JP5594899B2 - 変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体 - Google Patents
変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5594899B2 JP5594899B2 JP2010534956A JP2010534956A JP5594899B2 JP 5594899 B2 JP5594899 B2 JP 5594899B2 JP 2010534956 A JP2010534956 A JP 2010534956A JP 2010534956 A JP2010534956 A JP 2010534956A JP 5594899 B2 JP5594899 B2 JP 5594899B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucoamylase
- seq
- parent
- trga
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本出願は、2007年11月20日に出願された米国仮特許出願第60/989,426号の利益を主張する。
[配列表]
また、同米国仮特許出願には配列番号1〜167を含む配列表が添付されており、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
他様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示発明の属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。Singletonら、「微生物学および分子生物学辞典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)」、第2版、1994年、米国、ニューヨーク州、John Wiley and Sons社、ならびにHaleおよびMarkham、「ハーパーコリンズ生物学辞典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)」、1991年、米国、ニューヨーク州、Harper Perennial社は、本明細書で用いられた用語の多くの一般的な意味を当業者に提供する。明確化および参照の容易のために特定の用語が以下に定義される。
ある実施態様では、本開示発明はグルコアミラーゼ変異体を提供する。グルコアミラーゼ変異体は親グルコアミラーゼの変異体であり、これは触媒ドメインおよびデンプン結合ドメインの双方を含んでいることができる。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは配列番号1、2、3、5、6、7、8もしくは9で示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号1、2、3、5、6、7、8もしくは9で示されるアミノ酸配列のうちの1以上と少なくとも80%の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含んでいる。さらに他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号1、2または3のアミノ酸配列のうちの1を有するグルコアミラーゼの触媒ドメインをコードするDNAと、中程度、高度または緊縮性の条件下でハイブリダイズするDNA配列によってコードされた触媒ドメインを含んでいる。
分子生物学のセントラルドグマは、特定の酵素のための遺伝子をコードするDNAの配列がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列が次に該酵素の三次元の折りたたみを決定するというものである。この折りたたみは、触媒中心および基質結合表面を形成する異種の残基を寄せ近づけ、そしてこのことが、問題の酵素の高い特異性および活性をもたらす。
本開示発明に従う変異体は、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列中に少なくとも1の置換、欠失または挿入を含み、これは該変異体を親グルコアミラーゼと配列において異なったものにする。ある実施態様では、本開示発明の変異体は、配列番号2のTrGA活性の少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%のグルコアミラーゼ活性を有する。
D24/I43/D44/F175/V181/V314/T363、
D24/Q208/I292/G294/K297/Y310、
V181/E243/I292/K297/N317/Y395、
D24/V181/Q208/G294/T363/N376/N409、
D24/V181/I292/G294/E243/N409、
I43R/E243/I292/G294/K297、
I43/D44/N61/L417/E503/Q511/A539、
I43/D44/L417/E503/Q511/A539、
I43/N61/L417/T430/Q511/A539、
I43/N61/L417/E503/Q511/A539、
I43/N61/T430/A431/Q511/A539、
I43/N61/T430/Q511、
I43/N61/T430/Q511/A539、
I43/N61/Q511、
I43/N61/Q511/A539、
I43/G73/T430、
I43/L417/E503/Q511/A539、
I43/L417/Q511、
I43/L417/T430/A431/Q511/A539、
I43/L417/T430/Q511、
I43/L417/T430/Q511/A539、
I43/L417/E503/A539、
I43/L417/E503/Q511/A539、
I43/T430、
I43/T430/A431/E5O3/Q511、
I43/T430/A431/Q511、
I43/T430/A431/Q511/A539、
I43/T430/E503/Q511、
I43/T430/Q511、
I43Q/T430/Q511/A539、
I43/A431/Q511、
I43/T430/E503/Q511/N563、
I43/T430/E503/A535/N563、
I43/E503/Q511/A539、
I43/Q511/A539、
D44/G73/L417/N563、
D44/G73/E503/Q511、
D44/G73/N563、
D44/L417/N563、
D44/T430/Q511/A535、
D44/E503/Q511/N563、
G73/T430/E503/Q511、
G73/T430/Q511、
G294/L417/A431、
G294/L417/A431、
G294/L417/A431/Q511、
L417/T430/A431/Q511/A535/A539/N563、
L417/A431/Q511、
L417/T430/Q511/A535/N563、
L417/T430/Q511/A539/N563および
E503/N563、
または親グルコアミラーゼ、とりわけトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置における置換を含んでいる。
Y47F/W、Y315F/W;
D24E、L/I43F、R/D44H、N/F175H/V181K、L/V314D、H、K/T363R;
D24L、W、Y/Q208F/I292F、N、V/G294A、I、Q/K297A/Y31OF、Q、R;
V181F、K、L/E243A、N、M、R、Y/I292F、L、N、V/K297A、D、H、M、N、Q/N317H/Y395Q、R;
D24E、L、Y/V181F、K、L/Q208C、F/G294A、I、Q/T363R/N376Q/N409K、W;
D24E、L、Y/V181F、K、L/I292F、L、N、V/G294A、I、Q/E243A、M、N、R、Y/N409K、W;
I43R/E243A、M、N、R、Y/I292F、L、N、V/G294A/K297A、D、H、M、N、Q、S、R、W、Y;
I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/N61I/L417V/T430M/Q511H/A539R;
I43R/N61I/L417R、V/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R;
I43Q/N61I/T430A/Q511H;
I43Q/N61I/T430A/Q511H/A539R;
I43Q/N61I/T430M/Q511H/A539R I43Q/N61I/Q511H;
I43Q/N61I/Q511H/A539R;
I43R/G73F/T430A;
I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A539R;
I43Q/L417V/T430A/Q511H;
I43Q/L417V/T430A/Q511H/A539R;
I43R/L417R/E503A/A539R;
I43R、Q/L417V/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/L417V/Q511H;
I43R、Q/T430A:
I43Q/T430A/A431L/E503A/Q511H;
I43Q/T430A/A431L/Q511H;
I43Q/T430A/A431L/Q511H/A539R;
I43Q/T430A/E503A/Q511H;
I43Q/T430A/Q511H;
I43Q/T430A、M/Q511H/A539R;
I43R/T430A/E503A、V/Q511H/N563K;
I43Q/A431L/Q511H;
I43Q/E503A/Q511H/A539R;
I43Q/Q511H/A539R;
D44C/G73F/E503V/Q511H;
D44C/G73F/L417R/N563K;
D44C/G73F/N563K;
D44C/L417R/N563K;
D44R/E503A/Q511H/N563I;
D44R/T430A/Q511H/A535R;
G73F/T430A/E503V/Q511H;
G73F/T430A/Q511H;
G294C/L417R/A431L;
G294C/L417R/A431L、Q/Q511H;
G294C/L417V/A431Q;
L417R、V/A431L、Q/Q511H;
L417V/T430A/A431L、Q/Q511H/A535R/A539R/N563I;
L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I;
L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I;および
E503A/N563I、
または親グルコアミラーゼ、とりわけトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置における置換を含んでいることができる。
1の側面では、本開示発明は、変更された温度において親または野生型と比較して変更された熱安定性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。変更された温度とは、上げられたまたは下げられた温度を含む。ある実施態様では、該グルコアミラーゼ変異体は、所与の時間、たとえば少なくとも60分間、120分間、180分間、240分間、300分間等にわたって、変更された温度に曝露された後に、改良された熱安定性、たとえば少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%の酵素活性を保持する熱安定性を有する。ある実施態様では、変異体は、40℃〜80℃の範囲、また50℃〜75℃の範囲、および60℃〜70℃の範囲の中の選択された温度において、ならびに典型的には4.0〜6.0のpH範囲において親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性を有する。ある実施態様では、熱安定性は実施例に記載されたように測定される。
本開示発明のグルコアミラーゼ変異体は、たとえば1のグルコアミラーゼからのデンプン結合ドメイン(SBD)ならびに別のグルコアミラーゼからの触媒ドメインおよびリンカーを有するキメラまたはハイブリッドのグルコアミラーゼを含むこともできる。たとえば、AnGAからのSBDとTrGAからのSBDとを交換して、AnGAのSBDならびにTrGAの触媒ドメインおよびリンカーを有するハイブリッドを作ることによって、ハイブリッドグルコアミラーゼが作られることができる。あるいは、AnGAからのSBDおよびリンカーが、TrGAからのSBDおよびリンカーと交換されることができる。
他の側面では、本開示発明は、親または野生型グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。
本開示発明は、本開示発明の変異体グルコアミラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドは、従来技術で知られた確立された手法によって調製されることができる。該ポリヌクレオチドは合成的に、たとえば自動DNA合成機によって調製されることができる。該DNA配列は、断片を一緒に結合することによって調製された、ゲノム(またはcDNA)起源と合成起源との混合されたものであってもよい。ポリヌクレオチドは、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって調製されることもできる。一般的に、Minshull J.ら、「選択的アミノ酸多様化によって変更されたタンパク質の機能(Engineered protein function by selective amino acid diversification)」、Methods、2004年、第32巻(第4号)、p.416−427が参照される。また、多数の会社、たとえば独国、レーゲンスブルク、Geneart社が、現在DNAを合成している。
本開示発明の1の実施態様に従うと、本開示発明に包含される変異体グルコアミラーゼをコードしており、かつプロモーター配列に機能し得るように結合されている上記のポリヌクレオチドを含んでいるDNA構築体は、構築されて宿主細胞中に導入される。
本開示発明は、また本開示発明の変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞にも関し、該宿主細胞は本開示発明のグルコアミラーゼを産生するために用いられる。ある実施態様では、宿主細胞は、細菌、真菌、植物および酵母の細胞から選択される。宿主細胞の語は、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼを産生するために用いられる細胞、該細胞の子孫および該細胞から生成されたプロトプラストの双方を含む。
宿主細胞中へのDNA構築体またはベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(たとえば、リポフェクション仲介性およびDEAE−デキストリン仲介性トランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿を用いる培養、DNA被覆マイクロプロジェクタイルを用いる高速発射およびプロトプラスト融合のような手法を含む。一般的な形質転換手法は従来技術で知られている(たとえば、Ausubelら、上記、1987年、第9章およびSambrook、上記、1989年およびCampbellら、Curr.Genet.、1989年、第16巻、p.53−56参照)。
本開示発明はさらに、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターを有する宿主細胞を形質転換する工程を含む、変異体グルコアミラーゼを産生する方法に関し、任意的に、該方法は変異体グルコアミラーゼの産生に適した条件下に宿主細胞を培養する工程、および任意的に、該グルコアミラーゼを回収する工程を含む。
本開示発明の変異体グルコアミラーゼは、酵素組成物に、たとえば以下に限定されることなく、デンプン加水分解および糖化組成物、洗浄および洗剤組成物(たとえば、洗濯用洗剤、食器洗い機洗剤および硬表面洗浄組成物)、アルコール発酵組成物に、ならびに動物飼料組成物中に用いられることができる。さらに、該変異体グルコアミラーゼは、ベーキング用途品、たとえばパンおよびケーキの生産、醸造、ヘルスケア、繊維、環境廃棄物転換プロセス、バイオパルプ処理プロセスおよびバイオマス転換用途品に用いられることができる。
特に、変異体グルコアミラーゼは、デンプン転化プロセスのために、とりわけフルクトースシロップ、特にショ糖用のデキストロースの生産に、およびデンプン含有基質の発酵によるアルコールおよび他の最終製品(たとえば、有機酸、アスコルビン酸およびアミノ酸)に使用されることができる(G.M.A van Beynumら編、「デンプン転化技術(STARCH CONVERSION TECHNOLOGY)」、1985年、米国、ニューヨーク州、Marcel Dekker社)。本開示発明の変異体グルコアミラーゼ組成物を用いて産生されたデキストリンは、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%および少なくとも95%のグルコース収率をもたらすことができる。本開示発明に包含されるグルコアミラーゼを用いるデンプン基質の発酵からのアルコールの生産は、燃料アルコールまたはポータブルアルコールの生産を含むことができる。ある実施態様では、アルコールの産生量は、変異体グルコアミラーゼが親グルコアミラーゼと同じ条件下に用いられるとより大きくなる。ある実施態様では、アルコールの産生量は、親グルコアミラーゼよりも約0.5%〜2.5%優れており、たとえば以下に限定されることなく、親グルコアミラーゼよりも0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%および2.4%多いアルコールである。
以下の実施例は、本開示発明の特定の代表的な実施態様および側面を実証しさらに説明するために提供され、その範囲を限定するものと解釈されてはならない。
試薬溶液は、NaAc緩衝液:200mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5、基質:NaAc緩衝液中50mMのp−ニトロフェニル−α−Dグルコピラノシド(シグマ社N−1377)(0.3g/20ml)、および停止溶液:800mMのグリシン−NaOH緩衝液pH10であった。30μLのろ過上清が、新鮮な96ウェル平底MTPに入れられた。各ウェルに50μLのNaAc緩衝液および120μLの基質が添加され、50℃で30分間温置された(Thermo LabSystems社iEMSインキュベーター/シェーカーHT)。100μLの停止溶液を添加することによって、反応が停止された。405nmの吸光度がMTPリーダー(Molecular Devices社Spectramax 384 plus)で測定され、活性が0.011μM/cmのモル吸光係数を用いて計算された。
粗上清(100μl)が、100μLの50mMのNaAc緩衝液pH4.5に添加された。このサンプルが2つのMTP上に等量に分割された。一方のMTP(初期のプレート)は4℃で1時間温置され、他方のMTP(残存のプレート)は60℃で(Thermo LabSystems社iEMSインキュベーター/シェーカーHT)1時間温置された。残存のプレートが氷上で15分間冷却された。下記のエタノール生産適用アッセイに以下の変更、すなわち熱安定性アッセイのために採取されたサンプルの量が25μLであり、30mMのNaAc緩衝液pH4.0の量が35μLであるという変更を加えて用いて、両方のプレートについて活性が測定される。
(ABS(340)残存−ブランク)/(ABS(340)初期−ブランク)×100
試薬溶液はブラッドフォードQuickstart試験溶液(Biorad社カタログ番号500−0205)であった。100μLの10kDでろ過された上清が、新鮮な96ウェル平底プレートに入れられた。各ウェルに200μLの試薬が添加され、室温で5分間温置された。595nmの吸光度がMTPリーダー(Molecular Devices社Spectramax 384 plus)で測定された。ウシ血清アルブミン(BSA)(0〜50μg/ml)標準曲線に従って、タンパク質濃度が計算された。
ヘキソキナーゼカクテル(混合物):使用の10〜15分間前に、90mlの水が、BoatILコンテナのグルコースHK R1(IL社試験グルコース(HK)キット、Instrument Laboratory社番号182507−40)に添加され、穏やかに混合された。85μLのヘキソキナーゼカクテルが100μLのdH2Oに添加された。15μLのサンプルがこの混合物に添加され、室温で暗室中5分間温置された。340nmの吸光度がMTPリーダーで読み取られた。グルコース(0〜1mg/ml)標準曲線に従って、グルコース濃度が計算された。
8%ストック溶液を調製するために、8gの可溶性コーンスターチ(Sigma社番号S4180)が室温で40mlのdH2O中に懸濁された。50ミリリットルの沸騰dH2Oが250mlのフラスコ中でこのスラリーに添加され、5分間加熱された。このデンプン溶液が25℃まで冷却され、体積がdH2Oで100mlに調節された。このストック溶液を100mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH3.7で希釈(1:1)することによって、4(質量/体積)%の可溶性デンプン試験溶液が調製された。
8%ストック溶液を調製するために、8gの可溶性デンプン(Sigma社番号S4180)が室温で40mlの水中に懸濁された。次に、50mlの沸騰dH2Oが250mlのフラスコ中でこのスラリーに添加され、5分間加熱された。このデンプン溶液が25℃まで冷却され、体積がdH2Oで100mlに調節された。このストック溶液を100mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5で希釈(1:1)することによって、4(質量/体積)%の可溶性デンプン試験溶液が調製された。
TrGAシグナルペプチド、プロ配列、ならびに触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む成熟タンパク質をコードするDNA配列(配列番号4)からなるTrGA発現カセットが、Gateway(商標)エントリーベクターであるpDONR(商標)201(Invitrogen社、米国、カルフォルニア州、Carlsbad)中にクローニングされた。このTrGA発現カセットが、Gateway(商標)LR組換え反応によって、Gatewayの適合性デスティネーションベクターであるpREP3Y−DEST(図3)中にクローニングされた。
シゾサッカロミセスポンベ形質転換体が、選択培地(2×EMM−C)[64.4g/LのEMMブロス(Qbiogene社カタログ番号4110−032)、0.62g/Lのコンプリートサプリメント混合物(CSM−HIS−LEU−TRP、Qbiogene社カタログ番号4530−122)]を含む96ウェルマイクロタイタープレート(MTP)中に接種され、28℃で一晩温置された。一晩温置されたマイクロタイタープレートから、100mlの振とうフラスコ内の20mlの2×EMM−C液体培地に、200μLの育成されたシゾサッカロミセスポンベ培養物が接種され、Multitron振とうインキュベーター(スイス国、Bottmingen、Infors社)中280rpm、26℃で4日間温置された。この育成された培養物から、2mlのシゾサッカロミセスポンベ培養物がサンプリングされ、14,000rpmで5分間遠心分離(Sigma社)された。この上清が10kD級Vivaspin 500HTフィルター装置(独国、Hannover、VivaScience社)中に移され、1000Gで25分間遠心分離された。分離残余物が、0.015%のTween−80が加えられた50mMのNaAc pH4.5で元の出発体積に戻るまで希釈された。この溶液は別のアッセイに用いられた。
(A)以下の単一部位変異Q172F、Q208N、S211RおよびV314Hの組み合わせを有するTrGA変異体の構築のための実験が実施された。これらの変異体の通覧が以下に示される。
a) Q172F、Q208N
b) Q172F、S211R
c) Q172F、V314H
d) Q208N、S211R
e) Q208N、V314H
f) S211R、V314H
g) Q172F、Q208N、S211R
h) Q172F、Q208N、V314H
i) Q172F、S211R、V314H
j) Q208N、S211R、V314H
k) Q172F、Q208N、S211R、V314H
上記のアッセイを用いたエタノールスクリーニングアッセイにおいて、変異体が試験された。表7は、親TrGAの性能指数(PI)と比較して1.0よりも大きいPIを有する変異体についてのスクリーニングアッセイの結果を示す。PIは比活性(活性/酵素mg)の尺度である。比活性のPIは、変異体比活性を野生型比活性で割った商である「変異体比活性/野生型比活性」である。比活性のPIは1.0であり、1.0より大きいPIを有する変異体は親TrGAよりも大きい比活性を有する。この比活性は、エタノールスクリーニングアッセイによって測定された活性を上記のブラッドフォードアッセイで得られた結果で割ったものである。
A.変異体GAをコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターの構築
DNA配列である配列番号4を含んでいるTrGA発現カセットが、Gateway(商標)エントリーベクターであるpDONR(商標)201(Invitrogen社、米国、カリフォルニア州、Carlsbad)中にクローニングされた。このTrGA発現カセットは、Gateway(商標)LR組換え反応によって、国際公開第06/060062号に同様に記載されているGatewayの適合性デスティネーションベクターであるpTrex3g−DEST(図5)中にクローニングされた。pTrex3g−TrGA発現ベクター(図5)は、トリコデルマレーシ宿主中にTrGAタンパク質(配列番号2)の発現を可能にした。ベクターは、少なくとも以下の変異体、すなわち(1)V314H、(2)S211R、(3)Q208Nおよび(4)Q172Fをコードする、変更されたTrGAのcDNAを含むように構築された。
変異体GAを含んでいる発現ベクターが、RL−P37(IA52)に由来し各種の遺伝子欠失(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2)を有するトリコデルマレーシ宿主株中に、PDS−1000/ヘリウムシステム(BioRad社、カタログ番号165−02257)による粒子ボンバードメント法を用いて形質転換された。実験手順は以下に概説され、また国際公開第05/001036号の実施例6および11が参照される。
MMアセトアミドプレート上で5日間の育成後、安定な形態(morphology)を示す形質転換体が、30mlのProflo培地を含んでいる250mlの振とうフラスコ中に植菌された。Proflo培地は、30g/Lのα−ラクトース、6.5g/Lの(NH4)SO4、2g/LのKH2PO4、0.3g/LのMgSO4・7H2O、0.2g/LのCaCl2・2H2O、1ml/Lの400×微量元素塩溶液(クエン酸175g/L、FeSO4・7H2O 200g/L、ZnSO4・7H2O 16g/L、CuSO4・5H2O 3.2g/L、MnSO4・H2O 1.4g/L、H3BO3 0.8g/L、10%Tween80 2ml/L、ProFlo綿実粉22.5g/L(米国、テネシー州、メンフィス、Traders Protein社)、CaCO3 0.72g/L)を含有していた。28℃および140rpmで2日間の育成後、Proflo培養物の10%が、30mlのラクトース規定量培地を含有する250mlの振とうフラスコに移された。ラクトース規定量培地の組成は以下の通りであった、すなわち5g/Lの(NH4)2SO4、33g/Lの1,4−ピペラジンビス(プロパンスルホン酸)緩衝液、9g/Lのカサミノ酸、4.5g/LのKH2PO4、1.0g/LのMgSO4・7H2O、5ml/LのMazu DF60−P消泡剤(米国、イリノイ州、Mazur Chemicals社)、1000×微量元素溶液、pH5.5であり、40ml/Lの40(重量/体積)%ラクトース溶液が滅菌後にこの培地に添加された。ラクトース規定量培地を含有する振とうフラスコが28℃、140rpmで4〜5日間温置された。
単一変異の変異体a)V314H、b)S211R、c)Q172Fおよびd)Q208Nを発現するトリコデルマレーシ宿主株が、34℃、pH3.5における流加回分式14L発酵槽において、グルコース(Cerelose DE99)、KH2PO4、MgSO4・7H2O、(NH4)2SO4、CaCl2・2H2O、微量元素およびMazu消泡剤(DF6000K)を含む栄養培地中で育成された。グルコースが消費し終わると、育成温度およびpHが、それぞれ28℃および4.0まで変えられた。細胞物質がろ過によって除かれ、培養物上清が集められ、総タンパク質量として90%超のグルコアミラーゼを含有するように濃縮された。
親TrGAと比較してより高い性能指数を有すると、新規な小規模エタノール生産適用試験を用いて認定された変異体(表7/8参照)について、該スクリーニングの検証が実施された。部位の評価および組み合わせのライブラリー(表9)から得られた24の変異体が選択され、より大規模での発現および試験のためにトリコデルマレーシ中に直接、形質転換された。これらの変異体は、示差走査熱量計法(DSC解析は本明細書で以下に記載される。)を用いて熱変性について、および新規な第二の小規模エタノール生産適用アッセイを用いて性能について試験された。この方法は、2の工程、すなわち1)変異体をアニオン交換カラム中に注入してタンパク質濃度を正確に測定する工程、および2)野生型分子と比較したエタノール産生についての性能を計算するために、3の異なったTrGA濃度(乾燥固形分0.3−0.15−0.075g/28g)で変異体を滴定する工程からなっていた。
粗酵素調製物が、AKTA Explorer 100 FPLC装置(Amersham Biosciences社、米国、ニュジャージー州、Piscataway)を用いて精製された。β−シクロデキストリン(Sigma−Aldrich社、蘭国、Zwijndrecht、85.608−8)が、エポキシ活性化セファロースビーズ(GE Healthcare社、ベルギー国、Diegem、17−0480−01)に固定された。このカラムが酵素調製物からグルコアミラーゼを捕集するのに用いられた。25mMのトリス緩衝液pH7.5または10mMのα−シクロデキストリン(Sigma社、28705)を含有する50mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3を用いて、酵素がビーズから溶出された。SDS−PAGEによって、精製されたサンプルが分析された。変異体のタンパク質濃度を正確に測定するために、FPLCに基づいたタンパク質測定方法が開発された。精製されたマーカーTrGA分子のタンパク質濃度が、まず標準ブラッドフォード試験方法(Bio−Rad社カタログ番号500−0205)を用いて測定された。続いて、精製されたサンプルがResourceQ_1mlカラム(GE Healthcare社)中に注入され、酵素が500mMのNaClを有する25mMのトリスpH緩衝液で溶出された。ピーク面積が測定され、既知濃度の標準TrGAのピーク面積と比較してタンパク質濃度が計算された。
表10は、種々の組み合わせ変異体によるエタノールおよび糖(DP1、DP2、およびDP>3)の産生をまとめたものである。液化コーンマッシュのサンプルが得られ、希薄スチレッジを用いて乾燥固形分26%まで希釈された。このスラリーのpHが、4N硫酸を用いてpH4.3に調整された。マッシュの100mgのアリコートが32℃の水浴中に置かれ、放置平衡化された。100μlの400ppmの尿素の添加後、1mlの精製された変異体TrGA酵素サンプル(150μg/ml)または精製されたTrGA(300、150、75μg/ml)が各コーンマッシュサンプルに添加された。最後に、45mlの脱イオン水中に30分間水和させた15gのRed Star Red酵母(Lesaffre Yeast社、米国、ウィスコンシン州、ミルウォーキー)の溶液333μlが、各サンプルに添加された。サンプルが5、21、28、48および52時間後に採取され、Aminex HPX−87Hカラム9(Bio−Rad社)を用いたHPLCによって分析された。
2mlのエッペンドルフ遠心分離管に発酵槽液が入れられ、氷上で10分間冷却された。このサンプルが14,000Gで3分間遠心分離され、500μlの上清が50μlのキル(kill)溶液(1.1N硫酸)を含む試験管に移され、5分間静置された。5.0mlの水が試験管に添加され、次いで0.22μmのフィルタープレート(Multiscreen、Millipore社、蘭国、アムステルダム)でろ過され、そしてHPLCにかけられた。カラム温度:60℃、移動相:0.01N硫酸、流速0.6ml/分、検出器:RI、注入量:20μLであった。該カラムは電荷および分子量に基づいて分子、すなわちDP1(単糖)、DP2(二糖)、DP3(三糖)、DP>3(3超の重合度を有するオリゴ糖)、コハク酸、乳酸、グリセロール、メタノール、エタノールを分離する。
一組の組み合わせ変異体および組み合わせ変異体を構築するのに用いられたいくつかの単一部位変異体の比活性が、分析された(表13)。LR8(小規模生産適用アッセイで測定されたPIが1.56)が、さらに基質特異性に関して検討された。これは、GA変異体のグルコース産生速度を測定するためおよびLR8変異体の基質特異性を測定するためのMTPアッセイを確立することによって行われた。MTPアッセイは変異体の違いを見分けられることが見出され、ET7−1を除くすべての変異体が野生型(wt)トリコデルマレーシグルコアミラーゼよりも高い産生速度を示した。さらに、いくつかの変異体(LR8/ET8/Q172F)はTrGAよりも20〜30%優れた性能を示した。LR8は、可溶性コーンスターチおよび2の異なった液化コーンマッシュサンプル上で野生型と比較してより優れた性能を示した。
追加のTrGA変異体、とりわけSBD内に置換を有する変異体が作製され、トリコデルマレーシ中で直接スクリーニングされた。実施例1と同じようにして、別の10のTrGA部位飽和変異(SSM)ライブラリーが、テンプレートとしてpDONR−TrGAエントリーベクターを用いて、および表14に列挙されたプライマーを用いて構築された。該部位は、N61、G73、L417、T430、A431、E503、Q511、A535、A539およびN563を含んでいる。これらの部位の中で、E503、Q511、A535、A539およびN563は、TrGAのデンプン結合ドメイン内に位置している。その後、Invitrogen社によって提供された実験方法に従ってLR CLONASE(商標)II酵素混合物を用いてpTTT−Destベクター(図14)によって、組換えが実施された。組換え生成物は大腸菌最高効率DH5α(Invitrogen社)中に形質転換され、100μg/mLのアンピシリンが加えられた2×TY培地[Bactoトリプトン(Difco社)16g/L、Bacto酵母エキス(Difco社)10g/L、NaCL5g/L]上で平板培養された。37℃で一晩の温置後、各ライブラリーの96の単一コロニーが、100μg/mlのアンピシリンを含む2×TY寒天平板培地から採取され、100μg/mlのアンピシリンを含む200μLの2×TY培地を含むMTP中で37℃で24時間育成された。培養物が配列解析(ABI3100シーケンスアナライザー、Applied Biosystems社)に用いられた。各ライブラリーは、最終発現ベクター中に15〜19の異なったTrGA変異体を含んでいた。これらの変異体はトリコデルマレーシ中に個別に形質転換された。
実施例4〜6および11の結果に基づいて、選択された一組の組み合わせ変異体および単一部位変異体が、さらにこれらの変更された性質について特性解析された。この選択された一組は、I43、D44、N61、G73、G294、L417、T430、A431、E503、Q511、A535、A539および/またはN563に1または複数の置換を有する単一部位変異体および組み合わせ変異体を含む。変異体は、大規模発酵物から精製され、熱安定性および比活性のPIが測定された。具体的には、様々な基質、たとえばDP7、コーンスターチおよび液化物を用いて、比活性が測定された。結果が表18および19に示される。
トリコデルマレーシ(ハイポクレアジェコリーナ)グルコアミラーゼ(TrGA)の完全な3次元構造が、1.9Åの分解能で測定された。表20は、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの結晶構造を表す座標を示す。TrGAは、599の残基および野生型宿主において通常起きるであろうすべての翻訳後修飾を含むインタクトな形態で結晶化された。この結晶構造は、以下のように作製され分析された。
実施例13で同定されたTrGAの結晶構造が、アスペルギルスアワモリGA(AaGA)のすでに同定されている結晶構造の上に重ね合わされた。AaGA結晶構造はタンパク質データベース(PDB)から得られ、結晶化されたAaGAの形態は触媒ドメインのみを含む形態であった。すべての3の領域がインタクトな状態のトリコデルマレーシグルコアミラーゼの構造が、本明細書において1.8オングストロームの分解能まで測定された(表15および実施例12参照)。座標を用いて(表20参照)、この構造が、すでに測定されているアスペルギルスアワモリ株X100の触媒ドメインの座標(Aleshin,A.E.、Hoffman,C、Firsov,L.M.およびHonzatko,R.B.、「アスペルギルスアワモリ変異体X100からのグルコアミラーゼの精密化結晶構造(Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var.Xl00)」、J.Mol.Biol.、1994年、第238巻、p.575−591、およびPDB)とアラインメントされた。図12および13に見られるように、触媒ドメインの構造は非常にぴったりと重ね合わされ、この構造の重ね合わせに基づいて同等の残基の同定が可能となった。
Claims (24)
- 配列番号2のL417R/V、T430A/M、A431L/Q、E503A/V、 Q511H、A535R、A539RもしくはN563I/Kの変異から選択される2以上のアミノ酸置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の変異に対応する2以上のアミノ酸置換を含んでいるグルコアミラーゼ変異体であって、配列番号1、2、3、5、6、7、8または9と少なくとも90%の配列同一性を有するとともに、グルコアミラーゼ活性を有する、前記変異体。
- 親グルコアミラーゼが、配列番号1、2、3、5、6、7、8もしくは9と少なくとも90%の配列同一性を有する触媒ドメイン、または配列番号1もしくは2と少なくとも90%の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 配列番号1、2、3、5、6、7、8または9と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 配列番号1、2、3、5、6、7、8または9と少なくとも99.5%の配列同一性を有する、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼが、配列番号1または2である、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 配列番号2の70、137、141、143、146、148、169、297、321、350、375、376、415、418、421、433もしくは436の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する1以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 配列番号2の70、137、146、148、169、297、350、376、433もしくは436の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する1以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 配列番号2の70、141、146、148もしくは375の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する1以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 以下の置換、すなわち配列番号2のY70R/K/M/P/G/L/F、N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M、Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T、Y169D/F、T350S/E/A/N、N376Q/T/H/S/V、R433H/QもしくはI436A/Tの置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置の置換のうちの1以上をさらに含んでなる、請求項1に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼが、トリコデルマ種(Trichoderma spp.)、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)、フミコーラ種(Humicola spp.)、ペニシリウム種(Penicillium spp.)、タラロミセス種(Talaromycese spp.)またはシゾサッカロミセス種(schizosaccharomyces spp.)から得られたグルコアミラーゼから選択されてなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼが、トリコデルマ種またはアスペルギルス種から得られてなる、請求項10に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示してなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性を示してなる、請求項12に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を示してなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼと比較して高められた比活性を示してなる、請求項14に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性および高められた比活性の双方を示してなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載された変異体をコードしてなるポリヌクレオチド。
- 請求項17に記載されたポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- 請求項18に記載されたベクターを含んでなる宿主細胞。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載されたグルコアミラーゼ変異体を含んでなる酵素組成物。
- デンプン転化プロセスに用いられてなる、請求項20に記載された酵素組成物。
- アルコール発酵プロセスに用いられてなる、請求項20に記載された酵素組成物。
- 前記グルコアミラーゼ変異体の発現および産生に適した条件下に請求項19に記載された宿主細胞を培養する工程、および該グルコアミラーゼ変異体を産生する工程を含む、宿主細胞中のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法。
- 前記培養物からグルコアミラーゼ変異体を回収する工程をさらに含む、請求項23に記載された方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US98942607P | 2007-11-20 | 2007-11-20 | |
US60/989,426 | 2007-11-20 | ||
PCT/US2008/012934 WO2009067218A2 (en) | 2007-11-20 | 2008-11-20 | Glucoamylase variants with altered properties |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011502543A JP2011502543A (ja) | 2011-01-27 |
JP5594899B2 true JP5594899B2 (ja) | 2014-09-24 |
Family
ID=40352212
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010534956A Expired - Fee Related JP5594899B2 (ja) | 2007-11-20 | 2008-11-20 | 変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8058033B2 (ja) |
EP (3) | EP3323889B1 (ja) |
JP (1) | JP5594899B2 (ja) |
CN (1) | CN101868537B (ja) |
BR (1) | BRPI0820483B1 (ja) |
CA (1) | CA2705941C (ja) |
DK (3) | DK2816109T3 (ja) |
ES (2) | ES2527586T3 (ja) |
HU (1) | HUE050328T2 (ja) |
MX (1) | MX2010005461A (ja) |
PL (1) | PL2222842T3 (ja) |
WO (1) | WO2009067218A2 (ja) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2009003472A (es) * | 2006-10-10 | 2009-06-02 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de glucoamilasa con propiedades alteradas. |
US8592194B2 (en) | 2007-10-09 | 2013-11-26 | Danisco Us Inc. | Glucoamylase variants with altered properties |
US20110039307A1 (en) * | 2009-05-12 | 2011-02-17 | Henderson Jodi M | Ethanol yields in fermentation from an improved liquefaction process |
EP2461702B1 (en) | 2009-08-07 | 2018-11-21 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof |
PE20121504A1 (es) * | 2009-08-19 | 2012-11-05 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes de glucoamilasa |
US20120164695A1 (en) * | 2009-08-19 | 2012-06-28 | Danisco Us Inc. | Combinatorial variants of glucoamylase with improved specific activity and/or thermostability |
US9617527B2 (en) | 2010-04-14 | 2017-04-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
ES2565060T3 (es) * | 2010-04-14 | 2016-03-31 | Novozymes A/S | Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos |
EP2601300A1 (en) | 2010-08-06 | 2013-06-12 | Danisco US Inc. | Production of isoprene under neutral ph conditions |
AR082578A1 (es) | 2010-08-06 | 2012-12-19 | Danisco Us Inc | SACARIFICACION Y FERMENTACION A pH NEUTRO |
US20120276593A1 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Danisco Us Inc. | Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation |
JP2014512829A (ja) | 2011-04-29 | 2014-05-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | デンプンを液化及び糖化して高密度グルコースシロップを調製するための単一pHプロセス |
US8951764B2 (en) | 2011-08-05 | 2015-02-10 | Danisco Us Inc. | Production of isoprenoids under neutral pH conditions |
BR112014010045B1 (pt) | 2011-10-28 | 2021-12-21 | Danisco Us Inc | Polipeptídeo de alfa-amilase variante formadoras de malto-hexaose, composição compreendendo o mesmo, célula hospedeira, e métodos para remover uma mancha ou sujeira amilácea, para sacarificar uma composição que compreende amido, produção de uma composição alimentícia de desengomagem de um têxtil |
CN104053780A (zh) | 2011-12-09 | 2014-09-17 | 丹尼斯科美国公司 | 用于在微生物中生产蛋白质的来自枯草芽孢杆菌的核糖体启动子 |
CN104204214A (zh) | 2012-03-28 | 2014-12-10 | 丹尼斯科美国公司 | 用于制备高葡萄糖糖浆的低温法 |
WO2013169645A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
WO2013181647A2 (en) | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms |
EP2825643B1 (en) | 2012-06-08 | 2021-11-03 | Danisco US Inc. | Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers |
US20140024064A1 (en) | 2012-07-23 | 2014-01-23 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of fermentative alcohols |
AR092099A1 (es) * | 2012-08-14 | 2015-03-25 | Danisco Us Inc | Variantes de glucoamilasa de trichoderma reesei resistentes a la perdida de actividad relacionada con la oxidacion y su uso |
CA2878988A1 (en) | 2012-08-16 | 2014-02-20 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification |
US20150232901A1 (en) * | 2012-08-16 | 2015-08-20 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and isoamylase for saccharification |
MX2015002099A (es) * | 2012-08-22 | 2015-05-11 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes que tienen actividad glucoamilasa. |
US9879241B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-01-30 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same and uses thereof |
CA2883627A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of fermentation products |
WO2014059273A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of fermentation products |
WO2014081622A1 (en) | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
EP2931911A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Danisco US Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification |
WO2014099415A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification |
WO2014099523A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase variants |
WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
US9695406B2 (en) * | 2013-03-07 | 2017-07-04 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
EP3978604A1 (en) | 2013-03-11 | 2022-04-06 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
WO2014159309A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-02 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of alcohols |
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
EP3011020A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase from bacillaceae family member |
CN105518130A (zh) | 2013-06-21 | 2016-04-20 | 丹尼斯科美国公司 | 用于梭菌转化的组合物和方法 |
WO2015050723A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
US20160186102A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-06-30 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
WO2015057517A1 (en) | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Danisco Us Inc. | Use of hemicellulases to improve ethanol production |
CN105722989B (zh) | 2013-10-28 | 2020-12-18 | 丹尼斯科美国公司 | 发酵中的海藻糖酶 |
WO2015066669A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Danisco Us Inc. | Proteases in corn processing |
WO2015066667A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Danisco Us Inc. | Proteases in wheat processing |
WO2015077126A1 (en) | 2013-11-20 | 2015-05-28 | Danisco Us Inc. | Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof |
WO2015084920A2 (en) | 2013-12-04 | 2015-06-11 | Danisco Us Inc. | Glucoamylase variants |
WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
WO2015094714A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Proteases in grain processing |
CN103695386B (zh) * | 2013-12-25 | 2015-09-16 | 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 | 一种耐酸性高温β-淀粉酶突变体及其应用 |
CN107429267B (zh) * | 2014-12-19 | 2021-07-16 | 丹尼斯科美国公司 | 葡糖淀粉酶共混物 |
KR20170116159A (ko) | 2015-02-19 | 2017-10-18 | 다니스코 유에스 인크. | 향상된 단백질 발현 |
US20180362946A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-12-20 | Danisco Us Inc. | Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof |
US11447782B2 (en) | 2016-03-04 | 2022-09-20 | Danisco Us Inc. | Engineered ribosomal promoters for protein production in microorganisms |
US9598680B1 (en) * | 2016-08-05 | 2017-03-21 | Fornia Biosolutions, Inc. | G16 glucoamylase compositions and methods |
EP3703661A1 (en) | 2017-11-02 | 2020-09-09 | Danisco US Inc. | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
US20220264911A1 (en) | 2019-07-09 | 2022-08-25 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
CA3232987A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Marion BERNARDEAU | Feed additive compositions and methods for using the same |
WO2023122676A1 (en) | 2021-12-24 | 2023-06-29 | Danisco Us Inc. | Hybrid glucoamylases and methods of use thereof |
WO2024137350A2 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Danisco Us Inc. | Recombinant fungal strains and methods thereof for producing consistent proteins |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5534046A (en) | 1978-09-01 | 1980-03-10 | Cpc International Inc | Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production |
GB2089836B (en) | 1980-12-16 | 1984-06-20 | Suntory Ltd | Process for producing alcohol by fermentation without cooking |
US4794175A (en) | 1983-12-20 | 1988-12-27 | Cetus Corporation | Glucoamylase CDNA |
US4618579A (en) | 1984-09-28 | 1986-10-21 | Genencor, Inc. | Raw starch saccharification |
JPH0630586B2 (ja) | 1984-12-15 | 1994-04-27 | サントリー株式会社 | グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
EP0215594B2 (en) | 1985-08-29 | 2003-10-15 | Genencor International, Inc. | Heterologous polypeptide expressed in filamentous fungi, processes for their preparation, and vectors for their preparation |
US5024941A (en) | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
ATE125815T1 (de) | 1987-06-06 | 1995-08-15 | Omnigene Inc | Expressionsvektor für hefe. |
US6803499B1 (en) | 1989-08-09 | 2004-10-12 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US6777589B1 (en) | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
DK0551386T3 (da) | 1990-10-05 | 2004-05-10 | Genencor Int | Fremgangsmåde til behandling af bomuldsholdige stoffer med cellulase |
US5246853A (en) | 1990-10-05 | 1993-09-21 | Genencor International, Inc. | Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I |
US5475101A (en) | 1990-10-05 | 1995-12-12 | Genencor International, Inc. | DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase |
US5290474A (en) | 1990-10-05 | 1994-03-01 | Genencor International, Inc. | Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp |
JPH06503960A (ja) | 1990-12-10 | 1994-05-12 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | TRICHODERMA REESEIのβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニングおよび増幅によるセルロースの改良糖化 |
US5861271A (en) | 1993-12-17 | 1999-01-19 | Fowler; Timothy | Cellulase enzymes and systems for their expressions |
EP0777737B1 (en) | 1994-06-30 | 2005-05-04 | Novozymes Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
US5744716A (en) | 1995-06-08 | 1998-04-28 | Scp Global Technologies, A Division Of Preco, Inc. | Fluid displacement level, density and concentration measurement system |
US6537792B1 (en) | 1996-07-24 | 2003-03-25 | Iowa State University | Protein engineering of glucoamylase to increase pH optimum, substrate specificity and thermostability |
US6255084B1 (en) | 1997-11-26 | 2001-07-03 | Novozymes A/S | Thermostable glucoamylase |
US6352851B1 (en) * | 1998-07-15 | 2002-03-05 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
AU4769999A (en) * | 1998-07-15 | 2000-02-07 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
US6268328B1 (en) | 1998-12-18 | 2001-07-31 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
US6254914B1 (en) | 1999-07-02 | 2001-07-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Process for recovery of corn coarse fiber (pericarp) |
CN100510067C (zh) * | 1999-07-09 | 2009-07-08 | 诺维信公司 | 葡糖淀粉酶变体 |
CA2418317A1 (en) | 2000-08-11 | 2002-02-21 | Genencor International, Inc. | Bacillus transformation, transformants and mutant libraries |
US6582914B1 (en) | 2000-10-26 | 2003-06-24 | Genencor International, Inc. | Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations |
US7371546B2 (en) * | 2001-10-01 | 2008-05-13 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
GB0129864D0 (en) | 2001-12-13 | 2002-02-06 | Danisco | Animal feed |
CN1780560B (zh) | 2003-03-10 | 2011-05-25 | 布罗因联合公司 | 利用生淀粉生产乙醇的方法 |
ES2245621T3 (es) | 2003-03-10 | 2010-05-19 | Novozymes A/S | Procesos para un producto alcoholico. |
EP1862539B1 (en) | 2003-05-29 | 2012-01-25 | Danisco US Inc. | Novel trichoderma genes |
US6899910B2 (en) | 2003-06-12 | 2005-05-31 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Processes for recovery of corn germ and optionally corn coarse fiber (pericarp) |
WO2005052148A2 (en) | 2003-11-21 | 2005-06-09 | Genencor International, Inc. | Expression of granular starch hydrolyzing enzymes in trichoderma and process for producing glucose from granular starch substrates |
US7413887B2 (en) | 2004-05-27 | 2008-08-19 | Genecor International, Inc. | Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof |
KR101222413B1 (ko) | 2004-05-27 | 2013-01-16 | 다니스코 유에스 인크. | 아스퍼질러스 가와치 산-안정성 알파 아밀라제의 이종 발현및 입상 전분 가수분해에서의 이용 |
GB0423139D0 (en) | 2004-10-18 | 2004-11-17 | Danisco | Enzymes |
PL1824970T3 (pl) | 2004-11-30 | 2012-01-31 | Genencor Int | Glukoamylaza z Trichoderma reesei oraz jej homologi |
MX2007007862A (es) | 2004-12-30 | 2007-08-17 | Genencor Int | Proteasas fungales acidas. |
MX2009003472A (es) * | 2006-10-10 | 2009-06-02 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de glucoamilasa con propiedades alteradas. |
-
2008
- 2008-11-20 MX MX2010005461A patent/MX2010005461A/es active IP Right Grant
- 2008-11-20 DK DK14177958.7T patent/DK2816109T3/en active
- 2008-11-20 ES ES08851977.2T patent/ES2527586T3/es active Active
- 2008-11-20 EP EP17205190.6A patent/EP3323889B1/en active Active
- 2008-11-20 HU HUE17205190A patent/HUE050328T2/hu unknown
- 2008-11-20 CA CA2705941A patent/CA2705941C/en active Active
- 2008-11-20 DK DK17205190.6T patent/DK3323889T3/da active
- 2008-11-20 BR BRPI0820483-7A patent/BRPI0820483B1/pt active IP Right Grant
- 2008-11-20 JP JP2010534956A patent/JP5594899B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-20 DK DK08851977.2T patent/DK2222842T3/en active
- 2008-11-20 ES ES17205190T patent/ES2795989T3/es active Active
- 2008-11-20 PL PL08851977T patent/PL2222842T3/pl unknown
- 2008-11-20 EP EP08851977.2A patent/EP2222842B1/en active Active
- 2008-11-20 US US12/292,563 patent/US8058033B2/en active Active
- 2008-11-20 EP EP14177958.7A patent/EP2816109B1/en active Active
- 2008-11-20 CN CN2008801166952A patent/CN101868537B/zh active Active
- 2008-11-20 WO PCT/US2008/012934 patent/WO2009067218A2/en active Application Filing
-
2011
- 2011-09-30 US US13/251,116 patent/US8679792B2/en active Active
-
2014
- 2014-02-04 US US14/172,790 patent/US9290753B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2222842A2 (en) | 2010-09-01 |
PL2222842T3 (pl) | 2015-03-31 |
US8058033B2 (en) | 2011-11-15 |
HUE050328T2 (hu) | 2020-11-30 |
EP3323889B1 (en) | 2020-03-25 |
CA2705941C (en) | 2018-05-22 |
US20090275080A1 (en) | 2009-11-05 |
EP2816109A1 (en) | 2014-12-24 |
US9290753B2 (en) | 2016-03-22 |
WO2009067218A2 (en) | 2009-05-28 |
EP2816109B1 (en) | 2018-01-10 |
CN101868537B (zh) | 2013-11-06 |
ES2527586T3 (es) | 2015-01-27 |
DK2222842T3 (en) | 2015-01-19 |
JP2011502543A (ja) | 2011-01-27 |
DK3323889T3 (da) | 2020-06-29 |
CN101868537A (zh) | 2010-10-20 |
WO2009067218A3 (en) | 2009-08-06 |
DK2816109T3 (en) | 2018-04-16 |
US8679792B2 (en) | 2014-03-25 |
CA2705941A1 (en) | 2009-05-28 |
BRPI0820483B1 (pt) | 2022-04-12 |
MX2010005461A (es) | 2010-06-02 |
BRPI0820483A2 (pt) | 2014-10-14 |
US20120149087A1 (en) | 2012-06-14 |
EP2222842B1 (en) | 2014-10-15 |
ES2795989T3 (es) | 2020-11-25 |
EP3323889A1 (en) | 2018-05-23 |
US20140227754A1 (en) | 2014-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5594899B2 (ja) | 変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体 | |
US11130946B2 (en) | Glucoamylase variants with altered properties | |
JP5594898B2 (ja) | 性質が変えられたグルコアミラーゼ変異種 | |
US8592194B2 (en) | Glucoamylase variants with altered properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120918 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121112 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130318 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130723 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131125 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20131203 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20131219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20131219 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140523 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140708 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140804 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5594899 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |