CN1984998A - 液化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用细菌α－淀粉酶在65－75℃范围内进行1－2个小时从而液化含淀粉原料的方法。本发明也涉及利用本发明的液化方法生产发酵产物优选乙醇的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的液化含淀粉原料(starch containing material)的方法，该方法适合作为生产糖浆或发酵产物优选乙醇的方法中的步骤。本发明还涉及生产发酵产物，优选乙醇的方法，包含根据本发明的液化方法液化含有淀粉的起始原料。
背景技术
在从含淀粉原料中生产糖浆和发酵产物如乙醇的技术领域中，液化是一熟知的工序。在液化过程中，淀粉转化为链较短和粘性较小的糊精。一般来说，液化包括淀粉的凝胶化，并在凝胶化的同时或之后加入α-淀粉酶。
WO 94/18314公开了一种用于淀粉液化作用的氧化稳定的芽孢杆菌(Bacillus)α-淀粉酶变体，该淀粉液化作用包括在105-107℃时蒸汽加压蒸煮(jet cooking)，接着95℃次级液化90分钟。
WO 99/19467公开了使用芽孢杆菌α-淀粉酶变体液化含淀粉原料的方法，其中初级液化在105℃进行5分钟，次级液化在95℃、初始pH为5.5的条件下进行。
尽管液化方法已经得到了显著的改进，但仍然有必要改进适于在糖浆和发酵产物生产过程中使用的液化含淀粉原料的方法。
发明概要
本发明的目的是提供改进的适于作为生产糖浆或发酵产物(如特别是乙醇)过程中的步骤的液化含淀粉原料的方法。本发明还提供生产发酵产物，优选乙醇的方法，其包括本发明的液化方法。
本发明第一个方面涉及液化含淀粉原料的方法，包含在65-75℃范围内用细菌α-淀粉酶处理含淀粉原料1-2个小时。
在优选的实施方案中，液化在约70℃下进行约90分钟。本发明的液化方法可以在pH4.5-6.5下进行，特别是在pH5-6之间。细菌α-淀粉酶可以是下文“α-淀粉酶”部分描述的任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属菌株。
本发明另一方面提供一种通过发酵从含淀粉原料中生产乙醇的方法，所述的方法包括：
(i)根据本发明的液化方法液化含淀粉原料。
(ii)糖化在步骤(i)中获得的醪液(mash)。
(iii)用发酵微生物发酵原料。
术语“醪液”用于指经过液化处理的(liquefied)含淀粉原料，如经过液化处理的整谷粒(whole grain)。糖化和发酵顺序地进行，或者优选同时进行(SSF方法)。任选的，发酵后回收乙醇。
附图说明
图1显示在不同温度下液化(分别为50℃，70℃和85℃)，经过SSF后乙醇的产量。
发明详述
本发明提供了改进的适于作为生产发酵产物，如特别是乙醇，或糖浆，如葡萄糖或麦芽糖的过程中的步骤的液化方法。本发明还涉及生产发酵产物优选乙醇的方法，该方法包括本发明的液化方法。当终产物是乙醇时，其可用作，如燃料酒精、饮用酒精，也就是适于饮用的精制酒精(potableneutral spirits)，或工业酒精。
本发明的液化方法
“液化”是将含淀粉原料分解(水解)成麦芽糊精(糊精)的过程。因为通常要将含淀粉原料加热到凝胶化温度以上，所以液化还可以使含有淀粉的浆液(Slurry)变稀(thinning)而有利于操作。液化通常在85℃以上利用细菌α-淀粉酶进行。发明人吃惊地发现在液化过程中当将温度降低到约70℃时，同时进行糖化和发酵(SSF)后的乙醇的产量提高了(参见实施例1)。尽管高温(如85℃)可以增加凝胶化作用以及通常可以增加细菌α-淀粉酶反应速率，但事实上还是获得了乙醇产量的改善。据信，将液化温度降低至70℃左右时，酶动力学可能已经发生了改变，从而液化醪液的可溶性糖的特征谱(profile)也随之发生了改变。发明人发现，在70℃液化比在85℃利用同样的α-淀粉酶进行液化产生了更多的小的发酵性糖，特别是葡萄糖和麦芽糖。另一种解释可能是淀粉和/或释放糖的化学结构发生了变化。释放的糖可能在高温如85℃时发生改变，而在较低的温度如70℃时，释放的糖可能是自然形态。在85℃时，淀粉凝胶化，形成酶可以接近的较松散结构。在70℃时，淀粉颗粒较不易接近，导致酶只能从游离端水解糖单位，因而产生了较小的糖。
本发明第一个方面涉及液化含淀粉原料的方法，包含在65-75℃范围内用细菌α-淀粉酶处理含淀粉原料1-2个小时。
在优选的实施方式中，液化在约70℃下进行约90分钟。本发明的液化方法可以在pH4.5-6.5下进行，特别是在pH5-6之间。在本发明的一个实施方案中，在用或不用细菌α-淀粉酶液化之前，将含淀粉原料在90-120℃优选1 05℃左右下蒸汽加压蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是5分钟左右。应当理解，实施本发明的方法也可以不进行蒸汽加压蒸煮(jetcooking)步骤。在本发明的实施方案中，在液化或蒸汽加压蒸煮(如果进行)前，制备含有优选10-40％重量，特别是25-35％重量的含淀粉原料的含水浆液。在本发明液化方法的进一步的实施方案中，可以在液化过程中加入0.005-2AGU/g DS，优选0.01-0.3AGU/g DS，例如特别是0.05AGU/g DS左右的葡糖淀粉酶(Glucoamylase)。葡糖淀粉酶可以是下文“葡糖淀粉酶”部分提到的任意葡糖淀粉酶。
含淀粉原料
根据本发明所使用的含淀粉原料可以是任意的含淀粉原料，优选自：块茎、根和整谷粒；以及以上的任意组合。在一个实施方案中，含淀粉原料取自禾谷类(cereals)。含淀粉原料可以例如选自玉米、玉米穗轴(cob)、小麦、大麦、木薯(cassava)、高粱、黑麦、买罗高粱(milo)和马铃薯或其任意组合。
如果在本发明的乙醇生产过程中包括本发明的液化方法，则含淀粉的原材料优选整谷粒或至少主要是整谷粒。用作原材料的含淀粉谷类农作物有多种，包括：玉米(corn或maize)、买罗高粱、马铃薯、木薯、高粱、小麦、大麦或者其任意组合。在优选的实施方案中，含淀粉原料是选自玉米、小麦和大麦或其任意组合的整谷粒。
原料可以包含淀粉加工过程中的物料支流(side-stream)或由其组成，如含6碳糖(C6 carbohydrate)而不适于例如糖浆等的生产的工艺物料流。
碾磨(Milling)
在本发明的优选实施方式中，为了打开其结构和便于进一步加工，在(a)步骤前，即在初级液化前，优选通过碾磨减小含淀粉原料的大小。因此，在具体的实施方案中，液化方法进一步在初级液化步骤前，包括如下步骤：
i.减小含淀粉原料如整谷粒的大小，优选通过碾磨；
ii.形成包含经过碾磨的含淀粉原料和水的浆液。
通常使用的碾磨的两个方法：干磨和湿磨。
术语“干磨”表示碾磨整谷粒。在干磨中，碾磨整谷粒(whole kernel)，并将其用于该方法的后续工序。湿磨可以很好的分离胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，而且，除了少数例外，在并行生产糖浆的地方基本上采用湿磨。
在以生产乙醇为目标的过程中，优选干磨。
术语“研磨”(grinding)也可以理解为碾磨(milling)。在本发明的优选实施方案中，使用干磨。然而，可以理解，其它的减小含淀粉原料颗粒大小的方法也可以达到预期目的，并包含在本发明的范围之内。例子包括如乳化技术等技术，也可以使用回转脉动技术(rotary pulsation)。
发酵产物生产过程
本发明的发酵产物，优选乙醇的生产过程通常包括下列步骤：液化、糖化、发酵、和任选地回收产物，优选通过蒸馏。
根据此方面，本发明涉及从含淀粉原料通过发酵生产发酵产物，优选乙醇的方法，所述的方法包含以下步骤：
(i)使用本发明的液化方法液化含淀粉原料。
(ii)糖化在步骤(i)中获得的醪液。
(iii)用发酵微生物发酵原料。
在实施方案中，糖化和发酵顺序地进行，优选同时进行(SSF方法)。在本发明的优选的实施方案中，为了打开其结构和便于进一步加工，干磨含淀粉原料，如整谷粒，优选玉米(corn)。
在优选的实施方案中，在步骤i前，包括如上所定义的蒸汽加压蒸煮步骤。
在优选的实施方案中，可以使用在下文“α-淀粉酶”部分提及的任意细菌α-淀粉酶。
糖化
糖化是这样的步骤，其中麦芽糊精(如液化产物)转变成可被发酵微生物如酵母代谢的小分子的糖DP1-3(即糖源)。糖化步骤在本技术领域是熟知的，且通常用至少一种或多种如下文进一步描述的产生糖源的酶(Carbohydrate source generating enzyme)来酶促进行。包含于本发明生产发酵产物优选乙醇的方法中的糖化步骤，可以是本技术领域中熟知的糖化步骤。在一个实施方案中，使用葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶处理经过液化的原料。完整的糖化步骤可以持续20-100小时，优选约24-约72小时，且经常在约30-65℃温度范围内，pH4-6通常pH4.5-5.5左右进行。然而，有时更优选进行预糖化步骤，在30-65℃温度范围内，典型的是约65℃下，持续约40-90分钟，然后在同时糖化和发酵法(SSF)的发酵过程中进行完全的糖化。乙醇生产中最广泛应用的方法是同时糖化和发酵法(SSF)。通常情况下，糖化没有特定的保持(holding)阶段，这意味着发酵微生物如酵母和酶是同时添加的。在SSF方法中，经常在发酵前，在40-60℃温度范围内，优选50℃左右，引入预糖化步骤。
发酵
根据本发明，术语“发酵微生物”指适合用于所期望的发酵过程的任意微生物。适合的发酵微生物能够进行发酵，即直接或间接地把糖如葡萄糖或麦芽糖转变为所述的发酵产物，优选乙醇。发酵微生物的例子包括真菌类生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。商业上可利用的酵母包括，如REDSTAR/Lesaffre Ethanol Red(可以从美国的RED/Lesaffre获得)，SUPERSTART(可以从Alltech获得)，FALI(可以从美国的Fleischmann’sYeast，Burns Philp Food Inc的分公司获得)，GERT STRAND(可以从瑞典的Gert Strand AB获得)，以及FERMIOL(可以从DSM Specialties获得)。在优选的实施方案中，酵母施加于糖化的原料。发酵持续进行24-96小时，典型的如35-65小时。在优选的实施方案中，温度一般是26-34℃之间，特别是32℃左右，pH值通常是3-6，优选4-5左右。优选酵母细胞的用量是105-1012，优选107-1010，特别是5×107活酵母数每毫升发酵液。在乙醇生产阶段，酵母细胞的数量优选在107-1010之间，特别是2×108左右。有关使用酵母发酵的进一步指导可见于如“The alcohol Textbook”(编者，K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall，Nottingham University Press，UnitedKingdow 1999)，其在此引入作为参考。
发酵产物回收
发酵产物，优选乙醇，在发酵以后可以任选地回收，优选通过包括以下步骤：
(iv)蒸馏以获得发酵产物，优选乙醇。
在实施方案中，同时或单独/顺序地进行步骤(iii)的发酵和步骤(iv)的蒸馏；任选地随后进行一或多个工序来进一步精制发酵产物，优选乙醇。
淀粉转化
本发明的液化方法也可以包含于传统的生产糖浆如葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖(Malto-oligosaccharides)和异麦芽低聚糖(isomalto-oligosaccharides)的淀粉转化过程中。
细菌α-淀粉酶
依据本发明，细菌α-淀粉酶优选来自芽孢杆菌属。
在优选实施方案中，芽孢杆菌α-淀粉酶来源于地衣形芽孢杆菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilu)菌株，但也可以从其它的芽孢杆菌种类中获得。考虑到的α-淀粉酶的具体例子包括记载在WO99/19467的SEQ ID NO：4所示的地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶，SEQ ID NO：5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及SEQ ID NO：3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列在此引入作为参考)。在本发明的实施方案中，α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467所记载的SEQ ID NO：1、2或3所示的任意序列具有至少60％同一性，优选至少70％，较优选至少80％，更优选至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性的酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体，尤其是在WO 96/23873、WO 96/23874，、WO 97/41213、WO 99/19467、WO00/60059和WO 02/10355(所有文献在此引入作为参考)的任一个中描述的。具体考虑到的α-淀粉酶变体是公开在美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(在此引入作为参考)中的变体，此外还包括在R179至G182的位置上缺失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选是公开于WO 1996/023873的双缺失变体(如参看第20页的1-1 0行，在此引入作为参考)，优选和WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所示野生型BSGα-淀粉酶相比对应于Δ(181-182)，或按WO 99/19467中SEQ ID NO：3的编号缺失氨基酸R179和G180(其在此引入作为参考)。更优选芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与WO 99/19467公开的SEQID NO：3所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，其具有和Δ(181-182)相对应的双缺失，且进一步包含N193F替代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
具体考虑到的α-淀粉酶杂合体包含地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(WO 99/19467的SEQ ID NO：4所示)和来自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(显示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)的37个N-末端氨基酸残基，及具有一个或多个特别是所有的如下替代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(按照WO99/19467中SEQ ID NO：4所示地衣形芽孢杆菌编号)。也可以优选具有一个或多个如下突变的变体(或是在其它芽孢杆菌α-淀粉酶主链上相应的突变)：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在176和179位之间缺失两个残基，优选缺失E178和G179(使用的是WO 99/19467中SEQ IDNO：5所示的编号)。
细菌α-淀粉酶可以本技术领域公知的量加入。当以KNU单位(在下文“材料和方法”部分叙述)计量时，α-淀粉酶的活性优选以0.5-5,000NU/g DS的量存在，以1-500NU/g DS的量存在，或更优选5-1,000NU/g，如10-100NU/g DS的量。
产糖源的酶
术语“产糖源的酶”包括葡糖淀粉酶(是葡萄糖的生产者)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase，是麦芽糖的生产者)。产糖源的酶能为在本发明的方法中使用的发酵微生物提供能量以生产乙醇和/或可直接或间接转化为所期望的发酵产物尤其是乙醇。产糖源的酶可以是所限定的酶的混合物。特别考虑的混合物是至少由葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，尤其是酸性α-淀粉酶，更优选酸性真菌α-淀粉酶组成的混合物。在本发明的实施方案中，每葡糖淀粉酶活性(AGU)的酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)(AFAU/AGU)至少是0.1，特别至少是0.16，例如在0.12-0.50范围内。
适合的葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶的实例在下文部分阐述。
葡糖淀粉酶
依据本发明，所使用的葡糖淀粉酶是任意合适来源的，如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶源自真菌或细菌，选自：曲霉属(Aspergillus)葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉(A.niger)G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，1097-1102页)，或者其变体，如在WO 92/00381、WO00/04136和WO 01/04273中所公开的(来自丹麦的Novozymes)；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，941-949页)，或其变体或片断。
其它的曲霉葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等.(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)；和在A435及S436位引入脯氨酸残基(Li等(1997)，Protein Engng.10，1199-1204)。其它的葡糖淀粉酶包括Atheliarolfsii(以前表示为罗尔伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参阅美国专利号No.4,727,026和Nagasaka，Y.等(1998)的Purification and properties of the raw-starch-degradingglucoamylases from Corticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌(Talaromyces)葡糖淀粉酶，尤其是来源于Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(参见美国专利号32,153)、Talaromycesduponti、Talaromyces thermophilus，(美国专利号4,587,215)。适合的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是C.thermoamylolyticum(EP135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)。
商业上可利用的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U和AMGTME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在实施方案中，葡糖淀粉酶可以0.02-20AGU/g DS的量加入，优选0.1-10AGU/g DS的量，特别是在1-5AGU/g DS之间，如0.5AGU/g DS。
β-淀粉酶
至少依据本发明，β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)传统上是对体外起作用的麦芽淀粉酶的称谓，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡糖聚合物中1，4-α糖苷键的水解。麦芽糖被以逐步连续地从非还原性链末端去除，直到分子降解，或在是支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β差向异构体构型(anomeric configuration)，因而以β-淀粉酶命名。
β-淀粉酶已从多种植物和微生物中分离(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，Vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征是最适温度为40℃-65℃，最适pH为4.5-7。商业上可利用的大麦β-淀粉酶是来自丹麦Novozymes A/S的NOVOZYMTM WBA及来自美国Genencor Int.的SPEZYMETM BBA1500。
麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可以是麦芽糖α-淀粉酶。“麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖。商业上，来自嗜热脂肪芽胞杆菌NCIB 11837菌株的麦芽糖α-淀粉酶可以从Novozymes A/S获得，其商品名为MALTOGENASETM。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628，其在此引入作为参考。
在优选的实施方案中，麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量加入。
酶的生产
在此涉及的酶可以来源于或获自任意合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源。在本发明中术语“来源于”(derived)意思是该酶可能是从天然存在该酶的生物体中分离的，即酶的氨基酸序列本身与天然的酶相同。术语“来源于”也表示该酶可能是在宿主生物体中重组产生的，重组严生的酶其氨基酸序列或者与天然酶相同，或者具有修饰，如具有一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或替代，也就是说，重组产生的酶是一种突变体，和/或是天然氨基酸序列的片段，或者是通过本技术领域已知的核酸改组方法生产的酶。天然的变体包含在天然酶的意思范围内。此外，术语“来源于”包括通过合成生产的酶，如通过肽合成。术语“来源于”也包括无论是体内还是体外通过例如糖基化、磷酸化或者其它的化学修饰所修饰的酶。在本发明中，术语“获自”意思是酶具有与天然酶相同的氨基酸序列。该术语包含从天然存在该酶的生物中分离出的酶，或者在相同类型的或其它类型的生物中重组表达的酶，或者合成生产的，如通过肽合成生产的酶。对于重组生产的酶，术语“来源于”和“获自”是指酶本身(或酶的同一性)(identity)，而非指重组生产该酶的宿主生物本身(或其同一性)。
酶也可以是纯化的。在此使用的术语“纯化的”涵盖来源于生物而不含有该生物的其它组分的酶。术语“纯化”还涵盖从天然生物获得但不含该生物的其它组分的酶。纯化的酶可以含有少量的其它蛋白质。措辞“其它的蛋白质”特别指其它的酶。在此所用的术语“纯化”也涉及去除其它的组分，具体是去除其它的蛋白质，最具体是去除存在于本发明中的酶所来源的细胞中的酶。酶可以是“基本上纯的”(substantially pure)，也就是说，不含产生该酶的生物体的其它组分，即，例如重组生产酶的宿主生物体。在优选的实施方案中，酶至少是75％(w/w)纯，较优选至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％纯。在另一个优选的实施方案中，酶是100％纯的。
依据本发明，所用的酶可以是适于在此描述的方法中使用的任意形式，如，干粉或颗粒，非粉化(non-dusting)颗粒，液体，稳定化的液体，或者被保护的酶。颗粒可以按美国专利号4,106,991和美国专利号4,661,452公开的方法生产，可以任选地通过本技术领域已知的方法包被。根据已建立的方法，液体酶的制备物可以通过加入稳定剂如糖、糖醇(sugar alcohol)或其他多元醇、乳酸或其它有机酸使之稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中公开的方法制备。
即使在本发明的方法或过程的上下文中没有特别提及，可以理解，酶或试剂是以“有效量”使用的。
材料和方法
酶
细菌α-淀粉酶A：具有I181*+G182*+N193F*突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，公开于美国专利号6,187,576，可获自丹麦的Novozymes A/S。葡糖淀粉酶TN：具有黑曲霉葡糖淀粉酶和黑曲霉酸性α-淀粉酶副活性(side activity)、来源于Talaromyces emersonii的葡糖淀粉酶，公开于WO99,28448，如SEQ ID NO：7所示。
酵母
RedStarTM，可从美国Red Star/Lesaffre获得。
方法
α-淀粉酶活性(KNU)
可以用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉水解活性。该方法基于酶能分解改性的马铃薯淀粉，该方法是将碘溶液与淀粉/酶溶液样品混合。最初，形成黑蓝色，但随着淀粉的分解，蓝色逐渐变弱，变为红褐色(以有色玻璃为参照)。
1千Novoα-淀粉酶单位(Kilo Novoα-amylase Unit，KNU)定义为在标准条件下(即37+/-0.05℃；0.0003M Ca2+；和pH5.6)糊精化5260mg淀粉干物质Merck Amylum solubile的酶量。
较详细描述该分析方法的小册子EB-SM-0009.02/01可向丹麦的Novozymes A/S索取，其在此引入作为参考。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下：37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟，每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可以使用自动分析仪系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶，以便使存在的任何α-D-葡萄糖转变为β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，其可用光度计在340nm测量，并以此量度初始葡萄糖的浓度。
| AMG温育 | |
| 底物： | 麦芽糖23.2mM |
| 缓冲液： | 醋酸盐0.1M |
| pH： | 4.30±0.05 |
| 温育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 酶工作范围： | 0.5-4.0AGU/mL |
| 颜色反应： | |
| GlucDH： | 430U/L |
| 变旋酶： | 9U/L |
| NAD： | 0.21mM |
| 缓冲液： | 磷酸盐0.12M；NaCl0.15M |
| pH： | 7.60±0.05 |
| 温育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 波长 | 340nm |
较详细描述该分析方法的小册子(EB-SM-0131.02/01)可向丹麦的Novozymes A/S索取，其在此引入作为参考。
同一性确定
为了实现本发明的目的，可以通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)确定两个氨基酸序列间的同一性程度，其中上述方法使用的是LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，该软件带有同一性列表以及以下多个比对参数：空位罚分(gap penalty)10，空位长度罚分(gap length penalty)10。配对比对参数如下：Ktuple＝1，空位罚分＝3，windows＝5，diagonals＝5。
实施例
实施例1
细菌α-淀粉酶A在不同温度下进行液化，其最终的乙醇产量
为了考查细菌液化酶对SSF的作用，试验了三种不同的液化条件。首先，用研磨的玉米(ground corn)和自来水制成30％的浆液。在所有的液化中，用稀H2SO4将pH调整为5.4。表1显示了当使用浓度为50NU/g DS的细菌α-淀粉酶A时液化条件的温度和时间，一旦液化完成，加入2滴HCl(4N)终止反应。回收样品以分析糖特征谱。
表1细菌α-淀粉酶A(BAAA)温度研究的液化条件
| 液化 | 细菌α-淀粉酶A(NU/g) | 1.5小时温度(℃) |
| 123 | 505050 | 857050 |
通过微型发酵评估液化处理对SSF的影响。在液化后，用稀的NaOH将pH调整为5.0。将约4g醪液加入到16ml的聚苯乙烯试管(Falcon 352025)中。接着向试管中定量加入0.5AGU/g DS的葡糖淀粉酶TN。向试管中定量加入酶以后，与0.04ml/g醪液的繁殖酵母(RED STARTM)一起在试管中温育，所述繁殖酵母已在玉米醪液中培养了21个小时。将试管用旋盖盖住，该盖子用极小的针刺有孔以允许气体释放，短暂涡旋混合，然后称重并在32℃温育。随时间称量试管的重量以追踪发酵进程。在每一次称重前将试管短暂地涡旋混合。用以下公式将重量减轻值换算为乙醇产量(g乙醇/gDS)：
发酵后，将一个重复样用于HPLC分析(sacrificed)残余糖量和乙醇产量。将大约1ml的澄清上清液通过0.45μm的滤器以去除固体物质。将样品稀释10倍，然后通过HPLC分析葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、较大的可溶糖(DP4+)及乙醇。
结果表明，在70℃液化原料比在标准的85℃液化产生乙醇的速度更快。利用在70℃液化的玉米醪液，42小时时，乙醇水平增加了20％。发酵后，HPLC分析表明(表2)，在70℃液化时，葡萄糖几乎完全被利用，而在其它的液化中，则有约40-60g/l的葡萄糖剩余。
表2在不同温度进行液化处理，发酵后HPLC数据
| 液化处理 | 糊精(DP4)+ | 麦芽三糖(DP3) | 麦芽糖(DP2) | 葡萄糖 |
| BAAA-85℃ | 18.93 | 1.04 | 2.84 | 58.04 |
| BAAA-70℃ | 17.21 | 3.49 | 5.37 | 0.79 |
| BAAA-50℃ | 13.30 | 0.81 | 1.82 | 41.12 |
利用由于CO2释放而导致的重量减轻分析发酵的乙醇产量(参见图1)。发现在温度为50℃、72℃和85℃进行液化处理时，约50个小时时的终产量依次是0.143g、0.239g和0.206g乙醇/g醪液，表明在70℃液化比在标准方法(85℃)下液化能够提高大约16％的乙醇产量。
Claims (17)
1、液化含淀粉原料的方法，包括用细菌α-淀粉酶在65℃-75℃范围内处理含淀粉原料1-2个小时。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的含淀粉原料选自玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁和马铃薯；或其任意组合。
3、根据权利要求1所述的方法，进一步包含如下步骤：
(a)减小含淀粉原料的大小，优选通过碾磨；
(b)在液化含淀粉原料之前，形成包含原料和水的浆液。
4、根据权利要求3所述的方法，其中将α-淀粉酶加入到所述含水浆液中。
5、根据权利要求3所述的方法，其中所述的碾磨步骤是干磨步骤。
6、根据权利要求3所述的方法，其中所述的碾磨步骤是湿磨步骤。
7、根据权利要求1所述的方法，其中所述的细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或是具有I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F突变的变体。
8、根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述的含淀粉原料在步骤(a)之前，在90-120℃下蒸汽加压蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是5分钟左右。
9、根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中存在0.005-2AGU/G DS，优选0.01-0.3 AGU/g DS，如特别是0.05 AGU/g的葡糖淀粉酶。
10、通过发酵从含淀粉原料生产发酵产物，优选为乙醇的方法，所述的方法包括：
(a)如权利要求1-9中任意一项所定义的液化含淀粉的原料；
(b)糖化在步骤(a)中获得的醪液；
(c)用发酵微生物发酵原料。
11、根据权利要求10所述的方法，进一步包含回收发酵产物，优选乙醇。
12、根据权利要求10或11所述的方法，其中所述的糖化和发酵是顺序地或同时地进行(SSF方法)。
13、根据权利要求10所述的方法，进一步包含以下步骤：
(d)蒸馏，以获得发酵产物，优选乙醇；
其中步骤(c)中的发酵和步骤(d)中的蒸馏同时或分别/顺序地进行；任选地随后进行一个或多个工艺步骤以进一步精制发酵产物，优选乙醇。
14、根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤(c)中的发酵微生物能将糖发酵为乙醇，其中微生物优选是酵母，特别是来源于酵母属的种类，优选酿酒酵母。
15、根据权利要求10-14中任意一项所述的方法，其中所述的发酵是在产糖源的酶存在下进行的。
16、根据权利要求15所述的方法，其中所述的产糖源的酶是葡糖淀粉酶，优选来源于曲霉属的菌株，优选黑曲霉或米曲霉，或踝节菌属菌株，尤其是Talaromyces emersonii或Athelia属的菌株，优选Athelia rolfsii。
17、根据权利要求9-16中任意一项所述的方法，其中分别为糖化和发酵步骤的(b)和(c)作为SSF过程同时进行。
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