301-08；美国专利号4,514,496；美国专利号4,092,434；和Jensen等人(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223)。其他葡糖淀粉酶包括那些获自罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的葡糖淀粉酶和其变体(WO 04/111218)。

市售的葡糖淀粉酶产自，例如黑曲霉(例如，DISTILLASE^TM、OPTIDEX^TM L-400、G ZYME^TM G990 4X和OPTIMAX^TM4060VHP，全部来自Genencor)和根霉属(Rhizopus spp.)(例如，来自Shin NihonChemicals，日本的CU.CONC^TM)。另一市售的酶是GLUCZYME^TM(Amano Pharmaceuticals，日本；Takahashi等人(1985)J.Biochem.98：663-71)。其他酶包括根霉属的葡糖淀粉酶的3种形式，称为“Gluc1”(MW74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)，以及G Zyme480 Ethanol(Genencor)。

D.组合物和制剂

用于所述用途的酶组合物包括混合的或配制的酶组合物。在一些实施方案中，将一种或多种植酸酶和一种或多种α淀粉酶一起提供在混合物中，其可以加入到浆液或醪液中。在该情况下，该混合物代表在不需要进行pH调整的淀粉转变方法中使用的单一植酸酶/淀粉酶组合物。在其他实施方案中，将一种或多种植酸酶和一种或多种α淀粉酶分别提供在不同的组合物或制剂中。在该情况下，该植酸酶和淀粉酶组合物可以代表在不需要进行pH调整的淀粉转变方法中使用的单一植酸酶/淀粉酶试剂盒。可以将葡糖淀粉酶任选地加入到植酸酶/淀粉酶混合物或者植酸酶或淀粉酶组合物中，或者分别地提供，以加入到浆液或醪液中。

植酸酶组合物和α淀粉酶组合物可以以15∶1至1∶15，包括10∶1至1∶10、5∶1至1∶5和3∶1至1∶2的植酸酶(FTU/g DS)与α淀粉酶(AAU/g DS)的比率存在于混合物中，或者分别地加入到浆液或醪液中。

IV.含淀粉的物质

用于加工的颗粒淀粉可以获自植物材料，包括但不限于小麦、玉米、黑麦、高粱(买罗高粱)、稻、粟、大麦、黑小麦(triticale)、木薯(木薯淀粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类例如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻、买罗高粱和它们组合。植物材料包括杂交品种和基因修饰的品种(例如，包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任一部分都可以用于提供颗粒淀粉，包括但不限于植物部分例如叶、茎、壳、皮、块茎、玉米穗轴、谷物等。在一些情况下，可以使用基本上完整的植物，例如，可以使用整个玉米秸秆。在一些情况下，可以将全谷物用作为颗粒淀粉的来源。优选的全谷物包括玉米、小麦、燕麦、大麦、高粱和它们组合。在其他情况下，颗粒淀粉可以获自分级分离的谷粒，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。植物材料可以获自不同的来源(例如玉米和买罗高粱或玉米和大麦)并混合在一起以获得颗粒淀粉。

用于分级分离植物材料例如玉米和小麦的方法是本领域已知的。通过方法例如研磨，可以制备包含颗粒淀粉的植物材料。两种一般的研磨方法是湿磨法和干磨法。在干磨法中，将全谷物研磨并用于该方法。在湿磨法中，将谷物分离(例如，从粗粉(meal)中分离胚芽)。研磨全谷粒的方法是熟知的并包括使用锤磨机和轧制机。

V.使用的方法

本方法涉及热稳定植酸酶用于增加在涉及α淀粉酶的淀粉液化方法中淀粉液化的量或比例中的用途。然而，本方法避免了低温(即，低于约70℃)植酸酶预处理步骤的需求、避免了在液化处理前、期间和/或后pH调整的需求、增加了α淀粉酶的温度范围和/或避免了加入抗氧化剂以保护α淀粉酶免于降解的需求。

在一个实施方案中，提供了通过发酵产生乙醇的方法，包括使用10-70％v/v稀釜馏物、冷凝水和/或淡水(也称为蒸煮水)产生全磨谷物浆液，并在不进行任何pH调整的情况下，将热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶加入到浆液中，其中植酸酶去除了植酸以增强了热稳定性α淀粉酶的低pH热稳定性。也可以与植酸酶一起或在植酸酶之后加入热稳定性α淀粉酶，例如，以允许植酸酶在添加淀粉酶之前去除水解植酸。然后，在热稳定性α淀粉酶存在的情况下，可以将处理的浆液用或不用喷射蒸煮进行高温蒸煮。在使用喷射蒸煮的情况下，一般将温度升高到淀粉凝胶化温度以上约45℃(例如，到65℃至120℃、70℃至110℃、或70℃至90℃)约2分钟至6小时(例如，2分钟至4小时或者1小时至2小时)的时间。任选地，将额外量的热稳定性α淀粉酶加入到浆液中，并允许继续液化，而且，没有pH调整的要求。

浆液可以包含15-55％DS(例如，20-50％、25-45％、25-40％和20-35％DS)。浆液也可以包含10-70％v/v稀釜馏物(例如，10-60％、10-50％、20-50％、10-40％、20-40％或10-30％)。可以将植酸酶与α淀粉酶一起或者在添加淀粉酶之前与浆液中的颗粒淀粉接触5分钟至8小时(例如，5分钟至6小时，5分钟至4小时或者30分钟至4小时)。加入植酸酶时的温度可以是80℃以上、81℃以上、82℃以上、83℃以上、84℃以上、和甚至85℃以上。

浆液可以具有约4.8至低于约5.5的pH，例如，约5.2至5.5，并且在添加α淀粉酶之前不进行调整。因此，植酸酶处理和液化都可以在浆液的“天然”pH下进行。热稳定性植酸酶的添加可以允许淀粉液化方法在比使用α淀粉酶而没有植酸酶的条件下更低的pH下进行。例如，淀粉液化方法可以在比如果使用α淀粉酶而没有植酸酶的pH低约0.5至1.5个单位(例如，低0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0.、1.2或1.5pH单位)的pH下进行。

在液化方法中使用的植酸酶的量(剂量)可以在约0.001至50FTU/gDS，优选地0.01至10FTU/g DS，和甚至0.05至5.0FTU/g DS或0.5至5.0FTU/g DS的范围。示例的量是0.5FTU/g DS、1FTU/g DS、2FTU/g DS、3FTU/g DS、4FTU/g DS和5FTU/g DS。α淀粉酶的量是本领域技术人员已知的有效量，例如，0.1至50AAU/g DS，和优选地1至10AAU/g ds。

该方法可以进一步包括不进行任何其他pH调整的情况下，使用液化的淀粉作为发酵原料用于乙醇发酵。因此，可以在不进行单独的pH调整的情况下，进行从淀粉转变到乙醇生产的谷物加工的整个过程。发酵方法是本领域已知的，并且一般包括添加糖化酶例如葡糖淀粉酶和任选地其他次要酶。糖化过程可以持续约12-120小时；然而，通常进行30分钟至2小时的预糖化步骤，然后在发酵期间完全糖化。有时，这称为同时糖化和发酵(SSF)。通常在约30-65℃的温度和一般在约4.0至5.0的pH实施糖化。

用于发酵的生物取决于想要的终产物。如果乙醇是想要的终产物，那么一般将酵母用作为发酵生物。示例性产乙醇微生物是酵母属(Saccharomyces spp.)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)(参见，例如美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母是市售的，并且包括但不限于FALI(Fleischmann’s Yeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSMSpecialties)、RED STAR(Lesaffre)和Angel乙醇酵母(Angel YeastCompany，中国)。使用的起始酵母的量应当在合适的时间量内有效地产生商业上显著的乙醇量(例如，在少于72小时内，从具有25-40％DS的底物产生了至少10％的乙醇)。酵母细胞一般以10⁴至10¹²的量提供，并且优选地每毫升发酵液10⁷至10¹⁰个活酵母计数。除发酵微生物外，发酵方法可以包括，营养物、任选的酸和其他酶类，包括但不限于植酸酶和葡糖淀粉酶。

酵母在发酵中的用途是熟知的，并可以参考The Alcohol Textbook，K.Jacques等人，编辑1999，Nottingham University Press，英国。在一些实施方案中，通过由本发明包括的方法产生的乙醇的量是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％和至少18％(v/v)，以及至少23％v/v。任选地，在发酵后，可以通过，例如，蒸馏提取醇(例如，乙醇)。可以将乙醇用于燃料、饮用乙醇或工业乙醇。

使用合适的生物，任选地通过化学修饰或合成步骤后，可以产生终产物例如醇(例如，乙醇)、有机酸(例如，丁二酸、乳酸)、糖醇(例如，山梨醇)、抗坏血酸中间产物(例如，葡糖酸、DKG、KLG)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体和其片段)、生物化学物质和酶类。

其他相关的组合物和方法从前述描述和以下实施例将是显而易见的。在此处引用的所有参考文献以其整体引入作为参考。

实施例

提供下面的一般方法和实施例以说明，而不是限制本发明的组合物和方法。在本公开和以下的实验部分中，使用下列缩写：wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；dIH₂O(Milli-Q过滤的去离子水)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；℃(摄氏度)；DS(干固体)；DO(溶解氧)；w/v(重量/体积)；w/v(重量/重量)；V/V(体积/体积)；Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；IKA(IKAWorks Inc.2635 North Chase Parkway SE，Wilmington，NC)；MT(公吨)；DE(葡萄糖当量)；EtOH(乙醇)；HPLC(高压液相层析)；SSU(可溶性淀粉单位)；DP(聚合的程度)；GAU(葡糖淀粉酶活性单位)；具有可溶物的干酒糟(DDGS)；AAU(α淀粉酶活性单位)；和PNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷)。在上面也使用部分这些缩写。

一般方法

1.通过HPLC分析糖类：

使用维持在50℃，配备了合适的柱(Rezex 8 u8％H，单糖)的HPLC(Beckman System Gold 32 Karat Fullerton，CA，美国)测量寡糖反应产物的组成。仪器装配了折射率(RI)检测器(ERC-7515A，RI Detector，Anspec Company有限公司)。基于分子量并与标准比较分离糖类。符号“DP1”指单糖，例如葡萄糖；符号“DP2”指二糖，例如麦芽糖；符号“DP3”指三糖，例如麦芽三糖；和符号“DP4”指具有4或更大的聚合程度的寡糖。

2.植酸酶活性测量

通过无机磷酸的释放，测量植酸酶活性单位(FTU)。无机磷酸与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色络合物，所述黄色络合物可以在波长415nm处，在分光光度计中测量。在磷酸盐标准曲线的辅助下定量释放的无机磷酸盐的量。植酸酶的一个单位(FTU)是在欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)中给定的反应条件下，每分钟从植酸盐释放1微摩尔的无机磷酸盐所需的酶的量。

3.植酸含量测量

通过将5％的浆液(如果其是干样品)的pH调整到pH10提取样品中的植酸，并然后将其应用于HPLC离子交换柱，测量植酸含量。使用NaOH梯度从柱上洗脱植酸，并通过植酸标准曲线的计算量。

4.α淀粉酶活性测量

通过淀粉水解的速率(如反映为分光光度计测量的碘染色能力降低的速率)测量α淀粉酶活性单位(AAU)。细菌α淀粉酶活性的一个AAU是在标准化条件下，每分钟水解10mg的淀粉所需的酶的量。α淀粉酶活性也可以测量为基于通过在pH4.5，50℃酶样品的等分试样水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度的可溶性淀粉单位(SSU)。使用在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-28中所述的DNS方法测量还原糖含量。

5.葡糖淀粉酶活性测量

使用PNPG测定测量葡糖淀粉酶活性单位(GAU)，所述PNPG测定测量葡糖淀粉酶催化PCPG水解成葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH，硝基苯酚形成黄色，其可以在400nm处通过分光光度计测量，并用于计算GAU。一个GAU是在特定的测定条件下，每小时从可溶性淀粉底物释放1克计算为葡萄糖的还原糖所需的酶的量。

实施例1.使用热稳定性植酸酶增加变体嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶的性能

首先进行系列的实验以测定在不调整浆液的pH的情况下，热稳定性植酸酶的存在是否能增加市售α淀粉酶的性能，所述调整浆液的pH是使用常规组合物和方法所必需的。使用32％ds研磨玉米，用稀釜馏物补偿35％的液相，实施该实验。将调整到pH4.8的81.9千克的液体加热到196°F，并加入24千克的研磨玉米。应当注意，在该实验中，浆液的pH降低到pH4.8，以模拟蒸煮水的低pH条件，不像在常规方法中稳定α淀粉酶所必须的那样升高pH。

加入酶，并加入剩下的24千克玉米。在180-182°F水解20分钟后，以6.3升/分钟，将热浆液泵经蒸汽注射蒸煮器，工业上已知为Hydrothermal brand model M 103，设置在227°F。通过在维持在～20psi的配备了反压阀的延迟环(delay loop)中保持，维持该温度4.5-5分钟。允许离开该系统的物质快速达到大气压，并收集样品用于在185°F进行次级液化。

剂量和取样方案显示于表1中。示例性α淀粉酶是GC 358(包含替换S242Q的嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶的变体)。剂量以AAU/g DS玉米给出。示例性热稳定性植酸酶是BP 111(SEQ ID NO：3)。剂量以FTU/g干固体玉米给出。次级液化后，在多个间隔时间测量的葡萄糖当量(DE)显示于表2中。

表1.剂量和取样

表2.在用和不用植酸酶添加的情况下，次级液化(pH 5.2，185°F和190°F)下随时间的DE进展。

显示于表2中的DE发展是α淀粉酶活性的证据，并且在本文中其称为表观α淀粉酶活性。用热稳定性植酸酶处理20分钟明显导致了表观α淀粉酶活性的增加，可能是由于除去了植酸。应当注意，非热稳定性植酸酶在这些浆液温度下是失活的(参见，例如，实施例9-11)。在表2中显示的数据上进行的线性回归表明，对照线(即，不用植酸酶的浆液)从50至150分钟的斜率为0.019DE/分钟，而测试线(即，用植酸酶的浆液)在相同时间上的斜率为0.038DE/分钟。因此，植酸酶的添加大约加倍了相同量的α淀粉酶的有效性。

如在图3中所示，LC分析显示，通过在初级液化中包括4FTU植酸酶和在次级液化中包括2FTU植酸酶，完全去除了植酸(IP6)和中间产物IP4和IP3，并且IP5的水平也实质性降低了。

实施例2.使用热稳定性植酸酶增加变体地衣芽孢杆菌α淀粉酶的性能

将来自实施例1的液化产物在发酵前冷冻大约24小时。每一液化产物的DS为35.2％。pH为5.2且没有调整。准确称重325克每一液化产物到烧杯中。加入400ppm尿素到每一液化产物(1∶10稀释的1.3ml)中，然后加入1ml的20％w/w的酵母溶液。葡糖淀粉酶(即，获自GenencorInternational有限公司，Palo Alto，CA，美国的G Zyme 480乙醇)的剂量为0.325GAU/g DS。对于重量减轻测量，定量地称重大约150克每一液化产物到250ml锥形瓶中，并装配具有18号针的橡皮塞以允许CO₂逸出。称重另外的150克到另一组锥形瓶中，用于采样和HPLC分析。将所有烧瓶置于设定到32℃和150转/分钟的强制通风摇床中。在发酵期间，定期称重烧瓶，并基于重量减轻计算产生的醇的量。在表3中显示的数据表明，乙醇速率和产率不受液化中植酸酶的添加的负面影响。

表3.基于重量减轻产生的醇的量

实施例3.使用热稳定性植酸酶增加变体地衣芽孢杆菌α淀粉酶的性能-实验室规模测试

通过使用1kg规模的实验室设备说明添加热稳定性植酸酶的益处。将称重量的水(544克)在1升不锈钢烧杯中在搅拌加热板上加热至93-96℃。将热的液体置于设定为87.2℃的水浴锅中，并在加入～70％的以前称重的研磨玉米的同时继续搅拌。将酶加入到糊状浆液中，其立即降低了粘度。加入剩下的研磨玉米并立即开始计时。通过用表面皿覆盖烧杯控制由于蒸发的水损失。

实验室规模的浆液的液相包括来自典型的干磨乙醇植物的35％稀釜馏物(逆流物)和256克研磨玉米，由于添加了在稀釜馏物中存在的干物质，最后得到了32％DS。用碳酸钠将逆流物的pH调整到5.2。以每克干物质玉米10Liquefon单位(LU)使用地衣芽孢杆菌α淀粉酶(即，FRED；Genencor)，加入每克干物质玉米0FTU、2FTU或12FTU的BP111植酸酶。

每20分钟间隔进行的DE测定显示于表4中。实验清楚地表明，就表观α淀粉酶活性而言，含植酸酶的液化方法表现出了改进的性能。

表4.在35％DS全磨玉米的液化期间，热稳定性植酸酶对DE进展的影响

对照    测试1    测试2

由于DE发展随时间的斜率与α淀粉酶活性相关，在添加了2FTU/g植酸酶的干物质玉米的情况下，SPEZYME FRED的性能改进了67％，即从0.03DE/分钟到0.05DE/分钟，并且在添加了12FTU/g植酸酶的干物质玉米的情况下，改进了97％，即从0.03DE/分钟到0.059DE/分钟。

实施例4.使用热稳定性植酸酶增加截短的嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶的性能

液化条件如在实施例2中所述。在该情况下，在模拟的热浆液罐(初级液化)中使用1.55AAU剂量的嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(

XTRA；Genencor)，并在次级液化中加入0.75AAU。对照不含植酸酶，并且测试样品在热浆液罐中含有4FTU植酸酶和在次级液化中的2FTU植酸酶。液相达到了稀釜馏物重量的35％。蒸煮前，将pH调整至pH5.6。在液化结束时，室温样品的pH为5.35。次级液化期间的DE进展显示于表5中。

表5.在液化35％DS全磨玉米期间，热稳定性植酸酶BP111对DE进展的影响

热浆液方法    对照    测试    对照    测试

结果显示，在热浆液中添加BP 111植酸酶导致了次级液化步骤中改进的性能。如在表5中所示，当将

XTRA的第二剂量加入到对照样品中时，DE发展在α淀粉酶显示出失活后仍持续了约20分钟。然而，添加植酸酶延长了DE发展和淀粉酶的整体性能。

由于

XTRA是在约5.8的pH下进行的常规液化方法中设计使用的，所以其不具有在测试运行的pH下的最佳稳定性。因此，尽管显而易见的是热稳定性植酸酶的添加改进了测试条件下的DE发展，但是在存在和不存在植酸酶的情况下进行的DE发展的斜率的比较并不能充分反映可以使用优化的热稳定性酶类实现的DE发展的速率。为了获得更多意义的斜率数据，用5.65-5.70的初始pH重复测试。在这些条件下，DE发展的改进为约111％(即，在次级液化期间，从60分钟到160分钟，斜率改变从0.017DE/分钟到0.036DE/分钟)。在pH5.65-5.7的结果显示在接近其最佳条件的pH下，

XTRA与热稳定性植酸酶的用数值表示的性能改进，而在pH5.35获得的结果显示，在更低的pH观察到了热稳定性植酸酶的优点。

实施例5.植酸酶的纯化

使用与植酸酶氨基端融合的6组氨酸标记进行植酸酶的纯化。使用添加了20mg/l新霉素的标准LB培养基，在37℃和160转/分钟，在摇瓶中培养用编码6组氨酸标记的植酸酶的质粒转化的枯草芽孢杆菌。在该阶段，培养基累积了显著量的植酸酶活性。将约2升的培养液调整至pH8.0，过滤并应用于填充了10ml Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)的柱。用pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl洗涤柱直到OD280下降到0.05以下。随后，用含250mM盐酸咪唑的相同缓冲液洗脱结合的植酸酶。用pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液透析洗脱物并储存于4℃。然后将酶溶液应用于用pH5.0的20mM乙酸钠缓冲液平衡的Resource S柱，并用从0-1M NaCl的盐梯度进行10个柱体积以上的洗脱。任选地，在储存于4℃前，用pH5.0的20mM乙酸钠缓冲液透析洗脱物。

实施例6.植酸酶活性测定

在微量滴定板中实施植酸酶测定。反应物具有如下所述的含10mM植酸、1mM氯化钙和0.05％(w/v)Pluronic F68的缓冲液的100微升的总体积。允许反应在给定的温度，例如在37℃和90℃之间进行30分钟。

通过在37℃，在总体积50μl的磷酸检测测定中温育等分试样的样品(一般5μl)1小时，测定作为植酸酶活性度量的磷酸从植酸盐的释放。该测定含有以下给定终浓度的化合物：1M Tris/HCl，pH 7.0、0.01％(v/v)Triton X-100、0.025mM ADHP(MoBiTec，

，德国)、0.2U/ml麦芽糖磷酸化酶、0.25mM麦芽糖、1.25U/ml葡糖氧化酶、0.25U/ml辣根过氧化物酶、1mM EDTA、0.35mg/ml BSA。通过添加30μl在H₂O中的2700U/ml过氧化氢酶终止反应。随后，在595nm处测量荧光，使用535nm作为激发波长。使用已知浓度的磷酸溶液的校正曲线测定磷酸的量。将一个酶单位定义为每分钟释放一微摩尔磷酸。

对于在不同的pH值测定植酸酶活性，使用以下的缓冲液：从pH2.0至pH3.5的200mM甘氨酸/HCl和pH 4.0和pH 5.5之间的100mM乙酸钠/乙酸。

实施例7.比活性

使用纯化的酶，根据实施例5估计BP-WT和变体植酸酶的比活性。使用偶联的酶促测定在微量滴定板中测定植酸酶活性：在稀释缓冲液(50mM乙酸钠、0.05％Pluronic F-68、1mg/ml BSA)中稀释酶制备物。将等分试样的酶溶液，一般5μl至10μl温育在具有总体积80μl的植酸盐测定中。该测定含给定终浓度的以下缓冲液、底物和盐：200mM乙酸钠、pH5.5，10mM植酸盐、1mM CaCl₂、0.05％(w/v)Pluronic F-68。在BP-WT植酸酶的情况下，37℃温育测定30分钟，在变体植酸酶的情况下，在67℃或80℃温育测定30分钟。

通过在37℃，在总体积50μl的磷酸检测测定中温育等分试样的各个样品(一般5μl)1小时，测定磷酸从植酸盐的释放作为植酸酶活性度量。该测定含有给定终浓度以下化合物：1M Tris/HCl，pH 7.0、0.01％(v/v)Triton X-100、0.025mM ADHP(MoBiTec，

，德国)、0.2U/ml麦芽糖磷酸化酶、0.25mM麦芽糖、1.25U/ml葡糖氧化酶、0.25U/ml辣根过氧化物酶、1mM EDTA、0.35mg/ml BSA。通过添加30μl在H₂O中的2700U/ml过氧化氢酶终止反应。随后，在595nm处测量荧光，使用535nm作为激发波长。使用用已知浓度的磷酸溶液产生的校正曲线测定磷酸的量。将一个酶单位定义为每分钟释放一微摩尔磷酸。

从制备物在280nm处的吸光度和每一植酸酶变体的各个消光系数计算植酸酶浓度。根据由Gill和von Hippel，Analytical Biochemistry 182：319-326(1989)提供的方法，基于蛋白质的氨基酸组成计算消光系数。

表6.根据BP-WT，SEQ ID NO：1的植酸酶变体的比活性。如上所述，在67℃和80℃测定变体植酸酶的比活性。在上述条件下，BP-WT在37℃具有1021U/mg的比活性。

实施例8.植酸酶变体的产生和表征

使用用于诱变编码植酸酶蛋白质的DNA的不同方法，如盒诱变或PCR诱变或者本领域熟知的其他诱变方法，产生植酸酶变体。这些方法包括以上所列的方法，例如在Morinaga等人，Biotechnology 2：646-649(1984)中；在Nelson和Long，Analytical Biochemistry 180：147-151(1989)中；或在WO 92/18645中所述的the Error Threshold Mutagenesis protocol公开的方法。对于诱变PCR，另一合适的方法由Cadwell和Joyce，PCRMethods Appl.3：136-140(1994)公开。

在一个或多个以下表达宿主中异源表达植酸酶变体：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。

实施例9.热稳定性

通过植酸酶变体的失活温度表征它们的热稳定性。在不同的温度，pH5.5温育10分钟并随后在37℃温育60分钟后，通过植酸酶的残留活性测定失活温度。在pH3.5和37℃测量植酸酶活性60分钟来测定残留活性。失活温度定义为与在室温相同的条件下，温育相同的时间后的残留活性比较，残留活性为50％时的温度。适当时，对活性数据进行外推和插值，以测定对应于50％残留活性的温度。通过将两个酶的失活温度互减，计算以[℃]表示的热稳定性差异(TD)。

表7.根据BP-WT，SEQ ID NO：1的植酸酶变体的比活性。热稳定性的改进表示为变体和野生型(BP-WT)植酸酶之间的热稳定性差异TD，即，TD＝(变体植酸酶的失活温度)-(BP-WT的失活温度)。

实施例10.热活性

通过植酸酶变体的温度活性谱表征它们的热活性。作为温度活性谱的度量，定义了值T50，处于该值时，与基本上在相同条件但在植酸酶变体的温度最佳条件下运行的反应中底物的总酶更新相比，底物的总酶更新为50％。在实施例6中进一步描述的条件下，通过在pH5.5和多种温度温育植酸酶测定温度活性谱。通过从实验数据合适的插值和外推，测定T50值。通过将两个酶的T50值互减，计算以[℃]表示的热活性差异(TAD)。

表8.根据BP-WT，SEQ ID NO：1的植酸酶变体的热活性差异(TAD)。热活性的改进给出为变体和野生型(BP-WT)植酸酶之间的T50差异，即，TAD＝T50(变体植酸酶)-T50(BP-WT)。

实施例11.植酸酶变体的特性概述

表4总结了在前面实施例7-9中显示的植酸酶变体的特性比活性、热稳定性和热活性。

表9.根据BP-WT，SEQ ID NO：1，不同植酸酶变体的比活性、热稳定性和热活性。比活性、热稳定性(TD)和热活性(TAD)的数值分别来源于实施例7、实施例8和实施例9中所述。

实施例12.液化产物中的植酸水解

A.植酸测定

植酸含量：通过调整5％的浆液(如果其是干样品)的pH到pH10，从样品中提取植酸，并然后使用离子交换柱通过HPLC方法C测定。使用NaOH梯度系统从柱上洗脱植酸。然后通过与植酸标准比较，计算液体中植酸的含量。

B.结果

通过不同的热稳定性BP变体植酸酶，即BP110、BP111和BP112，研究了温度对来自常规干磨液化方法(来源：Illinois River Energy，Monroe，Illinois)的全磨玉米液化产物的植酸的水解的影响。将32％ds(“干固体”)全磨玉米干固体玉米液化产物的pH调整到pH5.0，并置于维持在85℃和89℃的水浴中。温度平衡后，加入4.0FTU/克干固体玉米的BP-植酸酶。然后在20分钟时取出样品，并通过添加10mM氢氧化钠(稀释1到10倍)终止酶反应。然后将稀释的样品过滤，并通过HPLC分析植酸盐衍生物谱(IP1至IP6)。图15和16中的HPLC层析图清楚地显示，来自全部3种变体的植酸酶都在大于85℃的温度催化植酸的水解。在全磨玉米液化产物中，植酸含量(植酸(IP6)和中间产物IP1至IP5)为大约1.7％干固体玉米，并且图5中数据显示，在当前的液化条件下，热稳定性植酸酶水解了95％以上的植酸。显著地，来自在89℃温育的样品的HPLC谱显示，与来自两种其他变体的植酸酶比较，BP-111植酸酶变体显示出更高的热稳定性(参见图6；BP-110和BP-112)。

实施例13.使用热稳定性植酸酶增加变体嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶的热稳定性促进了在使用喷射蒸煮器的液化系统中的单次α淀粉酶剂量系统

使用常规组合物和方法，如果需要，不调整浆液的pH，进行一系列的实验以测定热稳定性植酸酶的存在是否能增加市售α淀粉酶的稳固性和热稳定性。使用32％干固体研磨玉米，用稀釜馏物补偿35％的液相，实施该实验。将调整到pH4.8的81.9千克的液体加热到196°F，并加入24千克的研磨玉米。应当注意，在该实验中，浆液的pH降低到pH4.8，以模拟蒸煮水的低pH条件，不升高pH，这在常规方法中对稳定α淀粉酶是必需的。

加入酶并加入剩下的24千克玉米。在180-182°F水解20分钟后，以6.3升/分钟，将热浆液泵经蒸汽喷射蒸煮器，工业上已知为Hydrothermalbrand model M 103。测试了3种不同的喷射温度，以研究α淀粉酶的热稳定性(即225、220和215°F)。通过保持维持在～20psi的配备了反压阀的延迟环(delay loop)，维持该温度4.5-5分钟。允许离开该系统的物质快速降压至大气压，并收集样品用于在185°F进行次级液化。

喷射蒸煮温度、剂量和样品方案在表10中显示。示例性α淀粉酶是GC 358(包含替换S242Q的嗜热脂肪地芽孢杆菌α淀粉酶的变体)。剂量以AAU/克干固体玉米给出。示例性热稳定性植酸酶是BP 111(SEQ ID NO：3)。剂量以FTU/克干固体玉米给出。次级液化后，在多个时间间隔测量的葡萄糖当量(DE)显示于表11中。

表10.剂量和采样

显示于表11中的DE发展是α淀粉酶活性的证据，并且在本文中其称为表观α淀粉酶活性。用热稳定性植酸酶处理20分钟明显导致了表观α淀粉酶热稳定性的增加，可能是由于除去了植酸。在次级液化中，甚至在喷射蒸煮后没有第二剂量添加的情况下，DE进展也以0.04DE/分钟持续。在3个测试中，由持续的DE进展表示的α淀粉酶活性在泵经225、220和215°F的3个喷射温度后得以保留。

表11.在没有α淀粉酶或植酸酶的任一第二剂量添加的情况下，在浆液和次级液化(pH5.2，185°F)中随时间的DE进展。

Claims (25)

1.用于在包含淀粉和植酸盐的浆液中进行淀粉液化的方法，所述方法包括在初级液化或次级液化条件下将浆液与热稳定性植酸酶和α淀粉酶接触，其中存在所述热稳定性植酸酶与不存在所述植酸酶的等同方法相比增加了淀粉液化的量。

2.权利要求1的方法，其中所述浆液的pH在初级液化或次级液化之前或之后不进行调整。

3.权利要求1的方法，其中所述α淀粉酶在比不存在植酸酶的情况下该α淀粉酶具有活性的pH更低的pH下是有活性的。

4.权利要求1的方法，其中所述浆液在初级液化前不需要植酸酶预处理步骤。

5.权利要求1的方法，其中所述初级液化和次级液化的温度是75℃或更高。

6.权利要求1的方法，其中所述初级液化和次级液化的温度是80℃或更高。

7.权利要求1的方法，其中所述初级液化温和次级液化的温度是85℃或更高。

8.权利要求1的方法，其中所述次级液化的温度是90℃或更高。

9.权利要求1的方法，其中所述浆液不需要添加抗氧化剂。

10.权利要求1的方法，其中所述植酸酶获自布丘氏菌属(Buttiauxiellaspp.)

11.权利要求1的方法，其中所述植酸酶是来源于布丘氏菌属植酸酶的重组热稳定性植酸酶。

12.权利要求11的方法，其中所述植酸酶选自BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ ID NO：4)和BP-112(SEQ ID NO：5)。

13.权利要求12的方法，其中所述植酸酶是BP-111(SEQ ID NO：4)。

14.权利要求1的方法，其中所述α淀粉酶是热稳定性α淀粉酶。

15.权利要求14的方法，其中所述α淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。

16.用于在包含颗粒淀粉和植酸盐的浆液中进行淀粉液化的方法，所述方法包括：

(a)制备包含颗粒淀粉和稀釜馏物的浆液，

(b)将浆液与热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶接触，

(c)进行初级液化和次级液化，和

(d)使用在步骤(c)中产生的糊精进行发酵，

其中所述浆液的pH在任一步骤(a)-(d)中都不进行调整。

17.权利要求16的方法，其中所述浆液在初级液化前不需要植酸酶预处理步骤。

18.权利要求16的方法，其中所述热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶在75℃或更高的温度下加入。

19.权利要求16的方法，其中所述热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶在80℃或更高的温度下加入。

20.权利要求16的方法，其中所述热稳定性植酸酶和热稳定性α淀粉酶在85℃或更高的温度下加入。

21.权利要求16的方法，其中所述浆液不需要添加抗氧化剂。

22.权利要求16的方法，其中所述植酸酶是来源于布丘氏菌属植酸酶的重组热稳定性植酸酶。

23.权利要求22的方法，其中所述植酸酶选自BP-110(SEQ ID NO：3)、BP-111(SEQ ID NO：4)和BP-112(SEQ ID NO：5)。

24.权利要求23的方法，其中所述植酸酶是BP-111(SEQ ID NO：4)。

25.权利要求16的方法，其中所述α淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。

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