CN102421911B - 以改良的液化方法发酵的乙醇产量 - Google Patents

Abstract

改善的液化方法，包括使用增加剂量的α-淀粉酶配和不超过99℃的液化温度，例如在约88-92℃的范围内。改善的液化方法有利的排除了常规的高温处理，例如在约95-125℃的温度下喷射蒸煮，使得淀粉可以更经济的加工成例如乙醇。在一个实施方案中，改善的液化方法使用可商购的α-淀粉酶获得了增加的乙醇产量。

Description

以改良的液化方法发酵的乙醇产量

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年5月12日提交的美国临时专利系列申请号61/177,428的权利，其全文通过整合到本文中作为参考。

发明领域

本文描述了液化淀粉生产发酵产物例如乙醇的方法。本公开文本还提供了生产乙醇的方法，包括根据本文所述的液化方法液化淀粉。

背景

将植物性淀粉，尤其是玉米淀粉转化为乙醇是快速发展中的工业。乙醇作为工业化学品、石油添加剂、或本身作为液体燃料，具有广泛的应用。乙醇作为燃料或燃料添加剂的使用显著的降低了空气排放，同时保持甚至改善了引擎性能。另一方面，乙醇是可再生的燃料，因此它的应用可以降低对有限的化石燃料来源的依赖性。此外，使用乙醇可以减少大气层中二氧化碳的积累。

从含淀粉的原材料中生产乙醇的典型方法包括2个连续的酶催化步骤，所述步骤导致葡萄糖的产生。然后使用酵母将葡萄糖发酵为乙醇。第一个步骤是由α-淀粉酶催化的淀粉液化。α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是内切水解酶，催化内部的α-1，4-D-糖苷键的随机切割。能够将粘稠的liquefact降解为麦芽糖糊精。随着α-淀粉酶降解淀粉，粘稠度随之减少。由于液化典型的在高温下进行，以破坏淀粉颗粒，因此通常使用热稳定的α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属的α-淀粉酶。酶促液化通常在多步骤方法中进行。在添加酶后，将浆料(slurry)加热至在约60-95℃之间的温度，典型的约78-88℃。之后，通过例如喷射蒸煮(jet-cooking)或其他方式加热浆料，通常至约95-125℃之间的温度，然后冷却至约60-95℃。添加更多的酶，将醪液(mash)在理想的温度下再保持约0.5-4小时，获得最终的水解反应，所述温度典型的约60-95℃。在另一种频繁使用的液化方法中，首先将补充了酶的浆料加热至在约60-95℃之间的温度，典型的约78-88℃。在该温度下液化醪液约0.5-4小时。之后，通过例如喷射蒸煮或其他方式加热醪液，通常至约95-125℃之间的温度，实现理想的水解。

以该方式生产的麦芽糖糊精一般不能被酵母发酵形成醇。因而需要第二类酶催化的糖化步骤来降解麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶和/或产麦芽糖的α-淀粉酶常用于催化在液化后形成的麦芽糖糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱枝酶例如支链淀粉酶，可用于帮助糖化。糖化作用典型的在升高温度的酸性条件下发生，例如约60℃，pH4.3。

用于生产各种产物的典型的糖化方法描述如下：

虽然已建立了酶促的淀粉液化方法，但仍需要进一步改良用于商业化的淀粉加工，尤其是乙醇生产。特别的是，对于改良淀粉转化为乙醇的效率和降低制造乙醇需要的总能量仍然存在现实的需求。液化作用典型的需要高温加热淀粉浆料，例如喷射蒸煮，来降解淀粉颗粒。除需要高能量外，高温液化导致产物之后不能发酵为理想的产物，例如乙醇，从而降低了潜在产量。特别的是，在高温处理过程中，由于Maillard反应导致丢失可发酵的糖，所述反应是在氨基酸和还原糖之间的化学反应，通常需要热量。在糖的反应性羧基和氨基酸的亲核氨基之间的反应形成多种难表征的分子，导致较低的可发酵糖产量。因此，提供在降低的温度下的液化方法将节省能量，使乙醇生产在经济和环境上更有益。

已通过修饰液化方法实现增加乙醇产量。参见例如：2007年6月21日公开的US2007/0141689；2007年8月9日公开的US2007/0184150；2007年1月10日公开的US2008/0009048；和2008年5月29日公开的US2008/0121227。修饰的液化方法包括：(1)首先在较低温度下实施α-淀粉酶处理，然后转移至较高温度下；(2)添加支链淀粉酶；(3)补充真菌的酸性α-淀粉酶，达到更高的DE值；和/或(4)更长的液化时间。然而这些修饰方法是复杂的，因为它们需要额外的调节液化方法，例如在多个温度之间变换，或调节pH值以适应各种酶。因此，需要更简便的但仍更有效或更经济的生产乙醇的液化方法。

发明概述

通过利用高于普通的α-淀粉酶剂量的改善的液化方法，有利的排除了高温液化步骤，与高温液化的整体加工时间匹配，并改善了乙醇生产的产量和整体经济。排除高温步骤还可以节省能量，使乙醇生产在经济和环境上更加有益。作为参考，当乙醇售价为$1.50/加仑时，对于5千万加仑年产量(MMgpy)的工厂，即使乙醇产量增加1％也将导致年收入增加$750,000。

改良的淀粉加工方法相应的包括在存在增加剂量的α-淀粉酶的条件下，在较低温度下液化淀粉。增加剂量的α-淀粉酶可以是在约85℃的温度下实施的液化方法中，90分钟内达到至少约10的DE值所需的α-淀粉酶的量的至少约1.7、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0倍。改善的液化方法可以在不超过99℃的温度下实施，例如在约70℃至约95℃、约80℃至约95℃、约85℃至约95℃，或任选的约88℃至约92℃的范围内。液化可以持续约30-300分钟，例如30-180分钟。在液化结束时，有剩余的α-淀粉酶活性，其可用于下游过程中。在液化淀粉后可存在至少约10％，例如约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的剩余α-淀粉酶活性。

该淀粉加工方法可以进一步包括将液化的淀粉糖化，和发酵糖化的淀粉生产乙醇。另一个方面，涵盖包括回收乙醇的方法。乙醇生产可进一步包括蒸馏乙醇。发酵和蒸馏可以是同时、分别或依次进行。

本公开内容的一个方面涵盖了更有效的从淀粉转化为乙醇。在乙醇生产结束时，100克酒糟(grain)副产物中存在的剩余淀粉比在约85℃的温度和在90分钟内DE值达到至少约10所需的α-淀粉酶剂量下液化淀粉的乙醇生产方法所剩余的淀粉低至少约10％、至少约20％或至少约30％。本公开内容的另一个方面涵盖了更高产量的生产乙醇。乙醇产量，例如每蒲式耳谷物的未变性的乙醇的加仑数可以比具有约85℃的温度和在90分钟内DE值达到至少约10所需的α-淀粉酶剂量下液化淀粉的乙醇生产方法高至少约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％或约3.0％。

另一个方面涵盖了适用于来自玉米、玉米杆、小麦、大麦、黑麦、高粱和马铃薯，及其任意的组合的淀粉的淀粉加工方法。典型的，淀粉来自玉米或玉米醪。

引用文献的整合

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用整合到本文中作为参考，其程度与具体和分别指出每种出版物和专利申请通过引用整合到本文中作为参考相同。

发明详述

改善的液化方法包括使用增加剂量的α-淀粉酶结合不超过99℃的液化温度。改善的液化方法有利的排除了喷射蒸煮或常规的高温处理，使得可以更有效和更经济的加工含有淀粉的原材料，例如成为乙醇。特别的是，改善的液化方法需要比常规方法更短的时间，使得存在剩余的α-淀粉酶可进入发酵程序。在一个实施方案中，改善的液化方法导致使用可商购的α-淀粉酶的乙醇产量的增加。

1、定义和缩写

1.1、定义

如本文中使用的，“淀粉”指包括植物的复杂多糖碳水化合物的任何材料，包括通式为(C₆H₁₀O₅)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数。特别的是，术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷类、草、块茎和根，尤其是小麦、大麦、玉米、黑麦、燕麦、高粱(sorgum)、西非高粱(milo)、稻、高粱(sorghum)、麸皮、木薯(cassava)、黍、马铃薯、甜薯和木薯(tapioca)。

“α-淀粉酶”(例如E.C.3.2.1.1)一般指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这类酶也被描述为作用于含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中的1，4-α-D-糖苷键的外切或内切水解的酶。出于本公开内容的目的，“α-淀粉酶”指具有相对高的热稳定性的酶，即，在较高温度(例如80℃以上)下具有持续的活性。因此，α-淀粉酶能够液化淀粉，所述液化是在80℃以上的温度下实施的。

“α-淀粉酶单位”(AAU)指根据美国专利号5,958,739公开的方法所测量的α-淀粉酶活性，其通过引用整合到本文中。简而言之，测定使用对硝基苯基麦芽庚糖苷(PNP-G₇)作为底物，具有被化学封闭的非还原端糖。PNP-G₇可以被内切淀粉酶切割，例如α-淀粉酶。在切割后，α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶消化底物释放出游离的PNP分子，该分子表现出黄色，可以通过410nm的可见光谱测量。释放PNP的速率与α-淀粉酶活性成比例。相对于标准对照计算给定样品的AAU。一单位AAU指在具体条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶量。

如本文中使用的，“剩余的α-淀粉酶活性”指在完成液化步骤后，保留酶促活性的初始α-淀粉酶的部分，例如10％或更多。

术语“重组”当用于指代细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体被导入的异源核酸或蛋白质，或者被天然核酸或蛋白质的改变所修饰，或者所述细胞源自上述修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不可见的基因，或者表达否则是异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换的使用。

本文中氨基酸残基使用常规的一字母或三字母编码。

“信号序列”意指结合在蛋白质N端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形态的蛋白质分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性的。成熟形态的胞外蛋白质缺少在分泌过程中被切去的信号序列。

“基因”指在生产多肽中涉及的DNA片段，包括在编码区前后的区域，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“核酸”涵盖了单链或双链的DNA、RNA及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换的使用。

“载体”指设计用于将核酸导入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列，其中载体的元件是有效连接的。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”在本文中意指包含与合适的控制序列有效连接的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够使得DNA在合适宿主中有效地表达。此类控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

“启动子”是涉及结合RNA聚合酶来起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

“处于转录调控”是本领域普遍理解的术语，表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录取决于它与这样的元件有效连接，所述元件负责起始或促进转录。

“处于翻译调控”是本领域普遍理解的术语，表示在已形成mRNA后发生的调控过程。

如本文中使用的，当描述蛋白质及其编码基因时，基因的术语是用斜体表示的(例如，编码amyL(地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)AA)的基因可表示为)。蛋白质的术语一般不是用斜体表示的，且首字母一般为大写(例如，由基因编码的蛋白质可表示为AmyL或amyL)。

术语“源自”涵盖了术语“来源自”、“获得”或“获得自”和“分离自”。

术语“有效连接”指这样的相邻关系，其中元件处于允许它们功能性相关的排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与编码序列是有效连接的。

术语“选择性标志物”指能够在宿主中表达的基因，所述基因允许方便的选择含有导入的核酸或载体的那些宿主。选择性标志物的实例包括但不限于抗菌剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或产生代谢优势的基因，例如宿主细胞的营养优势。

与另一种序列具有特定百分比(例如，约80％、约85％、约90％、约95％或约99％)序列同一性的多核苷酸或多肽意指比对时，在比较的两条序列中相同的碱基或氨基酸残基的百分比。可以使用任何本领域已知的合适软件，来确定该比对和百分比同一性，例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人编著，1987，Supplement30，第7.7.18节中描述的。代表性的程序包括VectorNTIAdvance^TM9.0(InvitrogenCorp.Carlsbad，CA)、GCGPileup、FASTA(Pearson等人(1988)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85：2444-2448)和BLAST(BLASTManual，Altschul等人，Nat’lCent.Biotechnol.Inf.，Nat’lLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，Md.和Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25：3389-3402)程序。另一种典型的比对程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，PA)，一般使用默认的参数。可使用的另一种序列软件程序是可获得自SequenceSoftwarePackage6.0版(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)的TFASTADataSearchingProgram。

术语“亲代”或“亲代序列”指宿主细胞中天然的或天然存在的序列。亲代序列包括但不限于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶LAT(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804的SEQIDNO：4)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,886的SEQIDNO：1)的序列；两者都通过引用整合到本文中。

当最优比对进行比较时，“变体”可与多肽序列具有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或至少约99.5％序列同一性。

如本文中使用的，在多肽的上下文中，术语“特性”或其语法等价体指多肽的可以选择或检测的任何特征或因素。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、K_M、k_CAT、k_CAT/K_M比、蛋白质折叠、结合底物的能力和分泌的能力。

“热稳定的”或“热稳定性”意指在暴露于升高的温度之后酶保留活性。α-淀粉酶的热稳定性是通过其半衰期(t_1/2)评估的，其是在给定温度丢失一半的酶活性。通过确定在给定温度下随时间剩余的酶的具体α-淀粉酶活性，来测量半衰期，特别是在用于具体应用的温度下，例如液化。

“宿主菌株”或“宿主细胞”意指表达载体或DNA构建体的合适宿主，所述载体或构建体包含编码根据本公开内容的变体α-淀粉酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株典型的是细菌细胞。在典型的实施方案中，“宿主细胞”意指细胞和从微生物菌株的细胞产生的原生质体，特别是芽孢杆菌属物种。

术语“培养”指在液体或固体培养基中，在合适的条件下生长微生物细胞群体。在一个实施方案中，培养指将含颗粒淀粉的淀粉底物发酵性生物转化为终产物(典型的在容器或反应罐中)。发酵是微生物对有机底物的酶促和厌氧的降解，生产更简单的有机化合物。虽然发酵发生在厌氧条件下，但它并非意所述术语单纯限于严格的厌氧条件，因为发酵也可以发生在存在氧的条件下。

术语“接触”指将相应的酶置于与相应底物充分靠近，使酶能够将底物转化为终产物。本领域技术人员将认识到将酶溶液与相应底物混合可以产生接触。

术语“酶促转化”一般指通过酶作用对底物的修饰。术语在本文中也指通过酶作用对淀粉底物的修饰。

如本文中使用的，“糖化”指淀粉酶促转化为葡萄糖。

“糊化”意指通过蒸煮将淀粉分子溶解而形成粘性的悬浮液。

“液化”指淀粉转化中的阶段，其中糊化的淀粉被水解而产生低分子量的可溶性糊精。

术语“聚合度(DP)”指给定糖类中的无水吡喃葡萄糖单位的数目。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。

术语“终产物”或“理想的终产物”指任何从淀粉底物酶促转化来的碳源来源的分子产物。

如本文中使用的，术语“干燥固体含量(ds)”指基于干重以％计的浆料中的总固体。

术语“浆料”指含有不可溶性固体的含水混合物。

术语“剩余的淀粉”指发酵后的酒糟副产物中存在的淀粉的量。典型的，在100克含有可溶物的干酒糟(DDGS)中存在的剩余淀粉的量可以是评估乙醇生产方法中淀粉利用效率的一个参数。

如本文中使用的，“循环步骤”指醪液组分的再循环用于发酵包含淀粉的底物，所述组分可以包括剩余的淀粉、酶和/或微生物。

术语“醪液”指可发酵的碳源(碳水化合物)在水中的混合物，用于生产发酵产物，例如乙醇。在一些实施方案中，术语“啤酒”和“醪液”可互换的使用的。

术语“发酵槽液”意指未发酵的固体和水的混合物，是从发酵的醪液中去除醇类后的剩余物。

术语“干酒糟(DDG)”和“含有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷粒发酵的有用的副产物。

如本文中使用的，“产乙醇(ethanologenic)微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。凭借它们表达一种或多种单独或共同将糖转化为乙醇的酶的能力，产乙醇微生物是产乙醇的。

如本文中使用的，“乙醇生产者”或“生产乙醇的微生物”指能够从己糖或戊糖生产乙醇的任何生物或细胞。一般而言，生产乙醇的细胞含有乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。生产乙醇的微生物的实例包括真菌微生物，例如酵母。在乙醇生产中使用的典型的酵母包括酵母属的物种和菌株，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)。

术语“异源的”涉及多核苷酸或蛋白质时指在宿主细胞中非天然存在的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。术语意在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。

术语“内源的”涉及多核苷酸或蛋白质时指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。

术语“回收”、“分离”和“分隔”在本文中指去除了与其天然相关的至少一种组分的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文中使用的，“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”当用于指代细胞时意指所述细胞具有非天然的(例如，异源的)核酸序列，所述核酸序列整合到其基因组中，或作为附加体质粒维持多个世代。

如本文中使用的，“表达”指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。

术语“导入”在将核酸序列插入到细胞中的上下文中，意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括了指代将核酸序列整合到真核或原核细胞中，其中所述核酸序列可以整合到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

如本文中使用的，“比活”意指如下定义的酶单位，即在具体条件下，通过酶制品在单位时间被转化为产物的底物摩尔数。比活表述为单位(U)/mg蛋白质。

术语“产量”当指代乙醇产量时，指从起始材料(例如玉米)生产乙醇的相对效率。在一个实施方案中，乙醇产量计算为“galUD/蒲式耳玉米”，反映了每蒲式耳玉米生产的未变性的乙醇加仑数。一蒲式耳玉米重约56磅。

“ATCC”指位于Manassas，Va.20108的美国典型培养物收藏中心(ATCC)。

“NRRL”指美国农业研究菌种保藏中心，是美国农业利用研究的国立中心(之前称为USDA北部地区研究实验室)，Peoria，Ill。

“一个”和“这个”包括复数指代，除非上下文中明确的指出。

如本文中使用的，“包含”及其同源词使用其囊括性的含义；即，等价于术语“包括”及其相应的同源词。

1.2缩写

除非另外指出，否则使用下列缩写：

AAα-淀粉酶

AAUα-淀粉酶单位

AGU葡糖淀粉酶活性单位

AOSα-烯烃磺酸酯

AS醇硫酸盐

BAA细菌的α-淀粉酶

cDNA互补DNA

CMC羧甲基纤维素

DDG干酒糟

DDGS含有可溶物的干酒糟

DE糖化率(DextroseEquivalent)

DNA脱氧核糖核酸

DNS3，5-二硝基水杨酸

DP3具有3个亚单元的聚合度

DPn具有n个亚单元的聚合度

DS，ds干燥固体含量

DSC差示扫描量热法

DTMPA二乙三胺五乙酸

EC酶分类的酶学联合会

EDTA乙二胺四乙酸

EDTMPA乙二胺四甲叉膦酸(ethylenediaminetetramethylenephosphonicacid)

EO环氧乙烷

F&HC纺织物和家居护理

g克

gal加仑

HFCS高果糖玉米糖浆

HFSS高果糖淀粉糖浆

IPTG异丙基β-D-硫代半乳糖苷

LAS线性烷基苯磺酸

LU脂肪酶单位

MES2-(N-吗啉代)乙磺酸

MMgpy百万加仑每年

MW分子量

nm纳米

NOBS壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA氨三乙酸

PCR聚合酶链式反应

PEG聚乙二醇

pI等电点

PNP-G₇对硝基苯基麦芽庚糖苷(p-nitrophenylmaltoheptoside)

ppm百万分之一

PVA聚乙烯醇

PVP聚乙烯吡咯烷酮

RAU参照淀粉酶单位

RMS均方根

RNA核糖核酸

rpm每分钟转速

SAS仲烷基磺酸盐

1×SSC0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0

SSF同步糖化和发酵

TAED四乙酰乙二胺

TNBS三硝基苯磺酸

w/v重量/体积

w/w重量/重量

wt野生型

UD未变性的

μL微升

2、从淀粉生产乙醇

一般而言，从淀粉生产醇类(乙醇)可分为四个步骤：研磨、液化、糖化和发酵。

2.1原材料

在本公开内容的淀粉加工中，特别是在本公开内容的乙醇加工中，起始的原材料典型的是完整的谷粒或者至少主要是完整的谷粒。原材料可以选自多种含淀粉的完整谷粒作物，包括玉米、西非高粱、马铃薯、木薯、高粱、小麦和大麦。在一个实施方案中，含淀粉的原材料是完整的谷粒，选自玉米、西非高粱、马铃薯、木薯、高粱、小麦和大麦，或其任意组合。在典型的实施方案中，含淀粉的原材料是完整的谷粒，选自玉米、小麦和大麦，或其任意组合。

2.2研蘑

为了开放结构并允许进一步加工，研磨谷粒。三种常用的工艺是湿磨法、干磨法和各种分级方案(fractionationscheme)。在干磨法中，研磨完整的籽粒(kernel)并用于工艺的后续步骤中。另一方面，湿磨法产生非常良好的分离的胚芽(germ)和粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，并且，除少数例外外，在平行进行糖浆生产时使用这种方法。各种分级方案作为湿磨或干磨工艺的变体，涉及各种组分不同程度的分离。大部分乙醇来自干磨法。可选的，待加工的淀粉可以是高度精细的淀粉质量，例如至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99.5％纯。

2.3糊化和液化

如本文中使用的，术语“液化”或“使......液化”意指将淀粉转化为较不粘稠和较短链糊精的过程。该过程涉及淀粉的糊化，同时伴随或者之后再添加α-淀粉酶。

在一些实施方案中，用水搅拌如上所述制备的淀粉底物。淀粉浆料可含有干燥固体重量百分比为约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％或约30-35％的淀粉。为了优化α-淀粉酶稳定性和活性，可以调节浆料的pH。

在一个方面，可以使用比常规液化工艺一般要求的剂量更高剂量的α-淀粉酶。用于改善的液化的α-淀粉酶剂量可以是在约85℃的温度下实施的液化工艺中充分降低醪液粘稠度所需剂量的至少约1.7倍、约2.0倍、约2.5倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.0倍、约4.5倍、约5.0倍、约5.5倍、约6.0倍、约6.5倍、约7.0倍、约7.5倍、约8.0倍、约8.5倍、约9.0倍、约9.5倍或约10.0倍。典型的，α-淀粉酶剂量范围在2-10AAU/gds内，足以降低醪液的粘稠度，即，在约85℃的温度下实施的液化方法中，在90分钟内达到至少约10的DE值。用于液化工艺中的代表性的α-淀粉酶包括GC358和XTRA(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)，以及SC和SCDS(NovozymesA/S，Denmark)。可选的，可用于所述工艺中的α-淀粉酶产品包括但不限于FRED、HPA、MaxaliqTMONE(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)和LF(VereniumCorp.)。也可以使用任意上述酶产品的混合物。

淀粉醪液在本文中在低于约99℃的温度下液化，例如，在约70℃至约95℃、约80℃至约95℃、约85℃至约95℃，或任选的约88℃至约92℃的范围内。液化可以持续约30-300分钟，例如30-180分钟。在本文公开的方法中，有目的的排除了常规的高温处理(例如，喷射蒸煮)，其典型的在约100-125℃之间的温度下实施。排除高温处理导致在液化后存在剩余的α-淀粉酶活性。所述剩余的α-淀粉酶活性可以是至少10％或至少约15％。

2.4糖化

在液化后，通过糖化进一步水解醪液，产生可以被酵母方便的代谢的低分子糖(DP1-2)。在糖化过程中，一般通过葡糖淀粉酶的存在酶促的实现水解。典型的，除葡糖淀粉酶外，还可以补充α-葡萄糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。

完整的糖化步骤可以典型的持续约72小时。在一些实施方案中，糖化步骤和发酵步骤是组合的，该工艺被称为同步糖化和发酵(SSF)或同步糖化、酵母增殖和发酵。在一些实施方案中，在液化步骤和糖化步骤之间可以包括1-4小时的前糖化步骤。

2.5发酵

用于发酵的微生物取决于所需的终产物。典型的，如果乙醇是需要的终产物，则酵母可用作发酵生物。在一些实施方案中，生产乙醇的微生物是酵母，具体的是酵母属，例如酿酒酵母的菌株(美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母是可商购的，包括但不限于EthanolRed^TM(Fermentis)、和Superstart^TM(LallemandEthanolTechnology)、FALI(Fleischmann’sYeast)、(DSMSpecialties)、XR(NACB)和Angel醇酵母(AngelYeastCompany，China)。用于方法中的起始酵母的量是在适当量的时间中，有效产生商业显著量的乙醇的量(例如，在少于72小时内，从具有25-40％ds的底物中生产至少10％乙醇的量)。可提供的酵母细胞的量是约10⁴至10¹²，典型的约10⁷至10¹⁰活酵母计数/ml发酵液。除发酵微生物(例如，酵母)外，发酵还可包括营养物，任选其他的酶，包括但不限于植酸酶。酵母在发酵中的用途是普遍已知的。参见例如，TheAlcoholTextbook，K.A.Jacques等人编著，2003，NottinghamUniversityPress，UK。

如本文所述的改善的液化方法可导致改善的乙醇产量。改善的乙醇产量比这样的乙醇生产工艺的产量高约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％或约3.0％，所述乙醇生产工艺是在约85℃的温度下和在90分钟内达到至少约10的DE值所需的α-淀粉酶剂量下使淀粉液化。乙醇产量可以表述为“galUD/蒲式耳玉米”，反映了每蒲式耳玉米生产的未变性乙醇的加仑。现代技术典型的允许乙醇产量在约2.5至约2.8galUD/蒲式耳玉米。参见Bothast&Schlicher，“BiotechnologicalProcessesforConversionofCornintoEthanol，”Appl.Microbiol.Biotechnol.67：19-25(2005)。改善的乙醇生产效率可以归因于在本文所述的淀粉工艺中更有效的淀粉利用。在乙醇生产结束时，100克酒糟副产物中存在的剩余淀粉比这样的乙醇生产工艺的剩余淀粉低至少约10％、约20％或约30％，所述乙醇生产工艺是在约85℃的温度下和在90分钟内达到至少约10的DE值所需的α-淀粉酶剂量下使淀粉液化。

在其他实施方案中，通过使用本领域已知的恰当的发酵微生物，发酵终产物可包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体而言，当乳酸是理想的终产物时，可使用乳杆菌(干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei))；当甘油或1，3-丙二醇是理想的终产物时，可使用E.coli；当2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是理想的终产物时，可使用柠檬泛菌(Pantoeacitrea)作为发酵微生物。上文列举的名单仅是示例，本领域技术人员可理解多种发酵微生物都可恰当的用于获得理想的终产物。

标准的分批系统的适当变体是“分批补料式”系统。在该经典分批系统的变体中，随着发酵进程递增的添加底物。当分解代谢物阻抑可能抑制细胞代谢且需要培养基中具有有限量底物时，分批补料式系统是有效的。测量分批补料式系统中的实际底物浓度是困难的，因此基于可测量因子的改变进行估算，例如pH、溶解氧和废气分压，例如CO₂。分批和分批补料式发酵是本领域常见和普遍已知的。

连续发酵是开放式系统，其中向发酵罐中连续添加限定的发酵培养基，同时移除等量的条件培养基用于加工。连续发酵一般维持培养物在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许调节一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因子。例如，在一个实施方案中，以固定的速率维持有限的营养物，例如碳源或氮源，而允许调节所有其他的参数。在其他系统中，可以连续改变影响生长的多种因子，同时保持由基质浑浊度测量的细胞浓度恒定。连续系统争取维持稳态的生长条件。因而，由于移去基质导致的细胞丢失应该与发酵中的细胞生长速率平衡。调节连续发酵工艺的营养物和生长因子的方法，以及使产物形成速率最大化的技术，是工业微生物学领域普遍已知的。

2.6蒸馏

任选的，在发酵后，可以通过例如蒸馏提取乙醇，和任选的后续一个或多个加工步骤。在一些实施方案中，本方法生产的乙醇产量是至少约8％、至少约10％、至少约12％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％和至少约23％v/v。根据本公开内容的工艺获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮料乙醇(即，可饮用的中性酒精)或工业乙醇。

2.7副产物

发酵的酒糟副产物典型的以液体形式或干燥形式用于动物饲料。如果淀粉是湿磨的，则非淀粉副产物包括粗制蛋白质、油和纤维，例如玉米谷朊(cornglutenmeal)。如果淀粉是干磨的，则副产物可包括动物饲料副产品，例如干酒糟(DDG)和含有可溶固形物的干酒糟(DDGS)。然而，当谷粒是干磨的，并在液化和糖化之前与浆料混合时，则不遗留酒糟作为副产物。

3、在淀粉的乙醇生产中涉及的酶

3.1α-淀粉酶

如本公开内容所述的α-淀粉酶是表现出相对高的热稳定性因而能够在80℃以上的温度下液化淀粉的酶。适合液化过程的α-淀粉酶可以来自真菌或细菌来源，特别是从嗜热细菌分离的α-淀粉酶，例如芽孢杆菌。这类芽孢杆菌α-淀粉酶通常称为“Termamyl样α-淀粉酶”。普遍已知的Termamyl样α-淀粉酶包括从地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(原称为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)中分离的。其他的Termamyl样α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513和DSM9375的，都详细描述在WO95/26397中，并通过引用整合到本文中。考虑的α-淀粉酶还可以源自曲霉物种，例如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)的α-淀粉酶。此外，可商购的α-淀粉酶和含有α-淀粉酶的产品包括TERMAMYL^TMSC、FUNGAMYL^TM、SC和SANTMSUPER(NovozymesA/S，Denmark)、和XTRA、GC358、FRED、FRED-L和HPA(DaniscoUSInc，GenencorDivision)。

在一个方面，α-淀粉酶可以是野生型的亲代酶。在另一个方面，α-淀粉酶可以是亲代酶的变体。在另一个方面，变体α-淀粉酶可以与Termamyl样α-淀粉酶具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性。在另一个方面，变体α-淀粉酶可以与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶LAT(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804的SEQIDNO：4)或嗜热脂肪地芽孢杆菌AmySα-淀粉酶(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,886的SEQIDNO：1)具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性，两者都通过引用整合到本文中。考虑的变体描述在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中，并包括嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶变体——α-淀粉酶TTC，相比WO99/19467中公开的SEQIDNO：3所述野生型α-淀粉酶具有突变Δ(181-182)+N193F，并通过引用整合到本文中。

在一些实施方案中，相比亲代酶，变体α-淀粉酶可表现出一种或多种改变的特性。改变的特性可以有利的使变体α-淀粉酶能够在液化中有效的执行功能。相似的，改变的特性可以导致变体相比其亲代改善的性能。这些特性可以包括底物特异性、底物结合、底物切割模式、热稳定性、pH/活性谱、pH/稳定性谱、氧化稳定性、较低水平的钙离子(Ca²⁺)下的稳定性，和/或比活。可用于本公开内容中的代表性α-淀粉酶变体包括但不限于在2008年9月11日中公开的US2008/0220476；2008年7月3日中公开的US2008/0160573；2008年6月26日中公开的US2008/0153733；2008年4月10日中公开的US2008/0083406；2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804；2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,886中描述的，其都通过引用整合到本文中。

在另一个方面，液化可以涉及使用至少2种α-淀粉酶的混合物，每种都可以表现出不同的特性。混合物可以进一步包括植酸酶。

可以根据美国专利号5,958,739中公开的方法稍加改动而确定α-淀粉酶活性。简而言之，测定使用对硝基苯基麦芽庚糖苷(PNP-G₇)作为底物，具有被化学封闭的非还原端糖。PNP-G₇可以被内切淀粉酶切割，例如α-淀粉酶。在切割后，α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶消化底物释放出游离的PNP分子，该分子表现出黄色，可以通过410nm的可见光谱测量。释放PNP的速率与α-淀粉酶活性成比例。相对于标准对照计算给定样品的α-淀粉酶活性。

一些用于向基因中导入突变的方法是本领域已知的。编码亲代α-淀粉酶的DNA序列可以使用本领域普遍已知的各种方法自生产所讨论的α-淀粉酶的任何细胞或微生物分离。首先，应该使用来自生产所研究的α-淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成同源、标记的寡核苷酸探针，用于从所讨论的生物体制备的基因组文库中鉴别编码α-淀粉酶的克隆。可选的，含有与已知的α-淀粉酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针可用作探针，来鉴别编码α-淀粉酶的克隆，使用低严谨度的杂交和洗涤条件。

鉴别编码α-淀粉酶的克隆的另一种方法涉及将基因组DNA片段插入到表达载体(例如质粒)中，用获得的基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性的细菌，然后将转化的细菌涂板到含有α-淀粉酶底物的琼脂上，从而允许鉴别表达α-淀粉酶的克隆。

可选的，可以通过已建立的标准方法合成制备编码酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，TetrahedronLetters22：1859-1869(1981)描述的磷酰胺法，或Matthes等人，EMBOJ.3：801-895(1984)描述的方法。在磷酰胺方法中，在例如自动化DNA合成仪中合成寡核苷酸、纯化、退火、连接并克隆到恰当的载体中。

最后，根据标准技术，DNA序列可以是混合的基因组和合成起源的、混合的合成和cDNA起源的或混合的基因组和cDNA起源的，通过连接合成的、基因组的或cDNA起源的片段而制备的(恰当时，片段对应于完整DNA序列的各个部分)。还可以使用特定的引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如在美国专利号4,683,202或R.K.Saiki等人，Science239：487-491(1988)中描述的。

一旦分离了编码α-淀粉酶的DNA序列，并鉴别出突变的理想位点，则可以使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有位于理想的突变位点两侧的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的过程中插入变体核苷酸。在具体的方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中创造连接编码α-淀粉酶的序列的DNA单链缺口。然后，将携带理想突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。之后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填满剩余的缺口，并用T4DNA连接酶连接构建体。该方法的具体实例描述在Morinaga等人，Biotechnology2：636-639(1984)中。美国专利号4,760,025公开了通过实施盒的最小改变，导入编码多个突变的寡核苷酸。因为可以导入各种长度的多数的寡核苷酸，因此通过Morinaga方法可以在任一次导入更大量的突变。

另一种向编码α-淀粉酶的DNA序列中导入突变的方法描述在Nelson和Long，AnalyticalBiochem.180：147-151(1989)中。涉及在PCR反应中使用化学合成的DNA链作为一条引物，3步产生含有理想突变的PCR片段。从PCR产生的片段中，可以通过限制性内切核酸酶切割，分离携带突变的DNA片段，并重新插入到表达质粒中。

提供本公开内容的变体的备选方法包括基因穿梭，例如WO95/22625(AffymaxTechnologiesN.V.)或WO96/00343(NovoNordiskA/S)中描述的，或其它获得包含理想突变(例如取代和/或缺失)的杂交酶的相应技术。

可以使用表达载体，以酶的形式表达编码野生型α-淀粉酶或通过上述方法或本领域已知的任何备选方法所生产的变体的DNA序列，所述表达载体典型的包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的抑制基因或各种激活子基因的控制序列。

携带编码野生型α-淀粉酶或变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体，只要其便于进行重组DNA操作。载体的选择通常取决于所导入的宿主细胞。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微小染色体或人工染色体。可选的，载体可以是这样的载体，其导入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞基因组中，并与所整合的染色体一起复制。

在载体中，DNA序列应该与合适的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在选定的宿主细胞中表现出转录活性的DNA序列，可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指导编码本公开内容的α-淀粉酶变体的DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中转录的合适启动子的实例是E.coli的lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪地芽孢杆菌的产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了指导在真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖异构酶和构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶基因的启动子。

表达载体还可以包括合适的转录终止子，在真核细胞中，包含与编码本公开内容的α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的多聚腺苷酸序列。终止子和多聚腺苷酸序列可合适的源自与启动子相同的来源。

载体可以进一步包括使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可以包括可选择标志物，例如产物弥补宿主细胞缺陷的基因，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或产生抗生素抗性的基因，例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。此外，载体可以包括曲霉选择标志物，例如amdS、argB、niaD和sC，产生潮霉素抗性的标志物，或可以通过共转化实现的选择，例如WO91/17243中所述。

虽然在一些方面细胞内表达是有利的，例如使用某些细菌作为宿主细胞，但是一般有利的表达是细胞外的。一般而言，本文提及的芽孢杆菌α-淀粉酶包括允许表达的蛋白酶分泌到培养基中的前区(pre-region)。需要时，可以用不同的前区或信号序列替代该前区，常规通过取代编码相应的前区的DNA序列实现。

用于分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的程序，和将其插入到含有复制必需信息的合适载体中的程序，是本领域技术人员普遍已知的(参见例如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor，1989)。

有利的将包括上述DNA构建体或表达载体的本公开内容的细胞用作重组生产本公开内容的α-淀粉酶变体的宿主细胞。方便的通过将DNA构建体(一份或多份拷贝)整合到宿主染色体中，可以用编码变体的DNA构建体转化细胞。所述整合一般被认为是有利的，因为DNA序列更能够稳定的维持在细胞中。可以根据常规方法，例如同源或异源重组，实施将DNA构建体整合到宿主染色体中。可选的，可以用上述与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

本公开内容的细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫，但典型的是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。合适的细菌的实例是革兰氏阳性菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性菌，例如E.coli。可以通过例如原生质体转化或以本身已知的方式使用感受态细胞，产生细菌的转化。

酵母生物体可有利的选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。丝状真菌可有利的属于曲霉，例如米曲霉或黑曲霉。可以通过涉及原生质体形成和原生质体转化，之后以本身已知的方式再生细胞壁的方法，转化真菌细胞。转化曲霉宿主细胞的合适程序描述在EP238023中。

可以通过在有利于生产所述变体的条件下，培养如上所述的宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收所述变体，进一步生产α-淀粉酶变体。用于培养所述细胞的基质可以是任何适合生长所讨论的宿主细胞和获得α-淀粉酶变体表达的常规基质。合适的基质可获得自商业供应商，或者可根据公开的配方制备(例如，如美国典型培养物收藏中心的目录所述)。可以通过普遍已知的程序，从培养基中方便的回收宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体。例如，在通过离心或过滤将细胞与培养基分离后，通过使用盐类(例如硫酸铵)沉淀，移出培养基的蛋白质组分。通过使用层析程序进一步纯化α-淀粉酶或其变体，例如离子交换层析、亲和层析等。

3.2葡糖淀粉酶

考虑用于淀粉加工中，尤其是糖化作用过程中的另一种酶是葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。葡糖淀粉酶通常源自微生物或植物。例如葡糖淀粉酶可以是真菌或细菌来源的。

示例性的真菌葡糖淀粉酶是曲霉的葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人，(1984)，EMBOJ.3(5)：1097-1102)或其变体，例如在WO92/00381和WO00/04136中公开的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)，或其变体或片段。其他考虑的曲霉葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人，(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人，(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人，(1994)，Biochem.J.301：275-281)；二硫键A246C(Fierobe等人，(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；和在位置A435和S436导入Pro残基(Li等人，(1997)ProteinEng.10：1199-1204)。

示例性的真菌葡糖淀粉酶还包括里氏木霉(Trichodermareesei)葡糖淀粉酶及其同源物，如美国专利号7,413,879(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)中公开的。这类葡糖淀粉酶包括里氏木霉葡糖淀粉酶(SEQIDNO：4)、柠檬肉座菌美国变种(Hypocreacitrinavar.americana)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：6)、酒红肉座菌(Hypocreavinosa)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：8)、木霉属葡糖淀粉酶(SEQIDNO：10)、胶质肉座菌(Hypocreagelatinosa)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：12)、(Hypocreaorientalis)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：14)、康氏木霉(Trichodermakonilangbra)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：16)、木霉属葡糖淀粉酶(SEQIDNO：29)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：31)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：33)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：35)和严紧木霉(Trichodermastrictipilis)葡糖淀粉酶(SEQIDNO：37)。

其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(T.emersonii)(WO99/28448)、T.leycettanus(美国专利号RE32,153)、T.duponti或嗜热篮状菌(T.thermophilus)(美国专利号4,587,215)的。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属的葡糖淀粉酶，特别是热溶淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的。

合适的葡糖淀粉酶包括源自米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO00/04136的SEQIDNO：2所示氨基酸序列具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或者甚至约90％同一性的葡糖淀粉酶。合适的葡糖淀粉酶还可以包括源自里氏木霉的葡糖淀粉酶，例如与WO08/045489(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)的SEQIDNO：1或3所示氨基酸序列具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或者甚至约90％同一性的葡糖淀粉酶。具有改变的特性的里氏木霉葡糖淀粉酶变体，例如在2008年11月20日提交的WO08/045489和U.S.S.N.12/292,563(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)中公开的，是特别有效的。

还合适的是商业化葡糖淀粉酶，例如Fuel、Plus和Ultra(NovozymesA/S，Denmark)、480、480Ethanol、GC147、和(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)。添加的葡糖淀粉酶的量是约0.02-2.0AGU/gds或约0.1-1.0AGU/gds，例如约0.2AGU/gds。

3.3植酸酶

由于植酸酶能够在定义的孵育和液化步骤条件下水解植酸，因此植酸酶可用于本公开内容。在一些实施方案中，植酸酶能够从六磷酸肌醇(植酸)中释放至少一个无机磷。植酸酶可以根据它们对植酸分子中开始水解的磷脂基团的具体位置的偏爱性分类(例如，3-植酸酶(EC3.1.3.8)或6-植酸酶(EC3.1.3.26))。典型的植酸酶实例是六磷酸肌醇-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。

植酸酶可获得自微生物，例如真菌和/或细菌生物。一些这类微生物包括例如曲霉(例如，黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、A.ficum和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、篮状菌(嗜热篮状菌)、木霉(里氏木霉)和嗜热真菌(Thermomyces)(WO99/49740)。植酸酶还可获得自青霉物种，例如大麦青霉(P.hordei)(ATCCNo.22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCCNo.10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCCNo.48944)。参见例如美国专利号6,475,762。此外，植酸酶可获得自芽孢杆菌(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌(Pseudomonas)、隔孢伏革菌(Peniophora)、E.coli、柠檬酸细菌(Citrobacter)、肠细菌(Enterbacter)和布丘氏菌(Buttiauxella)(参见WO2006/043178))。

可获得的商业植酸酶例如NATUPHOS(BASF)、RONOZYMEP(NovozymesA/S)、PHZYME(DaniscoA/S，Diversa)和FINASE(ABEnzymes)。Maxaliq^TMONE(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)混合物含有能够有效降低liquefact的粘稠度和降解植酸的热稳定植酸酶。确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义公开在Engelen等人，(1994)J.ofAOACInt.，77：760-764中。植酸酶可以是野生型植酸酶、其变体或其片段。

在一个实施方案中，植酸酶是源自布丘氏菌(Buttiauxiella)的细菌的。布丘氏菌包括B.agrestis、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。布丘氏菌的菌株可获得自DSMZ，德国生物材料国家资源中心(Inhoffenstrabe7B，38124Braunschweig，Germany)。储藏于登录号NCIMB41248的布丘氏菌属(Buttiauxellasp.)菌株P1-29是从中获得植酸酶并根据本公开内容使用的特别有效的菌株的实例。在一些实施方案中，植酸酶是BP野生型，公开在WO06/043178中的变体(例如BP-11)，或者公开在2008年9月11日公开的US2008/0220498中的变体。例如，BP野生型及其变体公开在WO06/043178的表1中，其中编号是参照公开的PCT申请的SEQIDNO：3。

3.4其他酶

另一方面考虑的是额外使用β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外切的产麦芽糖淀粉酶，催化1，4-α-糖苷键水解为淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。已从多种植物和微生物中分离出β-淀粉酶(Fogarty等人，ProgressinIndustrialMicrobiology，第15卷，第112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征是具有最佳温度在从约40℃至约65℃的范围内，和最佳pH在从约4.5至约7.0的范围内。考虑的β-淀粉酶包括但不限于大麦的β-淀粉酶BBA1500、DBA、Optimalt^TMME、Optimalt^TMBBA(DaniscoUSInc，GenencorDivision)和Novozym^TMWBA(NovozymesA/S)。

另一种可任选添加的酶是脱枝酶，例如异淀粉酶(EC3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉(amylopectin)和β-有限糊精中的α-1，6-D-分枝糖苷键，其区别于支链淀粉酶在于异淀粉酶不能攻击普鲁兰糖(pullulan)，以及异淀粉酶对α-有限糊精的有限作用。脱枝酶可以添加本领域技术人员普遍已知的有效量。

实施例

下列实施例并非意在限制，而是使用所公开方法的示例性手段。

实施例1——比较乙醇生产

使用(1)常规液化方法，包括高温喷射蒸煮，和(2)修饰的液化方法，排除了高温处理并增加了α-淀粉酶剂量，来实施从原材料生产乙醇。在常规的液化方法中，使用1.2AAU/gdsGC358(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)在81℃处理pH5.9的浆料28分钟。之后，将浆料在103℃喷射蒸煮3分钟。冷却后，添加额外的2.6AAU/gdsGC358，并在84℃进一步处理浆料144分钟。

在修饰的液化方法中，使用8.3AAU/gdsGC358(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)在86℃处理pH5.8的浆料29分钟。替代喷射蒸煮的是，在没有其他α-淀粉酶的条件下，在85℃进一步处理浆料144分钟。

使用同步糖化发酵(SSF)方法生产乙醇。简而言之，在存在150-300ppm尿素的条件下，使用1-5×10⁸酵母细胞(XR(NACB))/ml醪液发酵27°Brix醪液。补充0.6GAU/gds的葡糖淀粉酶GC147(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)。发酵在31-33℃下进行，平均pH为约4.5，持续50-70小时。

基于八个月的测量，使用常规的液化方法的平均乙醇产量是2.753galUD/蒲式耳玉米。标准差为0.033。然而，当接下来五个月使用改良的液化方法时，乙醇产量增加至平均2.827galUD/蒲式耳玉米，标准差为平均0.021玉米(0.021corn)。表1显示了在常规液化方法和改良的液化方法之间的比较。使用双侧t检验(two-tailedt-test)的统计学分析提示，在99.5％的置信水平两种产量是不同的(P≤0.005)。

表1：乙醇生产的比较

此外，比较现在描述的液化方法与在较低温度下实施的常规液化方法。表2中显示了方法的参数和结果。改良的液化的平均乙醇产量是2.77galUD/蒲式耳玉米，而常规的低温液化是2.73galUD/蒲式耳玉米。使用双侧t检验的统计学分析提示，两种产量在97.5％的置信水平是不同的(P≤0.025)。因此，改良的液化方法能够从淀粉生产更多的乙醇。

表2：乙醇生产的比较

实施例2——比较DDSG中的剩余淀粉

通过修饰的液化方法观察到乙醇生产的增加可归因于更有效的淀粉液化。为了测试该假设，测量获得自如实施例1所示不同的液化处理的DDGS中的剩余淀粉。具体而言，使用2种商购的α-淀粉酶GC358(DaniscoUSInc.，GenencorDivision)和SCDS(NovozymesA/S，Denmark)。

为了确定剩余淀粉的量，首先将样品进行α-淀粉酶的液化，然后用葡糖淀粉酶糖化。然后，将所获得的葡萄糖用于计算样品中存在的剩余淀粉的量。

从DDGS开始，使用FallingMill生产研磨物，使其可以通过20目筛。为了确定DDGS中存在的可溶性葡萄糖的量，在100mLKohlrausch瓶中，将2克样品与50mL蒸馏水混合。样品在恒定搅拌下，在室温孵育1小时。之后，添加1.0mL1NH₂SO₄，并用蒸馏水补充总体积至100mL。然后，使用0.2μm注射过滤器过滤样品，并进行HPLC分析，确定存在的可溶性葡萄糖的量。

为了测量DDGS中存在的剩余淀粉的量，在100mLKohlrausch瓶中，将2克样品与45mLMOPS缓冲液pH7.0(补充了5mM氯化钙)混合。添加1毫升1∶50稀释的FRED。用锡箔覆盖瓶子，并与圈状砝码(donutweights)一起置于一锅沸水中15分钟。添加另外1mL1∶50稀释的FRED。将瓶子在95℃水浴中保持45分钟，然后在60℃水浴中1小时。通过添加20ml醋酸缓冲液pH4.2，调节pH。然后，添加1.0ml1∶100稀释的L-400(DaniscoA/S)，在60℃实施糖化18小时。通过煮沸样品15分钟然后冷却至室温，终止糖化。添加1毫升H₂SO₄，并用蒸馏水补充总体积至100mL。然后，使用0.2μm注射过滤器过滤样品，并进行HPLC分析。通过与在0.01N硫酸中制备的0.5％葡萄糖标准比较，确定液化和糖化后样品中的葡萄糖量。从总葡萄糖的量中减去可溶性葡萄糖的量，获得源自剩余淀粉的葡萄糖的量。然后，通过乘以因子0.9，将源自剩余淀粉的葡萄糖的量转化为剩余淀粉的量，所述因子反映了葡萄糖和淀粉分子之间的差异。

如表3所示，在使用改良的液化方法的发酵中观察到DDGS中显著更低水平的剩余淀粉，表示淀粉被更有效的转化。所述数据因而提示，改良的液化方法通过排除更高温度处理同时增加α淀粉酶剂量，使剩余的α淀粉酶活性能够进入发酵步骤。剩余的α淀粉酶的转移到下一步可能对更有效的淀粉利用和增加的乙醇生产有作用。

表3：比较DDGS中剩余淀粉的量

#1×α-淀粉酶剂量等于3.8AAU/gds。

虽然本文中显示和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅供示例。在不偏离本发明的条件下，本领域技术人员可以产生多种变体、改变和替代。应该理解，所述本文所述的本发明实施方案的各种替代方案都可用于实践本发明。

Claims (15)

1.淀粉加工方法，包括在温度为80℃至95℃的范围内，存在α-淀粉酶的条件下液化淀粉，其中α-淀粉酶的剂量是在85℃的温度下实施的液化方法中，90分钟内达到至少10的DE值所需α-淀粉酶量的至少1.7倍，且所述α-淀粉酶剂量范围在5.85-10AAU/gds内。

2.权利要求1的方法，其中所述淀粉是在温度为85℃至95℃的范围内液化。

3.权利要求1的方法，其中所述淀粉是在温度为88℃至92℃的范围内液化。

4.权利要求1的方法，其中液化实施30-300分钟。

5.权利要求1的方法，其中液化实施30-180分钟。

6.权利要求1的方法，其中在液化后存在至少10％的剩余α-淀粉酶活性。

7.权利要求1的方法，其中在液化后存在至少15％的剩余α-淀粉酶活性。

8.权利要求1的方法，进一步包括将液化的淀粉糖化。

9.权利要求1的方法，进一步包括发酵淀粉生产乙醇。

10.权利要求9的方法，进一步包括回收乙醇。

11.权利要求9的方法，进一步包括蒸馏淀粉获得乙醇，其中发酵和蒸馏是同时、分别或依次进行。

12.权利要求9的方法，其中在乙醇生产结束时100克酒糟副产物中存在的剩余淀粉比下述乙醇生产方法的剩余淀粉低至少10％，所述乙醇生产方法在85℃的温度和在90分钟内DE值达到至少10所需的α-淀粉酶剂量下液化淀粉。

13.权利要求9的方法，其中所述方法能够以比下述乙醇生产方法的产量高至少1.0％的产量生产乙醇，所述乙醇生产方法在85℃的温度和在90分钟内DE值达到至少10所需的α-淀粉酶剂量下液化淀粉。

14.权利要求1的方法，其中淀粉来自玉米、玉米杆、小麦、大麦、黑麦、高粱和马铃薯，及其任意的组合。

15.权利要求1的方法，其中淀粉来自玉米或玉米醪。