JP2019511218A - 微生物におけるタンパク質産生のための遺伝子操作されたリボソームプロモーター - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、2016年3月4日に出願された米国仮特許出願第62/304,061号明細書の利益を主張するものである。
2017年3月6日に作成され、サイズが72KBである、「NB40928WOPCT_SequenceListing.txt」と名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(I) 5’−UP−1stPro−ORF−3’;
(II) 5’−UP−1stPro−UTR−ORF−3’;
(III) 5’−UP−1stPro−2ndPro−ORF−3’;
(IV) 5’−UP−1stPro−2ndPro−UTR−ORF−3’;
(V) 5’−UP−1stPro−UTR−2ndPro−UTR−ORF−3’;
(VI) 5’−UP−1stPro−2ndPro−3rdPro−ORF−3’;
(VII) 5’−UP−1stPro−2ndPro−3rdPro−UTR−ORF−3’;および
(VIII) 5’−UP−1stPro−2ndPro−UTR−3rdPro−UTR−ORF−3’
(式中、UPは、プロモーター上流要素を含む核酸であり、1stPro、2ndProおよび3rdProは少なくとも−35/−10コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、UTRは未翻訳領域を含む核酸であり、ORFは関心対象のタンパク質をコードする核酸オープンリーディングフレームであり、UP要素は、配列番号45〜61のいずれか1つ、プロモーター活性を保持する配列番号45〜61の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号45〜61のいずれか1つと少なくとも60%相同である核酸、または中ストリンジェンシー条件下で配列番号45〜61のいずれか1つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含み、1stPro、2ndProおよび3rdProは、配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つ、プロモーター活性を保持する配列番号1〜39および101〜154の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つと少なくとも60%相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む)から選択される式を含む単離された核酸に関する。
他に特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する(例えば、Singleton,et al.,1994,Hale & Marham,1991を参照)。本発明の実施もしくは試験においては、本明細書に記載するものと同様もしくは同等である任意の方法および材料を使用できるが、好ましい方法および材料について記載する。
リボソームRNA(rRNA)合成は、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)およびバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)におけるリボソーム合成の律速工程である。リボソームRNAプロモーターからのリボソームRNA転写の調節は、以前に研究されている(Samarrai et al.,2011;Natori et al.,2009;Turnbough,2008;Krasny et al.,2008;Krasny and Gourse,2004)。リボゾームRNAプロモーターは栄養状態によって厳密に調節されるので、リボソームRNAおよびリボソームは、翻訳要件がより低い場合には過剰産生されない。
(式中、UPはプロモーター上流要素を含む核酸であり、1stProは少なくとも1つの−35/−10コアプロモーター配列を含む核酸であり、ORFはPOIをコードする核酸配列である)を含む。
(式中、UPはプロモーター上流要素を含む核酸であり、1stProおよび2ndProは少なくとも1つの−35/−10コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、ORFはPOIをコードする核酸である)を含む。
5’−UP−1stPro−UTR−ORF−3’;
5’−UP−1stPro−2ndPro−UTR−ORF−3’;
5’−UP−1stPro−UTR−2ndPro−UTR−ORF−3’
(式中、UPはプロモーター上流要素を含む核酸であり、1stProおよび2ndProは少なくとも1つの−35/−10コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、UTRは5’未翻訳領域を含む核酸であり、およびORFはPOIをコードする核酸である)を含む。
所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターは、関心対象のタンパク質(POI)をコードする核酸(例えば、ポリヌクレオチドもしくはORF)に操作可能に連結されている。1つ以上の実施形態では、POIは、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体もしくはその断片、受容体もしくはその部分、レポーター遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質)または他の二次代謝産物である。
Qp=gP/gDCW・hr
(式中、「gP」は、タンク内で産生するタンパク質のグラム数であり;「gDCW」はタンク内の乾燥細胞重量(DCW)のグラム数であり、「hr」は、産生時間ならびに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間(時間)である)を使用して決定することができる。
所定の実施形態では、本開示の改変宿主細胞は、非改変(親)細胞と比較して、POIを少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%もしくは少なくとも約10%以上産生する。
所定の実施形態では、特にPOIをコードする核酸が細胞外酵素、例えばセルラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼなどをコードする場合は、シグナル配列はコーディング配列のN末端部分に連結させることができる。シグナルは、本開示のPOIの細胞外分泌を促進するために使用されてよい。シグナル配列は、その中でPOIが発現させられる宿主生物にとって内在性であってよい、またはその中でPOIが発現させられる宿主生物に外来性(非相同)であってよい。
POIをコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたプロモーターを含む本発明の核酸構築物は、当技術分野において確立された標準方法によって合成的に調製することができる(例えば、Beaucage and Caruthers,1981によって記載されたホスホルアミダイト法、またはMatthes et al.,1984によって記載された方法)。核酸構築物は、混合合成およびゲノム起源の構築物であってよく、合成もしくはゲノムDNAの断片をライゲートする工程によって調製することができる。核酸構築物は、さらに、例えば米国特許第4,683,202号明細書またはSaiki et al.,1988に記載されたように、特定プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって調製することができる。
本発明のベクターは、宿主細胞内に形質転換させられるであろう。一般的形質転換技術は、当技術分野において公知である(Ausubel et al.,1994;Campbell et al.,1989)。これらの一般的技術の一部には、粒子銃もしくは遺伝子銃の使用(バイオリスティクス)、形質転換プロセス前の糸状菌細胞の透過化(例えば、高濃度のアルカリ、例えば0.05M〜0.4MのCaCl2もしくは酢酸リチウムの使用によって)、プロトプラスト融合、エレクトロポレーションもしくはアグロバクテリウム属(agrobacterium)媒介性形質転換(米国特許第6,255,115号明細書)およびCampbell et al.,1989およびPenttila et al.,1988に記載されたプロトプラストもしくはスフェロプラストのポリエチレングリコールおよびCaCl2による処理が含まれるがそれらに限定されない。
本発明にしたがって使用できる宿主細胞には、細菌細胞および真菌細胞の両方が含まれる。好ましい真菌宿主細胞には、糸状菌細胞、例えばアスペルギルス属(Aspergillus)およびトリコデルマ属(Trichoderma)細胞が含まれる。好ましい細菌宿主細胞には、バチルス属(Bacillus)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、アクチノミセス属(Actinomyces)およびストレプトミセス属(Streptomyces)宿主細胞を含むグラム陽性細胞およびグラム陰性細胞の両方が含まれる。宿主細胞にはさらに、制限なく、E.コリ(E.coli)シュードモナス種(Pseudomonas spp.)(例えば、P.エルギノア(P.aeruginoa)およびP.アルカリゲネス(P.alcaligenes))、ストレプトミセス種(Streptomyces spp.)(例えば、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans))、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、B.リケニホルミス(B.licheniformis)、B.レンツス(B.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B.alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.サーキュランス(B.circulans)、B.ラウツス(B.lautus)、B.メガテリウム(B.megatherium)およびB.チューリンギエンシス(B.thuringiensis)が含まれる。
本開示の宿主細胞および形質転換細胞は、一般に従来型の栄養培地中で培養される。形質転換宿主細胞のための培養培地は、プロモーターを活性化するため、および形質転換体を選択するために適宜改変されてよい。例えば温度、pHなどの特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のために使用される条件であってよく、当業者には明らかであろう。
本開示の形質転換宿主細胞により産生した関心対象のポリペプチドは、当業者には公知の、遠心分離もしくは濾過によって培地から宿主細胞を分離する工程、または必要であれば、細胞を崩壊させて細胞分画および細胞破片から上清を除去する工程を含む従来型手技によって培養培地から回収することができる。典型的には、清浄化後、上清もしくは濾液のタンパク性成分は、塩析法(例えば、硫酸アンモニム)によって沈澱させられる。沈殿したタンパク質は、その後に可溶化され、様々なクロマトグラフィー手技、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびその他の当技術分野で認識された手技によって精製することができる。したがって、所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターから発現したPOIは、単離されたPOI、回収されたPOIおよび/または精製されたPOIである。
所定の一般的実施形態では、本発明は、in vitroで核酸構築物を組み立てる(構築する)工程、その後に構築物が宿主ゲノムに組み込まれるようにコンピテント宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus)宿主細胞)内へそのような構築物を直接的にクローニングする工程を包含する。例えば、所定の実施形態では、in vitroでDNA構築物を組み立てるために、PCR融合、ギブソン・アッセンブリーおよび/またはライゲーションが使用される。所定の他の実施形態では、DNA(核酸)構築物は、非プラスミドDNA構築物である。他の実施形態では、DNA構築物は、突然変異がその中に導入されているDNAを含む。この構築物は、次に宿主細胞を形質転換させるために使用される。これに関連して、宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus))の高度にコンピテントな変異体は、好ましくは、細胞内への構築物の直接的クローニングを促進するために使用される。例えば、キシロース誘導性プロモーター(Pxyl−comK)の制御下でcomK遺伝子を運搬するバチルス属(Bacillus)は、極めて高い効率で確実に形質転換させることができる。
バチルス属(Bacillus)における発現のためのハイブリッドプロモーターもしくは非相同プロモーターを用いたDNA構築物の生成
A.ハイブリッドプロモーターを用いたDNA構築物
バチルス属(Bacillus)発現宿主における関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を転写させるために、単一非相同プロモーター、単一ハイブリッドプロモーター、複数(2種以上)の非相同プロモーター、複数(2種以上)のハイブリッドプロモーターおよびそれらの組み合わせを生成した。これらの単一非相同プロモーター、単一ハイブリッドプロモーター、複数の非相同プロモーター、複数のハイブリッドプロモーターおよびそれらの組み合わせは、さらに少なくとも1つの上流プロモーター要素(UP要素)5’を有すると定義され、少なくとも1つのプロモーター要素に操作可能に連結されており、ここで少なくとも1つのUP要素および少なくとも1つのプロモーター要素は天然では相互に結び付いて(すなわち、操作可能に連結されて)おらず、それらは同一天然「完全」プロモーターにも由来しない。
本実施例では、非相同もしくは相同バチルス属(Bacillus)プロモーターを備える核酸構築物は、バチルス属(Bacillus)発現宿主における関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を転写させるために生成した。これらのプロモーターは、それぞれUP要素5’を含んでプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1つの天然(野生型)「完全プロモーター」を有するが、UP要素および天然(野生型)「完全プロモーター」のプロモーターは、自然に結び付いていて同一の天然「完全プロモーター」と一緒に操作可能に連結されている、またはそれに由来する。
バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)における天然プロモーターおよび遺伝子操作されたプロモーターからのタンパク質発現
サブチリシンBPN’Y217Lの発現を駆動する天然プロモーターおよび合成プロモーターを振とうフラスコ培養中で試験した。試験したプロモーター配列は、以下のとおりであった:(1)PaprE(配列番号28)、(2)PssrA(配列番号25)、(3)Pscr(配列番号26)、(4)PspoVG(配列番号27)、(5)PrrnI−2(配列番号15)、(6)ハイブリッド単一プロモーター1(P1;配列番号65)および(7)ハイブリッド二重プロモーター7(P7;配列番号71)。上述した構築物のそれぞれを用いて形質転換させたB.サブチリス(B.subtilis)細胞を5mLのルリアブロス中で一晩増殖させた。1mLの各前培養を使用して、250rpmに設定した振とう器速度を用いて12時間インキュベートしながら振とうフラスコ中の25mLの脳心臓滲出物(BHI)培地を接種した。全ブロスを1時間毎に収集し、SpectraMax分光光度計(Molecular Devices、Downington、PA、USA)を使用して600nmでの吸光度を測定するために10倍に希釈した。600nmでの吸光度を各サンプルについて時間の関数としてプロットし、結果は図2に示した。図2に示したように、経時的に観察された細胞密度の増加は全菌株について類似であったが、これはサブチリシンBPN’Y217Lの発現における差の原因がサンプル間の培養密度の差ではないことを示していた(例えば、図2を参照)。同時に、相対タンパク質発現は、国際公開第2010/144283号パンフレットに記載されたN−suc−AAPF−pNA基質(Sigma Chemical Co.)を使用して、以下のプロモーター配列:(1)PaprE(配列番号:28)、(2)PssrA(配列番号:25)、(3)Pscr(配列番号:26)、(4)PspoVG(配列番号:27)、(5)PrrnI−2(配列番号:15)、(6)ハイブリッド単一プロモーター1(P1;配列番号65)および(7)ハイブリッド二重プロモーター7(P7;配列番号71)の1つを運ぶB.サブチリス(B.subtilis)細胞から監視した。この基質は、BPN’Y217Lなどのサブチリスプロテアーゼの活性を監視するために日常的に使用されている。手短には、培養期間中に培養ブロスを収集し、アッセイ用バッファー(100mMのトリス、0.005%のTween80、pH8.6)中で40倍に希釈し、希釈サンプル10μLをマイクロタイタープレートに配置した。AAPF基質ストックを希釈し、アッセイバッファー(DMSO中の100mg/mLのAAPFストックの100×希釈液)および190μLのこの溶液をマイクロタイタープレートに加えた。この溶液の増加する吸光度は、SpectraMax分光光度計を使用して405nmで25℃で5分間まで20秒間の増分で測定した。405nmでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図3に示した。これらの結果は、配列番号25(2;PssrA)、配列番号26(3;Pscr)、配列番号15(5;PrrnI−2)、配列番号65(6;ハイブリッド単一プロモーター1)および配列番号71(7;ハイブリッド二重プロモーター)にプロモーターが配列番号28(1;PaprE)および配列番号27(4;PspoVG)のプロモーターより高い生産性を生じさせることを示している。特に、図3に示したように、ハイブリッドプロモーター1(6;配列番号65)およびハイブリッドプロモーター7(7;配列番号71)は、試験した条件下でサブチリシンBPN’Y217L産生レベルが最高であることを証明している。
バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)における非相同プロモーターおよび遺伝子操作されたプロモーターからのタンパク質発現
B.リケニホルミス(B.licheniformis)におけるサイトファガ属(Cytophaga)種アミラーゼ変異体(配列番号63)の発現を駆動するために、非相同プロモーターPrrnI−2(配列番号15)およびその遺伝子操作された変異体プロモーター、すなわち、変異体2(ハイブリッドプロモーター1、配列番号65);変異体3(ハイブリッドプロモーター23、配列番号96);変異体10(ハイブリッドプロモーター22、配列番号95);変異体11(ハイブリッドプロモーター19、配列番号92);変異体12(ハイブリッドプロモーター18、配列番号91)および変異体13(ハイブリッドプロモーター17、配列番号90)を使用した。B.リケニホルミス(B.licheniformis)形質転換後に、当技術分野において公知の方法を使用して、細胞培養をソイトンおよびCaCl2が補給されたMOPS塩基性培地(pH6.8)中で増殖させた。37℃で強力に振とうしながらInforsインキュベーター内で64時間増殖させた後、アミラーゼ活性は、Ceralpha α−アミラーゼアッセイキット(Megazyme、Wicklow、Ireland)を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して培養ブロスサンプル中で測定した。Ceralpha基質は、規定のオリゴ糖非還元型末端ブロック化p−ニトロフェニルマルトヘプタオシド(BPNPG7)および過剰レベルのグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ(ブロック基の存在に起因して天然基質には作用を有していない)の混合物である。エンド作用性α−アミラーゼによりオリゴ糖が加水分解されると、混合物中に存在する過剰量のα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼは、p−ニトロフェニルマルト糖分画からグルコースおよび遊離p−ニトロフェノールへの瞬間的および定量的加水分解を生じさせる。
天然のバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)およびバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)リボソームプロモーターを使用した様々なアミラーゼの発現
B.サブチリス(B.subtilis)およびB.リケニホルミス(B.licheniformis)からの一連の天然(野生型)プロモーターをB.リケニホルミス(B.licheniformis)宿主における数種の細菌アミラーゼの発現について評価した。評価したプロモーターは:amyLバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)天然アミラーゼ遺伝子のPamyL(配列番号116)プロモーター;バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)リボソームRNA rrnIのPrrnI−2 Bsu(配列番号15)第2プロモーター;バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)Prrn1(配列番号101);バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)Prrn2(配列番号102);バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)Prrn4(配列番号103);バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)Prrn5(配列番号104)およびバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)Prrn6(配列番号105)であった。
様々なバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)およびバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)リボソームプロモーター配列の比較
バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)プロモーターPrrnO_P1(配列番号85)、PrrnO_P2(配列番号89)、PrrnA_P1(配列番号142)、PrrnA_P2(配列番号143)、PrrnJ_P1(配列番号144)、PrrnJ_P2(配列番号145)、PrrnI_P1(配列番号146)、PrrnE_P2(配列番号147)、PrrnE_P3(配列番号148)、PrrnD_P1(配列番号149)、PrrnD_P2(配列番号150)、PrrnG_P1(配列番号151)およびPrrnW_P1(配列番号152)の配列は、図6に示したGeneiousソフトウェア(Biomatters Ltd.)を使用してデフォルトパラメーターを用いて整列させた。コンセンサス配列および配列ロゴを提示するための選択肢を選択した。配列ロゴは、各位置でのヌクレオチドの相対頻度の表示であり、配列ロゴは、上記の図7における複数の配列アラインメントに示した、各位値の上方の1文字コードのサイズによって表される。このアラインメントを使用して、B.サブチリス(B.subtilis)rrnプロモーターについてのコンセンサス配列を生成し(配列番号153)、図2の一番上に示した。コンセンサス配列は、N=任意のヌクレオチド、R=A/G、Y=C/T、S=G/C、W=A/T、K=G/T、M=A/C、B=C/G/T、D=A/G/T、H=A/C/TおよびV=A/C/Gと規定されたIUPAC命名法を使用する。
カナダ国特許出願第2891519号明細書
欧州特許公開第323299号明細書
欧州特許公開第351029A号明細書
PCT国際出願番号 PCT/IB2011/053018号明細書
PCT国際公開番号 国際公開第1996/00787号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2000/37614号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2001/027252号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2001/027252号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2001/51643号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第200151620号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第200198462号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2003/089621号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2004/97001号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2004/99369号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2004/99370号パンフレット
PCT国際公開番号 国際公開第2005/93050号パンフレット
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Claims (17)
- 関心対象のタンパク質(POI)をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸であって、前記ハイブリッドプロモーターは、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96および配列番号97のいずれか1つの前記ヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号65〜80および90〜97の部分配列、配列番号65〜80および90〜97のいずれか1つと少なくとも60%相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号65〜80および90〜97のいずれか1つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む単離された核酸。
- 前記POIは酵素である、請求項1に記載の単離された核酸。
- 前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項2に記載の単離された核酸。
- 関心対象のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作された完全プロモーターを含む単離された核酸であって:
(I) 5’−UP−1stPro−ORF−3’;
(II) 5’−UP−1stPro−UTR−ORF−3’;
(III) 5’−UP−1stPro−2ndPro−ORF−3’;
(IV) 5’−UP−1stPro−2ndPro−UTR−ORF−3’;
(V) 5’−UP−1stPro−UTR−2ndPro−UTR−ORF−3’;
(VI) 5’−UP−1stPro−2ndPro−3rdPro−ORF−3’;
(VII) 5’−UP−1stPro−2ndPro−3rdPro−UTR−ORF−3’;および
(VIII) 5’−UP−1stPro−2ndPro−UTR−3rdPro−UTR−ORF−3’(式中、UPは、プロモーター上流要素を含む核酸であり、1stPro、2ndProおよび3rdProは少なくとも−35/−10コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、UTRは未翻訳領域を含む核酸であり、ORFは関心対象のタンパク質をコードする核酸オープンリーディングフレームであり、前記UP要素は、配列番号45〜61のいずれか1つ、プロモーター活性を保持する配列番号45〜61の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号45〜61のいずれか1つと少なくとも60%相同である核酸、または中ストリンジェンシー条件下で配列番号45〜61のいずれか1つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含み、前記1stPro、2ndProおよび3rdProは、配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つ、プロモーター活性を保持する配列番号1〜39および101〜154の部分配列、配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つと少なくとも60%相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号1〜39および101〜154のいずれか1つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む)から選択される式を含む、単離された核酸。 - 前記ORFによってコードされた前記POIは、酵素である、請求項4に記載の単離された核酸。
- 請求項1に記載の核酸を含むベクター。
- 前記ベクターは、発現ベクターもしくは染色体組込みベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む細菌宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、B.サブチリス(B.subtilis)、B.リケニホルミス(B.licheniformis)、B.レンツス(B.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、B.アルカロフィルス(B.alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.サーキュランス(B.circulans)、B.ラウツス(B.lautus)、B.メガテリウム(B.megatherium)、B.チューリンギエンシス(B.thuringiensis)およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)からなる群から選択されるバチルス属(Bacillus)宿主細胞である、請求項8に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載の前記核酸は、前記宿主細胞の染色体遺伝子座と相同である核酸配列に5’および3’の両方で隣接されている、請求項1に記載の核酸を含む組込みベクター。
- 前記宿主細胞は、バチルス属(Bacillus)細胞であり、前記5’および3’核酸配列は配列番号87の核酸を含むB.サブチリス(B.subtilis)aprE染色体座yhfOおよび配列番号88の核酸を含むB.サブチリス(B.subtilis)aprE染色体座yhfNと相同である、請求項10に記載のベクター。
- 請求項8の宿主細胞から単離された関心対象のタンパク質(POI)。
- POIの発現の増加について形質転換宿主細胞をスクリーニングするための方法であって:
(i)関心対象のタンパク質(POI)をコードする核酸に操作可能に連結された非相同遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって:前記ハイブリッドプロモーターが配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96および配列番号97のいずれか1つの前記ヌクレオチド配列を含む工程、
(ii)工程(i)と同一の前記POIをコードする核酸に操作可能に連結されたその天然プロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって、工程(i)および(ii)において形質転換される前記宿主細胞が同一の属種および遺伝的背景を備える宿主細胞である工程、および
(iii)前記POIが発現するような条件下で前記改変細胞を培養する工程を含み、
ここで、工程(ii)における同一の前記POIコーディング配列の発現と比較した工程(i)における前記POIコーディング配列の発現の増加が前記POIの発現の増加を示す方法。 - 宿主細胞におけるPOIの発現を増加させるための方法であって:
(i)関心対象のタンパク質(POI)をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む核酸を宿主細胞に導入することによって宿主細胞を改変する工程であって、前記ハイブリッドプロモーターが配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96および配列番号97のいずれか1つの前記ヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号65〜80および90〜97の部分配列を含む工程、および
(ii)前記POIが発現するような条件下で前記改変宿主細胞を培養する工程
を含む方法。 - 前記宿主細胞は、B.サブチリス(B.subtilis)、B.リケニホルミス(B.licheniformis)、B.レンツス(B.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、B.アルカロフィルス(B.alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.コアギュランス(B.coagulans)、B.サーキュランス(B.circulans)、B.ラウツス(B.lautus)、B.メガテリウム(B.megatherium)、B.チューリンギエンシス(B.thuringiensis)およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記POIは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である、請求項15に記載の方法。
- 産生した前記POIを単離する工程および精製する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
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