JP2018505686A - 増大したタンパク質発現 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
Description
本願は、2015年2月19日に出願された現在係属中の米国仮特許出願第62/118,382号明細書の利益を主張するものである。
「NB40178WOPCT−Sequence−Listing.txt」という名称のテキストファイル配列表の電子提出の内容は、2015年2月17日に作成され、サイズは27KBであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、新たに導入された核酸配列の宿主または発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。
非翻訳領域または「UTR」は、一般に翻訳されていない、mRNAの配列または対応するDNAの配列である。UTRは、mRNAの5’または3’末端にあってよい。5’非翻訳領域(5’UTR)(リーダ配列またはリーダRNAとしても知られる)は、開始コドンから上流にあるmRNAの領域である。この領域は、ウイルス、原核生物および真核生物で異なる機構による転写物の翻訳の調節に重要である。非翻訳と呼ばれるが、5’UTRまたはその一部がタンパク質産物に翻訳されることもある。その後、この産物は、mRNAの主要コード配列の翻訳を調節し得る。しかし、他の多くの生物では、5’UTRは、翻訳を調節する複雑な二次構造を形成するのではなく、非翻訳である。対応するDNA配列は、一般に、5’または3’UTR配列とも呼ばれる。
GTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATC(配列番号8)
を含み、バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来のaprE遺伝子は、次の5’UTR:
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA(配列番号2)
を含む。
特に、細菌宿主細胞での使用のための好適なプロモータの例として、限定はしないが、例えば、PamyE、PamyQ、PamyL、PpstS、PsacB、PSPAC、PAprE、PVeg、PHpaIIプロモータ、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)マルトース生成アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)(BAN)アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス(B.subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウジイ(B.clausii)アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミリス(B.pumilis)キシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)cryIIIA、およびバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子のプロモータが挙げられる。別のプロモータとして、限定はしないが、A4プロモータ、ならびにファージλPRまたはPLプロモータ、および大腸菌(E.coli)lac、trpもしくはtacプロモータがある。さらには、リボソームタンパク質およびRNAプロモータは、異種タンパク質産生に有用であることが判明している(例えば、国際公開第2013/086219号パンフレットを参照されたい;その開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)。以下のプロモータが考慮される。
本発明により包含されるプロモータは、目的タンパク質をコードする核酸(すなわち、目的のコード配列)に作動可能に連結される。コード配列によりコードされるポリペプチドは、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質もしくはその部分、受容体もしくはその部分、受容体遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質)またはその他の二次代謝物であってよい。
一部の実施形態では、特に目的のコード配列がセルラーゼ、プロテアーゼまたはデンプン分解酵素などの細胞外酵素をコードする場合、シグナル配列をコード配列のN−末端部分に連結してもよい。シグナルを用いてDNA配列の分泌を促進してもよい。シグナル配列は、宿主生物に対して内在性または外性のいずれであってもよい。シグナル配列は、コードされたポリペプチドと正常に結合しているものであってよい。一部の実施形態では、シグナル配列は、国際公開第2011/014278号パンフレットおよび同第2010/123754号パンフレットに記載されているように、改変または修飾してもよく、これらの明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、シグナル配列は、ストレプトマイセス(Streptomyces)セルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列を含む。一実施形態では、好ましいシグナル配列は、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)セルラーゼ、celAである(Bently et al.,(2002)Nature 417:141−147)。しかしながら、当業者であれば、宿主生物に発現および分泌させようとするタンパク質に応じて使用することができる多数のシグナル配列(例えば、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼシグナルペプチド)について知っている。
目的のコード領域を含む本発明の核酸構築物は、確立された標準的方法、例えば、Beaucage and Caruthers,(1981)Tetrahedron Letters 22:1859−1869により記載のホスホロアミダイト法、またはMatthes et al.,(1984)EMBO Journal 3:801−805により記載の方法により、合成的に調製することができる。核酸構築物は、混合合成およびゲノム起源であってもよく、合成またはゲノムDNAの断片を連結することにより調製してもよい。核酸構築物はまた、例えば、米国特許第4,683,202号明細書またはSaiki et al.,Science 239(1988),487−491に記載されているような特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により調製してもよい。
本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換する。一般的形質転換技術は、当該技術分野において公知である(Ausubel et al.,1994, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYおよびCampbell et al.,1989 Curr.Genet 16:53−56)。これらの一般的技術のいくつかは、限定はしないが、粒子もしくは遺伝子ガン(微粒子銃)の使用、形質転換プロセス前の糸状真菌細胞壁の透過化(例えば、高濃度のアルカリ、例えば、0.05M〜0.4M CaCl2もしくは酢酸リチウムの使用により)、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、またはアグロバクテリウム(agrobacterium)媒介形質転換(米国特許第6,255,115号明細書)を含み、また、ポリエチレングリコールおよびCaCl.sub.2によるプロトプラストもしくはスフェロプラストの処理がCampbell,et al.,(1989)Curr.Genet.16:53−56,1989およびPenttila,M.et al.,(1988)Gene,63:11−22に記載されている。
本発明に従って使用することができる宿主細胞は、細菌および真菌細胞の両方を含む。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス属(Aspergillus)およびトリコデルマ属(Trichoderma)細胞などの糸状真菌細胞が挙げられる。好ましい細菌宿主細胞は、グラム陽性およびグラム陰性細胞の両方を含み、例えば、バチルス属(Bacillus)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、アクチノマイセス属(Actinomyces)およびストレプトマイセス属(Streptomyces)細胞が挙げられる。宿主細胞は、限定はしないが、大腸菌(E.coli)、シュードモナス属(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(P.aeruginosa)およびシュードモナス・アルカリゲネス(P.alcaligenes))、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種(例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans))、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サーキュランス(B.circulans)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)も含む。
宿主細胞および形質転換細胞を従来の栄養培地で培養することができる。形質転換宿主細胞の培地は、プロモータを活性化し、形質転換体を選択するために、必要に応じて修飾してもよい。温度、pHなどの具体的な培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に使用されるものであってよく、当業者に明らかであろう。さらに、好ましい培養条件は、Sambrook,(1982)前掲;Kieser,T,M J.Bibb,M J.Buttner,K F Chater,and D.A.Hopwood(2000)PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS.John Innes Foundation,Norwich UK;Harwood,et al.,(1990)MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS,John Wileyなどの科学文献で、および/またはAmerican Type Culture Collection(ATCC;“http://www.atcc.org/”)から見出すことができる。トリコデルマ属(Trichoderma)細胞などの真菌宿主細胞の安定な形質転換体は、概して、その高速の増殖速度、または固体培地上にでこぼこではなく、滑らかな輪郭を有する円状コロニーの形成によって不安定な形質転換体から識別することができる。
形質転換宿主細胞により産生されるポリペプチドは、遠心分離もしくは濾過により培地から宿主細胞を分離する、または必要であれば、細胞を破壊し、細胞画分および残屑から上清を取り出すなどの従来の方法によって培地から回収することができる。典型的には、清澄化後、上清または濾過物のタンパク質成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる。次に、沈殿したタンパク質を可溶化した後、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびその他の当該技術分野で承認されている方法によって精製してもよい。
1つの一般的実施形態では、本発明は、DNA構築物をin vitroでアセンブリングするステップを含み、続いて、構築物が宿主ゲノムに組み込まれるように、この構築物をコンピテント宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus)宿主細胞)に直接クローニングする。例えば、いくつかの実施形態では、PCR融合および/または連結を使用してDNA構築物をin vitroでアセンブリングする。好ましい実施形態では、DNA構築物は、非プラスミドDNA構築物である。別の実施形態では、DNA構築物は、突然変異が導入されているDNAを含む。次に、この構築物を用いて宿主細胞を形質転換する。これに関して、宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus))の高度にコンピテントな突然変異体を用いて細胞への構築物の直接クローニングを促進するのが好ましい。例えば、キシロース誘導性プロモータ(Pxyl−comK)の制御下でcomK遺伝子を担持するバチルス属(Bacillus)は、本明細書に記載するように、極めて高い効率で確実に形質転換することができる。細胞の形質転換には、当該技術分野で公知のいずれの好適な方法を用いてもよい。形質転換前にDNA構築物をベクター(すなわち、プラスミド)に挿入することができる。一部の好ましい実施形態では、適切な制限酵素(すなわち、DNA構築物を破壊しないもの)を用いて環状プラスミドを切断する。従って、一部の実施形態では、環状プラスミドは、本発明で用途が見出される。しかしながら、代替の実施形態では、線状プラスミドを用いる。一部の実施形態では、DNA構築物(すなわち、PCR産物)は、プラスミドDNAの存在なしに使用されている。
aprE5’UTRによるバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ(LAT)の産生向上
ネイティブLATプロモータ、LAT5’UTR、LATシグナルペプチド配列およびLAT転写ターミネータと共に、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ(LAT)遺伝子を含有する発現構築物を、米国特許第7968691号明細書に記載される通りにpICatHベクターのXhoI部位にクローニングした。LAT発現カセット(XhoI断片)を配列番号1に示す。
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA
aprE5’UTRによるプルラナーゼPULm104の産生向上
PULm104は、N−末端104アミノ酸が欠失したバチルス・デラミフィカンス(Bacillus deramificans)プルラナーゼである。PULm104を産生するバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)株の構築は、米国特許第8354101号明細書に記載されている。米国特許第8354101号明細書に記載されている最良の産生株は、amyL(LAT)5’UTRを含有するBML780−PULm104−Ori1−CAP75であった。
リボソームRNAプロモータと共にaprE5’UTRを用いる目的タンパク質の産生向上
リボソームRNAプロモータ(例えば、P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnEまたはP3 rrnE)またはリボソームタンパク質プロモータ(例えば、PrpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJ)またはシグマ因子プロモータ(例えば、PrpoD)、aprE5’UTR、本明細書に記載する好適なシグナル配列(例えば、LAT、aprE、CBH1、ストレプトマイセス(Streptomyces)セルラーゼ遺伝子シグナル配列)、本明細書に記載する目的の好適な遺伝子ならびに転写ターミネータを含む発現構築物は、好適なベクター(例えば、pICatH)の好適な制限部位(例えば、XhoI)にクローニングする。発現カセットを配列番号12および13に示す。
aprE5’UTRおよびその変異体を用いたゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(G.stearothermophilus)アミラーゼ変異体の産生向上
標準的バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)組込みベクター、すなわち、LAT(バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)AmyL)プロモータの下流にゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(G.stearothermophilus)(AmyS)変異体遺伝子を含有するpKB360−CatHにおいて、LAT5’−UTR配列をAprE−WT 5’−UTRおよびAprE−V2−5’−UTRまたはAprE−V3−5’−UTRにより置換した(概略的プラスミドマップについては図3を参照)。発現カセットの配列を以下に示す。
Claims (34)
- 5’から3’方向に、目的の遺伝子(GOI)をコードする核酸配列に作動可能に連結された5’非翻訳領域(5’UTR)核酸配列を含むDNA分子であって、5’UTRは、バチルス属(Bacillus)種aprEプロテアーゼ遺伝子から得られ、前記5’UTRは、前記5’UTRが作動可能に連結される前記GOIに対して異種である、DNA分子。
- 前記5’UTRは、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)由来のaprE遺伝子から得られる、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記5’UTRは、配列番号9と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記5’UTRは、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記5’UTRは、配列番号10と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記5’UTRは、配列番号17と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載のDNA分子。
- 請求項1に記載のDNA分子を含む発現カセット。
- 請求項7に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載のDNA分子を含むベクター。
- 請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載のDNA分子を含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、バチルス属(Bacillus)種である、請求項8、10または11のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記バチルス属(Bacillus)種は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・クラウジイ(B.clausii)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)からなる群から選択される、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記バチルス属(Bacillus)種は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記目的の遺伝子は、酵素をコードする、請求項1に記載のDNA分子。
- 前記目的の遺伝子は、野生型バチルス属(Bacillus)種酵素または変異型バチルス属(Bacillus)種酵素をコードする、請求項15に記載のDNA分子。
- 前記酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される、請求項15に記載のDNA分子。
- 前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項15に記載のDNA分子。
- 配列番号3および11〜16からなる群から選択される配列と90%の配列同一性を有する配列を含むDNA分子。
- 配列番号3および11〜16からなる群から選択される配列を含むDNA分子。
- バチルス属(Bacillus)宿主細胞において目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞は、5’から3’方向に、少なくとも(i)バチルス属(Bacillus)種由来のaprE−5’UTR、と(ii)前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたaprE−5’UTRを含まない親バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも5%だけ増加される、方法。
- 増幅のために50ppm以下のクロラムフェニコールを用いて、修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞で目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞は、5’から3’方向に、(i)バチルス属(Bacillus)種由来のaprE−5’UTRと、(ii)前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたaprE−5’UTRを含まない親バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも5%である、方法。
- 前記aprE−5’UTRは、バチルス・サブチリス(B.subtilis)に由来する、請求項21または22に記載の方法。
- リボソームRNA遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記リボソームRNA遺伝子プロモータは、P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnEおよびP3 rrnEからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記リボソームタンパク質遺伝子プロモータは、PrpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJおよびPrpoDからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- LAT(AmyL)遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目的タンパク質を前記培地から回収するステップをさらに含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目的タンパク質は、前記細菌から分泌される、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目的タンパク質は、前記細菌内に蓄積する、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目的タンパク質は、野生型バチルス属(Bacillus)種酵素または変異型バチルス属(Bacillus)種酵素である、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目的タンパク質は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される酵素である、請求項21または22に記載の方法。
- 前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項32又は請求項33に記載の方法。
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