KR20170116159A - 향상된 단백질 발현 - Google Patents

Abstract

일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 핵산 및 박테리아 세포와, 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

향상된 단백질 발현

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 2월 19일자로 출원된, 현재 계류 중인 미국 가출원 제62/118,382호의 우선권을 주장한다.

서열 목록의 언급

"NB40178WOPCT-Sequence-Listing.txt"로 명명된 텍스트 파일 서열 목록의 전자 제출 내용은 2015년 2월 17일자로 생성되었으며, 크기가 27 KB이고, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

기술분야

일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 관심 대상의 단백질의 발현을 향상시키는 유전자 변화를 갖는 그람(Gram)-양성 미생물, 예컨대 바실루스(Bacillus) 종을 포함한다.

유전 공학은 산업용 생물반응기로서, 세포 공장으로서 그리고 식품 발효에서 사용되는 미생물의 개선을 허용하였다. 다수의 바실루스 종을 포함하는 그람-양성 유기체가 다수의 유용한 단백질 및 대사 산물을 생성하는 데 사용된다 (예를 들어 문헌[Zukowski, "Production of commercially valuable products", Doi and McGlouglin (eds.) Biology of Bacilli: Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass pp 311-337 [1992]] 참조). 산업계에서 사용되는 일반적인 바실루스 종은 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 바실루스 종의 주(strain)는, 일반적 산업 현장에서의 그의 사용 (예를 들어, 특히 세제용 효소, 바이오매스(biomass) 연료 생성)에 더하여, 그의 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정됨(generally recognized as safe)) 상태 때문에, 식품 및 제약 산업에서 이용되는 단백질의 생성을 위한 천연 후보이다. 그람-양성 유기체에서 생성되는 단백질의 예는 효소, 예를 들어, 아밀라아제, 중성 프로테아제, 알칼리 (또는 세린) 프로테아제, 및 풀룰라나아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

박테리아 숙주 세포에서의 단백질 생성의 이해에 있어서의 진전에도 불구하고, 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 발현하는 새로운 재조합 주의 개발 필요성이 여전히 남아있다.

특정 실시 양태에서, 본 발명은 재조합(즉, 유전자 변형) 박테리아 (숙주) 세포, 및 관심 대상의 단백질을 코딩하는 관심 대상의 유전자의 증가된 발현을 위한 이의 방법에 관한 것이다. 특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 (변형) 박테리아 숙주 세포에서의 관심 대상의 하나 이상의 단백질의 증가된 생성에 관한 것이다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의 하나 이상의 단백질을 발현시키고/시키거나 생성하기 위한 박테리아 숙주 세포의 변형 방법에 관한 것이다. 특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의 유전자와 작동가능하게 조합된 특정한 강력 5’ UTR의 사용이 관심 대상의 단백질의 더 많은 발현으로 이어짐을 입증하는, 본원에 개시된 놀랍고도 예기치 않은 결과에 관한 것이다.

따라서, 특정 실시 양태에서, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 5' 비번역 영역(5' UTR) 및 관심 대상의 이종 유전자의 코딩 영역을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 5’에서 3’ 방향으로 5’ 비번역 영역(5' UTR) 및 관심 대상의 이종 유전자의 코딩 영역을 포함하는 DNA 분자에 관한 것으로서, 여기서, 5' UTR은 바실루스 종으로부터의 aprE 프로테아제 유전자로부터 유래된 것이다. 다른 실시 양태에서, 5' UTR은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 aprE 유전자로부터 유래된다.

따라서, 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자의 발현에서 사용하기 위한 본 발명의 5' UTR은 비. 서브틸리스 aprE-5' UTR로부터 유래된다. 특정한 다른 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자의 발현에서 사용하기 위한 본 발명의 5' UTR은 하기 서열 번호로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 비. 서브틸리스 aprE-5' UTR로부터 유래된다: 서열 번호 2, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 17. 특정한 다른 실시 양태에서, 본 발명의 5' UTR은 하기 서열 번호로 나타낸 핵산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 서열 번호 2, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 17.

또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 상기 DNA 서열들 중 임의의 것을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 상기에 개시된 DNA 서열들 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 바실루스 종이다. 또 다른 측면에서, 바실루스 종은 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스(B. lentus), 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 메가테륨(B. megaterium), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 바실루스 sp . 주는 비. 서브틸리스 주이다. 또 다른 측면에서, 바실루스 sp . 주는 비. 리케니포르미스 주이다.

일 측면에서, 관심 대상의 유전자는 효소를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 효소는 아실 트랜스퍼라아제, 알파-아밀라아제, β-아밀라아제, 알파-갈락토시다아제, 아라비노시다아제, 아릴 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 카라기나아제, 카탈라아제, 셀로바이오히드롤라아제, 셀룰라아제, 콘드로이티나아제, 큐티나아제, 엔도-베타-1,4-글루카나아제, 엔도-β-만난아제, 에스테라아제, 엑소-만난아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 케라티나아제, 락카아제, 락타아제, 리그니나아제, 리파아제, 리폭시게나아제, 만난아제, 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙티나아제, 펜토사나아제, 퍼옥시다아제, 퍼히드롤라아제, 페놀옥시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 람노갈락투로나아제, β-글루카나아제, 탄나아제, 트랜스글루타미나아제, 자일란 아세틸-에스테라아제, 자일라나아제, 자일로글루카나아제, 및 자일로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 특정한 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 1에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 3의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 3의 서열은 비. 리케니포르미스 알파-아밀라아제 (LAT) 유전자를 포함하는 LAT 발현 카세트로서, 이는 천연 LAT 프로모터, 천연 LAT 5'UTR, 천연 LAT 신호 펩티드 서열 및 천연 LAT 전사 종결자를 포함한다).

다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 2에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 11의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 11의 서열은 서열 번호 2의 aprE-5'UTR이 바실루스 데라미피칸스(Bacillus deramificans) 풀룰라나아제(PUL)에 작동가능하게 연결된 것을 포함하며, 여기서, 상기 풀룰라나아제의 N-말단의 104개 아미노산은 결실되었고, 이는 본원에서 "PULm104"로 칭해진다).

또 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 3에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 12의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 12의 서열은 5’에서 3’ 방향으로 rrnI P2 프로모터 (서열 번호 20)가 aprE-5'UTR (서열 번호 2)과 작동가능하게 조합된 것이 전장 LAT ORF(즉, LAT 신호 펩티드 및 성숙 LAT 폴리펩티드를 코딩함)와 작동가능하게 조합된 것을 포함한다.

특정한 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 3에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 13의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 13의 서열은 5’에서 3’ 방향으로 rrnI P2 프로모터 (서열 번호 20)가 aprE-5'UTR (서열 번호 2)과 작동가능하게 조합된 것이 LAT 신호 펩티드와 작동가능하게 조합된 것이 PULm104 코딩 ORF와 작동가능하게 조합된 것을 포함한다).

특정한 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 4에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 14의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 14의 서열은 5’에서 3’ 방향으로 LAT 프로모터가 aprE-5'UTR (서열 번호 2)과 작동가능하게 조합된 것이 LAT 신호 펩티드와 작동가능하게 조합된 것이 성숙 AmyS 변이형 폴리펩티드 코딩 ORF와 작동가능하게 조합된 것을 포함한다).

특정한 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 4에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 15의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 15의 서열은 5’에서 3’ 방향으로 LAT 프로모터가 aprE-5'UTR (서열 번호 9; "V2 aprE-5'UTR"로도 칭해짐)과 작동가능하게 조합된 것이 LAT 신호 펩티드와 작동가능하게 조합된 것이 성숙 AmyS 변이형 폴리펩티드 코딩 ORF와 작동가능하게 조합된 것을 포함한다).

또 다른 실시 양태에서, DNA 분자는 실시예 4에 나타낸 핵산 서열, 서열 번호 16의 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(즉, 서열 번호 16의 서열은 5’에서 3’ 방향으로 LAT 프로모터가 aprE-5'UTR (서열 번호 10; "V3 aprE-5'UTR"로도 칭해짐)과 작동가능하게 조합된 것이 LAT 신호 펩티드와 작동가능하게 조합된 것이 성숙 AmyS 변이형 폴리펩티드 코딩 ORF와 작동가능하게 조합된 것을 포함한다).

특별한 실시 양태에서, DNA 분자는 서열 번호 11의 핵산 서열을 포함한다.

다른 실시 양태에서, 본 발명은 형질전환된 바실루스 spp. 박테리아를 관심 대상의 단백질의 발현에 적합한 배지에서 성장시키는 단계를 포함하는, 바실루스 spp. 박테리아에서 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 여기서, 바실루스 spp. 박테리아는 관심 대상의 단백질을 코딩하는 DNA 및 바실루스 spp. 박테리아의 aprE 프로테아제 유전자로부터의 5’ UTR을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환되고, 관심 대상의 단백질의 발현은 aprE 5' UTR을 포함하지 않는 발현 카세트로 형질전환된 바실루스 spp. 박테리아로부터의 관심 대상의 단백질의 발현과 비교하여 증가된다. 추가의 측면에서, 관심 대상의 단백질이 배지로부터 회수된다. 일 측면에서, 관심 대상의 단백질은 세포외로 분비된다. 또 다른 측면에서, 관심 대상의 단백질은 세포 내에 축적된다.

또 다른 측면에서, DNA 분자는 비. 서브틸리스로부터의 aprE 5' UTR을 포함한다.

또 다른 측면에서, DNA 분자는 리보솜 RNA 유전자로부터의 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 리보좀 RNA 유전자 프로모터는 P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 rrnE 및 P3 rrnE로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, DNA 분자는 추가로 리보솜 단백질 유전자로부터의 프로모터를 포함한다. 또 다른 측면에서, 리보솜 단백질 유전자 프로모터는 rpsD, P1 rpsJ, P2 rpsJ 및 시그마 인자 프로모터 rpoD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 프로모터는 LAT 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 상동 단백질이다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 이종 단백질이다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 효소이다. 특정 실시 양태에서, 효소는 아실 트랜스퍼라아제, 알파-아밀라아제, β-아밀라아제, 알파-갈락토시다아제, 아라비노시다아제, 아릴 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 카라기나아제, 카탈라아제, 셀로바이오히드롤라아제, 셀룰라아제, 콘드로이티나아제, 큐티나아제, 엔도-베타-1, 4-글루카나아제, 엔도-β-만난아제, 에스테라아제, 엑소-만난아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 케라티나아제, 락카아제, 락타아제, 리그니나아제, 리파아제, 리폭시게나아제, 만난아제, 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙티나아제, 펜토사나아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 람노갈락투로나아제, β-글루카나아제, 탄나아제, 트랜스글루타미나아제, 자일란 아세틸-에스테라아제, 자일라나아제, 자일로글루카나아제, 및 자일로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시 양태에서, 본 방법은 관심 대상의 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 방법은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 상기 관심 대상의 단백질이 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 방법은 관심 대상의 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 측면은 상기에 개시된 방법에 의해 생성되는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 포함한다.

도 1은 플라스미드 pICatH-LATori1이다.
도 2는 벡터 pHPLT-Blich-int-cassette의 지도이다.
도 3은 벡터 pKB360-AprE-WT-AmyS 변이체의 지도이다.

본 발명의 조성물 및 방법을 상세하게 기술하기 전에, 하기 용어가 명확함을 위하여 정의된다. 정의되지 않은 용어 및 약어는 본 기술 분야에서 사용되는 그의 일상적인 의미에 부합되어야 한다. 본원에서 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 달리 지시되지 않으면, 본 발명의 실시는 분자 생물학, 단백질 공학, 및 미생물학에서 일반적으로 이용되는 통상적인 기술을 포함한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시에서 그 용도가 발견되지만, 일부 적합한 방법 및 재료가 본원에서 설명된다. 바로 아래에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서에 대하여 참고로 더 충분히 설명된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은, 그 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않으면, 복수형을 포함한다. 달리 지시되지 않으면, 핵산 서열은 5’에서 3’ 방향으로 좌측에서 우측으로 적히며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 적힌다. 본 발명은 반대로 지시되지 않으면, 본원에 기술된 특정한 방법, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않음이 이해되어야 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 매 최대 수치 제한은, 마치 매 하한 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 매 하한 수치 제한을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 매 최소 수치 제한은, 마치 더 큰 매 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 더 큰 매 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 매 수치 범위는 마치 더 좁은 매 수치 범위 전부가 본원에 명백하게 적힌 것처럼 그러한 더 넓은 수치 범위 내에 있는 더 좁은 매 수치 범위를 포함할 것이다.

수치 값과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, “약”이라는 용어는 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않으면, 그 수치 값의 +/- 0.5의 범위를 나타낸다. 예를 들어, “약 6의 pH 값”이라는 어구는 그 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않으면 5.5 내지 6.5의 pH 값을 나타낸다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 재료를 이제 설명한다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 본원에 참고로 포함되며, 방법 및/또는 재료 (이와 관련하여 간행물이 인용됨)를 개시하고 설명하기 위하여 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 본 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대한 것이며, 본 발명의 조성물 및 방법이 종래 발명에 의해 그러한 간행물에 선행한다는 권리가 주어지는 것은 아님을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과는 상이할 수 있다.

A. 정의

본원에서 사용되는 바와 같이, “숙주 세포”는 새롭게 도입된 핵산 서열을 위한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 그람-양성 숙주 세포 바실루스 sp.이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “바실루스 속” 또는 “바실루스 sp.”는 당업자에게 공지된 바와 같이 “바실루스” 속 내의 모든 종을 포함하며, 이는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 라우투스, 및 비. 튜린기엔시스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바실루스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 상기 속은 현재 “게오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)”로 명명된 비. 스테아로서모필루스와 같은 유기체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에서의 저항성 내생포자의 생성은 바실루스 속의 정의적 특징으로 간주되지만, 이러한 특성은 현재 명명된 알리시클로바실루스(Alicyclobacillus), 암피바실루스(Amphibacillus), 아네우리니바실루스(Aneurinibacillus), 아녹시바실루스(Anoxybacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 필로바실루스(Filobacillus), 그라실리바실루스(Gracilibacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 살리바실루스(Salibacillus), 서모바실루스(Thermobacillus), 우레이바실루스(Ureibacillus), 및 비르기바실루스(Virgibacillus)에도 적용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “핵산”은 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA뿐만 아니라 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 또는 일부도 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 코딩할 수 있음이 이해된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “벡터”라는 용어는 세포에서 복제될 수 있고 새로운 유전자 또는 DNA 절편을 세포 내로 데려갈 수 있는 임의의 핵산을 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 상이한 숙주 세포들 사이에서의 이전용으로 설계된 핵산 구성물을 나타낸다. “발현 벡터”는 외래 세포 내에 이종 DNA 단편을 포함시켜 외래 세포에서 이를 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하다. “표적화 벡터”는 이것이 형질전환시키는 숙주 세포의 염색체 내의 영역에 상동성이고 그 영역에서 상동 재조합을 구동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 표적화 벡터는 상동 재조합을 통하여 세포의 염색체 내에 돌연변이를 도입하는 데 있어서 그 용도가 발견된다. 일부 실시 양태에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼(stuffer) 서열 또는 측면(flanking) 서열)을 포함한다. 말단들은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및/또는 구성은 당업자의 지식 내에 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “플라스미드”라는 용어는 벡터로서 사용되는, 그리고 많은 박테리아 및 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구성물을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 포함될 수 있다.

본원에 정의된 바와 같이, “LAT 아밀라아제”라는 용어는 비. 리케니포르미스 α-아밀라아제 "AmyL"을 나타내며, 따라서, 상기 용어들은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

“정제된” 또는 “단리된” 또는 “풍부화된”은 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 결부되어 있는 천연 발생 구성 성분의 일부 또는 이들 전부로부터 이를 분리함에 의해 그의 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 그러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 요망되지 않는 전 세포, 세포 잔사, 불순물, 외부 단백질 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에서의 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 성취될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 관심 대상의 생체분자 (예를 들어, 관심있는 단백질)의 발현을 나타낼 때 “향상된”, “개선된” 및 “증가된”이라는 용어는 생체분자의 발현이 본원의 교시에 따라 변경된 것은 아니지만 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 숙주 주 (예를 들어, 야생형 및/또는 모(parental) 주)에서의 발현 수준보다 더 높음을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질에 적용될 때 “발현”이라는 용어는 단백질을 유전자의 핵산 서열을 기반으로 하여 생성하고 따라서 전사 및 번역 둘 모두를 포함하는 과정을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 세포 내에 도입하는 맥락에서, “도입되다”라는 용어는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 이전시키는 데 적합한 임의의 방법을 나타낸다. 그러한 도입 방법은 원형질체 융합, 형질감염, 형질전환, 콘쥬게이션(conjugation), 및 형질도입을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 문헌[Ferrari et al., "Genetics”, Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72, [1989]] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, “형질전환된” 및 “안정하게 형질전환된”이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 개입에 의해 도입된 세포를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내에 통합될 수 있거나 적어도 두 세대 동안 유지되는 에피좀 플라스미드로서 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “선발가능 마커” 또는 “선발 마커”라는 용어는 숙주 세포에서 발현이 가능한 핵산 (예를 들어, 유전자)으로서 그 핵산을 포함하는 숙주의 용이한 선발을 허용하는 핵산을 나타낸다. 그러한 선발가능 마커의 예는 항미생물제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, “선발가능 마커”라는 용어는 숙주 세포가 관심 대상의 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 선발가능 마커는 외인성 DNA를 포함하는 세포와 형질전환 동안 어떠한 외인성 서열도 받지 않은 세포의 구별을 허용하기 위하여 숙주 세포에 항미생물적 내성 또는 대사적 이점을 부여하는 유전자이다. 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 영양요구성 마커, 예컨대 트립토판; 및 검출 마커, 예컨대 β-갈락토시다아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프로모터”라는 용어는 하류 유전자의 전사를 유도하는 기능을 하는 핵산 서열을 나타낸다. 실시 양태들에서, 프로모터는 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절하다. 프로모터는, 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 (“제어 서열”로도 칭해짐)과 함께, 주어진 유전자의 발현에 필요하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적으로 부착된” 또는 “작동가능하게 연결된”은 공지되거나 요망되는 활성을 갖는 조절 영역 또는 기능성 도메인, 예컨대 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역은 조절 영역 또는 기능성 도메인이 그의 공지되거나 요망되는 활성에 따라 표적 (예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 제어하도록 하는 것과 같은 방식으로 그 표적에 부착되거나 연결됨을 의미한다.

“유전자 변화” 또는 “유전자 변경”이라는 용어는 재조합 세포를 설명하는 데 사용될 때 이 세포가 모 세포와 비교하여 적어도 하나의 유전자 차이를 가짐을 의미한다. 상기 하나 이상의 유전자 차이는 염색체 돌연변이 (예를 들어, 염색체 영역의 삽입, 결실, 치환, 역위(inversion), 또 다른 것에 의한 대체 (예를 들어, 이종 프로모터에 의한 염색체 프로모터의 대체) 등) 및/또는 염색체외(extra-chromosomal) 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 플라스미드)의 도입일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 염색체외 폴리뉴클레오티드는 안정한 형질감염체(transfectant)/형질전환체를 생성하도록 숙주 세포의 염색체 내에 통합될 수 있다.

유전자의 “불활성화”는 유전자의 발현 또는 그의 코딩된 생체분자의 활성이 차단되거나 달리 그의 공지된 기능을 발휘할 수 없음을 의미한다. 불활성화는 임의의 적합한 수단을 통하여, 예를 들어 상기에 기술된 바와 같이 유전자 변화를 통하여 일어날 수 있다. 일 실시 양태에서, 불활성화된 유전자의 발현 생성물은 그 단백질의 생물학적 활성에 있어서의 상응하는 변화를 갖는 절두형(truncated) 단백질이다.

일부 실시 양태에서, 불활성화는 결실에 의해 달성된다. 일부 실시 양태에서, 결실에 대하여 표적화된 영역 (예를 들어, 유전자)은 상동 재조합에 의해 결실된다. 예를 들어, 결실에 대하여 표적화되는 영역에 대하여 상동성인 서열들 (여기서, 상기 서열들은 본원에서 “상동성 박스(homology box)”로서 칭해질 수 있음)이 양측에 있는 선발 마커를 갖는 유입 서열을 포함하는 DNA 구성물이 사용된다. DNA 구성물은 숙주 염색체의 상동 서열에 맞추어 정렬되며, 이중 교차 사건(double crossover event)에서 결실에 대한 표적화된 영역은 숙주 염색체에서 절단된다.

“삽입” 또는 “부가”는 천연 발생 서열 또는 모 서열과 비교하여, 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 부가된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “치환”은 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체하여 생긴다.

유전자를 돌연변이시키는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation), 랜덤 돌연변이의 생성, 및 갭 형성 이중가닥 접근법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 미국 특허제4,760,025호; 문헌[Moring et al., Biotech. 2:646 [1984]]; 및 문헌[Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12:9441 [1984]] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 유전자”는 상이한, 그러나 일반적으로 관련된 종으로부터의 한 쌍의 또는 이보다 더 많은 유전자를 나타내며, 이는 서로 상응하고 서로와 동일하거나 매우 유사하다. 상기 용어는 유전자 중복(genetic duplication)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 유사 유전자(paralogous gene))뿐만 아니라 종분화(speciation)(즉, 새로운 종의 발생)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 이종상동성 유전자(orthologous gene))도 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “오르소로그(ortholog)” 및 “이종상동성 유전자”는 종분화에 의해 공통 조상 유전자(즉, 상동 유전자)로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 오르소로그는 진화 과정 동안 동일 기능을 유지한다. 오르소로그의 확인은 새롭게 서열결정된 게놈에서의 유전자 기능의 신뢰가능한 예측에서 그 용도가 발견된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “파라로그(paralog)” 및 “유사 유전자”는 게놈 내에서의 중복에 의해 연관된 유전자를 나타낸다. 오르소로그는 진화 과정 내내 동일한 기능을 유지하지만, 파라로그에서는, 심지어 일부 기능이 흔히 원래의 것에 연관된다 해도, 새로운 기능이 발달된다. 유사 유전자의 예는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트롬빈 (이들 전부는 세린 프로테이나아제이며, 동일 종 내에서 함께 나타남)을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동성”은 서열 유사성 또는 동일성을 나타내며, 이때 동일성이 바람직하다. 이러한 상동성은 본 기술 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 결정된다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]]; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]]; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, “상사(analogous) 서열”은 유전자의 기능이 바실루스 서브틸리스 주 168로부터의 표기된 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 부가적으로, 상사 유전자는 바실루스 서브틸리스 주 168 유전자의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 다르게는, 상사 서열은 비. 서브틸리스 168 영역에서 발견되는 유전자의 70 내지 100%에 정렬되고/되거나 비. 서브틸리스 168 염색체에서의 유전자와 정렬되는 영역에서 발견되는 적어도 5 내지 10개의 유전자를 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 상기 특성들 중 하나 초과의 특성이 서열에 적용된다. 상사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정된다. 일반적으로 사용되는 정렬 방법으로는 BLAST가 있지만, 상기 및 하기에 나타낸 바와 같이, 서열들의 정렬에서 그 용도가 또한 발견되는 다른 방법이 있다.

유용한 알고리즘의 하나의 예로는 PILEUP이 있다. PILEUP은 진행식 쌍정렬(pairwise alignment)을 이용하여 관련 서열들의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 이것은 또한 정렬을 생성하는 데 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 나타낼 수 있다. PILEUP은 펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행식 정렬 방법의 단순화를 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]]). 상기 방법은 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)에 의해 설명된 것과 유사하다 (문헌[Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중 말단 갭을 포함한다.

유용한 알고리즘의 또 다른 예로는 알츠슐(Altschul) 등에 의해 설명된 BLAST 알고리즘이 있다 (문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]]; 및 문헌[Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (문헌[Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480(1996)] 참조). WU-BLAST-2는 몇몇 검색 파라미터를 이용하며, 이들 중 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 파라미터는 하기 값으로 설정된다: 중첩 범위(overlap span) =1, 중첩 분율(overlap fraction) = 0.125, 워드 역치(word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값(dynamic value)이며, 관심 대상의 서열을 검색하는 특정 데이터베이스의 구성 및 특정 서열의 구성에 따라 프로그램 그 자체에 의해 확립된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키기 위하여 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 % 값은 정렬된 영역에서 매칭 동일 잔기의 수를 “더 긴” 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 결정된다. “더 긴” 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제적인 잔기를 갖는 것이다 (정렬 스코어(score)를 최대화하기 위하여 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시됨).

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 확인된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "서열 동일성 퍼센트(%)”는 관심 대상의 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 이는 상기 서열들을 정렬하고 갭을 도입하여 (필요할 경우) 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서 정의된다.

“상동체” (또는 “호모로그(homolog)”)는 당해 아미노산 서열 및 당해 뉴클레오티드 서열과 특정한 정도의 동일성을 갖는 엔티티(entity)를 의미한다. 상동 서열은 통상적인 서열 정렬 툴(tool) (예를 들어, Clustal, BLAST 등)을 이용할 경우 당해 서열에 대하여 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상동체는 달리 특정되지 않으면 당해 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 잔기를 포함한다.

서열 정렬 수행 방법 및 서열 동일성 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 과도한 실험 없이 수행될 수 있고, 동일성 값의 계산은 명확함을 가지고서 얻어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]; 및 ALIGN 프로그램 (문헌[Dayhoff (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)]을 참조한다. 다수의 알고리즘이 서열 정렬 및 서열 동일성 결정에 이용가능하며, 이는 예를 들어 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol . Biol . 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌[Smith et al. (1981) Adv . Appl . Math. 2: 482]의 국부 상동성 알고리즘; 문헌[Pearson et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . 85: 2444]의 유사성 검색 방법; 스미스(Smith)-워터맨(Waterman) 알고리즘 (문헌[Meth . Mol . Biol. 70: 173-187 (1997)]; 및 BLASTP, BLASTN, 및 BLASTX 알고리즘 (문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 참조)을 포함한다.

이러한 알고리즘을 이용한 전산화 프로그램이 또한 이용가능하며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어, 또는 WU-BLAST-2 (문헌[Altschul et al., Meth.Enzymol., 266: 460-480 (1996)]); 또는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(GCG)의 패키지, 버전 8에서 이용가능한 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA; 및 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 CLUSTAL. 당업자라면, 비교되는 서열들의 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정되는 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된다. 구체적으로, 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 Clustal W (문헌[Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680])를 사용함으로써 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “혼성화”라는 용어는 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 핵산의 한 가닥이 염기쌍 형성을 통하여 상보성 가닥과 연결되는 과정을 나타낸다.

핵산 서열은 두 서열이 중간 정도의 엄격도 내지 고 엄격도의 혼성화 및 세척 조건 하에서 서로 특이적으로 혼성화될 경우 기준 핵산 서열에 “선택적으로 혼성화가능”한 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도(Tm)를 기반으로 한다. 예를 들어, “최대 엄격도”는 전형적으로 대략 Tm-5℃ (프로브의 Tm보다 5° 아래)에서 나타나며; “고 엄격도”는 Tm보다 대략 5 내지 10℃ 아래에서 나타나며; “중간 엄격도”는 프로브의 Tm보다 대략 10 내지 20℃ 아래에서 나타나며; “저 엄격도”는 Tm보다 대략 20 내지 25℃ 아래에서 나타난다. 기능적으로, 최대 엄격도 조건은 혼성화 프로브와 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 확인하는 데 사용될 수 있는 반면, 중간 또는 저 엄격도 혼성화는 폴리뉴클레오티드 서열 상동체를 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.

중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건 및 고 엄격도 혼성화 조건은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 고 엄격도 조건의 예는 약 42℃에서의 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 μg/ml의 변성 캐리어(carrier) DNA에서의 혼성화, 이어서 실온에서의 2X SSC 및 0.5% SDS에서의 2회의 세척 및 42℃에서의 0.1X SSC 및 0.5% SDS에서의 추가의 2회의 세척을 포함한다. 중간 정도의 엄격도의 조건의 예는 37℃에서의, 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성 분쇄(sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서의 하룻밤 인큐베이션, 이어서 약 37 내지 50℃에서의 1x SSC에서의 필터의 세척을 포함한다. 당업자라면 인자, 예컨대 프로브 길이 등을 수용하기 위하여 필요할 경우 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알고 있다.

“재조합”이라는 용어는, 생물학적 성분 또는 조성물 (예를 들어, 세포, 핵산, 폴리펩티드/효소, 벡터 등)과 관련하여 사용될 때, 생물학적 성분 또는 조성물이 자연에서는 발견되지 않는 상태로 있음을 나타낸다. 환언하면, 생물학적 성분 또는 조성물은 인간 개입에 의해 그의 자연 상태로부터 변형되었다. 예를 들어, 재조합 세포는 그의 천연 모(즉, 비-재조합) 세포에서는 발견되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는 세포, 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 양으로 발현하는 세포, 및/또는 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 조건 하에 발현하는 세포를 포함한다. 재조합 핵산은 천연 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있고/있거나 이종성 서열 (예를 들어, 이종성 프로모터, 비-천연 또는 변이형 신호 서열을 코딩하는 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나, 인트론 서열이 없을 수 있고/있거나 단리된 형태로 존재할 수 있다. 재조합 폴리펩티드/효소는 천연 서열과는 하나 이상의 아미노산만큼 상이할 수 있고/있거나, 이종성 서열과 융합될 수 있고/있거나, 절두되거나 아미노산의 내부 결실을 가질 수 있고/있거나, 천연 세포에서는 발견되지 않는 방식으로 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터의 세포에서의 존재로 인하여 폴리펩티드를 과다발현하는 재조합 세포로부터) 발현될 수 있고/있거나 단리된 형태로 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드/효소는 그의 야생형 대응물과 동일하지만 비-천연 형태로 (예를 들어, 단리되거나 풍부화된 형태로) 존재하는 서열을 갖는다는 것이 강조된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “표적 서열”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 게놈 내에 삽입되는 것이 요망될 경우 당해 서열을 코딩하는 숙주 세포에서의 DNA 서열을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 코딩하는 반면, 다른 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 코딩한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “측면 서열”은 논의되고 있는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 나타낸다 (예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B의 측면에 A 및 C 유전자 서열이 있다). 일 실시 양태에서, 유입 서열에는 양측에 상동성 박스가 있다. 또 다른 실시 양태에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 양측에 스터퍼 서열이 있는 단위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 있다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실루스 염색체에서의 서열에 대하여 상동성을 갖는다. 이러한 서열은 바실루스 염색체에서 새로운 구성물이 통합되게 되는 장소 및 바실루스 염색체의 어떤 부분이 유입 서열에 의해 대체될 것인지를 지시한다. 일 실시 양태에서, 선발 마커의 5’ 및 3’ 말단의 측면에는 불활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 있다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 존재한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 마커”, “증폭가능한 유전자” 및 “증폭 벡터”라는 용어는 적절한 성장 조건 하에 유전자의 증폭을 가능케 하는, 유전자를 코딩하는 벡터 또는 유전자를 나타낸다.

“주형 특이성”은 효소의 선택에 의해 대부분의 증폭 기술에서 달성된다. 증폭 효소는 이것이 사용되는 조건 하에서 핵산의 이종성 혼합물 중 핵산의 단지 특정 서열을 프로세싱하는 효소이다. 예를 들어, Qβ 레플리카아제의 경우, MDV-1 RNA는 이 레플리카아제의 특이적 주형이다 (예를 들어, 문헌[Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3038 [1972]] 참조). 다른 핵산은 이 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 이와 유사하게, T7 RNA 폴리머라아제의 경우, 이 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대하여 엄격한 특이성을 갖는다 (문헌[Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970]] 참조). T4 DNA 라이가아제의 경우, 이 효소는 두 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 라이게이션시키지 않으며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 기질과 주형 사이에는 라이게이션 연결부에 미스매치가 있다 (문헌[Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989]]). 마지막으로, Taq 및 Pfu 폴리머라아제는, 고온에서 기능하는 그의 능력 덕분에, 결합되는 그리고 이에 따라 프라이머에 의해 규정되는 서열들에 대하여 높은 특이성을 나타내는 것으로 밝혀져 있으며; 고온은 프라이머의 표적 서열과의 혼성화를 유리하게 하고 비-표적 서열과의 혼성화는 그렇게 하지 않는 열역학적 조건으로 이어진다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 핵산”이라는 용어는 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 나타낸다. “증폭가능한 핵산”은 일반적으로 “샘플 주형”을 포함할 것으로 사료된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “샘플 주형”이라는 용어는 “표적” (하기에 정의됨)의 존재에 대하여 분석되는 샘플로부터 기원하는 핵산을 나타낸다. 이와는 대조적으로, “배경 주형”은 샘플에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산과 관련하여 사용된다. 배경 주형은 가장 흔히는 우연한 것이다. 이것은 이월(carryover)의 결과일 수 있거나, 이것은 샘플로부터 정제해 내고자 하는 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출할 것 이외의 유기체로부터의 핵산이 테스트 샘플에서 배경으로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프라이머”라는 용어는 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해 생성된 것이든지 간에, 핵산 가닥에 상보성인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 (즉, 뉴클레오티드 및 유도 에이전트(agent), 예컨대 DNA 폴리머라아제의 존재 하에 그리고 적합한 온도 및 pH에서) 두어질 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥일 경우, 프라이머는 신장 생성물의 제조에 사용되기 전에 먼저 그의 가닥들이 분리되도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도 에이전트의 존재 하에 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스(source) 및 방법의 용도를 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프로브”라는 용어는, 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지 간에, 관심 대상의 또 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드들의 시퀀스(sequence))를 나타낸다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정한 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에서 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA와, 효소-기반 조직화학 분석법), 형광, 방사성, 및 발광 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 검출 시스템에서 검출가능해지도록 임의의 “리포터(reporter) 분자”로 표지될 것으로 사료된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지체에 한정되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “표적”이라는 용어는, 폴리머라아제 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머가 결합하는 핵산 영역을 나타낸다. 따라서, “표적”을 다른 핵산 서열과 구분하고자 한다. “절편”은 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “폴리머라아제 연쇄 반응” (“PCR”)이라는 용어는 특히, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,965,188호의 방법을 나타내며, 이는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “유전자 변경된 숙주 주” (예를 들어, 유전자 변경된 바실루스 주)는 재조합 숙주 세포로도 칭해지는 유전자 엔지니어링된(engineered) 숙주 세포를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 유전자 변경된 숙주 주는 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 숙주 주에서의 관심 대상의 단백질의 발현 및/또는 생성과 비교하여 관심 대상의 단백질의 향상된 (증가된) 발현을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 변경된 주는 하나 이상의 결실된 내인성 염색체 영역 또는 이의 단편을 갖는 유전자 엔지니어링된 바실루스 sp.이며, 여기서 관심 대상의 단백질은 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 바실루스 숙주 주와 비교하여 향상된 발현 또는 생성 수준을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상응하는 비변경 바실루스 주” 등은 지시된 유전자 변화를 갖지 않는 숙주 주 (예를 들어, 원래의 (모) 및/또는 야생형 주)이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “염색체 통합”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스)의 염색체 내에 도입되는 과정을 나타낸다. 형질전환 DNA의 상동성 영역들은 염색체의 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 상동성 박스들 사이의 서열은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, DNA 구성물의 불활성화 염색체 절편의 상동성 섹션들은 바실루스 염색체의 고유 염색체 영역의 측면 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 고유 염색체 영역은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 DNA 구성물에 의해 결실된다.

“상동 재조합”은 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열들의 부위에서의 두 DNA 분자 또는 쌍형성 염색체 사이에서의 DNA 단편의 교환을 의미한다. 일 실시 양태에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 서열”은 비교를 위하여 최적으로 정렬될 때 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 상동 서열들은 85% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 반면, 다른 실시 양태에서, 90% 내지 100%의 서열 동일성이 있으며, 더 많은 실시 양태에서 95% 내지 100%의 서열 동일성이 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “아미노산”은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이의 일부를 나타낸다. “단백질”, “펩티드” 및 “폴리펩티드”라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “관심 대상의 단백질” 및 “관심 대상의 폴리펩티드”는 요망되고/되거나 평가 중인 단백질/폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 세포내 단백질인 반면, 다른 실시 양태에서, 이것은 분비형 폴리펩티드이다. 특히 폴리펩티드는 전분 분해 효소(amylolytic enzyme), 단백질 분해 효소, 셀룰로오스 분해 효소(cellulytic enzyme), 옥시도리덕타아제 효소 및 식물 세포벽 분해 효소로부터 선택되는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 효소를 포함한다. 더 구체적으로, 이러한 효소는 아실 트랜스퍼라아제, 알파-아밀라아제, β-아밀라아제, 알파-갈락토시다아제, 아라비노시다아제, 아릴 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 카라기나아제, 카탈라아제, 셀로바이오히드롤라아제, 셀룰라아제, 콘드로이티나아제, 큐티나아제, 엔도-베타-1, 4-글루카나아제, 엔도-β-만난아제, 에스테라아제, 엑소-만난아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 케라티나아제, 락카아제, 락타아제, 리그니나아제, 리파아제, 리폭시게나아제, 만난아제, 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙티나아제, 펜토사나아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 람노갈락투로나아제, β-글루카나아제, 탄나아제, 트랜스글루타미나아제, 자일란 아세틸-에스테라아제, 자일라나아제, 자일로글루카나아제, 및 자일로시다아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 신호 펩티드(즉, 분비될 단백질 상의 아미노-말단 신장부)에 융합된 분비형 폴리펩티드이다. 거의 모든 분비형 단백질은 막에의 표적화 및 막을 가로지르는 전구체 단백질의 전좌에서 결정적인 역할을 하는 아미노-말단 단백질 신장부를 이용한다. 이러한 신장부는 막 이전 동안 또는 막 이전 후 신호 펩티다아제에 의해 단백질 분해에 의해 제거될 수 있다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 폴리펩티드 또는 단백질은 호르몬, 항체, 성장 인자, 수용체 등으로부터 선택된다. 본 발명에 포함되는 호르몬은 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 성선 자극 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 에리트로포이에틴, 인슐린 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 사이토카인, 예컨대 인터루킨 (예를 들어, IL-1 내지 IL-13), 인터페론, 콜로니 자극 인자 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 항체를 생성하는 것이 바람직한 임의의 종으로부터 직접적으로 수득된 면역글로불린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 본 발명은 변형된 항체를 포함한다. 다클론 및 단클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 특정한 실시 양태에서, 항체는 인간 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 “유도체” 또는 “변이체”는 C- 및 N-말단 중 어느 하나에의 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열에서의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 및 이들의 임의의 조합에 의해 전구체 폴리펩티드 (예를 들어, 천연 폴리펩티드)로부터 유래되는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드의 유도체 또는 변이체의 제조는 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어, 천연 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체형/변이체형 폴리펩티드를 형성하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유도체 또는 변이체는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “이종 단백질”이라는 용어는 숙주 세포에서 천연적으로는 나타나지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 단백질을 코딩하는 유전자는 천연 발생 유전자인 반면, 다른 실시 양태에서, 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이종 단백질을 코딩하는 DNA는 사실상 이종성인 5’ UTR과 연결되며, 이는 5’ UTR과 관심 대상의 단백질을 코딩하는 DNA가 상이한 유전자들 또는 상이한 유기체들로부터 유래됨을 의미한다. 따라서, 이종이라는 용어는 두 요소가 동일 기원 (예를 들어, 종, 세포, 핵산 등)의 것이 아니라는 그의 가장 넓은 의미로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 단백질”은 세포에서 천연 발생되거나 천연인 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 실시 양태들에서, 세포는 그람 양성 세포인 한편, 특정한 실시 양태에서, 세포는 바실루스 숙주 세포이다. 대안적인 실시 양태에서, 상동 단백질은 이. 콜라이(E. coli)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다른 유기체에 의해 생성된 천연 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 통하여 상동 단백질을 생성하는 숙주 세포를 포함한다.

B. 비번역 영역( UTR )

비번역 영역 또는 "UTR"은 일반적으로 번역되지 않는 mRNA 또는 상응하는 DNA의 서열이다. UTR은 mRNA의 5’ 또는 3’에 있을 수 있다. 5' 비번역 영역(5′ UTR) (리더 서열 또는 리더 RNA로도 공지됨)은 개시 코돈의 상류에 있는 mRNA의 영역이다. 이 영역은 바이러스, 원핵 생물 및 진핵 생물에서 기작을 다르게 함으로써 전사체의 번역을 조절하는 데 중요하다. 5’ UTR 또는 그의 일부분은, 비번역되는 것으로 묘사되기는 하지만, 가끔 단백질 생성물로 번역된다. 그 후 이 생성물은 mRNA의 주요 코딩 서열의 번역을 조절할 수 있다. 그러나, 많은 다른 유기체에서, 5’ UTR은, 번역을 조절하는 복잡한 이차 구조를 형성하는 대신, 비번역된다. 일반적으로, 상기 상응하는 DNA 서열은 5’ 또는 3’ UTR 서열로도 칭해진다.

5' UTR은 전사 개시 부위에서 시작할 수 있으며, 코딩 영역의 첫 번째 코돈 또는 번역 개시 부위에서 또는 그 근처에서 끝날 수 있다. 5'UTR은 길이가 3개 내지 10개의 뉴클레오티드로부터 몇 천개 초과의 뉴클레오티드까지 달라진다. 일반적으로 5’ UTR은 리보솜 결합 부위, 시스-작용 조절 요소와, 기타 조절 요소를 포함한다.

바실루스 박테리아로부터의 다양한 유전자는 5’ UTR을 포함한다. 비. 리케니포르미스로부터의 LAT (알파 아밀라아제) 유전자는 하기 5' UTR:

(서열 번호 8)을 포함하는 반면, 비. 서브틸리스로부터의 aprE 유전자는 하기 5' UTR:

(서열 번호 2)을 포함한다.

함브레우스(Hambraeus) 등은 비. 서브틸리스로부터의 aprE 유전자의 58개 뉴클레오티드 길이의 리더 서열(5' UTR)이 mRNA 안정성의 결정자임을 보여주었다 (문헌[Hambraeus et al. Microbiology (2002) 148: 1795-1803]). 이들은 이 영역이 5’ 말단에서 스템(stem)-루프(loop) 구조를 형성하며, 온전한 리보솜 결합 부위(ribosomal binding site; RBS)와 함께, mRNA의 안정성 향상을 초래함을 보여주었다. 그러나, 함브레우스 등은 발현 벡터에서의 강력 5’ UTR의 사용이 관심 대상의 단백질의 더 높은 발현으로 이어질 수 있음을 연구하지도 않았고, 교시하지도 않았고, 제안하지도 않았으며, 더욱이, 이를 인식하지 못하고 따라서 당업자에게 동기 부여를 하지 않는다. 본 발명자는 지금에 와서야 발현 벡터에서의 강력 5’ UTR이 변형된 숙주 세포에서 관심 대상의 단백질의 더 높은 발현으로 이어진다는 것을 밝혀냈다.

C. 프로모터

구체적으로, 박테리아 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 프로모터의 예는 예를 들어 비. 스테아로서모필루스 말토게닉(maltogenic) 아밀라아제 유전자, 비. 아밀로리쿠에파시엔스(BAN) 아밀라아제 유전자, 비. 서브틸리스 알칼리 프로테아제 유전자, 비. 클라우시이 알칼리 프로테아제 유전자, 비. 푸밀리스(B. pumilis) 자일로시다아제 유전자, 비. 투린기엔시스 cryIIIA, 및 비. 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자의 프로모터인 PamyE, PamyQ, PamyL, PpstS, PsacB, PSPAC, PAprE, PVeg, PHpaII 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 프로모터는 A4 프로모터와, 파지 람다(phage Lambda) PR 또는 PL 프로모터, 및 이. 콜라이(E. coli) lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 리보솜 단백질 및 RNA 프로모터는 이종 단백질 생성에 유용한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 국제 공개 제2013/086219호를 참조하며, 이의 개시 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨). 하기 프로모터가 고려된다.

[표 1-1]

[표 2-1]

리보솜 프로모터를 사용할 때 관심 대상의 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 예기치 않게 높은 수준의 발현은 몇몇 이득을 갖는다. 일 실시 양태에서, 리보솜 프로모터를 갖는 관심 대상의 코딩 서열의 발현은 그의 천연 프로모터로부터의 관심 대상의 코딩 서열의 발현과 비교할 때 관심 대상의 코딩 서열의 증가된 발현 수준을 허용한다. 증가된 발현 수준은 불안정한 전사체에 특히 유용하다.

또 다른 실시 양태에서, 리보솜 프로모터를 갖는 관심 대상의 코딩 서열의 발현은 리보솜 프로모터를 포함하는 발현 구성물의 증폭 없이 관심 대상의 코딩 서열의 증가된 발현 수준을 허용한다. 본 기술 분야에서의 다른 발현 구성물을 이용할 때, 관심 대상의 코딩 서열의 높은 발현 수준을 달성하기 위하여, 흔히 발현 구성물의 증폭이 요구된다. 그러나, 본원에 기술된 리보솜 프로모터에 의해 달성되는 발현 수준은 발현 구성물의 증폭이 필요하지 않을 수 있게 하기에 충분히 높다 (그러나 이는 관심 대상의 단백질의 훨씬 더 높은 발현을 달성하는 데 이용될 수 있음). 이것은 몇몇 이득을 제공한다. 첫째, 숙주 주는 증폭된 발현 구성물의 손실을 겪지 않기 때문에 더 안정하다. 또한, 발현 구성물이 증폭될 필요가 없을 경우, 주의 구성물은 더 효율적이다. 따라서, 시간, 돈 및 재료가 절약된다.

D. 관심 대상의 코딩 서열

본 발명에 포함되는 프로모터는 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산(즉, 관심 대상의 코딩 서열)에 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 항생제 또는 이의 일부, 수용체 또는 이의 일부, 리포터 유전자 (예를 들어, 녹색 형광 단백질) 또는 기타 이차 대사 산물일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 효소는 박테리아 또는 진균류에서 비롯된 프로테아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 큐티나아제, 피타아제, 락카아제, 리파아제, 이소머라아제, 에스테라아제, 만난아제, 카르보하이드라아제, 히드롤라아제, 옥시다아제, 퍼미아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 에피머라아제, 토토머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제, 포스파타아제 등이다.

다른 실시 양태에서, 효소는 프로테아제, 예컨대 세린, 메탈로, 티올 또는 산 프로테아제이다. 일부 실시 양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신)이다. 세린 프로테아제는 문헌[Markland, et al. (1983) Honne-Seyler's Z Physiol. Chem 364:1537-1540]; 문헌[Drenth, J. et al. (1972) Eur. J. Biochem. 26:177-181]; 미국 특허 제4,760,025호 (미국 재발행 특허 제34,606호), 미국 특허 제5,182,204호 및 미국 특허 제6,312,936호와 유럽 특허 제0 323,299호에 기술되어 있다. 알칼리 프로테아제의 예는 서브틸리신류, 특히 바실루스로부터 유래된 것 (예를 들어, 서브틸리신, 렌투스, 아밀로리쿠에파시엔스, 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168)을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로테아제는 예를 들어 미국 특허 공개 제2010/0152088호 및 국제 공개 제2010/056635호에도 기술되어 있다. 단백질 분해 활성의 측정 수단은 문헌[K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases" ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, A. Fiecht Ed. 1988]에 개시되어 있다.

다른 실시 양태에서, 효소는 아밀라아제, 예컨대 바실루스로부터 유래된 아밀라아제 (예컨대 비. 리케니포르미스 LAT 아밀라아제), 지오바실루스(Geobacillus) (예컨대 지. 스테아로서모필루스(G. stearothermophilus)) 또는 트리코데르마(Trichoderma) (예컨대 티. 레에세이(T. reesei))로부터 유래된 아밀라아제이다. 박테리아 및 진균류 아밀라아제는 예를 들어 미국 특허 제8,058,033호, 미국 특허 공개 제2010/0015686호, 미국 특허 공개 제2009/0314286호, 영국 특허 출원 제1011513.7호, 및 국제 특허 출원 제PCT/IB2011/053018호에 기술되어 있다. 이러한 참고 문헌 각각의 명세서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

다른 실시 양태에서, 효소는 자일라나아제이다. 특정 실시 양태에서, 자일라나아제는 트리코데르마 (예컨대 티. 레에세이)로부터 유래된다. 박테리아 및 진균류 자일라나아제는 예를 들어 국제 공개 제2001/027252호 및 미국 특허 제7,718,411호에 기술되어 있다. 이러한 참고 문헌 각각의 명세서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

다른 실시 양태에서, 효소는 피타아제이다. 특정 실시 양태에서, 피타아제는 시트로박터(Citrobacter) (예컨대 씨. 프레운디이(C. freundii)) 또는 이. 콜라이로부터 유래된다. 다른 실시 양태에서, 피타아제는 부티옥셀라(Buttiauxella) 피타아제, 예컨대 부티옥셀라 아그레스티스(Buttiauxella agrestis) 피타아제일 수 있다. 피타아제는 예를 들어 국제 공개 제2006/043178호, 국제 공개 제2006/038062호, 국제 공개 제2008/097619호, 국제 공개 제2009/129489호, 국제 공개 제2006/038128호, 국제 공개 제2008/092901호, 국제 공개 제2009/129489호, 및 국제 공개 제2010/122532호에 기술되어 있다. 이러한 참고 문헌 각각의 명세서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

일부 실시 양태에서, 효소는 셀룰라아제이다. 셀룰라아제는 셀룰로오스에서 베타-D-글루코시드 결합을 가수분해시키는 효소이다. 셀룰로오스 분해 효소는 전통적으로 하기 3가지의 주요 부류로 나뉘어졌다: 엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제 또는 셀로바이오히드롤라아제 및 베타-글루코시다아제 (문헌[Knowles, J. et al., TIBTECH 5:255-261 (1987)]). 다수의 셀룰라아제가 과학 문헌에 개시되었으며 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.

일부 실시 양태에서, 호르몬은 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 성선 자극 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 에리스로포이에틴, 인슐린 등이다.

일부 실시 양태에서, 세포 증식 및/또는 분화의 활성화의 일차적인 결과에 의해 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 단백질인 성장 인자는 혈소판-유래된 성장 인자, 상피 세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 형질전환 성장 인자 등을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 성장 인자는 사이토카인이다. 사이토카인은 콜로니 자극 인자, 인터루킨(IL-I (알파 및 베타), IL-2 내지 IL-13) 및 인터페론(알파, 베타 및 감마)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시 양태에서, 항체는 다량으로 생성되는 것이 바람직한 임의의 종으로부터의 면역글로불린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 인간 항체인 것이 특히 바람직하다. 면역글로불린은 임의의 클래스(class), 즉 G, A, M, E 또는 D로부터의 것일 수 있다.

코딩 서열은 숙주 세포에 대하여 이종성이거나 천연일 수 있다. 게다가, 코딩 서열은 전장 단백질, 또는 전장 단백질의 절두형을 코딩할 수 있다. 본 발명은 특정 코딩 서열에 한정되지 않지만, 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결된 다수의 코딩 서열을 포함한다.

E. 신호 서열

일부 실시 양태에서, 특히 관심 대상의 코딩 서열이 세포외 효소, 예컨대 셀룰라아제, 프로테아제 또는 전분 분해 효소를 코딩할 때, 신호 서열이 상기 코딩 서열의 N-말단 부분에 연결되어 있을 수 있다. 신호는 DNA 서열의 분비를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 신호 서열은 숙주 유기체에 대하여 내인성이거나 외인성일 수 있다. 신호 서열은 보통 코딩된 폴리펩티드와 결부된 것일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 신호 서열은 국제 공개 제2011/014278호 및 국제 공개 제2010/123754호에 기술된 바와 같이 변경되거나 변형될 수 있는데, 상기 국제 공개의 명세서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시 양태에서, 신호 서열은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 셀룰라아제 유전자로부터의 신호 서열을 포함한다. 일 실시 양태에서, 바람직한 신호 서열은 에스. 리비단스(S. lividans) 셀룰라아제, celA이다 (문헌[Bently et al., (2002) Nature 417:141-147]). 그러나, 당업자라면 숙주 유기체에서 발현되고 분비될 단백질에 따라 사용될 수 있는 다수의 신호 펩티드 (예를 들어, 비. 리케니포르미스 아밀라아제 신호 펩티드)를 알고 있다.

F. DNA 구성물 및 벡터

관심 대상의 코딩 영역을 포함하는 본 발명의 핵산 구성물은 확립된 표준 방법, 예를 들어 문헌[Beaucage and Caruthers, (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869]에 기술된 포스포르아미다이트법, 또는 문헌[Matthes et al., (1984) EMBO Journal 3: 801-805]에 기술된 방법에 의해 합성에 의해 제조될 수 있다. 핵산 구성물은 혼합된 합성 및 게놈 기원의 것일 수 있으며, 합성 또는 게놈 DNA의 단편들의 라이게이션에 의해 제조될 수 있다. 또한 핵산 구성물은 예를 들어 미국 특허 제4,683,202호 또는 문헌[Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491]에 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 이용하여 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 DNA 구성물은 벡터, 예컨대 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 진균류, 효모 및 박테리아에서 폴리펩티드의 클로닝, 형질전환 및 발현에 적합한 다양한 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트는 본 발명의 프로모터, 선택적으로 신호 서열, 관심 대상의 코딩 영역 및 종결 서열을 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 벡터는 신호 서열과 종결 서열 사이에 위치하는 하나 이상의 클로닝 부위를 포함한다.

G. 형질전환

본 발명의 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 일반적인 형질전환 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있다 (문헌[Ausubel et al., 1994, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY] 및 문헌[Campbell et al., 1989 Curr. Genet 16:53-56]). 이러한 일반적인 기술 중 일부는 입자 또는 유전자 총 (바이오리스틱스(biolistics)), 사상균 세포벽의 투과 후 형질전환 과정 (예를 들어, 고농도의 알칼리, 예를 들어 0.05 M 내지 0.4 M의 CaCl₂ 또는 아세트산리튬의 사용에 의해), 원형질체 융합, 전기천공법, 또는 아그로박테륨(agrobacterium) 매개된 형질전환 (미국 특허 제6,255,115호)의 이용을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리에틸렌 글리콜 및 CaCl.sub.2를 이용한 원형질체 또는 스피로플라스트(spheroplast)의 처리는 문헌[Campbell, et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56, 1989] 및 문헌[Penttila, M. et al., (1988) Gene, 63:11-22]에 기술되어 있다.

박테리아에 있어서의 형질전환 및 발현 방법은 문헌[Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, (1990), FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138]에 개시되어 있다. 프로테아제 결실된 바실루스 주에 바람직한 일반적인 형질전환 및 발현 프로토콜은 페라리(Ferrari) 등의 미국 특허 제5,264,366호에 제공되어 있다.

스트렙토마이세스에서의 형질전환 및 발현은 문헌[Hopwood et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, (1985) John Innis Foundation, Norwich UK]에서 발견될 수 있다.

다른 실시 양태에서, 아스페르길루스(Aspergillus) 및 트리코데르마에서의 형질전환 및 발현은 예를 들어 미국 특허 제5,364,770호; 미국 특허 제6,022,725호; 및 문헌[Nevalainen et al., 1992, The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes, MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leon and Berka, Marcel Dekker, Inc. pp. 129-148]에 기술되어 있다.

H. 숙주 세포

본 발명에 따라 사용될 수 있는 숙주 세포는 박테리아 세포 및 진균류 세포 둘 모두를 포함한다. 바람직한 진균류 숙주 세포는 사상균 세포, 예컨대 아스페르길루스 및 트리코데르마 세포를 포함한다. 바람직한 박테리아 숙주 세포는 그람 양성 및 그람 음성 세포 둘 모두를 포함하며, 이는 바실루스, 마이코박테륨(Mycobacterium), 악티노마이세스(Actinomyces) 및 스트렙토마이세스 세포를 포함한다. 또한 숙주 세포는, 제한 없이, 이. 콜라이, 슈도모나스(Pseudomonas ) spp. (예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 피. 알칼리게네스(P. alcaligenes)), 스트렙토마이세스 spp ., (예를 들어, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)), 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 라우투스, 비. 메가테륨, 및 비. 튜린기엔시스를 포함한다.

I. 세포 배양

숙주 세포 및 형질전환된 세포는 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포용 배양 배지는 프로모터의 활성화 및 형질전환체의 선발을 위하여 적절할 경우 변형될 수 있다. 특정 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 대하여 선발되는 숙주 세포에 이용되는 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 명백하다. 게다가, 바람직한 배양 조건은 과학 문헌, 예컨대 문헌[Sambrook, (1982), 상기 문헌]; 문헌[Kieser, T, M J. Bibb, M J. Buttner, K F Chater, and D. A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich UK]; 문헌[Harwood, et al., (1990) MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley]에서 및/또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC; "http://www.atcc.org/")으로부터 발견될 수 있다. 진균류 숙주 세포, 예컨대 트리코데르마 세포의 안정한 형질전환체는 일반적으로 고체 배양 배지 상에서의, 그의 더 빠른 성장 속도 또는 고르지 못한(ragged) 윤곽이라기보다는 오히려 매끄러운 윤곽을 갖는 원형 콜로니의 형성에 의해 불안정한 형질전환체와 구별될 수 있다.

J. 발현된 폴리펩티드의 회수

형질전환된 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드는 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 것, 또는 필요할 경우 세포를 파괴하는 것 및 상청액을 세포 분획 및 잔사로부터 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로 청징화 후, 상청액 또는 여과액의 단백질성 성분을 염, 예를 들어 황산암모늄에 의해 침전시킨다. 그 후, 침전된 단백질은 가용화되며, 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 본 기술 분야에서 인지되는 기타 절차에 의해 정제될 수 있다.

K. 구성물 어셈블리(Assembly)

일반적인 일 실시 양태에서, 본 발명은 시험관 내에서 DNA 구성물을 어셈블리하는 것, 이어서 그러한 구성물을 적격(competent) 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스 숙주 세포) 내에 직접적으로 클로닝하여 구성물이 숙주 게놈 내에 통합되도록 하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, PCR 융합 및/또는 라이게이션을 이용하여 시험관 내에서 DNA 구성물을 어셈블리한다. 바람직한 실시 양태에서, DNA 구성물은 비-플라스미드 DNA 구성물이다. 또 다른 실시 양태에서, DNA 구성물은 돌연변이가 도입된 DNA를 포함한다. 그 후, 이 구성물을 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 이와 관련하여, 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스)의 고도 적격 돌연변이체가 구성물의 상기 세포 내로의 직접적 클로닝을 용이하게 하는 데 바람직하게 이용된다. 예를 들어, 자일로스-유도성 프로모터의 제어 하의 comK 유전자(Pxyl-comK)를 지닌 바실루스는 매우 높은 효율로 신뢰성있게 형질전환될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 본 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 상기 세포를 형질전환시킬 수 있다. DNA 구성물은 형질전환 전에 벡터(즉, 플라스미드) 내에 삽입될 수 있다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 원형 플라스미드는 적절한 제한 효소(즉, DNA 구성물을 파괴하지 않는 것)를 이용하여 절단된다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 원형 플라스미드는 본 발명에서 그 용도가 발견된다. 그러나, 대안적인 실시 양태에서, 선형 플라스미드가 사용된다. 일부 실시 양태에서, DNA 구성물(즉, PCR 생성물)은 플라스미드 DNA의 존재 없이 사용된다.

본 발명 및 이의 이점을 추가로 예시하기 위하여, 하기의 특정 실시예가 본 발명을 예시하기 위해 제공되어 있으며 어떤 식으로도 그의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다는 이해를 가지고서 하기 특정 실시예가 주어진다.

DNA 구성물이 벡터 내에 포함되든지 플라스미드 DNA의 존재 없이 사용되든지 간에, 이것은 미생물의 형질전환에 사용된다. 임의의 적합한 형질전환 방법이 본 발명에서 그 용도가 발견될 것으로 사료된다. 실시 양태들에서, DNA 구성물의 적어도 하나의 카피가 숙주 바실루스 염색체 내에 통합된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 DNA 구성물이 숙주 세포의 형질전환에 사용된다.

실험

본 발명의 특정 실시 양태 및 측면을 입증하고 추가로 예시하기 위하여 하기 실시예를 제공하며, 하기 실시예는 이의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

하기의 실험에 대한 개시 내용에서, 특정한 하기 약어가 적용된다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분당 회전수); μg (마이크로그램); mg (밀리그램); μl　(마이크로리터); ml (밀리리터); mM (밀리몰랄); μM　(마이크로몰랄); sec (초); min (분); hr (시간); OD₂₈₀ (280 nm에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm에서의 광학 밀도); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (소듐 도데실 술페이트); Abs (흡광도).

실시예 1

aprE 5'UTR에 의한 비. 리케니포르미스 알파-아밀라아제( LAT )의 향상된 생성

천연 LAT 프로모터, LAT 5'UTR, LAT 신호 펩티드 서열 및 LAT 전사 종결자를 포함하는 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라아제(LAT) 유전자를 포함하는 발현 구성물을 미국 특허 제7968691호에 기술된 바와 같이 pICatH 벡터의 XhoI 부위 내에 클로닝하였다. LAT 발현 카세트 (XhoI 단편)을 서열 번호 1로 나타낸다.

LAT 전구체 유전자를 이탤릭체로 나타낸 반면 LAT 5'UTR을 볼드체로 나타낸다 (서열 번호 1).

pICatH-LATori1 플라스미드 (도 1 참조)로 미국 특허 제7,968,691호에 기술된 바와 같이 비. 리케니포르미스 주 BML780의 게놈을 형질전환시켰다. 절제 후, 50 ppm 클로람페니콜까지의 발현 카세트의 증폭이 LAT 5'UTR 주에서의 LAT 생성에 최적인 것으로 입증되었다.

융합 PCR 기술에 의해, pICatH-LATori1 내의 LAT 5'UTR을 바실루스 서브틸리스 aprE 5'UTR로 대체하였다. 5’ 말단에 추가의 구아닌을 포함하는 비. 서브틸리스 aprE 5'UTR의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 2로 나타낸다.

aprE 5'UTR을 포함하는 LAT 발현 카세트 (XhoI - NotI 단편)를 서열 번호 3으로 나타낸다. LAT 전구체 유전자를 이탤릭체로 나타낸 반면 aprE-5'UTR을 볼드체로 나타낸다:

상기에 설명한 바와 같이, LAT(즉, 비. 리케니포르미스 AmyL) 유전자가 aprE-5'UTR에 융합된 것을 포함하는 pICatH 플라스미드로 주 BML780을 형질전환시켰으며, 상기 플라스미드를 상기 주의 게놈 내에 통합시켰다. 절제 후, 25 ppm 클로람페니콜까지의 증폭은 aprE-5'UTR 주에서의 LAT 생성에 최적인 것으로 입증되었다.

주 BML780-LAT-CAP50 (LAT 5'UTR)에 의한 LAT의 생성을 BML780-[aprE-5'UTR]-LAT-CAP25 (aprE 5'UTR)의 생성과 비교하였으며, 이는 상기 둘 모두의 주를 생산 배지 (리터당: 10 g의 전분, 10 g의 소이톤(soytone), 10 g의 대두분, 20 g의 글루코스, 3.6 g의 우레아, 0.75 g의 CaCl₂.2H₂O, 21.75 g의 K₂HPO₄, 17 g의 KH₂PO₄, MOPS 완충제, 미량 영양소; pH 6.8)에서 성장시킴에 의한 것이었다. 인포스(Infors) 항온기 (37℃, 300 rpm)에서의 68시간의 성장 후, 상청액 중 LAT 활성을 공급처 (아일랜드 소재의 메가자임 인터내셔널(Megazyme International))의 지시에 따라 세랄파를 기질로 이용하여 메가자임의 α-아밀라아제 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 활성에 대한 상대적인 수, 즉 생산성을 표 3에 나타낸다.

[표 3]

실시예 2

aprE 5'UTR에 의한 풀룰라나아제 PULm104의 향상된 생성

PULm104는 N-말단의 104개 아미노산이 결실된 바실루스 데라미피칸스 풀룰라나아제이다. PULm104를 생산하는 바실루스 리케니포르미스 주를 구성하는 것은 미국 특허 제8354101호에 개시되어 있다. 미국 특허 제8354101호에 개시된 최상의 생산 주는 BML780-PULm104-Ori1-CAP75였으며, 이는 amyL (LAT) 5'UTR을 포함한다.

하기에 약술된 바와 같이 amyL (LAT) 5'UTR을 aprE 5'UTR로 대체하였다. 첫째, 플라스미드 pHPLT-Blich-int-cassette를 디엔에이2.0. 인크. (DNA2.0. Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성에 의해 구성하였다. 이 플라스미드의 설계는 벡터 pHPLT (미국 특허 제5871550호), 벡터 pICatH (미국 특허 제8354101호) 및 aprE 5'UTR, UTR V2 또는 UTR V3 (바실루스 서브틸리스로부터 유래)을 기반으로 하였다 (서열에 대해서는 하기 표). 벡터 pHPLT-Blich-int-cassette의 지도를 도 2에 나타낸다.

5'aprE UTR-PULm104 발현 카세트의 DNA 서열을 하기에 나타낸다 (5' UTR에는 밑줄이 그어져 있음) (서열 번호 11):

(서열 번호 11)

다음, PCR을 프라이머 PULm104-Vector-RV (

(서열 번호 4)) 및 PULm104-Vector-FW (

(서열 번호 5))를 이용하여 pHPLT-Blich-int-cassette (1 ng/μl)를 주형으로 사용하여 수행하였다. 두 번째 PCR을 프라이머 PulM104-Assbl.-FW (

(서열 번호 6)) 및 PulM104-Assbl.-RV (

(서열 번호 7))를 이용하여, BML780-PULm104-Ori1-CAP75의 세포 물질을 주형으로 사용하여 수행하였다. 상기 둘 모두의 PCR을 NEB Q5 표준 프로토콜, 26 사이클에 따라 수행하였다.

PULm104 단편을 컬럼 정제하고, 먼저 HindIII (NEB)으로 완전히 절단하고, 그 후 NheI (NEB)로 부분 절단하였다. 벡터 단편을 또한 컬럼 정제하고, NheI 및 HindIII으로 완전히 절단하였다. 상기 둘 모두의 벡터 및 PULm104 절단 혼합물을 다시 정제하고, 그 후 로슈(Roche) T4 신속 라이게이션 키트 (#11635379001)를 이용하여 라이게이션시켰다. RCA 증폭 (지이 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)로부터의 템플리파이(TempliPhi) DNA 증폭 키트(Amplification Kit) 후, RCA 생성물로 적격 비. 서브틸리스 세포를 형질전환시키고, 이를 5 ppm의 클로람페니콜 및 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 심장 침출액 한천(Heart Infusion agar) (디프코(Difco)) 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 형질전환 플레이트로부터의 24개의 cfu를 5 ppm의 클로람페니콜 및 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 신선 심장 침출액 한천 플레이트 상에 이중으로 반복하고(replicated), 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 플레이트를 100 mM NaAc (pH 5) 중 0.1% AZCL-풀룰란을 포함하는 1% 한천의 오버레이(overlay)로 덮었다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 할로 양성 (풀룰라나아제 양성)을 반복 플레이트(replica plate)로부터 채집하고, 5 ppm의 클로람페니콜 및 10 ppm의 네오마이신을 포함하는 10 ml TSB에서 성장시켰다. 2 ml의 배양물을 이용하여 플라스미드 DNA를 준비하고, 30 μl의 상기 DNA 준비물을 NotI 및 ApaI로 절단하였다. 5'반복체-catH-PULm104 발현 카세트를 포함하는 4 Kb 단편을 겔로부터 정제하고, 자가 라이게이션시키고 (T4 라이가아제 로슈), RCA 증폭시키고, 이것으로 바실루스 리케니포르미스 주 BML780을 형질전환시켰다. 7.5 ppm의 클로람페니콜을 포함하는 심장 침출액 한천 상에서의 선발 후, 형질전환체를 AZCL-풀룰란 오버레이법을 이용하여 풀룰라나아제 활성에 대하여 체크하였으며, 이는 상기에 설명한 바와 같았다. 4개의 풀룰라나아제 양성 클론에서의 발현 카세트의 서열을 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다 (네덜란드 소재의 베이스클리어(BaseClear)). 상기 발현 카세트를 미국 특허 제8354101호에 설명된 바와 같이 증폭시켰다. 25 ppm의 클로람페니콜까지의 증폭은 aprE 5'UTR 주에서의 풀룰라나아제 생성에 최적인 것으로 입증되었으며, BML780-[aprE-5'UTR]-PULm104-Ori1-CAP25 주를 추가의 연구에서 사용하였다.

주 BML780-PULm104-Ori1-CAP75 (LAT 5'UTR)에 의한 PULm104의 생성을 BML780-[aprE-5'UTR]-PULm104-Ori1-CAP25 (aprE 5'UTR)의 생성과 비교하였으며, 이는 상기 둘 모두의 주를 생산 배지에서 성장시킴에 의한 것이었다 (실시예 1 참조). 인포스 인큐베이션 진탕기 (300 ppm, 37℃)에서의 68시간의 성장 후, 상청액 중 풀룰라나아제 활성을 공급처 (아일랜드 소재의 메가자임 인터내셔널)의 지시에 따라 레드-풀룰란을 기질로 이용하여 메가자임의 풀룰라나아제 분석을 이용하여 측정하였다. 활성에 대한 상대적인 수, 즉 생산성을 표 4에 나타낸다. 5'aprE UTR의 버전(version) 2 및 3은 비견되는 단백질 생산성을 나타냈다.

[표 4]

실시예 3

리보솜 RNA 프로모터를 포함하는 aprE 5' UTR을 이용한 관심 대상의 단백질의 향상된 생성

리보솜 RNA 프로모터 (예를 들어, P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 rrnE 또는 P3 rrnE) 또는 리보솜 단백질 프로모터 (예를 들어, PrpsD, P1 rpsJ, P2 rpsJ) 또는 시그마 인자 프로모터 (예를 들어, PrpoD), aprE 5' UTR, 본원에 개시된 적합한 신호 서열 (예를 들어, LAT, aprE, CBH1, 스트렙토마이세스 셀룰라아제 유전자 신호 서열), 본원에 개시된 관심 대상의 적합한 유전자 및 전사 종결자를 포함하는 발현 구성물을 적합한 벡터 (예를 들어, pICatH)의 적합한 제한효소 부위 (예를 들어, XhoI) 내에 클로닝한다. 상기 발현 카세트를 서열 번호 12 및 13으로 나타낸다.

관심 대상의 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터로 적합한 박테리아 주 (예를 들어, 상기에 설명한 바와 같은 주 BML780)를 형질전환시켜서 상기 플라스미드 벡터를 상기 박테리아 주의 게놈 내에 통합시킨다.

상기 박테리아 주에 의한 관심 대상의 단백질의 생성을 다양한 대조 주와 비교하며, 이는 상기 주들을 생산 배지 (예를 들어, 리터당: 10 g의 전분, 10 g의 소이톤(soytone), 10 g의 대두분, 20 g의 글루코스, 3.6 g의 우레아, 0.75 g의 CaCl₂.2H₂O, 21.75 g의 K₂HPO₄, 17 g의 KH₂PO₄, MOPS 완충제, 미량 영양소; pH 6.8)에서 성장시킴에 의한 것이다. 인포스 인큐베이터 (37℃, 300 rpm)에서의 68시간의 성장 후, 상청액 중 단백질 활성을 측정한다.

rrnI P2 프로모터 (비. 서브틸리스로부터 유래됨)를 소문자로 나타낸다. aprE 5'UTR은 볼드체로서 밑줄이 그어져 있다. 성숙 코딩 사슬은 이탤릭체로 되어 있다. 종결 코돈은 볼드체로 되어 있다. 전사 종결자를 보유한 서열에는 밑줄이 그어져 있다.

rrnI P2 프로모터 - aprE 5'UTR - LAT 신호 펩티드 - 성숙 LAT 발현 구성물을 하기에 나타낸다 (서열 번호 12):

rrnI P2 프로모터 - aprE 5'UTR - LAT 신호 펩티드 - 성숙 PULm104 발현 구성물을 하기에 나타낸다 (서열 번호 13):

실시예 4

aprE 5' UTR 및 이의 변이체를 이용한 지. 스테아로서모필루스 아밀라아제 변이체의 향상된 생성

표준 비. 리케니포르미스 통합 벡터인, LAT (바실루스 리케니포르미스 AmyL) 프로모터의 하류에 지. 스테아로서모필루스 (AmyS) 변이 유전자를 포함하는 pKB360-CatH에서, LAT 5'-UTR 서열을 AprE-WT 5'-UTR 및 AprE-V2-5'-UTR 또는 AprE-V3-5'-UTR로 대체하였다 (일반 플라스미드 지도에 대해서는 도 3 참조). 발현 카세트의 서열을 하기에 나타낸다.

LAT 프로모터는 소문자로 되어 있고; aprE 5'UTR은 볼드체로서 밑줄이 그어져 있고 ; LAT 신호 펩티드는 소문자로서 밑줄이 그어져 있고; AmyS 변이체의 성숙 사슬은 이탤릭체로 되어 있고; 종결 코돈은 볼드체로 되어 있고; 전사 종결자를 보유한 서열에는 밑줄이 그어져 있다.

LAT 프로모터 - aprE 5'UTR - LAT 신호 펩티드 - 성숙 AmyS 변이체 (서열 번호 14):

LAT 프로모터 - V2_5'UTR - LAT 신호 펩티드 - 성숙 AmyS 변이체 (서열 번호 15):

LAT 프로모터 - V3_5'UTR - LAT 신호 펩티드 - 성숙 AmyS 변이체 (서열 번호 16)

형질전환 후, 플라스미드들을 비. 리케니포르미스 염색체 상의 cat 유전자좌 내에 통합시켰다. 후속적으로, ‘루프-아웃(loop-out)’ 주를 벡터 서열의 절제를 통하여 수득하여, 상기 염색체 내에 통합된 cat - LAT-5'-UTR-AmyS 변이체 발현 카세트만을 남겼다. 그 후, 상기 주에 클로람페니콜 농도의 단계적 증가 (cap5, cap25, cap50, cap75 mg/ml)를 상기 주에 인가함으로써 상기 발현 카세트를 증폭시켰다. 분비된 아밀라아제의 활성을 측정하였으며, 이를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

더욱이, 발현 카세트의 카피수(copy number)를 증폭 후 측정하고, 이를 아밀라아제 생성과 비교하였으며, 이는 표 6에 요약되어 있다.

[표 6]

따라서, aprE 5' UTR 또는 그의 변이체를 포함하는 발현 카세트는 LAT 5' UTR과 비교하여 아밀라아제의 비견되는 생성 및 분비를 성취하기 위하여 더 낮은 양의 클로람페니콜 농도를 필요로 함을 알 수 있다. 환언하면, 더 적은 증폭이 더 높은 발현 역가의 성취에 필요하다.

전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확함을 위하여 예시 및 예로서 약간 상세하게 기술하였지만, 본원에서의 교시를 고려하면 이에 대하여 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 당업자에게 기꺼이 명백하다.

따라서, 전술한 것은 단지 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 예시한다. 당업자라면, 본원에 명백하게 기술되어 있지 않거나 예시되어 있지만 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 구현하는 그리고 그의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 처리 방식을 고안할 수 있음이 인정된다. 더욱이, 본원에 상술된 모든 실시예 및 조건적 언어는 주로 독자가 본 발명의 조성물 및 방법의 원리와 본 기술 분야의 심화에 본 발명자가 기여하는 개념을 이해하는 것을 돕고자 하는 것이며, 그렇게 구체적으로 상술된 실시예 및 조건을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 게다가, 본 발명의 조성물 및 방법의 원리, 측면 및 실시 양태와, 이의 특정 실시예를 상술하는 본원에서의 모든 진술은 이의 구조적 등가물 및 기능적 등가물 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조와는 관계 없이, 동일 기능을 수행하는 개발될 임의의 요소 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법의 범주는 본원에 예시되고 설명된 예시적인 실시 양태에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니다.

<110> Danisco <120> ENHANCED PROTEIN EXPRESSION <130> NB40178-PCT <150> 62/118,382 <151> 2015-02-19 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 ctcgaggctt ttcttttgga agaaaatata gggaaaatgg tacttgttaa aaattcggaa 60 tatttataca atatcatatg tttcacattg aaaggggagg agaatcatga aacaacaaaa 120 acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt atttgcgctc atcttcttgc tgcctcattc 180 tgcagcttca gcagcaaatc ttaatgggac gctgatgcag tattttgaat ggtacatgcc 240 caatgacggc caacattgga agcgtttgca aaacgactcg gcatatttgg ctgaacacgg 300 tattactgcc gtctggattc ccccggcata taagggaacg agccaagcgg atgtgggcta 360 cggtgcttac gacctttatg atttagggga gtttcatcaa aaagggacgg ttcggacaaa 420 gtacggcaca aaaggagagc tgcaatctgc gatcaaaagt cttcattccc gcgacattaa 480 cgtttacggg gatgtggtca tcaaccacaa aggcggcgct gatgcgaccg aagatgtaac 540 cgcggttgaa gtcgatcccg ctgaccgcaa ccgcgtaatt tcaggagaac acctaattaa 600 agcctggaca cattttcatt ttccggggcg cggcagcaca tacagcgatt ttaaatggca 660 ttggtaccat tttgacggaa ccgattggga cgagtcccga aagctgaacc gcatctataa 720 gtttcaagga aaggcttggg attgggaagt ttccaatgaa aacggcaact atgattattt 780 gatgtatgcc gacatcgatt atgaccatcc tgatgtcgca gcagaaatta agagatgggg 840 cacttggtat gccaatgaac tgcaattgga cggtttccgt cttgatgctg tcaaacacat 900 taaattttct tttttgcggg attgggttaa tcatgtcagg gaaaaaacgg ggaaggaaat 960 gtttacggta gctgaatatt ggcagaatga cttgggcgcg ctggaaaact atttgaacaa 1020 aacaaatttt aatcattcag tgtttgacgt gccgcttcat tatcagttcc atgctgcatc 1080 gacacaggga ggcggctatg atatgaggaa attgctgaac ggtacggtcg tttccaagca 1140 tccgttgaaa tcggttacat ttgtcgataa ccatgataca cagccggggc aatcgcttga 1200 gtcgactgtc caaacatggt ttaagccgct tgcttacgct tttattctca caagggaatc 1260 tggataccct caggttttct acggggatat gtacgggacg aaaggagact cccagcgcga 1320 aattcctgcc ttgaaacaca aaattgaacc gatcttaaaa gcgagaaaac agtatgcgta 1380 cggagcacag catgattatt tcgaccacca tgacattgtc ggctggacaa gggaaggcga 1440 cagctcggtt gcaaattcag gtttggcggc attaataaca gacggacccg gtggggcaaa 1500 gcgaatgtat gtcggccggc aaaacgccgg tgagacatgg catgacatta ccggaaaccg 1560 ttcggagccg gttgtcatca attcggaagg ctggggagag tttcacgtaa acggcgggtc 1620 ggtttcaatt tatgttcaaa gatgagttaa cagaggacgg atttcctgaa ggaaatccgt 1680 ttttttattt taagcttgga gacaaggtaa aggataaaac ctcgag 1726 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 gacagaatag tcttttaagt aagtctactc tgaatttttt taaaaggaga gggtaaaga 59 <210> 3 <211> 1764 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 ctcgaggctt ttcttttgga agaaaatata gggaaaatgg tacttgttaa aaattcggaa 60 tatttataca atatcatatg acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt 120 aaaaggagag ggtaaagaat gaaacaacaa aaacggcttt acgcccgatt gctgacgctg 180 ttatttgcgc tcatcttctt gctgcctcat tctgcagctt cagcagcaaa tcttaatggg 240 acgctgatgc agtattttga atggtacatg cccaatgacg gccaacattg gaagcgtttg 300 caaaacgact cggcatattt ggctgaacac ggtattactg ccgtctggat tcccccggca 360 tataagggaa cgagccaagc ggatgtgggc tacggtgctt acgaccttta tgatttaggg 420 gagtttcatc aaaaagggac ggttcggaca aagtacggca caaaaggaga gctgcaatct 480 gcgatcaaaa gtcttcattc ccgcgacatt aacgtttacg gggatgtggt catcaaccac 540 aaaggcggcg ctgatgcgac cgaagatgta accgcggttg aagtcgatcc cgctgaccgc 600 aaccgcgtaa tttcaggaga acacctaatt aaagcctgga cacattttca ttttccgggg 660 cgcggcagca catacagcga ttttaaatgg cattggtacc attttgacgg aaccgattgg 720 gacgagtccc gaaagctgaa ccgcatctat aagtttcaag gaaaggcttg ggattgggaa 780 gtttccaatg aaaacggcaa ctatgattat ttgatgtatg ccgacatcga ttatgaccat 840 cctgatgtcg cagcagaaat taagagatgg ggcacttggt atgccaatga actgcaattg 900 gacggtttcc gtcttgatgc tgtcaaacac attaaatttt cttttttgcg ggattgggtt 960 aatcatgtca gggaaaaaac ggggaaggaa atgtttacgg tagctgaata ttggcagaat 1020 gacttgggcg cgctggaaaa ctatttgaac aaaacaaatt ttaatcattc agtgtttgac 1080 gtgccgcttc attatcagtt ccatgctgca tcgacacagg gaggcggcta tgatatgagg 1140 aaattgctga acggtacggt cgtttccaag catccgttga aatcggttac atttgtcgat 1200 aaccatgata cacagccggg gcaatcgctt gagtcgactg tccaaacatg gtttaagccg 1260 cttgcttacg cttttattct cacaagggaa tctggatacc ctcaggtttt ctacggggat 1320 atgtacggga cgaaaggaga ctcccagcgc gaaattcctg ccttgaaaca caaaattgaa 1380 ccgatcttaa aagcgagaaa acagtatgcg tacggagcac agcatgatta tttcgaccac 1440 catgacattg tcggctggac aagggaaggc gacagctcgg ttgcaaattc aggtttggcg 1500 gcattaataa cagacggacc cggtggggca aagcgaatgt atgtcggccg gcaaaacgcc 1560 ggtgagacat ggcatgacat taccggaaac cgttcggagc cggttgtcat caattcggaa 1620 ggctggggag agtttcacgt aaacggcggg tcggtttcaa tttatgttca aagatgagtt 1680 aacagaggac ggatttcctg aaggaaatcc gtttttttat tttaagcttg gagacaaggt 1740 aaaggataaa acagctgcgg ccgc 1764 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggtttagca gctgcgctag ctgcagaatg aggc 34 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggcaaaaaa tgaaagcttc tcgaggttaa cagag 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 cagctagcgc agctgctaaa ccggcagtca gcaac 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgagaagctt tcattttttg ccgtggtccg ggctg 35 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 gtttcacatt gaaaggggag gagaat 26 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 gaccgcatag tccgttaagt gggtctacgc ggaatttttt taaaaggaga gggtaaaga 59 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 gacagaatag tcttttaagt aagtctactc tgtttcacat tgaaaggaaa ggagagggta 60 atc 63 <210> 11 <211> 2787 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 11 ctcgaggctt ttcttttgga agaaaatata gggaaaatgg tacttgttaa aaattcggaa 60 tatttataca atatcatatg acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt 120 aaaaggagag ggtaaagaat gaaacaacaa aaacggcttt acgcccgatt gctgacgctg 180 ttatttgcgc tcatcttctt gctgcctcat tctgcagctt cagcagctgc taaaccggca 240 gtcagcaacg cttatctgga tgccagcaac caagtcctgg tcaaactgag ccaaccgctg 300 acacttggag aaggagcgag cggatttacg gtccatgatg acacggcgaa caaagatatc 360 ccggtcacga gcgttaaaga tgctagcctg ggccaagatg tcacagcagt tctggcgggc 420 acgtttcaac atatctttgg cggatcagat tgggcaccgg ataatcacag cacgctgctg 480 aaaaaagtca cgaacaacct gtatcagttt agcggagatc tgccggaagg caactatcaa 540 tataaagtcg ccctgaacga tagctggaac aatccgagct atccgagcga taacatcaat 600 ctgacagtcc cggcaggcgg agcacatgtc acgtttagct atatcccgag cacacatgcc 660 gtctatgaca cgatcaacaa cccgaacgcc gatcttcaag tcgaaagcgg cgtcaaaacg 720 gatctggtca cagtcacatt gggagaagat ccggatgtca gccatacact gagcatccaa 780 acggatggct atcaagcgaa acaagtcatc ccgagaaacg tcctgaacag cagccagtat 840 tattatagcg gcgatgatct gggcaacacg tatacacaaa aagcgacgac gtttaaagtt 900 tgggcgccga caagcacaca agtcaacgtc ctgctgtatg attcagcaac aggcagcgtc 960 acaaaaatcg tcccgatgac agcatcagga catggagtct gggaagcgac ggtcaaccaa 1020 aacctggaaa actggtatta tatgtatgaa gtcacgggcc aaggatcaac aagaacagcg 1080 gtcgatccgt atgctacagc aatcgccccg aatggaacaa gaggcatgat cgtcgatctg 1140 gcaaaaacag acccggcagg ctggaatagc gataaacata tcacgccgaa aaacatcgaa 1200 gatgaagtca tctatgaaat ggacgtccgg gattttagca tcgatccgaa cagcggcatg 1260 aaaaacaaag gcaaatatct ggcgctgacg gaaaaaggaa caaaaggccc ggataacgtc 1320 aaaacaggca tcgatagcct gaaacaactg ggcatcacac atgtccaact gatgccggtc 1380 tttgctagca atagcgtcga tgaaacggac ccgacacaag ataactgggg ctatgacccg 1440 agaaattatg atgtcccgga aggccaatat gccacgaacg ccaatggaaa cgcccggatc 1500 aaagaattta aagaaatggt cctgagcctt catagagaac atatcggcgt caacatggac 1560 gtcgtctata accatacgtt tgccacacag atcagcgact ttgataaaat cgtgccggaa 1620 tattattatc ggacggatga cgccggcaat tatacgaatg gcagcggcac aggaaatgaa 1680 atcgccgccg aaagaccgat ggtccagaaa tttatcatcg acagccttaa atattgggtc 1740 aacgaatatc atatcgacgg ctttcgcttt gatctgatgg cgctgctggg caaagataca 1800 atgagcaaag cggcgagcga acttcatgct atcaatccgg gcatcgctct ttatggagaa 1860 ccgtggacag gaggaacatc agcactgccg gatgatcaac tgctgacaaa aggcgcccaa 1920 aaaggaatgg gagtcgccgt ctttaacgac aacctgagaa atgccctgga tggcaacgtt 1980 tttgatagca gcgcccaagg atttgctaca ggagcgacag gactgacaga tgccatcaaa 2040 aatggcgtcg aaggcagcat caacgatttt acaagcagcc cgggagagac gatcaattat 2100 gtcacgagcc atgacaacta tacgctgtgg gacaaaatcg ctctgagcaa cccgaatgat 2160 agcgaagcgg accggatcaa aatggatgaa ctggcacaag cagtcgtcat gacatcacaa 2220 ggcgtcccgt ttatgcaagg cggagaagaa atgctgagaa cgaaaggcgg caacgacaac 2280 agctataatg ccggcgatgc cgtcaatgaa tttgactgga gccggaaagc acaatatccg 2340 gacgtcttta actattattc aggacttatc catctgagac tggaccatcc ggcgtttaga 2400 atgacgacgg cgaacgaaat caacagccat cttcagtttc tgaacagccc ggaaaatacg 2460 gtcgcctatg aactgacgga ccatgtgaac aaagacaaat ggggcaacat catcgtcgtt 2520 tataacccga acaaaacggt cgccacaatc aatcttccga gcggcaaatg ggcaatcaat 2580 gccacaagcg gcaaagttgg agaaagcaca ctgggacaag cagaaggatc agtccaagtc 2640 ccgggaatca gcatgatgat ccttcatcaa gaagtcagcc cggaccacgg caaaaaataa 2700 gttaacagag gacggatttc ctgaaggaaa tccgtttttt tattttaagc ttggagacaa 2760 ggtaaaggat aaaacagctg cggccgc 2787 <210> 12 <211> 1777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 12 tcgctgataa acagctgaca tcaactaaaa gcttcattaa atactttgaa aaaagttgtt 60 gacttaaaag aagctaaatg ttatagtaat aaaacagaat agtcttttaa gtaagtctac 120 tctgaatttt tttaaaagga gagggtaaag aatgaaacaa caaaaacggc tttacgcccg 180 attgctgacg ctgttatttg cgctcatctt cttgctgcct cattctgcag ctagcgcagc 240 aaatcttaat gggacgctga tgcagtattt tgaatggtac atgcccaatg acggccaaca 300 ttggaagcgt ttgcaaaacg actcggcata tttggctgaa cacggtatta ctgccgtctg 360 gattcccccg gcatataagg gaacgagcca agcggatgtg ggctacggtg cttacgacct 420 ttatgattta ggggagtttc atcaaaaagg gacggttcgg acaaagtacg gcacaaaagg 480 agagctgcaa tctgcgatca aaagtcttca ttcccgcgac attaacgttt acggggatgt 540 ggtcatcaac cacaaaggcg gcgctgatgc gaccgaagat gtaaccgcgg ttgaagtcga 600 tcccgctgac cgcaaccgcg taatttcagg agaacaccta attaaagcct ggacacattt 660 tcattttccg gggcgcggca gcacatacag cgattttaaa tggcattggt accattttga 720 cggaaccgat tgggacgagt cccgaaagct gaaccgcatc tataagtttc aaggaaaggc 780 ttgggattgg gaagtttcca atgaaaacgg caactatgat tatttgatgt atgccgacat 840 cgattatgac catcctgatg tcgcagcaga aattaagaga tggggcactt ggtatgccaa 900 tgaactgcaa ttggacggtt tccgtcttga tgctgtcaaa cacattaaat tttctttttt 960 gcgggattgg gttaatcatg tcagggaaaa aacggggaag gaaatgttta cggtagctga 1020 atattggcag aatgacttgg gcgcgctgga aaactatttg aacaaaacaa attttaatca 1080 ttcagtgttt gacgtgccgc ttcattatca gttccatgct gcatcgacac agggaggcgg 1140 ctatgatatg aggaaattgc tgaacggtac ggtcgtttcc aagcatccgt tgaaatcggt 1200 tacatttgtc gataaccatg atacacagcc ggggcaatcg cttgagtcga ctgtccaaac 1260 atggtttaag ccgcttgctt acgcttttat tctcacaagg gaatctggat accctcaggt 1320 tttctacggg gatatgtacg ggacgaaagg agactcccag cgcgaaattc ctgccttgaa 1380 acacaaaatt gaaccgatct taaaagcgag aaaacagtat gcgtacggag cacagcatga 1440 ttatttcgac caccatgaca ttgtcggctg gacaagggaa ggcgacagct cggttgcaaa 1500 ttcaggtttg gcggcattaa taacagacgg acccggtggg gcaaagcgaa tgtatgtcgg 1560 ccggcaaaac gccggtgaga catggcatga cattaccgga aaccgttcgg agccggttgt 1620 catcaattcg gaaggctggg gagagtttca cgtaaacggc gggtcggttt caatttatgt 1680 tcaaagatga gttaacagag gacggatttc ctgaaggaaa tccgtttttt tattttaagc 1740 ttggagacaa ggtaaaggat aaaacagctg cggccgc 1777 <210> 13 <211> 2890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 13 tcgctgataa acagctgaca tcaactaaaa gcttcattaa atactttgaa aaaagttgtt 60 gacttaaaag aagctaaatg ttatagtaat aaaacagaat agtcttttaa gtaagtctac 120 tctgaatttt tttaaaagga gagggtaaag aatgaaacaa caaaaacggc tttacgcccg 180 attgctgacg ctgttatttg cgctcatctt cttgctgcct cattctgcag ctagcgcagc 240 tgctaaaccg gcagtcagca acgcttatct ggatgccagc aaccaagtcc tggtcaaact 300 gagccaaccg ctgacacttg gagaaggagc gagcggattt acggtccatg atgacacggc 360 gaacaaagat atcccggtca cgagcgttaa agatgctagc ctgggccaag atgtcacagc 420 agttctggcg ggcacgtttc aacatatctt tggcggatca gattgggcac cggataatca 480 cagcacgctg ctgaaaaaag tcacgaacaa cctgtatcag tttagcggag atctgccgga 540 aggcaactat caatataaag tcgccctgaa cgatagctgg aacaatccga gctatccgag 600 cgataacatc aatctgacag tcccggcagg cggagcacat gtcacgttta gctatatccc 660 gagcacacat gccgtctatg acacgatcaa caacccgaac gccgatcttc aagtcgaaag 720 cggcgtcaaa acggatctgg tcacagtcac attgggagaa gatccggatg tcagccatac 780 actgagcatc caaacggatg gctatcaagc gaaacaagtc atcccgagaa acgtcctgaa 840 cagcagccag tattattata gcggcgatga tctgggcaac acgtatacac aaaaagcgac 900 gacgtttaaa gtttgggcgc cgacaagcac acaagtcaac gtcctgctgt atgattcagc 960 aacaggcagc gtcacaaaaa tcgtcccgat gacagcatca ggacatggag tctgggaagc 1020 gacggtcaac caaaacctgg aaaactggta ttatatgtat gaagtcacgg gccaaggatc 1080 aacaagaaca gcggtcgatc cgtatgctac agcaatcgcc ccgaatggaa caagaggcat 1140 gatcgtcgat ctggcaaaaa cagacccggc aggctggaat agcgataaac atatcacgcc 1200 gaaaaacatc gaagatgaag tcatctatga aatggacgtc cgggatttta gcatcgatcc 1260 gaacagcggc atgaaaaaca aaggcaaata tctggcgctg acggaaaaag gaacaaaagg 1320 cccggataac gtcaaaacag gcatcgatag cctgaaacaa ctgggcatca cacatgtcca 1380 actgatgccg gtctttgcta gcaatagcgt cgatgaaacg gacccgacac aagataactg 1440 gggctatgac ccgagaaatt atgatgtccc ggaaggccaa tatgccacga acgccaatgg 1500 aaacgcccgg atcaaagaat ttaaagaaat ggtcctgagc cttcatagag aacatatcgg 1560 cgtcaacatg gacgtcgtct ataaccatac gtttgccaca cagatcagcg actttgataa 1620 aatcgtgccg gaatattatt atcggacgga tgacgccggc aattatacga atggcagcgg 1680 cacaggaaat gaaatcgccg ccgaaagacc gatggtccag aaatttatca tcgacagcct 1740 taaatattgg gtcaacgaat atcatatcga cggctttcgc tttgatctga tggcgctgct 1800 gggcaaagat acaatgagca aagcggcgag cgaacttcat gctatcaatc cgggcatcgc 1860 tctttatgga gaaccgtgga caggaggaac atcagcactg ccggatgatc aactgctgac 1920 aaaaggcgcc caaaaaggaa tgggagtcgc cgtctttaac gacaacctga gaaatgccct 1980 ggatggcaac gtttttgata gcagcgccca aggatttgct acaggagcga caggactgac 2040 agatgccatc aaaaatggcg tcgaaggcag catcaacgat tttacaagca gcccgggaga 2100 gacgatcaat tatgtcacga gccatgacaa ctatacgctg tgggacaaaa tcgctctgag 2160 caacccgaat gatagcgaag cggaccggat caaaatggat gaactggcac aagcagtcgt 2220 catgacatca caaggcgtcc cgtttatgca aggcggagaa gaaatgctga gaacgaaagg 2280 cggcaacgac aacagctata atgccggcga tgccgtcaat gaatttgact ggagccggaa 2340 agcacaatat ccggacgtct ttaactatta ttcaggactt atccatctga gactggacca 2400 tccggcgttt agaatgacga cggcgaacga aatcaacagc catcttcagt ttctgaacag 2460 cccggaaaat acggtcgcct atgaactgac ggaccatgtg aacaaagaca aatggggcaa 2520 catcatcgtc gtttataacc cgaacaaaac ggtcgccaca atcaatcttc cgagcggcaa 2580 atgggcaatc aatgccacaa gcggcaaagt tggagaaagc acactgggac aagcagaagg 2640 atcagtccaa gtcccgggaa tcagcatgat gatccttcat caagaagtca gcccggacca 2700 cggcaaaaaa taagttaaca gaggacggat ttcctgaagg aaatccgttt ttttatttta 2760 agcttggaga caaggtaaag gataaaacag ctgcggccgc tgagttaaca gaggacggat 2820 ttcctgaagg aaatccgttt ttttatttta agcttggaga caaggtaaag gataaaacag 2880 ctgcggccgc 2890 <210> 14 <211> 1726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 gcttttcttt tggaagaaaa tatagggaaa atggtacttg ttaaaaattc ggaatattta 60 tacaatatca tatgacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg 120 agagggtaaa gaatgaaaca acaaaaacgg ctttacgccc gattgctgac gctgttattt 180 gcgctcatct tcttgctgcc tcattctgca gcttcagcag ccgcaccgtt taacggtacc 240 atgatgcagt attttgaatg gtacttgccg gatgatggca cgttatggac caaagtggcc 300 aatgaagcca acaacttatc cagccttggc atcaccgctc tttggctgcc gcccgcttac 360 aaaggaacaa gccgcagcga cgtagggtac ggagtatacg acttgtatga cctcggcgaa 420 ttcaatcaaa aagggaccgt ccgcacaaaa tatggaacaa aagctcaata tcttcaagcc 480 attcaagccg cccacgccgc tggaatgcaa gtgtacgccg atgtcgtgtt cgaccataaa 540 ggcggcgctg acggcacgga atgggtggac gccgtcgaag tcaatccgtc cgaccgcaac 600 caagaaatct cgggcaccta tcaaatccaa gcatggacga aatttgattt tcccgggcgg 660 ggcaacacct actccagctt taagtggcgc tggtaccatt ttgacggcgt tgattgggac 720 gaaagccgaa aattaagccg catttacaaa ttcaggggca tcggcaaagc gtgggattgg 780 ccggtagaca cagaaaacgg aaactatgac tacttaatgt atgccgacct tgatatggat 840 catcccgaag tcgtgaccga gctgaaaaac tgggggaaat ggtatgtcaa cacaacgaac 900 attgatgggt tccggcttga tgccgtcaag catattaagt tcagtttttt tcctgattgg 960 ttgtcgtatg tgcgttctca gactggcaag ccgctattta ccgtcgggga atattggagc 1020 tatgacatca acaagttgca caattacatt acgaaaacaa acggaacgat gtctttgttt 1080 gatgccccgt tacacaacaa attttatacc gcttccaaat cagggggcgc atttgatatg 1140 cgcacgttaa tgaccaatac tctcatgaaa gatcaaccga cattggccgt caccttcgtt 1200 gataatcatg acaccgaacc cggccaagcg cttcagtcat gggtcgaccc atggttcaaa 1260 ccgttggctt acgcctttat tctaactcgg caggaaggat acccgtgcgt cttttatggt 1320 gactattatg gcattccaca atataacatt ccttcgctga aaagcaaaat cgatccgctc 1380 ctcatcgcgc gcagggatta tgcttacgga acgcaacatg attatcttga tcactccgac 1440 atcatcgggt ggacaaggga aggggtcact gaaaaaccag gatccgggct ggccgcactg 1500 atcaccgatg ggccgggagg aagcaaatgg atgtacgttg gcaaacaaca cgctggaaaa 1560 gtgttctatg accttaccgg caaccggagt gacaccgtca ccatcaacag tgatggatgg 1620 ggggaattca aagtcaatgg cggttcggtt tcggtttggg ttcctagaaa aacgacctga 1680 gttaacagag gacggatttc ctgaaggaaa tccgtttttt tatttt 1726 <210> 15 <211> 1726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 15 gcttttcttt tggaagaaaa tatagggaaa atggtacttg ttaaaaattc ggaatattta 60 tacaatatca tatgaccgca tagtccgtta agtgggtcta cgcggaattt ttttaaaagg 120 agagggtaaa gaatgaaaca acaaaaacgg ctttacgccc gattgctgac gctgttattt 180 gcgctcatct tcttgctgcc tcattctgca gcttcagcag ccgcaccgtt taacggtacc 240 atgatgcagt attttgaatg gtacttgccg gatgatggca cgttatggac caaagtggcc 300 aatgaagcca acaacttatc cagccttggc atcaccgctc tttggctgcc gcccgcttac 360 aaaggaacaa gccgcagcga cgtagggtac ggagtatacg acttgtatga cctcggcgaa 420 ttcaatcaaa aagggaccgt ccgcacaaaa tatggaacaa aagctcaata tcttcaagcc 480 attcaagccg cccacgccgc tggaatgcaa gtgtacgccg atgtcgtgtt cgaccataaa 540 ggcggcgctg acggcacgga atgggtggac gccgtcgaag tcaatccgtc cgaccgcaac 600 caagaaatct cgggcaccta tcaaatccaa gcatggacga aatttgattt tcccgggcgg 660 ggcaacacct actccagctt taagtggcgc tggtaccatt ttgacggcgt tgattgggac 720 gaaagccgaa aattaagccg catttacaaa ttcaggggca tcggcaaagc gtgggattgg 780 ccggtagaca cagaaaacgg aaactatgac tacttaatgt atgccgacct tgatatggat 840 catcccgaag tcgtgaccga gctgaaaaac tgggggaaat ggtatgtcaa cacaacgaac 900 attgatgggt tccggcttga tgccgtcaag catattaagt tcagtttttt tcctgattgg 960 ttgtcgtatg tgcgttctca gactggcaag ccgctattta ccgtcgggga atattggagc 1020 tatgacatca acaagttgca caattacatt acgaaaacaa acggaacgat gtctttgttt 1080 gatgccccgt tacacaacaa attttatacc gcttccaaat cagggggcgc atttgatatg 1140 cgcacgttaa tgaccaatac tctcatgaaa gatcaaccga cattggccgt caccttcgtt 1200 gataatcatg acaccgaacc cggccaagcg cttcagtcat gggtcgaccc atggttcaaa 1260 ccgttggctt acgcctttat tctaactcgg caggaaggat acccgtgcgt cttttatggt 1320 gactattatg gcattccaca atataacatt ccttcgctga aaagcaaaat cgatccgctc 1380 ctcatcgcgc gcagggatta tgcttacgga acgcaacatg attatcttga tcactccgac 1440 atcatcgggt ggacaaggga aggggtcact gaaaaaccag gatccgggct ggccgcactg 1500 atcaccgatg ggccgggagg aagcaaatgg atgtacgttg gcaaacaaca cgctggaaaa 1560 gtgttctatg accttaccgg caaccggagt gacaccgtca ccatcaacag tgatggatgg 1620 ggggaattca aagtcaatgg cggttcggtt tcggtttggg ttcctagaaa aacgacctga 1680 gttaacagag gacggatttc ctgaaggaaa tccgtttttt tatttt 1726 <210> 16 <211> 1730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 16 gcttttcttt tggaagaaaa tatagggaaa atggtacttg ttaaaaattc ggaatattta 60 tacaatatca tatgacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgtttca cattgaaagg 120 aaaggagagg gtaatcatga aacaacaaaa acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt 180 atttgcgctc atcttcttgc tgcctcattc tgcagcttca gcagccgcac cgtttaacgg 240 taccatgatg cagtattttg aatggtactt gccggatgat ggcacgttat ggaccaaagt 300 ggccaatgaa gccaacaact tatccagcct tggcatcacc gctctttggc tgccgcccgc 360 ttacaaagga acaagccgca gcgacgtagg gtacggagta tacgacttgt atgacctcgg 420 cgaattcaat caaaaaggga ccgtccgcac aaaatatgga acaaaagctc aatatcttca 480 agccattcaa gccgcccacg ccgctggaat gcaagtgtac gccgatgtcg tgttcgacca 540 taaaggcggc gctgacggca cggaatgggt ggacgccgtc gaagtcaatc cgtccgaccg 600 caaccaagaa atctcgggca cctatcaaat ccaagcatgg acgaaatttg attttcccgg 660 gcggggcaac acctactcca gctttaagtg gcgctggtac cattttgacg gcgttgattg 720 ggacgaaagc cgaaaattaa gccgcattta caaattcagg ggcatcggca aagcgtggga 780 ttggccggta gacacagaaa acggaaacta tgactactta atgtatgccg accttgatat 840 ggatcatccc gaagtcgtga ccgagctgaa aaactggggg aaatggtatg tcaacacaac 900 gaacattgat gggttccggc ttgatgccgt caagcatatt aagttcagtt tttttcctga 960 ttggttgtcg tatgtgcgtt ctcagactgg caagccgcta tttaccgtcg gggaatattg 1020 gagctatgac atcaacaagt tgcacaatta cattacgaaa acaaacggaa cgatgtcttt 1080 gtttgatgcc ccgttacaca acaaatttta taccgcttcc aaatcagggg gcgcatttga 1140 tatgcgcacg ttaatgacca atactctcat gaaagatcaa ccgacattgg ccgtcacctt 1200 cgttgataat catgacaccg aacccggcca agcgcttcag tcatgggtcg acccatggtt 1260 caaaccgttg gcttacgcct ttattctaac tcggcaggaa ggatacccgt gcgtctttta 1320 tggtgactat tatggcattc cacaatataa cattccttcg ctgaaaagca aaatcgatcc 1380 gctcctcatc gcgcgcaggg attatgctta cggaacgcaa catgattatc ttgatcactc 1440 cgacatcatc gggtggacaa gggaaggggt cactgaaaaa ccaggatccg ggctggccgc 1500 actgatcacc gatgggccgg gaggaagcaa atggatgtac gttggcaaac aacacgctgg 1560 aaaagtgttc tatgacctta ccggcaaccg gagtgacacc gtcaccatca acagtgatgg 1620 atggggggaa ttcaaagtca atggcggttc ggtttcggtt tgggttccta gaaaaacgac 1680 ctgagttaac agaggacgga tttcctgaag gaaatccgtt tttttatttt 1730 <210> 17 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag ggtaaaga 58 <210> 18 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 atagattttt tttaaaaaac tattgcaata aataaataca ggtgttatat tattaaacgt 60 cgctg 65 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 cacatacagc ctaaattggg tgttgacctt ttgataatat ccgtgatata ttattattcg 60 tcgctg 66 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 ttaaatactt tgaaaaaagt tgttgactta aaagaagcta aatgttatag taataaagct 60 gctt 64 <210> 21 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 ataaaaaaat acaggaaaag tgttgaccaa ataaaacagg catggtatat tattaaacgt 60 cgctg 65 <210> 22 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 aacaaaaaag ttttcctaag gtgtttacaa gattttaaaa atgtgtataa taagaaaagt 60 cgaat 65 <210> 23 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 tcgaaaaaac attaaaaaac ttcttgactc aacatcaaat gatagtatga tagttaagtc 60 gctc 64 <210> 24 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 gtttttatca cctaaaagtt taccactaat ttttgtttat tatatcataa acggtgaagc 60 aataatggag gaatggttga cttcaaaaca aataaattat ataatgacct tt 112 <210> 25 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 gtaccgtgtg ttttcatttc agggaaacat gacttaattg ttcctgcaga aatatcgaaa 60 cagtattatc aagaacttga ggcacctgaa aagcgctggt ttcaatttga gaattcagct 120 cacaccccgc atattgagga gccatcatta ttcgcgaaca cattaagtcg gcatgcacgc 180 aaccatttat gatagatcct tgataaataa gaaaaacccc tgtataataa aaaaagtgtg 240 caaatgatgc atattttaaa taagtcttgc aacatgcgcc tattttctgt ataatggtgt 300 ata 303 <210> 26 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 aacatataac tcaggacgct ctatcctggg tttttggctg tgccaaaagg gaataatgaa 60 aaacaatagc atctttgtga agtttgtatt ataataaaaa att 103

Claims (34)

1. 5’에서 3’ 방향으로 5’ 비번역 영역(5' untranslated region; 5' UTR) 핵산 서열이 관심 대상의 유전자(gene of interest; GOI)를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 DNA 분자로서, 5' UTR은 바실루스(Bacillus) 종(spp.) aprE 프로테아제 유전자로부터 유래되며, 5' UTR은 5’ UTR이 작동가능하게 연결된 GOI에 대하여 이종성인 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 5' UTR은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 aprE 유전자로부터 유래된 DNA 분자.
3. 제1항에 있어서, 5' UTR은 서열 번호 9의 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자.
4. 제1항에 있어서, 5' UTR은 서열 번호 2의 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자.
5. 제1항에 있어서, 5' UTR은 서열 번호 10의 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자.
6. 제1항에 있어서, 5' UTR은 서열 번호 17의 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자.
7. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트.
8. 제7항의 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포.
9. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 벡터.
10. 제9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
11. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
12. 제8항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 종인 숙주 세포.
13. 제12항에 있어서, 바실루스 종은 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 렌투스(B. lentus), 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 메가테륨(B. megaterium), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 바실루스 종은 비. 리케니포르미스인 숙주 세포.
15. 제1항에 있어서, 관심 대상의 유전자는 효소를 코딩하는 DNA 분자.
16. 제15항에 있어서, 관심 대상의 유전자는 야생형 바실루스 spp. 효소 또는 변이형 바실루스 spp. 효소를 코딩하는 DNA 분자.
17. 제15항에 있어서, 효소는 아실 트랜스퍼라아제, 알파-아밀라아제, β-아밀라아제, 알파-갈락토시다아제, 아라비노시다아제, 아릴 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 카라기나아제, 카탈라아제, 셀로바이오히드롤라아제, 셀룰라아제, 콘드로이티나아제, 큐티나아제, 엔도-베타-1, 4-글루카나아제, 엔도-β-만난아제, 에스테라아제, 엑소-만난아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 케라티나아제, 락카아제, 락타아제, 리그니나아제, 리파아제, 리폭시게나아제, 만난아제, 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙티나아제, 펜토사나아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 람노갈락투로나아제, β-글루카나아제, 탄나아제, 트랜스글루타미나아제, 자일란 아세틸-에스테라아제, 자일라나아제, 자일로글루카나아제, 및 자일로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 분자.
18. 제15항에 있어서, 효소는 아밀라아제 또는 풀룰라나아제인 DNA 분자.
19. 서열 번호 3 및 서열 번호 11 내지 서열 번호 16의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자.
20. 서열 번호 3 및 서열 번호 11 내지 서열 번호 16의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA 분자.
21. 바실루스 숙주 세포에서 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 변형된 바실루스 숙주 세포를 관심 대상의 단백질을 발현시키기에 적합한 배지에서 성장시키는 단계를 포함하며, 변형된 바실루스 숙주 세포는 5’에서 3’ 방향으로 적어도 (i) 바실루스 spp.로부터 유래된 aprE-5' UTR 및 (ii) 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환되고, 관심 대상의 단백질의 발현은 aprE-5' UTR이 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것을 포함하지 않는 모(parental) 바실루스 숙주 세포로부터 발현된 관심 대상의 동일 단백질의 발현에 비하여 5% 이상 증가된 방법.
22. 증폭을 위하여 50 ppm 이하의 클로람페니콜을 사용하여 변형 바실루스 숙주 세포에서 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 변형된 바실루스 숙주 세포를 관심 대상의 단백질을 발현시키기에 적합한 배지에서 성장시키는 단계를 포함하며, 변형된 바실루스 숙주 세포는 5’에서 3’ 방향으로 (i) 바실루스 spp.로부터 유래된 aprE-5' UTR 및 (ii) 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환되고, 관심 대상의 단백질의 발현은 aprE-5' UTR이 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것을 포함하지 않는 모 바실루스 숙주 세포로부터 발현된 관심 대상의 동일 단백질의 발현에 비하여 5% 이상인 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, aprE 5'-UTR은 비. 서브틸리스로부터 유래된 방법.
24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 리보솜 RNA 유전자로부터의 프로모터를 추가로 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 리보솜 RNA 유전자 프로모터는 P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 rrnE 및 P3 rrnE로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
26. 제21항 또는 제22항에 있어서, 리보솜 단백질 유전자로부터의 프로모터를 추가로 포함하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 리보솜 단백질 유전자 프로모터는 PrpsD, P1 rpsJ, P2 rpsJ 및 PrpoD로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
28. 제21항 또는 제22항에 있어서, LAT (AmyL) 유전자로부터의 프로모터를 추가로 포함하는 방법.
29. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관심 대상의 단백질을 배지로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
30. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관심 대상의 단백질은 박테리아로부터 분비되는 방법.
31. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관심 대상의 단백질은 박테리아 내에 축적되는 방법.
32. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관심 대상의 단백질은 야생형 바실루스 spp. 효소 또는 변이형 바실루스 spp. 효소인 방법.
33. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관심 대상의 단백질은 아실 트랜스퍼라아제, 알파-아밀라아제, β-아밀라아제, 알파-갈락토시다아제, 아라비노시다아제, 아릴 에스테라아제, 베타-갈락토시다아제, 카라기나아제, 카탈라아제, 셀로바이오히드롤라아제, 셀룰라아제, 콘드로이티나아제, 큐티나아제, 엔도-베타-1, 4-글루카나아제, 엔도-β-만난아제, 에스테라아제, 엑소-만난아제, 갈락타나아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 히알루로니다아제, 케라티나아제, 락카아제, 락타아제, 리그니나아제, 리파아제, 리폭시게나아제, 만난아제, 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙티나아제, 펜토사나아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 포스파타아제, 포스포리파아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 풀룰라나아제, 리덕타아제, 람노갈락투로나아제, β-글루카나아제, 탄나아제, 트랜스글루타미나아제, 자일란 아세틸-에스테라아제, 자일라나아제, 자일로글루카나아제, 및 자일로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인 방법.
34. 제33항에 있어서, 효소는 아밀라아제 또는 풀룰라나아제인 방법.

Images