CN103492579A

CN103492579A - 用纤维素酶和葡糖淀粉酶提高发酵制备乙醇的产率

Info

Publication number: CN103492579A
Application number: CN201280020637.6A
Authority: CN
Inventors: 李勉; C·米奇森
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-01-01
Also published as: US20120276593A1; CA2834061A1; EP2702161A1; JP2014512828A; MX2013012338A; BR112013027582A2; WO2012149275A1

Abstract

本发明提供了一种改进的糖化工艺，所述糖化工艺包括使用葡糖淀粉酶和至少一种纤维素酶。所述改进的糖化工艺使发酵产物例如乙醇的产率提高。在一个实施例中，所述改进的糖化工艺使用商购的纤维素酶使乙醇的产率提高最多0.5%至1%。还提供了改进的同步糖化发酵(SSF)工艺，和包含液化淀粉浆、葡糖淀粉酶和纤维素酶的组合物。

Description

用纤维素酶和葡糖淀粉酶提高发酵制备乙醇的产率

优先权

本专利申请要求提交于2011年4月29日的美国临时申请No.61/481,094的优先权，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本专利涉及淀粉和/或生物质的发酵，具体地讲，涉及利用此类发酵提高产率例如乙醇产率的方法。具体地讲，本专利涉及用葡糖淀粉酶和纤维素酶的组合糖化和/或发酵淀粉和/或生物质来发酵（包括同步糖化发酵(SSF)工艺）生产乙醇的组合物和方法。

背景技术

通过淀粉和/或生物质的工业发酵来生产可用产品（例如乙醇）仍然是受到广泛关注的领域。乙醇的许多用途包括食品和饮料以及工业化学品、燃料添加剂或液体添加剂的应用。当前经济、社会、政治、环境、能源和地质问题使燃料乙醇尤为受到关注。作为潜在的燃料源并因为其来源于可再生资源，乙醇可帮助降低对化石燃料源的依赖，减少不良排放，提高汽油发动机的性能，以及减小大气中二氧化碳的积聚。

虽然已经关注利用主要为纤维质原料的糖化和发酵来获得乙醇，但大多数乙醇由淀粉质原料的发酵制备而来。用含淀粉的原料制备乙醇的典型方法包括两个连续的酶催化步骤，这些步骤导致在发酵前从淀粉释中放出葡萄糖。第一个步骤是液化经过α-淀粉酶催化的淀粉。α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是随机裂解内部α-1,4-D-糖苷键的内切水解酶。它们能够将淀粉浆料降解成短麦芽糖糊精。由于α-淀粉酶降解淀粉，混合物的粘度降低。因为液化通常在高温下进行，所以优选使用热稳定性的α-淀粉酶，如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶。近年来，已经开发出许多新的α-淀粉酶来提高液化并提供许多引人关注的、新型和可用的酶学性质。

酶液化可为多步骤方法。例如，添加酶之后，加热浆料至约60至95℃之间的温度，通常为约78至88℃之间的温度。随后，该浆料被加热（例如喷射蒸煮或以其它方式）至通常约95至125℃之间的温度，然后冷却至约60至95℃。添加更多的酶，并以所需温度（通常约60至95℃）另外保持该糊状物约0.5至4小时。在一些情况下，已知纤维素酶被添加至液化槽来帮助降低糊状物的粘度。用于该目的的商业纤维素酶产品的例子包括由丹尼斯克公司杰能科分公司(Danisco’s Genencor Division)）生产的多种OPTIMASH^TM，例如OPTIMASH^TMBG、OPTIMASH^TMTBG、OPTIMASH^TMVR和OPTIMASH^TMXL。

尽管在此类液化过程中粘度下降，并且长淀粉分子裂解成短麦芽糖糊精，但这些麦芽糖糊精无法容易地通过酵母发酵来形成醇。因此，可能需要第二酶催化步骤糖化进一步分解麦芽糖糊精。通常使用葡糖淀粉酶和/或麦芽糖α-淀粉酶来催化液化后形成的麦芽糖糊精的非还原性末端的水解，以释放葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。还可用分支酶例如支链淀粉酶来帮助糖化。糖化通常在高温的酸性条件下进行，例如。约60℃、pH4.3。

虽然基本的酶淀粉液化方法得到很好的建立，但进一步提高商业淀粉加工是有用的。具体地讲，在碾磨原料（例如谷物，如玉米）以及淀粉的凝胶化和液化后剩余有纤维素材料。这种纤维素材料可捕获或结合一些淀粉，从而降低了理论和实际产率。液化期间可使用纤维素酶来降低浆料的粘度。参见例如

等人的Process Biochemistry,Vol.42,pp.834-839,2007（《过程生物化学》，第42卷，第834-839页，2007年）。SSF过程中还可将纤维素酶用于预处理的木质纤维素材料，例如针叶木浆和甘蔗渣。参见例如

等人的Process Biochemistry,Vol.44,pp.1323-1329,2009（《过程生物化学》，第44卷，第1323-1329页，2009年）；和daSilva等人的Bioresource Technology,Vol.101,pp.7402-7409,2010（《生物资源技术》，第101卷，第7402-7409页，2010年）。能够提高发酵产物例如乙醇的产率的方法代表本领域的一次进步，因为仅根据在美国每年生产的120亿加仑乙醇来考虑而言，即使很小的可再生产率的提高（如果在不投入额外能源的条件下可以达到）也是有价值的。

发明内容

提供了用于糖化和发酵含淀粉材料的方法。在存在用于发酵原液的纤维素酶和葡糖淀粉酶的情况下，可通过糖化淀粉植物材料（例如粮谷）来提高产率。该方法涉及在液化后优选地在例如糖化和/或发酵过程中添加纤维素酶和葡糖淀粉酶。本方法不同于以下本领域已知的方法：(1)在用以降低浆料的粘度的液化过程中使用纤维素酶（纤维素酶通常在高温液化步骤结束时失活）；以及(2)在针对具有低淀粉含量的富含纤维素的材料的SSF过程中使用纤维素酶。例如在同步糖化发酵(SSF)过程中可添加酶。不限于任何特定作用模式，所述酶可水解纤维素材料的某些部分和/或帮助释放结合到纤维素纤维或纤维素纤维捕获的淀粉分子。无论何种机制，添加所述酶的净效应是提高产率，这明显是由于释放/转化额外的可发酵材料来生成额外的葡萄糖。

干酒糟及可溶物(DDGS)是干磨乙醇设施的副产物，其通常含有约葡聚糖总量的20%或更多，其中约16%（干重计）来源于纤维素。（参见Youngmi等人的Bioresource Technology，99:5165-5176(2008)（《生物资源技术》，第99卷，第5165-5176页，2008年））。如果完全转变成葡萄糖，该纤维素理论上每蒲式耳玉米可多生产约0.1加仑乙醇。（Saville andYacyshyn,“Effect of Cellulase Supplementation on Cookline Operation in ADry Mill Ethanol Plant,”27th Symposium on Biotechnology for Fuels andChemicals.,May1-4,2005,Denver,CO)（Saville和Yacyshyn，“补充纤维素酶对在干磨乙醇植物中进行Cookline操作的影响”，《第27届燃料与化学物用生物技术专题讨论会》，2005年5月1日至4日，科罗拉多州丹佛））。例如，对于乙醇发酵，产率可提高0.4-0.5%。如果在工业范围内应用，此类提高每年会在美国多生产4800-6000万加仑乙醇。

因此，在第一方面，提供了一种糖化含淀粉底物以生成发酵原液的方法。该方法包括(a)在足以产生酶活性的条件下使包含至少一些纤维素材料的液化的淀粉浆料（即液化物）与葡糖淀粉酶和纤维素酶接触，以及(b)使酶有时间产生活性，从而生成发酵原液。优选地，酶活性足以至少：(a)提高发酵原液中至少一种可发酵糖的浓度；(b)释放至少一条结合到纤维素或纤维素捕获的淀粉链；或(c)水解存在于液化淀粉浆料中的纤维素材料的某些部分。

在一个实施例中，提供了用于提高通过发酵淀粉底物生产的发酵产物的产率的方法。该方法通常包括以下步骤：选择包含至少一些纤维素材料的液化淀粉，在足以产生酶活性的条件下使液化淀粉与葡糖淀粉酶和纤维素酶接触，随后发酵该混合物以生产发酵产物。在一个目前的优选实施例中，发酵产物为乙醇。在多个实施例中，发酵产物的产率可提高约0.1%至约1.0%。

在另外的实施例中，提供了同步糖化和发酵液化谷类淀粉的方法。此类方法包括以下步骤：(1)在存在适于发酵的生物体的情况下，使液化淀粉浆料与葡糖淀粉酶和纤维素酶在足以产生酶活性和发酵的条件下接触，(2)使酶产生活性并进行发酵。在一个实施例中，发酵进行至少24至约72小时。相对于没有添加纤维素酶的对照发酵，该发酵可具有提高的产率。在一个实施例中，该发酵生成乙醇，并且乙醇产率提高了例如约0.1至约1.0%。

在另一个方面，提供了包含液化淀粉浆料、葡糖淀粉酶和纤维素酶的组合物。此类组合物可用于制备发酵乙醇或其他可用产品的给料。

附图说明

图1示出了在对32%干固体(DS)玉米醪进行72小时发酵的过程中添加纤维素酶对乙醇产率的影响。实验使用了SSF方法。所述葡糖淀粉酶为0.4GAU/g玉米的G-ZYME480（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(DaniscoUS Inc.,Genencor Division)）。所述纤维素酶为以5千克/公吨干玉米添加的ACCELLERASE1000（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）。对照包含葡糖淀粉酶，但不添加纤维素酶。测量乙醇DP1和DP2浓度以进行对照和纤维素酶处理。y轴示出了浓度(g/L)；x轴表示发酵的时间（小时）。

图2是条形图，示出了在存在葡糖淀粉酶的情况下在液化物中每公吨干固体(kg/MT DS)含有0、5、10和50kg纤维素酶的结果。y轴示出了指定时间的乙醇的量(g/L)。

图3-4示出了将葡糖淀粉酶（G-ZYME，（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)以0.4GAU/g玉米）和纤维素酶（ACCELLERASE1500（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）0.5-2kg/MT DS）添加至玉米醪发酵的一个实验的结果。图3描述了葡糖淀粉酶和纤维素酶对乙醇产率的影响。该图表示出了相对于添加的纤维素酶的量(%重量/重量DS)，y轴上乙醇的最终量(%体积/v体积)。图4示出了图3描述的实验中相对于添加的纤维素酶的量，发酵中葡萄糖的最终浓度。该图表示出了相对于添加的纤维素酶的量(%重量/重量DS)，y轴上的最终葡萄糖浓度(%重量/体积)。

具体实施方式

本文提供的方法包括在液化后糖化淀粉材料的位置使用纤维素酶。在淀粉材料例如粮谷的糖化或SSF过程中添加纤维素酶可提高发酵产物的产率。改进的糖化或SSF工艺有利地增加了葡萄糖的浓度，释放结合到纤维素材料、与纤维素材料结合或被其捕获的一个或多个淀粉分子，或分解在例如干磨和液化后剩余的纤维素的至少某些部分。在一个实施例中，改进的糖化工艺使用与葡糖淀粉酶一起添加的商购的纤维素酶，导致乙醇的产率提高。

1.定义和缩写

根据此描述，应用下面的缩写和定义。应该指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种酶”包括多个此种酶，而提及“该制剂”，包括提及一个或多个制剂以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。另外，本文所用的术语“包含”及其同源词以其“包括在内”的含义使用；也就是说，与术语“包括”及其相应的同源词等同。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。

1.1.定义

相对于数值或范围的术语“约”表示数值可最高至10%，大于或小于所述值。在其他实施例中，“约”表示数值可最高至5%，大于或小于所述值。

如本文所用，“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C₆H₁₀O₅)_x（其中X可以是任何正整数）的直链淀粉和支链淀粉构成。具体地讲，该术语指任何植物基材料，包括（但不限于）谷物、草、块茎和根。所述淀粉材料优选地为小麦、大麦、玉米、裸麦、燕麦、水稻、高粱或蜀黍、糠、木薯、稷、马铃薯、甘薯和木薯。针对本文中的目的，“高粱”通常包括“谷物高粱”，也被称为“蜀黍”。

术语“浆料”指含有至少一些不溶性固体的水性混合物。浆料还可包含一种或多种可溶组分。研磨的谷物、面粉或淀粉通常悬浮在水性溶液中，以形成浆料，用于检测淀粉酶或液化工艺。

“凝胶化”意指使淀粉分子通过蒸煮增溶形成粘性悬浮液。

术语“液化”意指淀粉被“液化”或转变成粘性更低的短链可溶糊精的过程。液化过程包括在至少添加α-淀粉酶的同时或之前凝胶化淀粉。因此，液化是胶凝化淀粉被酶法水解例如从而减小淀粉的链长并降低其粘度的阶段。如本文所用，“液化物”指液化淀粉浆料，即所得的水解混合物。此类液化物通常是与发酵结合的糖化过程的原料。

如本文所用，“糖化”指酶将淀粉转化为葡萄糖。液化后，“糖化”淀粉浆料以将麦芽糖糊精转化为可发酵糖，例如葡萄糖、麦芽糖。糖化涉及使用酶，特别是葡糖淀粉酶，但也经常使用分支酶。

术语“聚合度”(DP)指给定的糖类中无水吡喃葡萄糖的数目(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP>3表示聚合度大于3的聚合物。可使用DP来测量淀粉（高DP）分解至糖（低DP）的相对程度。术语“DE”或“右旋糖当量”被定义为还原糖占总碳水化合物的百分比。

“同步糖化发酵”(SSF)指特定类型的发酵方法，其中糖化原料（例如全谷物或其他包含淀粉和纤维素材料的生物质）的步骤和发酵步骤结合成一起进行的单一步骤。

“淀粉酶”意指除其他方面外还能够催化淀粉、直链淀粉、支链淀粉等的降解的酶。一般来讲，淀粉酶包括(a)裂解含三个或更多个α-D-(1→4)连接的葡萄糖单元的多糖中的α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶活性（例如存在于α-淀粉酶（EC3.2.1.1;α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）），和(b)依次从非还原性末端裂解底物分子的外切淀粉分解活性。后者的例子可见于β-淀粉酶(EC3.2.1.2)，其生成β-麦芽糖。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20;α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶）、葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶）和产物特异性淀粉酶可由相应底物生成特定长度的麦芽低聚糖。

“α-淀粉酶”（例如E.C.3.2.1.1）通常指催化α-1,4-葡糖苷键水解的酶。这些酶影响含1,4-α-键合的D-葡萄糖单元的多糖中1,4-α-D-葡糖苷键的水解。α-淀粉酶在α-构型中释放还原性基团。针对本发明的目的，“α-淀粉酶”尤其包括那些具有相对高热稳定性（即在高温下具有持续活性）的α淀粉酶。例如，α-淀粉酶可用于在高于80℃的温度下液化淀粉。

相对于酶的“活性”意指催化活性并包括任何可接受的测量酶活性的度量，例如活性速率、活性量或比活性。如本文所用，术语“比活性”意指一种酶单位，定义为在特定条件下每单位时间被酶制剂转化为产物的底物的摩尔数。比活性表达为蛋白质单位(U)/mg。

“α-淀粉酶单位”(AAU)指按照美国专利No.5,958,739中公开的方法测量的α-淀粉酶活性。简而言之，测定法使用对硝基苯麦芽庚糖苷(PNP-G7)作为底物，其非还原末端糖被化学封闭。PNP-G7可被内切淀粉酶例如α-淀粉酶裂解。裂解后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化该底物以释放游离的PNP分子，从而显示黄颜色，可通过可见光分光光度法在410nm处测量。PNP释放速率与α-淀粉酶活性成比例。比照标准对照品计算给定样品的AAU。一个单位的AAU指在指定条件下每分钟水解10mg的淀粉所需的酶量。

“葡糖淀粉酶”是一种外切淀粉酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。葡糖淀粉酶还催化水解α-1,6和α-1,3键，尽管速率远低于α-1,4键。葡糖淀粉酶活性可在“葡糖淀粉酶单元”(GAU)中表达。

如本文所用，“纤维素”是通用术语，包括纤维素、半纤维素、木质素、相关β-D-葡聚糖等。

如本文所用，“纤维素酶”指所有水解纤维素的酶，即其任何组分，例如纤维素、半纤维素、木质素和/或相关β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键，例如存在于谷物中的那些。因此，“纤维素酶”至少包括所有分类为E.C.3.2.1.4（纤维素酶/内切纤维素酶）、E.C.3.2.1.91（外切纤维素酶）和E.C.3.2.1.21（纤维二糖酶）的酶。内切纤维素酶的例子包括内切糖酶-1,4-β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切糖酶葡聚糖水解酶和纤维素糊精酶。外切纤维素酶的例子包括从还原性末端作用的纤维二糖水解酶和在纤维素分子的非还原性末端作用的那些。β葡萄糖苷酶是纤维二糖酶的另一个名称。在本文的某些实施例中，纤维素酶优先指内切纤维素酶、外切纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶中的一种或多种，或它们的任意组合。商业制备纤维素酶组合物在本文中适用，包括例如丹尼斯克公司杰能科分公司(Danisco’sGenencor Division)的产品，如ACCELLERASE1000和ACCELLERASE1500，其包括外切-和内切-葡聚糖酶、半纤维素酶和β葡萄糖苷酶。

在本文中，术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。

术语“衍生自”涵盖术语“来源于”、“获自”或“可获自”和“分离自”。

“发酵”是通过微生物酶分解和/或无氧分解有机物质以生成更简单的有机化合物。虽然发酵在无氧条件下进行，但并不是说该术语只限于严格的无氧条件，因为在存在多种氧气含量的条件下也可以进行发酵。发酵涵盖了含颗粒淀粉的淀粉底物向终产物的至少任何发酵生物转化（例如在容器或反应器中）。

术语“接触”指将相应酶放置在反应器、管等中，使得所述酶能够足够接近相应底物，以便使酶将底物转化为终产物。本领域的技术人员将认识到，将酶（例如在溶液中）与一种或多种相应底物混合（无论是以相对纯或不纯的形式）会影响接触。

如本文所用，术语“干固体含量(ds)”指按干重计的混合物（如浆料）的总固体。干固体含量和干重计通常表达为例如被测材料的重量占总干材料重量的百分比。

术语“残余淀粉”指发酵后以谷物副产物形式存在的淀粉的量。通常，100克DDGS中存在的残余淀粉的量可以是其中一个参数，以评估发酵过程（例如乙醇制备过程）中淀粉的利用率。

如本文所用，“回收步骤”指回收糊状物组分，其可包括残余淀粉、酶和/或微生物以发酵包括淀粉的底物。

术语“糊状物”指可发酵碳源（碳水化合物）在水中的混合物，其用于制备发酵产物，例如醇。在一些实施例中，术语“啤酒”和“糊状物”可交换使用。

术语“釜馏物”指非发酵固体与水的混合物，所述混合物是将醇从发酵糊状物移除后的残余物。

术语“干酒糟”(DDG)和“干酒糟及可溶物”(DDGS)指谷物发酵的可用副产物。

如本文所用，“微生物”包括任何细菌、酵母或真菌种。

如本文所用，“乙醇微生物”指能够将糖或低聚糖转化为乙醇的微生物。乙醇微生物能生产乙醇是因为其能够表达一种或多种酶，所述酶单独或一起将糖转化为乙醇。

如本文所用，“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指任何能够从己糖或戊糖制备乙醇的有机物生物体或细胞。一般来讲，产生乙醇的细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的例子包括真菌微生物，例如酵母。在乙醇制备过程中使用的典型酵母包括酵母属的菌种和菌株，例如酿酒酵母。

结合多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。在一些实施例中，蛋白质是商业上很重要的工业蛋白质。意在使该术语涵盖通过天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。

结合多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所用，术语“回收的”、“离析的”和“分离的”指从至少一种与其天然结合的组分移除开来的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

关于乙醇产率的术语“产率”指从一定量的原料制备化合物（例如乙醇）。“产率”可表达为在特定时间段内从原料形成的产物。在一个实施例中，乙醇产率计算为“加仑UD/蒲式耳玉米”，表示每蒲式耳玉米制备的未变性乙醇的加仑数。一蒲式耳玉米重约56磅。

“ATCC”指位于马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心，VA 20108(ATCC)。

1.2.缩写

除非另有指明，否则应用下述缩写：

AA α-淀粉酶

AAU α-淀粉酶单元

CMC 羧甲基纤维素

DDG 干酒糟

DDGS 干酒糟及可溶物

DE 葡萄糖当量

DNA 脱氧核糖核酸

DPn 具有n个亚单位的聚合度

DS,ds 干固体

EC 进行酶分类的酶学委员会

g 克

gal 加仑

GAU 葡糖淀粉酶活性单位

h 小时

kg 千克

MT 公吨

nm 纳米

pI 等电点

PNP-G₇ 对硝基苯麦芽庚糖苷

ppm 份每一百万份

rpm 转每分钟

SSF 同时糖化发酵

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

UD 未变性

μL 微升

2.乙醇制备

在其中一个方面，本文提供的改进的糖化工艺特别适用于乙醇的制备。通常，用含淀粉材料制备醇（乙醇）总体上可分为四个步骤：碾磨、液化、糖化和发酵。

2.1.原料

在本发明的淀粉加工过程中，尤其是本发明的乙醇工艺中，起始原料优选地为包括基本淀粉来源和至少一些纤维素材料来源的材料。通常，原料（例如玉米籽粒）包含低于5%的纤维素材料（基于干重量计）。参见例如Kim等人的Bioresour.Technol.Vol.99,pp.5177-5192(2008)（《生物资源技术》，第99卷，第5177-5192页，2008年）。在一个实施例中，淀粉和纤维素在自然状态下紧密相关。在一个典型应用中，本文所用淀粉的来源是全谷物或至少主要是全谷物。原料可选自多种含淀粉作物，包括玉米、马铃薯、木薯、高粱或蜀黍、小麦、大麦、裸麦、燕麦等。在一个实施例中，含淀粉原料是谷物。在某些优选的实施例中，含淀粉原料可以是选自玉米、小麦和大麦或它们的组合的全谷物。

2.2.碾磨

碾磨谷粒以打开结构，从而允许进一步加工。三个常用工艺是湿磨、干磨和多种分级法。在干磨法中，碾磨整个去壳谷粒并用于该工艺的后续步骤。另一方面，湿磨很好地分离胚芽和粗粉（淀粉颗粒和蛋白质），使得其常应用于平行制备糖浆剂的位置，但也有一些例外。不同的分级工艺（例如湿磨或干磨工艺的变型形式）导致谷物组分更高或更低程度的分离。干磨是乙醇发酵最常用的碾磨方法。预期针对本文的用法，不要求高度纯化的淀粉，但优选地，至少一些纤维素残余物将保持与淀粉相关。因此，干磨非常适用于本发明公开的工艺。

2.3.凝胶化和液化

在一些实施例中，将如上所述制备的淀粉底物用水调成浆液。淀粉浆液含有的淀粉以干物质重量百分比计可为约10-55%、约20-45%、约30-45%、约30-40%或约30-35%。在一个目前优选的实施例中，干固体含量可介于约20%和约35%之间。如果可用或需要的话，可用例如NaOH或HCl调节浆料的pH，例如以最大化酶稳定性和/或活性。有时调节pH是有利的，以便改善或优化α-淀粉酶稳定性和活性。

针对本文的液化，任何常规的液化工艺是合适的，其他不太常规的液化方法也适用。可以任何有效量使用α-淀粉酶以完成液化目标。按本文可使用比常规更高的剂量。还预期按本文使用不同液化时间和/或温度，前提是它们能有效地实现要求的粘度下降和淀粉分解。虽然可使用任何适于液化的α-淀粉酶，预期按本文使用的代表性α-淀粉酶包括GC358和

XTRA（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）以及

SC和

SC DS（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）。或者，可用于液化的α-淀粉酶产品包括（但不限于）

FRED、

HPA、Maxaliq^TMONE（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,GenencorDivision)）和

LF（维莱尼姆公司(Verenium Corp.)）。还可使用任何上述酶产品的组合物或共混物。

还预期可按本文使用常规高温处理如喷射蒸煮，其通常在介于约100-125℃之间的温度下进行，这是省略高温步骤的液化工艺。液化物中存在残余α-淀粉酶对于本文提供的改进的糖化方法是可以接受的。

2.4.改进的糖化方法

液化之后，通过糖化进一步水解糊状物或液化物，以生成可易于发酵的低分子糖(DP1-DP2)。在一些实施例中，可在液化步骤和糖化步骤之间加入1-4小时的预糖化步骤。糖化过程中，通常通过在葡糖淀粉酶的酶促作用下完成水解。通常，除了葡糖淀粉酶还可补充α-葡萄糖苷酶和/或酸α-淀粉酶。

在改进的糖化方法中，例如按以下所述将纤维素酶与葡糖淀粉酶一起添加。

在一个方面，提供了糖化含淀粉底物（如谷物或其他淀粉作物）的改进方法。所述方法可用于例如制备发酵给料。该方法包括：确定至少包含一些纤维素材料的液化淀粉浆（液化物）；在足以产生酶活性的条件下，使液化物与葡糖淀粉酶和纤维素酶接触；并使酶有时间产生活性。发酵给料通过该方法制备并可用于任何类型的发酵，无论是制备工业化学品、医药，还是制备甚至乙醇或其他生物燃料。

在一个实施例中，酶活性，尤其是纤维素酶的活性足以至少：(a)提高发酵原液中至少一种可发酵糖的浓度；(b)释放至少一条结合到纤维素或纤维素捕获的淀粉链；或(c)水解纤维素材料的某些部分。可进行实验，其中可相对于糖化过程中未与纤维素酶接触或用其处理的对照液化物测量上述(a)、(b)或(c)中的任一者。

如技术人员将会知道的那样，“纤维素酶”活性是酶活性中的复杂群组，并不是能够催化水解多个葡聚糖键的单一蛋白质或多肽。在多个实施例中，纤维素酶因而包括任何通常被视为或称为纤维素酶的酶，包括任意一种或多种外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性或它们的任意组合。所述纤维素酶包括至少外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性。以下3.3节中提供了预期按本文使用的商业纤维素酶的一些例子。

可以任何可用的剂量添加纤维素酶。技术人员将会知道，过度施加任何酶可对例如糖化处理时或之后的发酵造成负面影响。在多个实施例中，纤维素酶加入液化物的剂量介于约0.05至约50kg/公吨干固体之间，介于约0.075至约25kg/公吨之间，介于约0.1至约12.5kg/公吨之间，介于约0.3至约6kg/公吨之间或介于约0.5至约1kg/公吨干固体之间。在一个目前优选的实施例中，液化物中每公吨干固体可使用约5kg纤维素酶。

或者，可相对于添加的葡糖淀粉酶制定纤维素酶的剂量。在多个实施例中，纤维素酶/葡糖淀粉酶比率可介于约0.00011至约0.14g/GAU之间，介于约0.00017至约0.07g/GAU之间，介于约0.00022至约0.04g/GAU之间，介于约0.00068至约0.016g/GAU之间或介于约0.0011至约0.0028g/GAU之间。

可以注意到，虽然淀粉液化物的任何糖化可能包括纤维素酶而不对糖化造成任何负面影响，但至少从经济的角度，确定可从添加纤维素酶获益的液化物是有用的。因此，例如已知包含或可能包含纤维素材料的液化物可能是干磨的淀粉源（如谷物，尤其是玉米）产生的液化物。

接触步骤可以是连续的，先添加葡糖淀粉酶或先添加纤维素酶。接触步骤还可以是同时的，同时或几乎同时添加酶。为了避免出现问题，优选的是选择有共同活性条件的酶–例如pH、温度、离子强度、盐和/或其他要求重叠，使得更易于为使酶具有活性设置条件。

在一个实施例中，可通过使液化物接触一种或多种额外的选自去分支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶的酶进一步改善糖化。此类酶可用于分解研磨后剩余或未受到液化过程影响的植物壁和其他多孔材料。额外的此类材料的消化可有助于葡萄糖或其等同物的制备，无论是直接方式（通过释放还原糖）还是间接方式（例如通过释放其他材料例如纤维素捕获或结合的淀粉分子）。

在另一方面，提供了用于提高通过发酵淀粉底物制备的发酵产物的产率的方法。与前述方法一样，该方法涉及液化后在含淀粉材料的糖化期间添加纤维素酶的步骤。该方法通常包括以下步骤：选择包含至少一些纤维素材料的液化淀粉，在足以产生酶活性的条件下使液化淀粉与葡糖淀粉酶和纤维素酶接触，随后发酵该混合物以生产发酵产物。

选择步骤大体上类似于上述确定步骤，因为改进方法的优点将使得更易于恰当地选择液化物–即优选地具有至少一些纤维素材料的液化物。在一个实施例中，发酵产物为乙醇。优选地，产率提高至少约0.1%至约1.0%。对于乙醇制备而言，提高至少0.3%至约0.5%在实施过程中是可实现的。

纤维素酶通常包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的一种或多种或其任意组合。在一个实施例中，所述纤维素酶包括至少外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性。

纤维素酶的剂量类似于上述的那些。因此，可在液化物中以每公吨干固体约0.05至约50kg的量添加纤维素酶。一般来讲，商业纤维素酶例如ACCELLERASE产品（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）的剂量可以为约5kg/公吨干固体。

接触步骤和发酵步骤可进行对产率和其他考虑因素有利的任意时间长度。优选地，这两个步骤总共进行约24至72小时。然而，如果需要的话，仅糖化步骤就可能持续几天。在一个实施例中，被糖化的淀粉来自玉米、小麦、大麦、高粱或蜀黍、裸麦、马铃薯或它们的任意组合。更优选地，所述淀粉可来自玉米，例如玉米醪。

所述方法还可包括以下步骤：使液化物与如上所述的一种或多种额外的选自去分支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶的酶接触。

如技术人员将会知道的那样，完全糖化可能需要最高至约72小时。在一些目前可优选用于本文的实施例中，糖化步骤和发酵步骤结合为一个步骤，称为同步糖化发酵或SSF。

结合SSF，另一方面提供了同步糖化和发酵液化淀粉的改进方法，所述方法包括在存在适于发酵的生物体的情况下，使液化物与葡糖淀粉酶和纤维素酶在足以产生酶活性和发酵的条件下接触，并且使酶产生活性和让发酵进行至少24至约72小时；其中，相对于没有添加纤维素酶的对照发酵，该发酵具有提高的产率。

与本文所公开的其他方面一样，通过一个实施例中的发酵制备乙醇，并且乙醇产率得到提高。同样，所述纤维素酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的任意一种或多种。某些目前优选的纤维素酶包括至少外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性。

纤维素酶的剂量可以是任何可用的量，纤维素酶加入液化物的量介于约0.05至约50kg/公吨干固体之间，介于约0.1至约25kg/公吨之间，介于约1至约10kg/公吨之间，或为约2.5-7.5kg/公吨干固体。在一个目前优选的实施例中，液化物中每公吨干固体使用约5kg纤维素酶。

在多个实施例中，产率提高约0.1至约1.0%，或约0.3至约0.6%。

在一个实施例中，接触和发酵步骤总共需要约24至72小时。在多个实施例中，淀粉来自玉米、小麦、大麦、高粱或蜀黍、裸麦、马铃薯或它们的组合。示例性淀粉为玉米，尤其与乙醇发酵结合。

改进的方法中可任选地包括额外的酶，例如分支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶。

在改进糖化的另一个方面，提供了包含淀粉、葡糖淀粉酶和纤维素酶的液化物的组合物。所述组合物可用于制备发酵的给料。可例如在低于对酶活性有用的温度的温度下保存组合物，并随后可根据以上所述将其升温并保持以进一步进行糖化。优选地，组合物包含的纤维素酶的量介于液化物中每公吨干固体0.05至约50kg之间。所述淀粉通常来自玉米、小麦、大麦、高粱或蜀黍、裸麦、马铃薯或它们的任意组合，但目前优选玉米，特别是对于乙醇发酵。所述组合物还可包含一种或多种额外的酶，例如分支酶、果胶酶、β淀粉酶和/或植酸酶。

2.5.发酵

发酵中使用的生物体将取决于所需的终产物。通常，如果乙醇是所需的终产物，那么酵母将被用作发酵生物体。在一些实施例中，产乙醇微生物是酵母，特别是酵母属，例如酿酒酵母菌株（美国专利No.4,316,956）。多种酿酒酵母可商购获得，其包括（但不限于）EthanolRed^TM（富酶泰斯公司(Fermentis)），和Superstart^TM（拉曼乙醇技术公司(Lallemand Ethanol Technology)），FALI（弗莱舍曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)），

（帝斯曼特种公司(DSMSpecialties)），

XR（美国临床生化学会(NACB)）和安琪酿酒酵母（中国安琪酵母公司(Angel Yeast Company,China)）。该方法中使用的发酵剂为这样的量，其能有效地在适当的时间内生产商业上大量的乙醇，（例如在小于72小时的时间内从具有介于25-40%之间的干固体的底物生产至少10%的乙醇）。可以每毫升发酵液约10⁴至10¹²活酵母菌数的量提供酵母细胞，通常为每毫升发酵液约10⁷至10¹⁰活酵母菌数。发酵除了发酵微生物（例如酵母）包括营养素、任选的额外的酶，包括（但不限于）植酸酶。发酵中酵母的用法是已知的。参见例如THE ALCOHOL TEXTBOOK,K.A.JACQUES ET AL.,EDS.2003,NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS,UK（《醇教科书》，K.A.JACQUES等人编辑，2003年，英国诺丁汉大学出版社）。

本文所述的改进方法可使乙醇产率提高。提高的乙醇产率为约0.1至约1.0%，大于未添加葡糖淀粉酶和纤维素酶的乙醇制备方法的产率。乙醇产率可表达为“加仑UD/蒲式耳玉米”，表示每蒲式耳玉米制备的未变性乙醇的加仑数。现代技术通常使乙醇产率保持在约2.5至约2.8加仑UD/蒲式耳玉米的范围内。参见Bothast&Schlicher,“Biotechnological Processesfor Conversion of Corn into Ethanol,”Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:19-25(2005)（Bothast和Schlicher，“玉米转化为乙醇的生物技术工艺”，《应用微生物学与生物技术》，第67卷，第19-25页，2005年）。提高的乙醇制备效率可归因于本文所述的淀粉处理过程中更高的淀粉利用率。乙醇制备结束时，100克谷物副产物中的残余淀粉比下述乙醇制备方法的残余淀粉量低至少约10%、约20%或约30%，该乙醇制备方法在约85℃的温度下并且要求α-淀粉酶在90分钟内达到至少约10的DE值的条件下液化淀粉。

在另外的实施例中，通过使用本领域已知的适当的发酵微生物，发酵终产物可包括（但不限于）甘油、1,3-丙二醇、葡糖酸盐、2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮-D-葡糖酸盐、2-酮基-L-古龙酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及它们的衍生物。更具体地讲，当乳酸为所需的终产物时，可使用乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)（干酪乳杆菌(L.casei)）；当甘油或1,3-丙二醇为所需终产物时，可使用大肠杆菌(E.coli)；当2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮-D-葡糖酸盐和2-酮基-L-古龙酸为所需终产物时，柠檬泛菌(Pantoea citrea)可用作发酵微生物。以上列举的名单仅为例子，本领域技术人员会知道多种可适当地用于获得所需的终产品的发酵微生物。

标准分批系统的适当变型是“分批补料发酵”系统。在典型的分批系统的这个变型中，随着发酵的进行以增量的形式(in increments)添加底物。在分解代谢物阻遏可能抑制细胞的代谢时和在需要在培养基中具有有限量的底物的情况下可使用补料分批系统。补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，因此根据诸如pH、溶氧、废气（如CO₂）分压的可测量因素的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域普通且公知的。

连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基被连续地添加到生物反应器，并同时移取等量的经调理的培养基进行加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵使得可以调节影响细胞生长和/或产品浓度的一个或多个因素。例如，在一个实施方案中，以固定的速率维持限制性营养物如碳源或氮源，同时让所有其他参数调节。在其他系统中，可连续地改变多个影响生长的因素，同时保持细胞浓度（通过培养基浊度测量）恒定。连续系统旨在维持稳态生长条件。因此，应使由于移取培养基导致的细胞损失与发酵中的细胞生长速率保持平衡。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域公知的。

2.6.蒸馏

任选地，发酵之后，乙醇可通过例如蒸馏然后任选地进行一个或多个处理步骤来提取。在一些实施例中，本方法制备的乙醇的产率将是至少约8%，至少约10%，至少约12%，至少约14%，至少约15%，至少约16%，至少约17%，至少约18%和至少约23%体积/体积。根据本公开的工艺获得的乙醇可用作例如，燃料乙醇；饮用乙醇（即可饮用的中性烈酒或工业乙醇）。

2.7.副产物

发酵产生的谷物副产物通常以液体形式或干燥形式用作动物饲料。如果湿磨淀粉，则非淀粉副产物包括粗蛋白、油和纤维，例如玉米蛋白粉。如果干磨淀粉，则副产物可包括动物饲料副产物，例如干酒糟(DDG)和干酒糟及可溶物(DDGS)。然而，当干磨谷物并在液化和糖化前将其混入浆料中，则没有谷物剩作副产物。

3.淀粉制备乙醇过程中涉及的酶

就本文所公开的改进的糖化工艺而言，此类方法可与多种酶结合使用，已知其中一些酶用于制备发酵的淀粉材料，例如乙醇。

在一些实施例中，额外的酶可包括在本文所公开的改进的糖化工艺或SSF工艺的液化步骤中。此类酶的例子包括α淀粉酶，其可加入液化步骤，还可加入糖化步骤或从液化步骤转入。其他例子包括纤维素酶和植酸酶，它们也可加入如上所述的液化步骤和糖化步骤。可以在淀粉分解过程中在一个或多个点加入的其他酶包括葡糖淀粉酶、果胶酶、分支酶和β-淀粉酶。这些酶的一些另外的方面和/或来源在下文讨论。

3.1.α-淀粉酶

任何可用于淀粉底物的液化和/或糖化的α-淀粉酶预期可用于本文。尤其可用的是具有相对高热稳定性并因此能够在高于80℃的温度下液化淀粉的那些。适用于液化处理的α-淀粉酶可来自真菌或细菌来源，特别是分离自嗜热细菌（例如芽孢杆菌属(Bacillus)）的α-淀粉酶。这些芽孢杆菌α-淀粉酶通常被称为“Termamyl样α-淀粉酶”。已知的Termamyl样α-淀粉酶包括来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)（此前被称为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)）的那些。其他Termamyl样α-淀粉酶包括来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp)的那些。在WO95/26397中公开了NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513和DSM9375。预期α-淀粉酶还可来源于曲霉菌属(Aspergillus)，例如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)α-淀粉酶。此外，商购的α-淀粉酶和含α-淀粉酶的产品包括TERMAMYL^TMSC、FUNGAMYL^TM、SC andSAN^TMSUPER（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）和XTRA、GC358、FRED、

FRED-L和HPA（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）。

本文可用的α-淀粉酶包括野生型（或亲本）酶以及所述亲本酶的变体。此类变体可与Termamyl样α-淀粉酶或其他野生型淀粉酶（例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶（在提交于2008年11月3日的US2009/0238923中公开）或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶（在提交于2008年11月3日的US2009/0252828中公开））具有约80%至约99%的序列同一性。WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中公开的淀粉酶变体还可预期在本文中使用，包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)α-淀粉酶变体，其与WO99/19467中公开的野生型α-淀粉酶相比具有突变Δ(181-182)+N193F。

在一些实施例中，与亲本酶的性质相比变体α-淀粉酶可显示一种或多种改变的性质。改变的性质可有利地使变体α-淀粉酶在液化中有效地进行。相似地，该改变的性质可导致与其亲本相比改良的变体性能。这些性质可包括底物特异性、底物结合、底物裂解模式、热稳定性、pH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化的稳定性、在较低水平的钙离子(Ca²⁺)下的稳定性和/或比活。代表性的α-淀粉酶变体包括公布于2008年9月11日的US2008/0220476；公布于2008年7月3日的US2008/0160573；公布于2008年6月26日的US2008/0153733；和公布于2008年4月10日的US2008/0083406中所公开的那些。两种或多种α-淀粉酶的共混物还可预期在本文中使用，其中每一种可具有不同的性质。

可根据美国专利No.5,958,739中公开的经过细微修改的方法测定α-淀粉酶的活性。简而言之，测定法使用对硝基苯麦芽庚糖苷(PNP-G₇)作为底物，其非还原末端糖被化学封闭。PNP-G₇可被内切淀粉酶例如α-淀粉酶裂解。裂解后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化该底物以释放游离的PNP分子，所述PNP分子显示黄颜色，可通过可见光分光光度法在410nm处测量。PNP释放速率与α-淀粉酶活性成比例。比照标准对照物计算样本的α-淀粉酶活性。

从例如任何已知的野生型序列开始，变体或突变型α-淀粉酶也可由技术人员制备以在本文中使用。许多例如通过将突变体引入已知基因来制备此类变体的方法在本领域中是已知的。利用多种本领域已知的方法，编码亲本α-淀粉酶的DNA序列可分离自产生所考虑的α-淀粉酶的任何细胞或微生物。

3.2.葡糖淀粉酶

另一种预期用于淀粉处理（特别是糖化期间）的酶是葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。葡糖淀粉酶通常来源于微生物或植物。例如，葡糖淀粉酶可以是真菌或细菌来源。

示例性真菌葡糖淀粉酶是曲霉菌(Aspergillus)葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉(A.niger)G1或G2葡糖淀粉酶（Boel et al.(1984),EMBO J.3(5):1097-1102)（Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学学会会刊》第3卷第5期，第1097-1102页）或其变体，例如WO92/00381和WO00/04136中所公开的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉(A.oryzae)葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4):941-949)（《农业生物化学杂志》，1991年，第55卷第4期，第941-949页）或其变体或片段。其他预期的曲霉菌(Aspergillus)葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen et al.(1996),Prot.Eng.9:499-505)（Chen等人，1996年，《蛋白工程》，第9卷，第499-505页）；D257E和D293E/Q(Chen et al.(1995),Prot.Eng.8:575-582)（Chen等人，1995年，《蛋白工程》，第8卷，第575-582页）；N182(Chen et al.(1994),Biochem.J.301:275-281)（Chen等人，1994年，《生物化学杂志》，第301卷，第275-281页）；二硫键、A246C(Fierobe et al.(1996),Biochemistry,35:8698-8704)（Fierobe等人，1996年，《生物化学杂志》，第35卷，第8698-8704页）；和将Pro残基引入位置A435和S436(Li et al.(1997)Protein Eng.10:1199-1204)（Li等人，1997年，《蛋白工程》，第10卷，第1199-1204页）。

示例性真菌葡糖淀粉酶还可包括里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶和其在美国专利No.7,413,879中公开的同源物（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）。葡糖淀粉酶可包括例如里氏木霉(T.reesei)葡糖淀粉酶、美洲橙黄肉座菌变种(Hypocrea citrina var.americana)葡糖淀粉酶、酒红肉座菌(H.vinosa)葡糖淀粉酶、胶质肉座菌(H.gelatinosa)葡糖淀粉酶、东方肉座菌(H.orientalis)葡糖淀粉酶、康长木霉(T.konilangbra)葡糖淀粉酶、哈茨木霉(T.harzianum)葡糖淀粉酶、长枝木霉(T.longibrachiatum)葡糖淀粉酶、棘孢木霉(T.asperellum)葡糖淀粉酶和短孢钩状木霉(T.strictipilis)葡糖淀粉酶。

其他预期用于本文的葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌(T.emersonii)(WO99/28448)、T.leycettanus（美国专利RE32,153）、T.duponti或嗜热踝节菌(T.thermophilus)（美国专利No.4,587,215）。预期的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。

合适的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，如与WO00/04136中公开的氨基酸序列具有约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%或甚至约90%同一性的葡糖淀粉酶。合适的葡糖淀粉酶还可包括来源于里氏木霉(T.reesei)的葡糖淀粉酶，如与WO08/045489中公开的氨基酸序列具有约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%或甚至约90%同一性的葡糖淀粉酶（丹尼斯克美国公司杰能科分公司(Danisco US Inc.,Genencor Division)）。具有改变的性质的里氏木霉(T.reesei)葡糖淀粉酶变体（如提交于2008年11月20日的WO08/045489和US2009/0275080中公开的那些（丹尼斯克美国

Claims

1.一种糖化含淀粉底物以制备发酵给料的方法，所述方法包括(a)在足以产生酶活性的条件下，使包含至少一些纤维素材料的液化淀粉浆料与葡糖淀粉酶和纤维素酶接触，以及(b)使所述酶有时间产生活性，从而生成发酵给料。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶活性足以至少：(a)提高所述发酵给料中至少一种可发酵糖的浓度；(b)释放至少一条结合到纤维素或所述纤维素捕获的淀粉链；或(c)水解所述纤维素材料的某些部分；其中，可相对于未接触纤维素酶的对照液化淀粉浆料测定(a)、(b)或(c)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的一种或多种，或它们的任意组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述纤维素酶包括至少外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或β-葡萄糖苷酶活性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶加入所述液化淀粉浆料的量介于约0.05kg/公吨至约50kg/公吨干固体之间。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述纤维素酶的添加量为约5kg/公吨干固体。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述液化淀粉浆料与一种或多种额外的选自脱支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶的酶接触。

8.根据权利要求1所述的方法，还包括发酵所述发酵给料以制备发酵产物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵产物为乙醇。

10.根据权利要求8所述的方法，其中与未添加所述纤维素酶的产率相比，所述发酵产物的产率提高约0.1至约1.0%。

11.根据权利要求10所述的方法，其中与未添加所述纤维素酶的产率相比，所述发酵产物的产率提高约0.3至约0.5%。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述接触和发酵步骤总共需要约24至72小时。

13.根据权利要求1所述的方法，其中淀粉来自玉米、小麦、大麦、高粱、裸麦、马铃薯或它们的任意组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述淀粉来自玉米。

15.根据权利要求8所述的方法，还包括使所述液化淀粉浆料与一种或多种选自脱支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶的酶接触。

16.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵与所述糖化同时进行。

17.一种组合物，所述组合物包含液化淀粉浆料、葡糖淀粉酶和纤维素酶。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述纤维素酶以介于约0.05kg/公吨至约50kg/公吨干固体的量存在。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中淀粉来自玉米、小麦、大麦、高粱、裸麦、马铃薯或它们的任意组合。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述淀粉来自玉米。

21.根据权利要求17所述的组合物，还包含一种或多种额外的选自脱支酶、果胶酶、β淀粉酶和植酸酶的酶。