CN109071615A - 用于在微生物中产生蛋白质的工程化核糖体启动子 - Google Patents

用于在微生物中产生蛋白质的工程化核糖体启动子 Download PDF

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Abstract

本公开总体上涉及来自芽孢杆菌属的新颖工程化杂合核糖体启动子。在某些实施例中，本公开涉及一种或多种核酸组合物，其包含与编码目的蛋白质的核酸有效地连接的所述工程化启动子。因此，本文所阐述的公开描述了使用本公开的一种或多种新颖工程化杂合核糖体启动子产生目的蛋白质的方法和组合物。

Description

用于在微生物中产生蛋白质的工程化核糖体启动子
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学和基因工程领域。在某些实施例中，本发明涉及工程化启动子的用途，并且更具体地涉及工程化杂合核糖体启动子的用途，用于在宿主微生物中表达和产生一种或多种目的蛋白质。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月04日提交的美国临时申请号62/304,061的权益，该临时申请通过引用以其全文特此结合。
序列表的引用
命名为“NB40928WOPCT-SequenceListing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2017年3月06日，并且大小为72KB，将其通过引用以其全文特此结合。
背景技术
基因工程促进了用作工业生物反应器或细胞工厂的宿主微生物的各种改进。例如，革兰氏阳性芽孢杆菌属(Bacillus)物种产生并分泌大量有用的蛋白质和代谢物。工业中使用的最常见芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。由于其通常认为安全(GRAS)的状态，这些芽孢杆菌属物种的菌株是用于产生用于食品和制药工业中的蛋白质的天然候选物。例如，重要的生产酶包括α-淀粉酶、中性蛋白酶、碱性(或丝氨酸)蛋白酶等。然而，尽管在芽孢杆菌属宿主细胞中生产蛋白质的知识有所进步，仍然需要通过微生物改善这些蛋白质的表达和产生的方法及其组合物。
由目的基因(或ORF)编码的目的蛋白质(POI)的重组产生通常通过构建适用于所需宿主细胞的表达载体来完成，其中编码所需POI的核酸置于启动子的表达控制之下。因此，通过各种技术(例如，经由转化)将表达载体引入宿主细胞，并通过在适于表达和产生蛋白质产物的条件下培养经转化的宿主细胞来实现所需蛋白质产物的产生。例如，本领域已经描述了用于功能性多肽的同源和/或异源表达的芽孢杆菌属启动子(及其相关元件)(例如，参见PCT国际公开号WO 2013086219；美国专利号4,559,300；Kim等人，2008，等)。
尽管已知许多启动子，但本领域仍需要新颖启动子，其改善编码目的蛋白质的同源和/或异源核酸的表达。例如，在工业生物技术领域中，甚至工业相关蛋白质(例如，酶、抗体、受体等)的表达水平的小幅增加也转化为所产生的POI的显著成本、能量和时间节省。本发明的新颖且令人惊讶的有效工程化杂合启动子解决了本领域长期感觉到的需求。
发明内容
在某些实施例中，本发明涉及工程化启动子，并且更特别地工程化杂合核糖体启动子的用途，用于在宿主微生物中表达和产生一种或多种目的蛋白质。
在具体的实施例中，本发明涉及分离的核酸，该分离的核酸包含与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接的工程化杂合启动子，其中该杂合启动子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列。在其他实施例中，本发明的核酸包含保留启动子活性的SEQ ID NO:65-80和90-97的子序列。在其他实施例中，本发明的核酸序列是与SEQ ID NO:65-80和90-97中的任一个至少60％同源的核酸，或是在中严格条件下与SEQ ID NO:65-80和90-97(或其保留启动子活性的子序列)中任一个杂交的核酸。
在某些实施例中，该杂合启动子包含SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:71的核苷酸序列。在某些其他实施例中，由该分离的核酸编码的目的蛋白质(POI)是酶。在具体的实施例中，该酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、甘露聚糖酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。
在某些其他实施例中，本发明涉及分离的核酸，该分离的核酸包含与编码目的蛋白质的核酸有效地连接的工程化完整启动子，该分离的核酸包含选自以下的式：
(I)5′-UP-第1 Pro-ORF-3′；
(II)5′-UP-第1 Pro-UTR-ORF-3′；
(III)5′-UP-第1 Pro-第2 Pro-ORF-3′；
(IV)5′-UP-第1 Pro-第2 Pro-UTR-ORF-3′；
(V)5′-UP-第1 Pro-UTR-第2 Pro-UTR-ORF-3′；
(VI)5′-UP-第1 Pro-第2 Pro-第3 Pro-ORF-3′；
(VII)5′-UP-第1 Pro-第2 Pro-第3 Pro-UTR-ORF-3′；以及
(VIII)5′-UP-第1 Pro-第2 Pro-UTR-第3 Pro-UTR-ORF-3′，
其中UP是包含启动子上游元件的核酸，第1Pro、第2Pro和第3Pro是与至少包含-35/-10核心启动子序列相同或不同的核酸，UTR是包含非翻译区的核酸，并且ORF是编码目的蛋白质的核酸可读框，其中该UP元件包含SEQ ID NO:45-61中的任一个、保留启动子活性的SEQ ID NO:45-61的子序列、与保留启动子活性的SEQ ID NO:45-61中的任一个至少60％同源的核酸、或在中严格条件下与SEQ ID NO:45-61中的任一个或其保留启动子活性的子序列杂交的核酸，并且其中第1Pro、第2Pro和第3Pro包含SEQ ID NO:1-39和101-154中的任一个、保留启动子活性的SEQ ID NO:1-39和101-154的子序列、与保留启动子活性的SEQ IDNO:1-39和101-154中的任一个至少60％同源的核酸、或在中严格条件下与SEQ ID NO:1-39和101-154中的任一个或其保留启动子活性的子序列杂交的核酸。
在具体的实施例中，该UTR包含SEQ ID NO:155的核苷酸序列。在某些其他实施例中，该UP元件包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的核苷酸序列。
在其他实施例中，第1Pro包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的核苷酸序列。
在某些其他实施例中，第2Pro包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的核苷酸序列。
在又其他实施例中，第3Pro包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的核苷酸序列。
在具体的实施例中，由ORF编码的POI是酶。在某些其他实施例中，该酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、甘露聚糖酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶。
在另一个实施例中，本发明涉及包含本公开的核酸的表达载体。在其他实施例中，本发明涉及包含表达载体的细菌宿主细胞，该表达载体包含本公开的核酸。
在某些实施例中，本公开的细菌宿主细胞是芽孢杆菌属的成员。在具体的实施例中，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)以及嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。在另一个实施例中，该芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
在某些其他实施例中，本发明涉及包含至少一个本公开的核酸的拷贝的芽孢杆菌属宿主细胞，其中该核酸的至少一个拷贝包含在整合载体内。在某些实施例中，该核酸的至少一个拷贝整合到宿主细胞的染色体或基因组中。
在某些其他实施例中，包含本公开的核酸的整合载体在5′和3′端的侧翼为与宿主细胞的染色体基因座同源的核酸序列。在一个具体的实施例中，该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞，并且5′和3′核酸序列与包含SEQ ID NO:87的核酸的枯草芽孢杆菌aprE染色体基因座yhfO和包含SEQ ID NO:88的核酸的枯草芽孢杆菌aprE染色体基因座yhfN同源。因此，在具体的实施例中，将包含至少一个本公开的核酸的拷贝的芽孢杆菌属宿主细胞整合到芽孢杆菌属宿主细胞的染色体或附加体中。
在其他实施例中，由本公开的宿主细胞产生的目的蛋白质分离自该宿主细胞。在另一个实施例中，该分离的POI是纯化的。
在具体的实施例中，本公开的POI是酶。在某些实施例中，该酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、支链淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、甘露聚糖酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶。
在其他实施例中，本发明涉及一种用于筛选转化的(经修饰的)宿主细胞以增加POI表达的方法，该方法包括：(i)用包含异源工程化杂合启动子的分离的核酸转化宿主细胞，该杂合启动子与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接，其中该杂合启动子包含SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列，(ii)用包含其天然(野生型)启动子的分离的核酸转化宿主细胞，该天然(野生型)启动子与编码和步骤(i)相同的POI的核酸有效地连接，其中在步骤(i)和(ii)中被转化的宿主细胞是属于相同属种且具有相同遗传背景的宿主细胞，以及(iii)在表达POI的条件下培养经修饰的细胞，其中相对于步骤(ii)中相同POI编码序列的表达，步骤(i)中POI编码序列的表达的增加表明POI的表达增加。
在某些其他实施例中，本发明涉及一种用于筛选转化的(经修饰的)宿主细胞以增加POI表达的方法，该方法包括：(i)用本公开的分离的核酸转化第1个宿主细胞，(ii)用包含其天然(野生型)启动子的分离的核酸转化第2个宿主细胞，该天然(野生型)启动子与编码和步骤(i)相同的POI的核酸有效地连接，其中在步骤(i)和(ii)中被转化的宿主细胞是属于相同属种且具有相同遗传背景的宿主细胞，以及(iii)在表达POI的条件下培养经修饰的细胞，其中相对于步骤(ii)中相同POI编码序列的表达，步骤(i)中POI编码序列的表达的增加表明POI的表达增加。
在另一个实施例中，本发明涉及一种增加POI在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括：(i)通过将包含与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接的工程化杂合启动子的核酸引入宿主细胞来修饰宿主细胞，其中该杂合启动子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列，以及(ii)在表达POI的条件下培养经修饰的细胞。
在某些其他实施例中，本发明涉及一种增加POI在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括：(i)通过将本公开的核酸引入宿主细胞来修饰宿主细胞，和(ii)在表达POI的条件下培养经修饰的宿主细胞。
在这些方法的具体实施例中，该宿主细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及嗜热脂肪土芽孢杆菌。
附图说明
图1显示了本公开的同源启动子(图1；启动子类型1)、单(工程化)杂合启动子(图1；启动子类型2)和双(工程化)杂合启动子(图1；启动子类型3)的示意图。如图1中所描绘的，启动子类型1包含称为“Px”的启动子区和称为“(启动子)Px的UP元件”的上游(UP)元件，其中启动子Px和(启动子)Px的UP元件衍生自相同的(同源的)天然启动子。相反，如图1中所描绘的，启动子类型2(单杂合体)包含称为“Py”的启动子区和称为“(启动子)Px的UP元件”的上游(UP)元件，其中启动子Py和(启动子)Px的UP元件不是衍生自相同的(同源的)天然启动子，并且因此，启动子类型2是衍生自不同(非同源的)启动子的UP元件和启动子的杂合体(组合)。类似地，如图1中所描绘的，启动子类型3(双杂合体)包含称为“Py”和“Pz”的两个启动子区和称为“(启动子)Px的UP元件”的上游(UP)元件，其中这两个(双)启动子Py和Pz可以包含(i)相同的核苷酸序列(即，两个相同的启动子核酸序列；即，Py＝Pz)或(ii)两种不同的核苷酸序列(即，两个启动子衍生自包含不同核酸序列的不同启动子来源，即Py≠Pz)，其中启动子Py和Pz不是衍生自与(启动子)Px的UP元件相同的(同源的)天然启动子。
图2显示了表达蛋白酶BPN′(Y217L)的枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度，其的表达由以下天然(野生型)和工程化(杂合)启动子驱动：PaprE(SEQ ID NO:28)、PssrA(SEQ ID NO:25)、Pscr(SEQ ID NO:26)、PspoVG(SEQ ID NO:28)、PrrnI-2(SEQ ID NO:15)、杂合启动子1(SEQ ID NO:65)和杂合启动子7(SEQ ID NO:71)。
图3显示了在以下天然(野生型)和工程化(杂合)启动子的控制下表达枯草杆菌蛋白酶BPN′(Y217L)的枯草芽孢杆菌培养物的蛋白酶活性谱：PaprE(SEQ ID NO:28)、PssrA(SEQ ID NO:25)、Pscr(SEQ ID NO:26)、PspoVG(SEQ ID NO:28)、PrrnI-2(SEQ ID NO:15)、杂合启动子1(SEQ ID NO:65)和杂合启动子7(SEQ ID NO:71)。
图4显示了使用以下天然(野生型)和工程化(杂合)启动子在地衣芽孢杆菌中表达的噬细胞菌属物种变体淀粉酶的相对表达：PrrnI-2(野生型；SEQ ID NO:15)；变体2(杂合启动子1；SEQ ID NO:65)；变体3(杂合启动子23；SEQ ID NO:96)；变体4(杂合启动子24；SEQID NO:97)；变体6(杂合启动子20；SEQ ID NO:93)；变体10(杂合启动子22；SEQ ID NO:95)；变体11(杂合启动子19；SEQ ID NO:92)；变体12(杂合启动子18；SEQ ID NO:91)和变体13(杂合启动子17；SEQ ID NO:90)。
图5显示了相对于地衣芽孢杆菌淀粉酶L的内源性PamyL启动子，使用各种天然核糖体启动子在地衣芽孢杆菌中产生三种细菌淀粉酶(即，Amy1、Amy3和Amy4)。如图5中所描绘的，Amy1是天然地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:43)；Amy3是嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶变体(SEQ ID NO:64)，并且Amy4是噬细胞菌属物种α-淀粉酶变体(SEQ ID NO:63)。
图6显示了各种枯草芽孢杆菌核糖体RNA(rrn)启动子的多序列比对，这展示了序列标识标语和源自rrn启动子比对的“共有”序列。
图7显示了各种地衣芽孢杆菌核糖体RNA(rrn)启动子的多序列比对，这展示了上游元件的序列标识和启动子序列以及源自rrn启动子比对的“共有”序列。
具体实施方式
本发明提供了用于在微生物宿主细胞中表达和产生一种或多种目的蛋白质的新颖组合物(及其方法)。在某些实施例中，这些组合物(及其方法)包含并涉及工程化(经修饰的)启动子。在具体的实施例中，本发明的工程化(经修饰的)启动子衍生自一种或多种芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子前体和/或一种或多种芽孢杆菌属物种核糖体蛋白启动子前体，在本文中共同地称为芽孢杆菌属物种“核糖体启动子”。在某些实施例中，本公开的工程化核糖体启动子可以进一步包含衍生自芽孢杆菌属物种启动子的启动子核酸序列片段，所述芽孢杆菌属物种启动子不是核糖体RNA启动子或核糖体蛋白启动子。
在某些实施例中，本公开的工程化核糖体启动子包括但不限于工程化(杂合)核糖体RNA启动子、工程化(杂合)核糖体蛋白启动子及其工程化(杂合)组合。在另外的实施例中，公开了新产品微生物宿主细胞和使用一种或多种工程化(杂合)核糖体启动子产生一种或多种目的蛋白质的方法。
A.定义
除非在此另外定义，否则在此所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义(参见，例如，Singleton等人，1994；Hale和Marham，1991)。虽然相似或等效于在此描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但描述优选的方法和材料。
在此提到的所有专利、公开的专利申请和科学参考文献，包括在此类专利和出版物中披露的所有序列，都通过引用清楚地结合在此。
数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则核酸从左向右以5'至3'方向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基到羧基方向书写。
本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施例的限制。因此，把说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。
如本文所使用的，术语“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分，以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA和RNA，无论是代表有义链还是反义链。应该理解，由于遗传密码的简并性，许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。
如本文所使用的，“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可互换地使用，并且包括提及氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。所述术语也适用于含有使得多肽保持功能的保守氨基酸取代的聚合物。
如本文所使用的，短语“目的基因”可以缩写为“GOI”，其中这两个术语是可互换的。如本文所使用的，短语“目的蛋白质”可以缩写为“POI”，其中这两个术语是可互换的。如本文所使用的，短语“可读框”可以缩写为“ORF”，其中这两个术语是可互换的。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指具有作为如本文所述的进入序列(即引入细胞的序列)的宿主或表达载体的能力的细胞。在某些实施例中，该宿主细胞是微生物。在某些实施例中，该微生物(宿主细胞)是为芽孢杆菌科成员的革兰氏阳性细菌细胞。在某些其他实施例中，该微生物(宿主细胞)是为芽孢杆菌属成员的革兰氏阳性细菌细胞。在具体的实施例中，该芽孢杆菌属宿主细胞选自：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌。
如本文所使用的，术语“DNA构建体”或“表达构建体”是指核酸序列，其包含至少两种DNA(多核苷酸)片段。DNA或表达构建体可用于将核酸序列引入宿主细胞中。DNA可以在体外(例如，通过PCR)或通过任何其他合适的技术产生。在某些实施例中，DNA构建体包含编码目的蛋白质的目标核酸序列(例如，GOI或ORF)。在具体的实施例中，包含GOI或ORF的DNA构建体与本公开的工程化启动子有效地连接。在一些实施例中，该DNA构建体进一步包含至少一种可选择标记。在另外的实施例中，该DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施例中，该DNA构建体包含非同源序列。
如本文所使用的，术语“编码目的蛋白质的核酸”或“目的编码序列”可互换使用，并且是指当被翻译成蛋白质时编码目的蛋白质的核酸序列。在一些实施例中，编码区以cDNA形式或ORF存在，而在其他实施例中，其以基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链(即有义链)或双链的。在一些实施例中，如果需要允许适当地启动原始RNA转录物的转录和/或正确的加工，则可以紧邻基因的编码区放置合适的控制元件(例如增强子、启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等)。可替代地，在一些实施例中，在本发明的表达载体中使用的编码区包含内源性增强子、剪接点、间插序列、多腺苷酸化信号、或内源性和外源性的两种控制元件的组合。
如本文所定义的，“内源基因”是指位于生物体基因组的其天然位置中的基因。
如本文所定义的，“异源”基因、“非内源”基因、“外源”基因或“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移而引入宿主生物体中的基因(或可读框(ORF))。外来(异源)基因包含插入非天然生物体中的天然基因(或ORF)和/或插入天然或非天然生物体中的嵌合基因。因此，如本文所使用的，术语“异源的”通常是指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或多肽(即，对宿主细胞是外源的)，或是指衍生自与宿主细胞相同的遗传来源或物种但是处于对异源序列不是天然的位置上的多核苷酸或多肽。在一些实施例中，异源序列是非宿主细胞序列，而在其他实施例中，异源序列是经修饰的序列，来自不同宿主细胞菌株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的同源序列。
如本文所使用的，术语“启动子”、“启动子元件”、“启动子序列”和“启动子区”是指当启动子被置于寡核苷酸/多核苷酸(编码)序列的5′末端(即，在其之前)时，能够控制寡核苷酸/多核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。因此，启动子典型地位于寡核苷酸序列(其转录成该启动子控制的mRNA)的5′(即，上游)，并提供RNA聚合酶特异性结合的位点和转录起始位点。
术语“有效地连接”是指并置，其中元件处于使得它们在功能上相关的布置中。例如，如果启动子控制序列的转录，则启动子有效地连接到目的编码序列。
如本文所定义的，短语“启动子”、“启动子元件”、“启动子区”和/或“启动子序列”是指启动转录所需的启动子核酸序列的最小部分(即，包含RNA聚合酶结合位点)。例如，本公开的启动子包含-10(共有序列)元件和-35(共有序列)元件，这两个元件位于上游(5′)并且与待转录的基因或ORF的+1转录起始位点是相对的。核心启动子-10和-35元件在本领域中通常被分别称为“TATAAT”(Pribnow盒)共有区和“TTGACA”共有区。核心启动子-10和-35序列区域的间隔通常被15-20个间插碱基对(核苷酸)分开(或间隔)。
如本文进一步定义的，本公开的“启动子”序列可另外包含位于5′(即，上游)并且与天然发现的启动子天然地缔合(例如，天然缔合的UP元件序列，其位于启动子序列的5′)的核苷酸。例如，下表3-10中列出的某些启动子包含(除了-10/-35最小启动子区之外)天然相关的UP元件序列。因此，如本文所定义的，本公开的“启动子”可包含UP元件序列的一个或多个核苷酸，该UP元件序列位于天然发现的启动子序列的5′。
如本文所使用的，“上游元件”、“启动子上游元件”、“UP元件”和“UP序列”可互换使用，并且是指位于-35核心启动子区的上游(5′)的富含“A+T”的核酸序列区域。UP元件可以进一步定义为位于-35核心启动子元件的上游(5′)的核酸序列区域，其直接与RNA聚合酶的α-亚基的C-末端结构域相互作用。下面表2中列出的是UP元件序列，其与一种或多种异源启动子序列(表3-10中列出)组合以形成本发明的一种或多种工程化杂合“完整”启动子。
如本文所使用的，“核糖体启动子”包括例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白启动子。
如本文所使用的，“完整启动子”或“杂合启动子”是指至少包含“UP元件”和“启动子”的工程化启动子，其中UP元件位于启动子的上游(5′)并且其中启动子位于UP元件的下游(3′)和+1转录起始位点的上游(5′)。本公开的杂合(完整)启动子通常衍生自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌核糖体启动子序列，其中该杂合(完整)启动子的UP元件序列和启动子序列有效地连接。例如，在某些实施例中，通过将表2中列出的UP元件序列与表3-10中列出的一种或多种异源启动子元件组合来工程化本公开的杂合(完整)启动子。在某些其他实施例中，这些一种或多种异源启动子元件(序列)包括天然相关的UP元件序列的一个或多个核苷酸，该UP元件序列位于最小启动子(-10/-35)元件的上游(5′)。例如，在某些实施例中，通过将表2中列出的UP元件序列与表3-10中列出的一种或多种异源启动子元件(其中所述一种或多种异源启动子元件任选地包含天然相关的且有效地连接的UP元件序列的一个或多个核苷酸)组合来工程化本公开的杂合(完整)启动子。
如本文进一步定义的，“杂合(完整)启动子”是工程化启动子(即，包含UP元件序列和启动子元件序列两者)，其中该杂合启动子的UP元件和启动子元件构建自或衍生自与在自然界中未发现彼此有效地连接或缔合的核酸序列不同的核酸序列。举例来说，非杂合“完整启动子”衍生自或构建自天然(野生型)芽孢杆菌属核糖体启动子(例如，P1-rrnI(启动子元件))和天然(野生型)UP元件(例如，UP-rrnI元件)，其中该启动子元件(P1-rrnI)和UP元件(UP-rrnI)如在自然界中所发现地有效地连接(即，该启动子元件和UP元件以从基因组DNA来源分离或鉴定的形式有效地连接)。
相反，未发现本公开的工程化“杂合(完整)启动子”与如在自然界中所发现地彼此有效地连接或缔合(即，启动子元件和UP元件不以从基因组DNA来源分离或鉴定的形式有效地连接或缔合)。因此，举例来说，本公开的工程化“杂合(完整)启动子”衍生自或构建自天然(野生型)芽孢杆菌属核糖体启动子(例如，P1-rrnI(启动子元件))和天然(野生型)UP元件(例如，UP-rrnO元件)，其中该启动子元件(P1-rrnI)和UP元件(UP-rrnO)不如在自然界中所发现地有效地连接(即，该启动子元件和UP元件不以从基因组DNA来源分离或鉴定的形式有效地连接)。如本文所使用的，当提及核酸序列时，术语“启动子活性”是指核酸序列启动寡核苷酸序列转录成mRNA的能力。
术语“载体”在本文中定义为被设计用于携带待引入一种或多种细胞类型中的核酸序列的多核苷酸。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体或病毒颗粒、DNA构建体、盒等。典型的表达载体(其也包括质粒)包括调节序列，如启动子、信号序列、目的基因和转录终止子。
如本文所定义的术语“分离的”是指与通常与其天然来源相关联的至少一种其他化合物、蛋白质、细胞、核酸序列、氨基酸或其他生物物质分离的化合物、蛋白质、细胞、核酸序列或氨基酸。
如本文所使用的，术语“编码区”在本文中定义为转录成mRNA的核酸序列，当被放置于包含启动子的适当的控制序列的控制之下时该mRNA被翻译成多肽。编码序列可包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和重组DNA。
如本文所使用的，5′非翻译区(下文中，“5′UTR”)是指位于mRNA链上的编码序列的5′(即，在其之前)的核酸序列。如本文所使用的，3′非翻译区(下文中，“3′UTR”)是指位于mRNA链上的编码序列的3′(即，在其以下)的核酸序列。因此，转录的mRNA的非翻译区(UTR)是非蛋白质编码核酸序列。
如本文所使用的，术语“野生型”基因、基因产物或细胞是指具有当在天然存在的来源中发现时该基因、基因产物或细胞的特征的基因、基因产物或细胞。野生型基因、基因产物或细胞是在群体中最经常观察到的基因、基因产物或细胞，并且因此被称为“天然”或“野生型”形式。如本文所使用的，术语“野生型序列”和“野生型基因”可互换使用，并且是指宿主细胞中天然的或天然存在的序列。
相反，术语“经修饰的”、“突变体”或“变体”基因、基因产物或细胞是指当与野生型形式相比时显示序列和/或功能性质的修饰(即，改变的特征)的基因、基因产物或细胞。序列修饰可以通过例如取代、插入、缺失或产生改变的序列或特征的任何其他修饰而发生。应注意，天然发生的突变体可以是分离的；这些突变体通过当与野生型基因或基因产物比较时它们具有改变的特征这一事实得到鉴定。
如本文所使用的，术语“经修饰的序列”和“经修饰的基因”可互换使用，并且是指天然存在的核酸序列的取代、插入、缺失、中断或任何其他修饰。在一些实施例中，经修饰的序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果该修饰是序列的缺失或中断)。在一些实施例中，截短的蛋白质保留了生物学活性。在其他实施例中，经修饰的序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，如果该修饰是进入到核酸序列中的插入)。在其他实施例中，插入导致产生截短的蛋白质作为表达产物(例如，如果该插入导致终止密码子的形成)。
如本文所使用的，“输入序列”意指引入宿主细胞染色体或基因组中的DNA序列。该序列可以编码一个或多个目的蛋白质。该输入序列可包含与编码目的蛋白质的序列有效地连接的启动子。在一些实施例中，输入序列包含已经存在于待转化细胞的基因组中的序列，而在其他实施例中，其尚未存在于待转化细胞的基因组中(即，在一些实施例中，它是同源的，而在其他实施例中，它是异源序列)。
在一些实施例中，输入序列编码至少一种同源或异源蛋白质，包括但不限于激素、酶、生长因子或细胞因子。在某些实施例中，该输入序列编码至少一种酶，该酶包括但不限于：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
在一些实施例中，该输入序列编码功能性野生型基因或操纵子、功能性突变基因或操纵子、或非功能基因或操纵子。
如本文所使用的，术语“报告基因”是指能够在细胞中表达的核苷酸序列，并且其中该报告基因的表达赋予含有该表达的基因的细胞易于被检测和测量的能力。
如本文所使用的，术语“侧翼序列”是指位于正在讨论的序列的上游或下游的任何序列(例如，针对序列A B C，序列B侧翼有A和C序列)。在一些实施例中，该输入序列每侧均侧接同源盒。
如本文所使用的，术语“同源盒”是指与另一核酸序列同源的序列。例如，同源盒可以与基因组DNA中的核酸序列同源。在这种情况下，同源盒可用于指导新构建体整合到基因组DNA中的何处。
如本文所使用的，术语“同源重组”是指在相同核苷酸序列的位点处两个DNA分子或成对染色体之间(即，在交叉过程中)的DNA片段的交换。在一个实施例中，染色体整合是经由同源重组完成的。
如本文所使用的术语“转染”和“转化”均指将DNA引入细胞的方法。
如本文所使用的，术语“互补”或“互补性”用于提及因碱基配对原则而相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(它们是指核苷酸的序列的可互换的术语)。例如，序列“5'-CAGT-3'”与序列“5'-ACTG-3'”互补。互补性可以是“部分的”或“完全的”。“部分的”互补性是指根据碱基配对原则，一个或多个核酸碱基不匹配的情况。核酸之间的“完全的(total/complete)”互补性是指在碱基配对原则下每一个核酸碱基都与另一碱基匹配。
如本文所使用的，术语“染色体整合”是指将输入序列引入宿主细胞的染色体(即，基因组)的过程。
如本文所使用的，术语“可选择标记”是指使用任何“标记”(即，指示物)，其指示目的蛋白质或基因的存在或不存在。在一些实施例中，该术语涵盖编码酶活性的基因，所述酶活性赋予在缺乏本来必需的物质的培养基中生长的能力。在其他实施例中，可选择标记赋予表达可选择标记的细胞对抗生素或药物的抗性。
如本文所使用的，术语“信号序列”或“信号肽”是指在蛋白质的N-末端部分的序列，其促进成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。
“扩增”在本文中通常定义为核酸序列的额外拷贝的产生。核酸的扩增可以通过例如聚合酶链式反应或本领域熟知的其他技术进行。如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中的方法，所有这些专利通过引用特此结合，它们描述了用于在不进行克隆或纯化的情况下增加DNA样品(例如，基因组DNA)中靶序列的区段浓度的方法。
在某些其他实施例中，在体内扩增本公开的核酸(多核苷酸)序列。在具体的实施例中，在体内扩增包含(i)编码目的蛋白质的基因(或ORF)和(ii)抗生素抗性标记的核酸(多核苷酸)序列。
使用PCR，可以将基因组DNA中特异性靶序列的单拷贝扩增至通过若干种不同方法可检测的水平(例如，与标记的探针杂交；掺入生物素化引物，再经抗生物素蛋白-酶缀合物检测；或将32P标记的脱氧核苷酸三磷酸(如dCTP或dATP)掺入扩增区段)。除了基因组DNA之外，可用合适的引物分子组来扩增任何寡核苷酸序列。具体地讲，经PCR方法本身所产生的扩增区段自身就是用于随后的PCR扩增的有效模板。
如本文所使用的，术语“引物”是指当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下能作为合成起始点的寡核苷酸，无论是纯化的限制性消化物中天然存在的还是经合成而产生的。引物优选是单链，用于最大效率的扩增，但是可替代地可以是双链。
如本文所使用的，术语“探针”是指能与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸，无论是纯化的限制性消化物中天然存在的还是经合成而产生的。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期的是，本发明所用的任何探针都将用任何“报道分子”标记，使得其在任何检测系统中都可检测，所述检测系统包括但不限于酶(例如ELISA、以及基于酶的组织化学测定)系统、荧光系统、放射性系统、和发光系统。本发明并不旨在限于任何具体的检测系统或标记。
如本文所使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”是指细菌酶，每种这样的酶在特定核苷酸序列上或附近切割双链或单链DNA。
如本文所使用的，短语“AmyL淀粉酶”可与“LAT淀粉酶”互换使用。
B.核糖体启动子
核糖体RNA(rRNA)合成是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中核糖体合成的限速步骤。先前已经研究了来自核糖体RNA启动子的核糖体RNA转录的调节(Samarrai等人，2011；Natori等人，2009；Turnbough，2008；Krasny等人，2008；Krasny和Gourse，2004)。核糖体RNA启动子受营养条件的严格调节，因此当翻译要求较低时，核糖体RNA和核糖体不会过量产生。
在大肠杆菌中，有七个rRNA(rrn)操纵子，每个操纵子包含两个称为P1和P2的启动子。大肠杆菌rrn P1启动子中的核心-10/-35启动子区的前面是启动子上游(UP)元件，所述启动子上游元件通过结合RNA聚合酶使启动子活性增加高至20-50倍。枯草芽孢杆菌含有10个rRNA(rrn)操纵子(Krasny和Gourse，2004)，所述操纵子前面也是增加启动子活性的启动子上游(UP)元件。
先前已在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中研究了编码核糖体蛋白的基因的调节(Grundy和Henkin，1991)。在许多情况下，已经发现核糖体蛋白质充当自体阻遏物，控制其中它们被进行编码的操纵子的表达。
已经研究了核糖体RNA启动子对天然核糖体RNA的产生的调节，并且最近，已经描述了当使用核糖体RNA(rRNA)启动子时编码目的异源蛋白质的核酸序列的表达水平(参见，PCT公开号WO 2013/086219)。
如本文所述，本发明证明，包含芽孢杆菌属物种启动子元件和UP元件的杂合组合的新颖工程化核糖体启动子在产生目的异源蛋白质(当在宿主微生物中表达时)方面出乎意料地有效。例如，如实例2中所述，在枯草芽孢杆菌宿主细胞中测试了来自天然(异源)启动子(例如，PaprE、PssrA、Pscr、PspoVG)、天然(异源)核糖体启动子(例如，PrrnI-2)和工程化(异源)核糖体启动子(例如，杂合启动子1和杂合启动子7)的枯草杆菌蛋白酶BPN′(Y217L)的表达。结果(参见图3)表明，PssrA启动子、Pscr启动子、PrrnI-2启动子、杂合启动子1和杂合启动子7提供比PaprE启动子和PspoVG启动子更高的蛋白质(BPN′)生产率。具体而言，如图3所示，杂合启动子1(SEQ ID NO:65)和杂合启动子7(SEQ ID NO:71)清楚地表明在测试条件下最高水平的枯草杆菌蛋白酶BPN′生产。
类似地，如实例3中所述，在地衣芽孢杆菌宿主细胞中测试了来自天然(异源)启动子PrrnI-2(SEQ ID NO:15)及其工程化(异源)变体PrrnI-2启动子(即，变体2(杂合启动子1)；变体3(杂合启动子23)；变体4(杂合启动子24)；变体6(杂合启动子20)；变体10(杂合启动子22)；变体11(杂合启动子19)；变体12(杂合启动子18)和变体13(杂合启动子17))的噬细胞菌属物种淀粉酶变体(SEQ ID NO:63)的表达。具体而言，如图4所示，来自工程化(变体)PrnI-2启动子(即，图4；变体2、变体3、变体10、变体11、变体12和变体13)的淀粉酶表达/产率与天然(异源)PrrnI-2启动子相比导致淀粉酶蛋白的产生增加。
此外，如实例4中所述，针对在地衣芽孢杆菌宿主中3种不同的细菌淀粉酶的表达来评估来自枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的一系列天然(野生型)启动子。评估了以下用于驱动淀粉酶蛋白表达的启动子：amyL地衣芽孢杆菌天然淀粉酶基因的PamyL启动子(SEQ IDNO:116)；枯草芽孢杆菌核糖体RNA rrnI的PrrnI-2启动子(SEQ ID NO:15)；地衣芽孢杆菌Prrn1启动子(SEQ ID NO:101)；地衣芽孢杆菌Prrn2启动子(SEQ ID NO:102)；地衣芽孢杆菌Prrn4启动子(SEQ ID NO:103)；地衣芽孢杆菌Prrn5启动子(SEQ ID NO:104)和地衣芽孢杆菌Prrn6启动子(SEQ ID NO:105)。
SEQ ID NO:15、101、102、103、104和105中所示的天然(野生型)核糖体启动子核酸序列各自包含天然(-35/-10)核糖体启动子和如在自然界中所发现地有效连接的或分离的天然启动子上游(UP)元件核酸序列。编码3种细菌淀粉酶(即，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶L(SEQID NO:43；Amy1)、嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶变体(SEQ ID NO:64；Amy3)和噬细胞菌属物种淀粉酶变体(SEQ ID NO:63；Amy4))的多核苷酸的表达/产率与上面提到的启动子(即，SEQ ID NO:15和101-105的启动子)有效地连接(3′)。如图5所示，由各种天然(野生型)启动子(即，PamyL、PrrnI-2、Prrn1、Prrn2、Prrn4、Prrn5和Prrn6)驱动的3种细菌淀粉酶(即，Amy1、Amy 3和Amy 4)的相对表达表明，在大多数情况下，使用这些异源核糖体启动子代替内源性天然地衣芽孢杆菌淀粉酶启动子(PamyL)提供了增加的蛋白质表达/生产率。
因此，在某些实施例中，本公开涉及用于表达编码目的蛋白质(POI)的核酸序列(或ORF)的工程化(经修饰的)异源启动子。在某些实施例中，工程化启动子至少包含与启动子核酸序列有效地连接的启动子上游(UP)元件核酸序列，其中有效连接的UP元件和启动子元件的组合在本文中称为异源“完整启动子”或异源杂合“完整启动子”。更具体地，如以上A部分所定义的，异源杂合“完整启动子”是工程化启动子(即，包含UP元件序列和启动子元件序列)，其中该异源杂合“完整启动子”的UP元件和启动子元件构建自或衍生自在自然界中未发现彼此有效地连接或缔合的不同核酸序列(例如，基因组/染色体DNA)。
因此，在某些实施例中，本公开的异源杂合完整启动子包含下表1中列出的核酸序列，如SEQ ID NO:65-97。
表1
异源杂合(完整)启动子
在某些其他实施例中，本公开涉及用于表达编码目的蛋白质(POI)的核酸序列(或ORF)的工程化(经修饰的)异源杂合完整启动子，其中通过将包含表2中列出的核酸序列的启动子UP元件与以下各项组合并有效地连接来构建或衍生该异源杂合完整启动子：(1)包含表3中列出的核酸序列的枯草芽孢杆菌核糖体RNA启动子元件，(2)包含表4中列出的核酸序列的枯草芽孢杆菌核糖体蛋白启动子，(3)包含表5中列出的核酸序列的枯草芽孢杆菌转移信使RNA(tmRNA)启动子，(4)包含表6中列出的核酸序列的枯草芽孢杆菌小细胞质RNA(scRNA)启动子，(5)包含表7中列出的核酸序列的枯草芽孢杆菌蛋白启动子，(6)包含表8中列出的核酸序列的地衣芽孢杆菌核糖体RNA启动子元件，(7)表9中列出的枯草芽孢杆菌Prrn核糖体RNA启动子共有序列，和/或(8)表10中列出的地衣芽孢杆菌Prrn核糖体RNA启动子共有序列。
表2
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌启动子UP元件
**SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。SEQ ID NO:59是衍生自前三个短枯草芽孢杆菌σH-依赖性启动子序列的共有核酸序列，并且SEQ ID NO:60是衍生自前三个长枯草芽孢杆菌σH-依赖性启动子的共有核酸序列。
表3
枯草芽孢杆菌核糖体RNA启动子
**SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:128-140是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。
表4
枯草芽孢杆菌核糖体蛋白启动子
表5
枯草芽孢杆菌转移信使RNA(tmRNA)启动子
表6
枯草芽孢杆菌小细胞质RNA(scRNA)启动子
表7
枯草芽孢杆菌蛋白启动子
**SEQ ID NO:33-39是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。
表8
地衣芽孢杆菌核糖体RNA启动子
**SEQ ID NO:118-127是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。
表9
枯草芽孢杆菌Prrn核糖体RNA启动子共有序列
**SEQ ID NO:153是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。
表10
地衣芽孢杆菌Prrn核糖体RNA启动子共有序列
**SEQ ID NO:154是共有序列，并使用如下定义的IUPAC代码表示：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T以及V＝A/C/G。
因此，在某些实施例中，本公开提供了用于表达编码目的蛋白质(POI)的核酸序列的工程化异源杂合完整启动子，其中该杂合启动子包含与至少一个启动子元件(表3-10)有效地连接的至少一个UP元件(表2)。例如，在某些实施例中，工程化异源杂合完整启动子包含以下通式：5′-UP-第1Pro-ORF-3′；
其中UP是包含启动子上游元件的核酸，第1Pro是至少包含至少-35/-10核心启动子序列的核酸，并且ORF是编码POI的核酸序列。
在其他实施例中，本公开涉及用于表达编码目的蛋白质(POI)的核酸序列(或ORF)的工程化异源杂合完整启动子，其中该杂合启动子包含与至少两个启动子元件(表3-10)有效地连接的至少一个UP元件(表2)。例如，在某些实施例中，工程化异源杂合完整启动子包含以下通式：5′-UP-第1Pro-第2Pro-ORF-3′；
其中UP是包含启动子上游元件的核酸，第1Pro和第2Pro是与至少包含-35/-10核心启动子序列相同的或不同的核酸，并且ORF是编码POI的核酸。
在其他实施例中，本公开涉及用于表达编码目的蛋白质(POI)的核酸序列(或ORF)的工程化异源杂合完整启动子，其中该杂合启动子包含与至少一个或两个启动子元件(表3-10)有效地连接的至少一个UP元件(表2)。例如，在某些实施例中，工程化异源杂合完整启动子包含以下通式：
5′-UP-第1Pro-UTR-ORF-3′；
5′-UP-第1Pro-第2Pro-UTR-ORF-3′；
5′-UP-第1Pro-UTR-第2Pro-UTR-ORF-3′；
其中UP是包含启动子上游元件的核酸，第1Pro和第2Pro是与至少包含-35/-10核心启动子序列相同的或不同的核酸，UTR是包含5′非翻译区的核酸，并且ORF是编码POI的核酸。
当使用本公开的工程化启动子时，通过表达编码异源POI的核酸序列而获得的出乎意料的高蛋白质生产率水平具有若干益处。例如，当与从其天然启动子表达的相同ORF的表达或蛋白质生产率相比，用本公开的工程化异源杂合完整启动子表达目的编码序列(例如，编码POI的目的ORF)提供了ORF编码序列的增加的表达和/或产生的POI增加。在具体的实施例中，本公开的工程化启动子提供增加水平的mRNA表达，这对于不稳定的转录物特别有用。
在另一个实施例中，用工程化启动子表达目的编码序列允许在不扩增含有该工程化启动子的表达构建体的情况下增加目的编码序列的表达水平。当使用本领域中其他表达构建体时，为了达到目的编码序列的较高表达水平，通常需要扩增所述表达构建体。然而，用本文所述的工程化启动子实现的表达水平足够高，通常不需要扩增所述表达构建体。相反，可以用包含工程化启动子的表达构建体的单一整合体实现较高表达水平，这提供了若干益处。首先，宿主细胞典型地是更稳定的，因为它们不会经历扩增的表达构建体的丢失。此外，如果表达构建体不需要被扩增，则宿主细胞构建更有效，从而节省时间、金钱和材料。
在某些其他实施例中，对位于本文所述的工程化启动子的+1转录起始位点的核苷酸进行从鸟嘌呤修饰为腺嘌呤。例如，本发明的某些实施例预期，+1转录起始位点的修饰(例如，在+1位点处的A到G取代)允许来自本文所述的启动子的一致产生，因此导致来自启动子的更好的总体生产率(参见，例如，PCT国际公开号WO 2013/086219)。
在某些实施例中，本公开的工程化异源杂合完整启动子包含SEQ ID NO:65-97中所示的核酸序列、或其子序列。子序列将保留启动子活性并包含至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约90个核苷酸或至少约100个核苷酸。SEQID NO:65-97中任何一个的子序列应最低限度地包含-35和-10共有区域(即，核心启动子元件)和UP元件。
在某些其他实施例中，本公开的工程化异源杂合完整启动子构建自或衍生自表2中列出的至少一种UP元件，该UP元件与表3-10中任一个所列出的启动子元件或其子序列组合并有效地连接。子序列将保留启动子活性并包含至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约90个核苷酸或至少约100个核苷酸。表3-10中列出的启动子元件核酸序列中的任何一个的子序列应该最低限度地包含-35和-10共有区(即，核心启动子元件)。
在其他实施例中，本公开的工程化启动子包含与表1-10中列出的核酸序列中的任何一个杂交的核酸序列(或其子序列)，所述工程化启动子将具有至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约80％和至少约100％的其相应的亲本启动子核酸序列的启动子活性。在一些实施例中，启动子活性将更大，例如超过约100％、超过约150％、超过约200％和超过约250％。在一些实施例中，该启动子将包括在中、高或非常高严格条件下杂交的核酸序列。
在一个具体的实施例中，杂交用于分析给定的核酸片段是否对应于本文所述的启动子核酸序列，因此落入本发明的范围内(参见，Sambrook等人，1989，其描述了一般杂交方法)。
“杂交条件”是指在其下测量杂交的条件的“严格”程度。杂交条件可以基于核酸结合复合物的熔融温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987)中所教授的。杂交条件也可以基于本领域已知的杂交后使用的洗涤条件。仅出于说明的目的，“低严格”条件可以指用0.2x SSC/0.1％SDS溶液在20℃洗涤15分钟。“中严格”条件可以指用0.2x SSC/0.1％SDS溶液在37℃洗涤30分钟。“高严格”条件可以指用0.2x SSC/0.1％SDS溶液在37℃洗涤45分钟。“非常高严格”条件可以指用0.2x SSC/0.1％SDS溶液在37℃洗涤60分钟。然而，与特定溶液成分、温度和洗涤时间相关的严格性可以根据具体的核酸和所涉及的其他条件而变化。技术人员将能够确定与所需严格程度相关的杂交条件。
本发明的另一方面是使用基于核酸结合复合物的熔融温度(Tm)的杂交条件，如Berger和Kimmel(1987)中所教授的。出于说明的目的，“非常高严格性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm5℃)；“高严格性”典型地发生在低于Tm约5℃至10℃；“中严格性”发生在低于Tm约10℃至20℃；以及“低严格性”发生在低于Tm约20℃至25℃。
在两个核酸序列或两个多肽的背景下，术语“同一性”是指这两个序列中的核苷酸或氨基酸残基在比对最大对应性时是相同的，如使用以下“序列比较算法”之一测量的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下方法进行：Smith和Waterman，1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，1970的同源性比对算法；Pearson和Lipman，1988的相似性方法的搜寻；这些算法的计算机化执行(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，575Science Dr.,Madison,Wisconsin[威斯康星州麦迪逊市科学大道575号]中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)；或目视检查。
在某些其他实施例中，使用Geneious软件(生物物质有限公司(BiomattersLtd.))，将枯草芽孢杆菌启动子PrrnO_P1(SEQ ID NO:85)、PrrnO_P2(SEQ ID NO:89)、PrrnA_P1(SEQ ID NO:142)、PrrnA_P2(SEQ ID NO:143)、PrrnJ_P1(SEQ ID NO:144)、PrrnJ_P2(SEQ ID NO:145)、PrrnI_P1(SEQ ID NO:146)、PrrnE_P2(SEQ ID NO:147)、PrrnE_P3(SEQ ID NO:148)、PrrnD_P1(SEQ ID NO:149)、PrrnD_P2(SEQ ID NO:150)、PrrnG_P1(SEQ ID NO:151)和PrrnW_P1(SEQ ID NO:152)的序列与默认参数进行比对，如图6所示。使用该比对，产生了枯草芽孢杆菌rrn启动子的共有序列(SEQ ID NO:153)，并显示在图6的顶部。共有序列SEQ ID NO:153使用如下定义的IUPAC代码：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T，V＝A/C/G。
在某些其他实施例中，使用Geneious软件，将启动子序列和地衣芽孢杆菌核糖体启动子rrn1-P1(SEQ ID NO:106)、rrn2-P1(SEQ ID NO:107)、rrn2-P2(SEQ ID NO:108)、rrn3-P1(SEQ ID NO:109)、rrn4-P1(SEQ ID NO:110)、rrn4-P2(SEQ ID NO:111)、rrn5-P1(SEQ ID NO:112)、rrn5-P2(SEQ ID NO:113)、rrn6-P1(SEQ ID NO:114)和rrn6-P2(SEQ IDNO:115)的上游元件序列与默认参数进行比对，如图7所描绘的。使用该比对，使用产生共有序列的75％的阈值(碱基匹配所有序列的至少75％)产生了共有序列(SEQ ID NO:154)。共有序列SEQ ID NO:154使用如下定义的IUPAC代码：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T，V＝A/C/G。
在某些其他实施例中，本公开的一种或多种工程化启动子(例如，工程化双启动子、工程化三启动子、工程化四启动子等)可以进一步包含在宿主细胞中具有活性的其他启动子，并且包括突变启动子、截短的启动子等，它们对于宿主细胞可以是或不是天然的。可以用于本发明的杂合启动子中的其他启动子的实例包括真菌和细菌启动子。
一些具体的非限制性实例包括：aprE启动子或突变型aprE启动子(PCT国际公开号WO 2001/51643)；弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)氨基糖苷3'-磷酸转移酶基因的aph启动子；黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)启动子；密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)的葡糖异构酶(GI)启动子和衍生物GI(GIT)启动子(U.S.6,562,612和EP351029)；来自变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的葡糖异构酶(GI)启动子，短野生型GI启动子，1.5GI启动子，1.20GI启动子，或如在WO20303/089621中公开的变体GI启动子中的任一个；来自丝状真菌的cbh1、cbh2、eg11和eg12启动子，并且特别地是里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶启动子(GenBank登录号D86235)；lacZ和tac启动子(Bagdasarion等人，1983)；ermE启动子(Ward等人，1986和Schmitt-Joh等人，1992)；以及枯草芽孢杆菌噬菌体o29启动子(Pulido等人，1986)。在链霉菌属(Streptomyces)中有效的启动子列于Hopwood等人，1986中。链霉菌属噬菌体启动子也公开在Labes等人，1997中。可有效用于本文杂合启动子中的其他启动子是Deuschle等人，1986和WO 1996/00787中列出的启动子。
C.目的蛋白质
在某些实施例中，本公开的工程化启动子与编码目的蛋白质(POI)的核酸(例如，多核苷酸或ORF)有效地连接。在一个或多个实施例中，该POI是酶、激素、生长因子、细胞因子、抗体或其片段、受体或其部分、报告基因(例如，绿色荧光蛋白)或其他次级代谢物。
在某些实施例中，该酶是乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、以及起源于细菌或真菌的类似物。
在某些实施例中，该酶是蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、硫醇或酸性蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶将是丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶描述于Markland等人，1983；Drenth等人，1972；美国专利号4,760,025(RE 34,606)、5,182,204和6,312,936以及EP号EP 323,299中。预期使用的蛋白酶也描述于美国专利公开号2010/0152088和PCT国际公开号WO 2010/056635、WO 200/8010925、WO 2003/62380、WO2010/56640、WO 2011/72099等中。用于测量蛋白水解活性的方法公开于Kalisz，1988中。
在另一个实施例中，待由本发明的工程化启动子表达的蛋白酶是包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的成熟BPN′(Y217L变体)蛋白酶，或包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的前体(全长)BPN′(Y217L变体)蛋白酶。
在其他实施例中，该酶是淀粉酶，例如衍生自木霉属(例如里氏木霉)的淀粉酶、木霉属葡糖淀粉酶、衍生自芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌)的淀粉酶、或衍生自土芽孢杆菌属(例如嗜热脂肪土芽孢杆菌)的淀粉酶。细菌和真菌淀粉酶描述于例如美国专利号8,058,033，美国专利公开号2010/0015686，美国专利公开号2009/0314286，英国申请号1011513.7，PCT国际申请号PCT/IB 2011/053018以及PCT国际公开号WO 2008/112459、WO2008/118377、WO 2008/153805、WO 2008/153815、WO 2010/133644、WO 2014/9952、WO201499525等中。
在某些实施例中，待由本发明的工程化启动子表达的淀粉酶是包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的枯草芽孢杆菌AmyE淀粉酶、包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌AmyL淀粉酶、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的嗜热脂肪土芽孢杆菌AmyS淀粉酶、或包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的噬细胞菌属物种淀粉酶。
在其他实施例中，该酶是木聚糖酶。在某些实施例中，该木聚糖酶衍生自木霉属(如里氏木霉)。细菌和真菌木聚糖酶一般描述于美国专利号7,718,411和PCT国际公开号WO2001/027252、WO 2001/66711、WO 2004/97001、WO 2010/72225、WO 2013/127069、WO 2013/37933、WO 2015/114108等中。
在其他实施例中，该酶是植酸酶。在某些实施例中，该植酸酶衍生自柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii))或大肠杆菌(E.coli)。在其他实施例中，该植酸酶可以是布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶如乡间布丘菌(Buttiauxellaagrestis)植酸酶。植酸酶描述于例如PCT国际公开号WO 006/043178、WO 2006/038062、WO2008/097619、WO 2009/129489、WO 2006/038128、WO 2008/092901、WO 2009/129489、WO2010/122532、WO 2003/38035、WO 2004/15084、WO 2003/38111等中。
在某些其他实施例中，该酶是纤维素酶。纤维素酶是水解纤维素中β-D-糖苷键的(纤维素分解)酶。纤维素分解酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(或纤维二糖水解酶)和β-葡糖苷酶(Knowles等人，1987)。
科学文献中已描述了许多纤维素酶，这些纤维素酶的实例包括来自里氏木霉的那些：Shoemaker等人，1983，其公开了CBHI；Teeri等人，1987，其公开了CBHII；Penttila等人，1986，其公开了EGI；Saloheimo等人，1988，其公开了EGII；Okada等人，1988，其公开了EGIII；Saloheimo等人，1997，其公开了EGIV；以及Saloheimo等人，1994，其公开了EGV。本领域还描述了来自木霉属以外的物种的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
在一个具体的实施例中，待由本发明的工程化启动子表达的纤维素酶是美国专利号6,2,87,839和6,562,612中公开的纤维素酶。在某些实施例中，待表达的纤维素酶是如下纤维素酶，其包含美国专利号6,562,612中的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有纤维素分解活性以及与美国专利号6,562,612中的SEQ ID NO:1的活性部分具有大于70％序列同一性的片段或衍生物。纤维素酶通常公开于PCT国际公开号：WO 2004/97001、WO 2005/93050、WO 2004/99370、WO 2004/99369、WO 2009/149202、WO 2008/45214、WO 2006/71598、WO 2009/35537、WO 2013/37933、WO 2010/141779、WO 2008/153903、WO 2000/37614以及美国专利公开号US 2010/0048417中。
在其他实施例中，该酶是甘露聚糖酶(β-甘露糖苷酶)。甘露聚糖酶水解β-D-甘露糖苷中的末端非还原性β-D-甘露糖残基(例如，参见，PCT国际公开号WO 200198462、WO2012149325、WO 2012149333，加拿大专利申请号CA2891519等)。
在其他实施例中，该酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶是降解短梗霉多糖的特定种类的葡聚糖酶(即，淀粉分解酶胞外酶)(例如，参见，PCT国际公开号WO 2008024372、WO200151620、WO 9419468等)。例如，在某些实施例中，支链淀粉酶由革兰氏阴性细菌(例如，克雷伯杆菌属)作为细胞外的细胞表面锚定脂蛋白产生。在某些实施例中，支链淀粉酶是“I型支链淀粉酶”，其特异性攻击α-1,6键。在其他实施例中，支链淀粉酶是“II型支链淀粉酶”，其除了裂解α-1,6键之外，还能够水解(裂解)α-1,4键。
编码本公开的POI(例如，酶、激素、生长因子、细胞因子、抗体等)的核酸相对于表达POI的宿主细胞可以是天然(内源)POI或异源(外源)POI。在某些实施例中，编码POI的核酸可以编码全长蛋白质或全长蛋白质的截短形式。在其他实施例中，编码POI的核酸编码POI的全长“成熟”形式(即，缺乏信号序列或前导肽序列的POI的成熟形式)。在其他实施例中，编码POI的核酸编码全长前蛋白，该全长前蛋白包含编码N-末端前导序列或信号序列(位于5′并且与编码成熟形式的POI的核酸有效地连接)的核酸(例如，参见，下文D部分)。本发明不限于特定的编码序列，而是涵盖与本发明的启动子有效地连接的大量编码序列。
因此，在某些实施例中，经修饰的宿主细胞产生增加水平的POI，其中可以应用各种筛选方法来确定产生的增加水平的POI。例如，POI可以编码为多肽融合物并用作可检测的标签，或可替代地，靶蛋白本身可以用作可选择的或可筛选的标记。还可以使用蛋白质印迹、斑点印迹(这样的方法的详细描述可获自冷泉港实验方案(Cold Spring HarborProtocols)的网站)、ELISA、或者(如果该标记为GFP)全细胞荧光或FACS来检测经标记的蛋白质。
例如，可以包含6-组氨酸标签以与靶蛋白融合，并且蛋白质印迹可以用于检测这种标签。此外，如果靶蛋白以足够高的水平表达，可以进行与考马斯/银染色结合的SDS-PAGE以适当地检测与野生型相比突变体表达的增加，并且在这种情况下不需要标记任何分子。
在其他实施例中，经修饰的(宿主)细胞相对于未经修饰的(亲本)细胞中POI的表达与mRNA转录物水平相关。例如，某些实施例涉及编码POI的基因或ORF的分子表征，其通常包括对RNA表达的时间和空间分布的彻底分析。存在许多广泛使用的程序，并且这些程序在本领域中已知用于检测和确定总RNA或聚(A)RNA样品中具体mRNA的丰度。非限制性实例包括例如Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交、和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法。
可以采用其他方法来确认目的蛋白质的改善水平，包括例如，检测蛋白质活性或每个细胞中的量、蛋白质活性或每毫升培养基中的量的增加，从而允许培养或发酵有效地继续更长时间段，或通过这些方法的组合。
比生产力的检测是用于评估蛋白质生产的另一种适合的方法。比生产力(Qp)可以使用以下公式确定：
Qp＝gP/gDCW·hr
其中，“gP”是罐中产生的蛋白质的克数，“gDCW”是罐中的干细胞重量(DCW)的克数，并且“hr”是从接种时间开始的几小时内的发酵时间，其包括生产时间以及生长时间。
在某些实施例中，本公开的经修饰的宿主细胞如与其未经修饰的(亲本)细胞相比，产生至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、或至少约10％或更多的POI。
D.信号序列
在某些实施例中，特别是当编码POI的核酸编码胞外酶(例如纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶等)时，信号序列可以连接到编码序列的N-末端部分。该信号可用于促进本公开的POI的胞外分泌。该信号序列可以对于表达POI的宿主生物是内源的，或对于表达POI的宿主生物是外源的(异源的)。
在某些实施例中，编码本公开的POI的基因(或ORF)进一步包含(并且有效地连接至)衍生自枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶aprE基因信号序列或其变体信号序列的N-末端信号序列。在其他实施例中，该信号序列衍生自枯草芽孢杆菌(amyE)α-淀粉酶基因信号序列或枯草芽孢杆菌BglC(即，芳基-磷酸-β-D-葡糖苷酶(EC:3.2.1.86))信号序列或其变体。
在某些其他实施例中，编码本公开的POI的基因(或ORF)包含衍生自地衣芽孢杆菌(amyL)α-淀粉酶基因信号序列或其变体信号序列的N-末端信号序列。
在一些实施例中，可以如PCT国际专利公开号WO 2011/014278和WO 2010/123754中所述改变或修饰该信号序列。在某些其他实施例中，该信号序列包括来自链霉菌属纤维素酶基因的信号序列。在一个实施例中，优选的信号序列是变铅青链霉菌纤维素酶celA(Bently等人，2002)。然而，本领域技术人员知道许多信号肽，它们中的任何一种都可考虑使用，并根据宿主细胞和待在所述宿主细胞中表达的多肽(POI)进行选择。
E.DNA构建体和载体
包含与编码POI的核酸有效地连接的工程化启动子的本发明的核酸构建体可以通过本领域已建立的标准方法合成制备(例如，由Beaucage和Caruthers，1981描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，1984描述的方法)。核酸构建体可以是混合的合成和基因组来源，并且可以通过连接合成或基因组DNA的片段来制备。也可以通过聚合酶链式反应使用特异性引物来制备核酸构建体，例如如美国专利号4,683,202中所述或如Saiki等人，1988中所述。
可以将本发明的DNA构建体插入载体(例如表达载体)中。适合于在真菌、酵母和细菌中克隆、转化和表达多肽的各种载体是本领域技术人员已知的。典型地，载体或盒将包含本发明的工程化启动子，任选地包含信号序列、目的编码区和终止子序列。
在某些实施例中，合适的载体可以进一步包含使得该载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。
在其他实施例中，载体还可以包含可选择标记(例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因)，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因；或者赋予抗生素抗性(例如像氨苄青霉素抗性、壮观霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
在某些实施例中，表达载体包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包含控制核苷酸序列，例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。
如本文描述的用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件，并将它们插入到包含复制必需信息的适合载体中的方案是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989和Sambrook等人，1989第3版2001)。
包含多核苷酸构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生POI的宿主细胞。所述细胞可以用编码POI的DNA构建体转化，方便地通过将构建体(按一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的，因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
在其他实施例中，从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得该基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。
F.转化
本发明的载体将被转化到宿主细胞中。一般的转化技术是本领域已知的(Ausubel等人，1994；Campbell等人，1989)。这些一般技术中的一些包括但不限于使用颗粒或基因枪(基因枪法)，在转化过程之前丝状真菌细胞壁的透化(例如，通过使用高浓度的碱，例如0.05M至0.4M CaCl2或乙酸锂)，原生质体融合，电穿孔或农杆菌介导的转化(美国专利号6,255,115)以及用聚乙二醇和CaCl2处理原生质体或原生质球，如描述于Campbell等人，1989和Penttila等人，1988中。
细菌的转化和表达方法公开于Brigidi等人，1990中。在Ferrari等人的美国专利号5,264,366中提供了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的优选的一般转化和表达方案。可用常规技术修饰以包含并且表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI(Vogtentanz，2007)。
通常，DNA介导的芽孢杆菌属感受态细胞的转化是本领域已知的。例如，关于这一遗传交换过程的大部分信息源于物理化学研究，这导致建立了产生转化细胞的以下事件顺序：(1)转化DNA与感受态细胞的结合，导致供体DNA的双链片段化，(2)结合的DNA的一条链的进入，伴随着互补链的同时降解，(3)将单链DNA的片段整合到受体DNA中，以及(4)新获得的信息的表达(参见，例如，Dubnau，1976；Venema，1979)。芽孢杆菌属转化方法进一步公开于PCT国际公开号WO 200214490中。
G.宿主细胞
可根据本发明使用的宿主细胞包括细菌和真菌细胞。优选的真菌宿主细胞包括丝状真菌细胞，例如曲霉属和木霉属细胞。优选的细菌宿主细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞两者，包括芽孢杆菌属、分支杆菌属、放线菌属和链霉菌属宿主细胞。宿主细胞还包括但不限于：大肠杆菌、假单胞菌属物种(例如，铜绿假单胞菌和产碱假单胞菌)、链霉菌属物种(例如，变铅青链霉菌)、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
H.细胞培养
通常在常规营养培养基中培养本公开的宿主细胞和转化细胞。用于经转化的宿主细胞的培养基可以适当地被修饰以用于激活启动子并选择转化体。特定培养条件(例如温度、pH等)可以是用于所选择的宿主细胞的表达的那些条件，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。
此外，优选的培养条件可以在以下科学文献中找到，例如Sambrook，1989，Kieser等人，2000和Harwood等人，1990；和/或来自美国典型培养物保藏中心(ATCC；马纳萨斯(Manassas)，维吉尼亚州(VA))。真菌宿主细胞(如木霉属细胞)的稳定转化体通常可以通过其较快的生长速度或者在固体培养基上形成具有光滑而不是粗糙轮廓的圆形菌落来与不稳定转化体区分开来。
I.表达的目的多肽的回收
可以通过本领域技术人员已知的常规方法从培养基中回收由本公开的经转化的宿主细胞产生的目的多肽，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，或者如果需要，破坏细胞并从细胞部分和碎片中除去上清液。通常经过澄清后，将上清液或滤液的蛋白质组分通过盐沉淀作用(例如硫酸铵)进行沉淀。然后沉淀的蛋白质被溶解，并且可以通过各种色谱法进行纯化，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法和其他本领域公认的程序。因此，在某些实施例中，由本公开的工程化启动子表达的POI是分离的POI、回收的POI和/或纯化的POI。
J.构建体组装
在某些一般的实施例中，本发明涉及在体外组装(构建)核酸构建体，然后将这种构建体直接克隆到感受态宿主细胞(例如，芽孢杆菌属宿主细胞)中，使得构建体整合到宿主基因组中。例如，在某些实施例中，使用PCR融合、Gibson组装和/或连接以在体外组装DNA构建体。在某些其他实施例中，该DNA(核酸)构建体是非质粒DNA构建体。在其他实施例中，该DNA构建体包含其中已引入突变的DNA。然后将该构建体用于转化宿主细胞。在这方面，优选使用宿主细胞(例如，芽孢杆菌属)的高度感受态的突变体来促进构建体直接克隆到细胞中。例如，携带在木糖诱导型启动子(Pxyl-comK)控制下的comK基因的芽孢杆菌属能以非常高的效率被可靠地转化。
可以使用本领域已知的任何合适的方法来转化细胞。在转化前可将DNA构建体插入载体(即，质粒)中。在一些实施例中，使用适当的限制酶(即，不破坏DNA构建体的限制酶)来切割环状质粒。因此，在一些实施例中，环状质粒可用于本发明。然而，在替代性实施例中，使用线性质粒。在一些实施例中，在不存在质粒DNA的情况下使用DNA构建体(即，PCR产物)。
实例
为了进一步说明本发明及其优点，给出以下具体实例是为了说明本发明而提供的，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例1
产生具有杂合启动子或异源启动子的DNA构建体以在芽孢杆菌属中表达
A.具有杂合启动子的DNA构建体
产生具有单个异源启动子、单个杂合启动子、多个(两个或更多个)异源启动子、多个(两个或更多个)杂合启动子及其组合的各种DNA构建体，用于在芽孢杆菌属表达宿主中使编码目的蛋白质的基因进行转录。这些单个异源启动子、单个杂合启动子、多个异源启动子、多个杂合启动子及其组合进一步定义为具有至少一个位于5′并且与至少一个启动子元件有效地连接的上游启动子元件(UP元件)，其中该至少一个UP元件和至少一个启动子元件彼此不是天然相关的(即，有效地连接)，也不是衍生自相同的天然“完整”启动子。
例如，合成具有SEQ ID NO:65的单个杂合启动子(杂合启动子1)或SEQ ID NO:71的双杂合启动子(双杂合启动子7)的核酸，并连接到编码该解淀粉芽孢杆菌BPN’(Y217L)枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:41)的目的基因上。所得的DNA构建体分别具有SEQ ID NO:81(杂合启动子1+BPN′(Y217L))和82(杂合启动子7+BPN′(Y217L))的核苷酸序列。此外，合成具有SEQ ID NO:65(杂合启动子1)、SEQ ID NO:96(杂合启动子23)和SEQ ID NO:97(杂合启动子24)的序列的单杂合启动子或具有SEQ ID NO:71(双杂合启动子7)、SEQ ID NO:90(双杂合启动子17)、SEQ ID NO:91(双杂合启动子18)、SEQ ID NO:92(双杂合启动子19)、SEQ IDNO:93(双杂合启动子20)、SEQ ID NO:94(双杂合启动子21)、或SEQ ID NO:95(双杂合启动子22)的序列的双杂合启动子的核酸，并连接到编码噬细胞菌属物种成熟淀粉酶变体(SEQID NO:63)的目的基因上。上面表2中列出的是本公开中测试的杂合启动子。
按照gBlocks(IDT，集成DNA技术(Integrated DNA Technologies)公司)合成产生包含所需启动子序列的DNA片段，并通过本领域已知的方法连接至目的基因，如BPN’Y217L。将这些核酸构建体插入DNA盒中或通过本领域已知的方法扩增以转化合适的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌株。用所得的DNA盒，使用Spizizen(Anagnostopoulos和Spizizen，1961)的方案来转化合适的枯草芽孢杆菌宿主细胞。例如，用于转化枯草芽孢杆菌的DNA盒含有壮观霉素抗性标记(spcR，SEQ ID NO:86)和两个用于在枯草芽孢杆菌染色体的aprE基因座处整合的aprE同源区(SEQ ID NO:87和88)以及野生型aprE UTR(SEQ ID NO:62)。合成具有SEQ ID NO:65(杂合启动子1)、66(杂合启动子2)、71(杂合启动子7)、75(杂合启动子11)、76(杂合启动子12)、77(杂合启动子13)、78(杂合启动子14)、79(杂合启动子15)、80(杂合启动子16)、90(杂合启动子17)、91(杂合启动子18)、92(杂合启动子19)、93(杂合启动子20)、94(杂合启动子21)、95(杂合启动子22)、96(杂合启动子23)或97(杂合启动子24)的序列的杂合启动子，并连接到如下目的基因，该目的基因编码(1)与SEQ ID NO:42的枯草芽孢杆菌淀粉酶E(AmyE)变体有效地连接的SEQ ID NO:156的AprE信号序列，(2)与SEQ ID NO:43的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL)有效地连接的SEQ ID NO:156的AprE信号序列，(3)与地衣芽孢杆菌AmyL成熟序列有效地连接的地衣芽孢杆菌AmyL信号序列，其中该AmyL信号序列和AmyL成熟序列有效地连接，如SEQ ID NO:44所示，(4)与SEQ ID NO:64的嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶(AmyS)变体有效地连接的SEQ ID NO:156的AprE信号序列，以及(5)与SEQ ID NO:63的噬细胞菌属物种淀粉酶变体有效地连接的SEQ ID NO:156的AprE信号序列。如以上前一段所述，在某些实施例中，枯草芽孢杆菌中AmyE和AmyL的表达利用SEQ ID NO:156的AprE信号序列，而不是天然AmyE和AmyL信号序列。
另外，还合成具有其他杂合启动子的核酸构建体并连接到上述目的基因或其他目的基因，所述其他杂合启动子包含选自SEQ ID NO:45-61(参见，表1)的UP元件序列和选自SEQ ID NO:1-8、15-18、37、105-115和118-140的一个、两个、或三个启动子序列。SEQ IDNO:1-8、15-18、37、105-115和118-140的启动子序列如上表3-10所示。
这些核酸构建体在DNA盒或表达载体中制备，扩增或直接用于转化各种芽孢杆菌属物种。这些核酸构建体、盒或扩增产物中的一些含有spcR标记、氯霉素抗性标记或其他可选择标记。一些含有丙氨酸消旋酶基因。在某些实施例中，该核酸构建体是非整合构建体或盒。在其他实施例中，通过用于在各种芽孢杆菌属物种的染色体的不同位点进行整合的特定同源区，将这些核酸构建体进行染色体整合。在其他实施例中，通过用于整合到各种芽孢杆菌属物种的天然存在的质粒中的特定同源区，将这些核酸构建体整合到质粒中。
在其他实施例中，合成具有SEQ ID NO:67(杂合启动子3)、68(杂合启动子4)、69(杂合启动子5)、70(杂合启动子6)、72(杂合启动子8)、73(杂合启动子9)和74(杂合启动子10)的序列的另外的杂合启动子的核酸构建体，并连接到如下目的基因上，该目的基因编码BPN’Y217L枯草杆菌蛋白酶(包含SEQ ID NO:40或41)、枯草芽孢杆菌淀粉酶E(AmyE，包含SEQ ID NO:42)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL，SEQ ID NO:43或44)、嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶(AmyS，SEQ ID NO:64)变体、噬细胞菌属物种淀粉酶(SEQ ID NO:63)变体、或其他淀粉酶，支链淀粉酶，纤维素酶或蛋白酶，野生型或其变体。这些核酸构建体在DNA盒或表达载体中制备，扩增或直接用于转化各种芽孢杆菌属物种。在某些实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物含有spcR标记、氯霉素抗性标记或其他可选择标记。在某些其他实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物包含丙氨酸消旋酶基因。在某些其他实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物是非整合核酸构建体、盒或其扩增产物。在其他实施例中，通过用于在各种芽孢杆菌属物种的染色体的不同位点进行整合的特定同源区，将这些核酸构建体、盒或扩增产物进行染色体整合。在另一个实施例中，通过用于整合到各种芽孢杆菌属物种的天然存在的质粒中的特定同源区，将这些核酸构建体、盒或扩增产物整合到质粒中。在其他实施例中，SEQ ID NO:15、65、71、96、97和101-105的启动子序列具有在启动子序列的3'端有效地连接的SEQ ID NO:62的aprE野生型UTR，而SEQ ID NO:90、91、92、93、94和95的启动子序列具有在启动子序列的3'端有效地连接的LAT野生型UTR(SEQ ID NO:155)。
B.具有异源或同源完整启动子的核酸构建体
在该实例中，产生具有异源或同源芽孢杆菌属启动子的核酸构建体，用于在芽孢杆菌属表达宿主中使编码目的蛋白质的基因进行转录。这些启动子各自具有至少一个天然(野生型)“完整启动子”，该完整启动子包含位于5′并且与启动子有效地连接的UP元件，其中该天然(野生型)“完整启动子”的UP元件和启动子是天然缔合的并有效地连接在一起或衍生自同一个天然“完整启动子”。
例如，合成具有枯草芽孢杆菌rrnI(SEQ ID NO:15)、ssrA(SEQ ID NO:25)、scr(SEQ ID NO:26)、spoVG(SEQ ID NO:27)、aprE(SEQ ID NO:28)、vpr(SEQ ID NO:29)、mpr(SEQ ID NO:30)、bpr(SEQ ID NO:31)、或ispA(SEQ ID NO:32)的完整启动子序列的同源启动子的核酸，并连接到编码BPN’Y217L枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:41)的目的基因上。将所得的核酸构建体插入DNA盒中以转化合适的枯草芽孢杆菌菌株。SEQ ID NO:15(如上所述)的枯草芽孢杆菌rrnI的完整启动子序列列于上表3中。SEQ ID NO:25-32(如上所述)的“完整”启动子序列示于表5、6和7中。
另外，合成具有枯草芽孢杆菌rrnI(SEQ ID NO:15)、地衣芽孢杆菌PamyL(SEQ IDNO:116)、或地衣芽孢杆菌核糖体启动子Prrn1(SEQ ID NO:101)、Prrn2(SEQ ID NO:102)、Prrn4(SEQ ID NO:103)、Prrn5(SEQ ID NO:104)或Prrn6(SEQ ID NO:105)的“完整启动子”序列的异源或同源启动子的核酸，并连接到编码地衣芽孢杆菌AmyL(SEQ ID NO:43或44)或嗜热脂肪土芽孢杆菌AmyS(SEQ ID NO:64)变体的目的基因上。所得的核酸构建体用于转化合适的地衣芽孢杆菌菌株。SEQ ID NO:15(如上所述)的枯草芽孢杆菌rrnI的完整启动子序列列于表3中。上述地衣芽孢杆菌PamyL和地衣芽孢杆菌核糖体启动子Prrn1、Prrn2、Prrn4、Prrn5和Prrn6的“完整”启动子序列列于上表8中。
合成具有来自SEQ ID NO:5、9-15、18-32、100-117和141的一个、两个或三个“完整”启动子序列的异源启动子的核酸，并连接到如下目的基因上，该目的基因编码BPN’Y217L枯草杆菌蛋白酶(包含SEQ ID NO:40)、枯草芽孢杆菌淀粉酶E(AmyE，包含SEQ ID NO:42)、地衣芽孢杆菌淀粉酶L(AmyL，包含SEQ ID NO:43)，嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶(AmyS，包含SEQ ID NO:64)S变体或其他淀粉酶或蛋白酶变体。SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQID NO:18和SEQ ID NO:105-115的异源“完整”启动子序列如上表3-10所示。SEQ ID NO:9-14、19-32、100-104、116、117和141的异源完整启动子如上表3-10所示。
另外，还合成了具有其他完整的天然异源启动子(其包含选自SEQ ID NO:1-4、6-8、16-17、33-39、118-140的序列)的核酸构建体，并连接到上述目的基因或其他目的基因上。SEQ ID NO:1-4、6-8、16-17、33-39和118-140的启动子序列如上表3-10所示。存在于构建体中的另外的序列包括AmyL信号序列(SEQ ID NO:83)和AmyL终止子序列(SEQ ID NO:84)。
这些核酸构建体在DNA盒或表达载体中制备，扩增或直接用于转化各种芽孢杆菌属物种。在某些实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物含有spcR标记、氯霉素抗性标记或其他可选择标记。
在其他实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物含有丙氨酸消旋酶基因作为非抗生素抗性标记。在某些其他实施例中，这些核酸构建体、盒或扩增产物是非染色体整合构建体或盒。在其他实施例中，通过用于在各种芽孢杆菌属物种的染色体的不同位点进行整合的特定同源区，将这些核酸构建体、盒或扩增产物进行染色体整合。在某些实施例中，将本公开的核酸构建体或其载体(即，包含与编码POI的核酸有效地连接的工程化启动子的核酸)整合到芽孢杆菌属宿主细胞的同源染色体区域中。在一个具体的实例中，将本公开的核酸构建体掺入枯草芽孢杆菌aprE基因座yhfO和yhfN中。
因此，在某些实施例中，待整合到宿主细胞基因组中的核酸构建体(或其载体)侧翼为5′和3′核酸序列，其包含含有SEQ ID NO:87的核酸序列的枯草芽孢杆菌aprE基因座yhfO和含有SEQ ID NO:88的核酸序列的枯草芽孢杆菌aprE yhfN基因座。
在某些其他实施例中，通过用于整合到各种芽孢杆菌属物种的天然存在的质粒中的特定同源区，将这些核酸构建体、盒或扩增产物整合到质粒中。
本公开的图1显示了在这些研究中设计并测试的各种类型的启动子构型的组成的示意图：启动子类型1(同源启动子)、启动子类型2(单杂合启动子)、启动子类型3(双杂合启动子)。启动子类型1是任何同源启动子，其中UP元件和启动子区起源于同一个原始(完整)启动子(称为“Px”)。启动子类型2是任何杂合启动子，其中UP元件来自一个启动子(称为“Px”)，并且启动子来自任何其他启动子(称为“Py”)。启动子类型3是任何(双)杂合启动子，其中UP元件来自一个启动子(称为“Px”)，并且两个启动子区来自两个不同的启动子(称为“Py”和“Pz”)，其中“Py”和“Pz”启动子与插入的UTR(即，UTR位于“Py”和“Px”启动子之间，或反之亦然)以及任选地在3'端的另外的UTR有效地连接。
如上所述，“Px”、“Py”和“Pz”启动子序列的3种构型可选自SEQ ID NO:3-20、SEQID NO:26、SEQ ID NO:37中的启动子，和/或选自SEQ ID NO:101-105中的启动子。可以从SEQ ID NO:45-61中的上游元件序列中选择上游(UP)元件。上游(UP)元件和启动子序列可以使用本领域已知的方法组合以产生组成型人工启动子，例如对应于SEQ ID NO 65、SEQID NO 67和SEQ ID NO 71的核酸序列的杂合启动子。
实例2
来自枯草芽孢杆菌中的天然和工程化启动子的蛋白质表达
在摇瓶培养物中测试驱动枯草杆菌蛋白酶BPN’Y217L表达的天然和合成启动子。测试的启动子序列如下：(1)PaprE(SEQ ID NO 28)，(2)PssrA(SEQ ID NO 25)，(3)Pscr(SEQ ID NO 26)，(4)PspoVG(SEQ ID NO 27)，(5)PrrnI-2(SEQ ID NO 15)，(6)杂合单启动子1(P1；SEQ ID NO 65)，以及(7)杂合双启动子7(P7；SEQ ID NO 71)。将用每种上述构建体转化的枯草芽孢杆菌细胞在5mL的Luria肉汤中生长过夜。将一(1)mL每种预培养物用于在摇瓶中接种25mL的脑心浸液(BHI)培养基，以设定为250rpm的摇床速度孵育12小时。每小时收集全肉汤并稀释10倍以使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司(MolecularDevices)，唐宁镇(Downington)，宾夕法尼亚州(PA)，美国)测量在600nm处的吸光度。将每个样品在600nm处的吸光度作为时间的函数来作图，并且结果示于图2中。如图2所示，随着时间的推移观察到的细胞密度的增加对于所有菌株是相似的，这表明枯草杆菌蛋白酶BPN’Y217L的表达差异(例如，参见图2)不是由于样品中培养物密度的差异。平行地，使用如WO2010/144283中所述的N-suc-AAPF-pNA底物(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.))，从携带以下启动子序列之一的枯草芽孢杆菌细胞监测相对蛋白质表达：(1)PaprE(SEQ IDNO:28)，(2)PssrA(SEQ ID NO:25)，(3)Pscr(SEQ ID NO:26)，(4)PspoVG(SEQ ID NO:27)，(5)PrrnI-2(SEQ ID NO:15)，(6)杂合单启动子1(P1；SEQ ID NO 65)，以及(7)杂合双启动子7(P7；SEQ ID NO 71)。该底物通常用于监测枯草杆菌蛋白酶如BPN’Y217L的活性。简言之，在培养期间收集培养液，在测定缓冲液(100mM Tris，0.005％Tween 80，pH 8.6)中稀释40倍，并且将10μL稀释的样品排列在微量滴定板中。将AAPF底物原液稀释，并且将测定缓冲液(在DMSO中的100mg/ml AAPF原液，稀释100倍)和190μL该溶液添加到微量滴定板中。使用SpectraMax分光光度计在25℃、在405nm、以20s时间增量测量溶液的增加的吸光度，持续高至5分钟。将405nm下的吸光度作为时间的函数作图，并且将结果示于图3中。结果表明，SEQID NO:25(2；PssrA)、SEQ ID NO:26(3；Pscr)、SEQ ID NO:15(5；PrrnI-2)、SEQ ID NO:65(6；杂合单启动子1)和SEQ ID NO:71(7；杂合双启动子)中的启动子提供比SEQ ID NO:28(1；PaprE)和SEQ ID NO 27(4；PspoVG)中的启动子更高的生产率。具体而言，如图3所示，杂合启动子1(6；SEQ ID NO:65)和杂合启动子7(7；SEQ ID NO:71)表明在测试条件下最高水平的枯草杆菌蛋白酶BPN’Y217L生产。
实例3
来自地衣芽孢杆菌中的异源和工程化启动子的蛋白质表达
异源启动子PrrnI-2(SEQ ID NO:15)及其工程化变体启动子，即，变体2(杂合启动子1，SEQ ID NO:65)、变体3(杂合启动子23，SEQ ID NO:96)、变体10(杂合启动子22，SEQ IDNO:95)、变体11(杂合启动子19，SEQ ID NO:92)、变体12(杂合启动子18，SEQ ID NO:91)和变体13(杂合启动子17，SEQ ID NO:90)，用于驱动地衣芽孢杆菌中噬细胞菌属物种淀粉酶变体(SEQ ID NO:63)的表达。在地衣芽孢杆菌转化后，使用本领域已知的方法，使细胞培养物在补充有大豆蛋白胨和CaCl2的pH 6.8的MOPS基础培养基中生长。在37℃和剧烈振荡的Infors培养箱中生长64小时后，按照制造商的说明书使用Ceralphaα-淀粉酶测定试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme)，威克洛(Wicklow)，爱尔兰)，在培养液样品中测量淀粉酶活性。该Ceralpha底物是限定的寡糖非还原端封闭的对硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)以及过量水平的葡糖淀粉酶和β-葡糖苷酶(由于存在阻断基团，其对天然底物没有作用)的混合物。当通过内切作用型α-淀粉酶水解寡糖时，混合物中存在的过量的α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶使对硝基苯基麦芽糖片段瞬时和定量水解成葡萄糖和游离的对硝基苯酚。
因此，将底物和培养物上清液的样品在25℃孵育8分钟。终止反应并使用MTP分光光度计在405nm下测量吸光度。使用无酶对照来校正背景吸光度。通过测量405nm处的吸光度来定量对硝基苯酚的释放，这直接与分析的样品中的淀粉酶活性水平相关。在来自该研究的样品中检测到的相对淀粉酶活性显示在图4上。如该图所示，当与异源非工程化rrnI-2启动子(SEQ ID NO:15)相比时，来自任何工程化(变体)rrn启动子(即，变体2(杂合启动子1；SEQ ID NO:65)、变体3(杂合启动子23；SEQ ID NO:96)、变体10(杂合启动子22；SEQ IDNO:95)、变体11(杂合启动子19；SEQ ID NO:92)；变体12(杂合启动子18；SEQ ID NO:91)和变体13(杂合启动子17；SEQ ID NO:90))的淀粉酶(SEQ ID NO:63)表达导致淀粉酶蛋白的产生增加。
实例4
使用天然枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌核糖体启动子表达多种淀粉酶
针对在地衣芽孢杆菌宿主中几种细菌淀粉酶的表达来评估来自枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的一系列天然(野生型)启动子。所评估的启动子是：amyL地衣芽孢杆菌天然淀粉酶基因的PamyL(SEQ ID NO:116)启动子；枯草芽孢杆菌核糖体RNA rrnI的PrrnI-2Bsu(SEQ ID NO:15)第二启动子；地衣芽孢杆菌Prrn1(SEQ ID NO:101)；地衣芽孢杆菌Prrn2(SEQ ID NO:102)；地衣芽孢杆菌Prrn4(SEQ ID NO:103)；地衣芽孢杆菌Prrn5(SEQ ID NO:104)以及地衣芽孢杆菌Prrn6(SEQ ID NO:105)。
SEQ ID NO:15、101、102、103、104和105的核糖体序列含有启动子和天然上游(UP)元件序列。因此，在本实例中，将编码细菌淀粉酶Amy1、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶L(SEQ IDNO:43)、Amy3嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶S变体(SEQ ID NO:64)以及Amy4噬细胞菌属物种淀粉酶变体(SEQ ID NO:63)的多核苷酸与上面提到的启动子(即，SEQ ID NO:15和101-105的启动子)进行融合(3′)。使用本领域已知的方法用这些不同的构建体转化合适的地衣芽孢杆菌细胞。随后，使细菌培养物在补充有大豆蛋白胨和CaCl2的pH 6.8的MOPS基础培养基中生长。将培养物在37℃伴随有剧烈搅拌的Infors培养箱中孵育64小时。然后基本上如上文实例3中所述地，按照制造商的说明书使用Ceralphaα-淀粉酶测定试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme)，威克洛(Wicklow)，爱尔兰)，测量培养物中的淀粉酶活性。确定了由各种天然(野生型)启动子(即，PamyL(SEQ ID NO:116)；PrrnI-2Bsu(SEQ ID NO:15)；Prrn1(SEQ IDNO:101)；Prrn2(SEQ ID NO:102)；Prrn4(SEQ ID NO:103)；Prrn5(SEQ ID NO:104和Prrn6(SEQ ID NO:105))驱动的3种细菌淀粉酶(即，Amy 1、Amy 2和Amy 3)的相对表达。如图5所示，相对的淀粉酶生产被报道为当使用启动子“PAmyL”作为参考时观察到的总量的百分比。如该图所见，使用核糖体启动子代替内源性地衣芽孢杆菌淀粉酶启动子(PamyL)在大多数情况下导致蛋白质表达增加。
实例5
多种枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌核糖体启动子序列的比较
使用Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))，将枯草芽孢杆菌启动子PrrnO_P1(SEQ ID NO:85)、PrrnO_P2(SEQ ID NO:89)、PrrnA_P1(SEQ ID NO:142)、PrrnA_P2(SEQ ID NO:143)、PrrnJ_P1(SEQ ID NO:144)、PrrnJ_P2(SEQ ID NO:145)、PrrnI_P1(SEQ ID NO:146)、PrrnE_P2(SEQ ID NO:147)、PrrnE_P3(SEQ ID NO:148)、PrrnD_P1(SEQ ID NO:149)、PrrnD_P2(SEQ ID NO:150)、PrrnG_P1(SEQ ID NO:151)和PrrnW_P1(SEQ ID NO:152)的序列与默认参数进行比对，如图6所示。选择了显示共有序列和序列标识的选项。序列标识是每个位置处核苷酸的相对频率的显示，并且它由每个位置上方的单字母代码的大小表示，显示在图7中的多序列比对的上方。使用该比对，产生了枯草芽孢杆菌rrn启动子的共有序列(SEQ ID NO:153)，并显示在图2的顶部。共有序列使用如下定义的IUPAC代码：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T，V＝A/C/G。
使用Geneious软件，将启动子和地衣芽孢杆菌核糖体启动子rrn1-P1(SEQ ID NO:106)、rrn2-P1(SEQ ID NO:107)、rrn2-P2(SEQ ID NO:108)、rrn3-P1(SEQ ID NO:109)、rrn4-P1(SEQ ID NO:110)、rrn4-P2(SEQ ID NO:111)、rrn5-P1(SEQ ID NO:112)、rrn5-P2(SEQ ID NO:113)、rrn6-P1(SEQ ID NO:114)和rrn6-P2(SEQ ID NO:115)的上游元件序列与默认参数进行比对。选择了显示共有序列和序列标识的选项。核苷酸的相对频率由每个位置上方的单字母代码的大小表示，如图7所示。
使用该比对，使用产生共有序列的75％的阈值(碱基匹配所有序列的至少75％)产生了共有序列(SEQ ID NO:154)。共有序列使用如下定义的IUPAC代码：N＝任何核苷酸，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C，W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，B＝C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T，V＝A/C/G。
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Claims (17)

1.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接的工程化杂合启动子，其中所述杂合启动子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列，保留启动子活性的SEQ IDNO:65-80和90-97的子序列，与SEQ ID NO:65-80和90-97中任一个至少60％同源的核酸，或在中严格条件下与SEQ ID NO:65-80和90-97中任一个或其保留启动子活性的子序列杂交的核酸。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述POI是酶。
3.如权利要求2所述的分离的核酸，其中所述酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。
4.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含与编码目的蛋白质的核酸有效地连接的工程化完整启动子，所述分离的核酸包含选自以下的式：
(I)5′-UP-第1Pro-ORF-3′；
(II)5′-UP-第1Pro-UTR-ORF-3′；
(III)5′-UP-第1Pro-第2Pro-ORF-3′；
(IV)5′-UP-第1Pro-第2Pro-UTR-ORF-3′；
(V)5′-UP-第1Pro-UTR-第2Pro-UTR-ORF-3′；
(VI)5′-UP-第1Pro-第2Pro-第3Pro-ORF-3′；
(VII)5′-UP-第1Pro-第2Pro-第3Pro-UTR-ORF-3′；以及
(VIII)5′-UP-第1Pro-第2Pro-UTR-第3Pro-UTR-ORF-3′，
其中UP是包含启动子上游元件的核酸，第1Pro、第2Pro和第3Pro是与至少包含-35/-10核心启动子序列相同或不同的核酸，UTR是包含非翻译区的核酸，并且ORF是编码目的蛋白质的核酸可读框，其中所述UP元件包含SEQ ID NO:45-61中的任一个、保留启动子活性的SEQ ID NO:45-61的子序列、与保留启动子活性的SEQ ID NO:45-61中的任一个至少60％同源的核酸、或在中严格条件下与SEQ ID NO:45-61中任一个或其保留启动子活性的子序列杂交的核酸，并且其中所述第1Pro、第2Pro和第3Pro包含SEQ ID NO:1-39和101-154中任一个、保留启动子活性的SEQ ID NO:1-39和101-154的子序列、与保留启动子活性的SEQ IDNO:1-39和101-154中任一个至少60％同源的核酸、或在中严格条件下与SEQ ID NO:1-39和101-154中任一个或其保留启动子活性的子序列杂交的核酸。
5.如权利要求4所述的分离的核酸，其中由ORF编码的POI是酶。
6.一种载体，所述载体包含如权利要求1所述的核酸。
7.如权利要求6所述的载体，其中所述载体是表达载体或染色体整合载体。
8.一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞包含如权利要求6所述的载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞，所述芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)以及嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。
10.一种整合载体，所述整合载体包含如权利要求1所述的核酸，其中如权利要求1所述的核酸的5′和3′侧翼均为与所述宿主细胞的染色体基因座同源的核酸序列。
11.如权利要求10所述的载体，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属细胞，并且5′和3′核酸序列与包含SEQ ID NO:87的核酸的枯草芽孢杆菌aprE染色体基因座yhfO和包含SEQ IDNO:88的核酸的枯草芽孢杆菌aprE染色体基因座yhfN同源。
12.一种从如权利要求8所述的宿主细胞分离的目的蛋白质(POI)。
13.一种用于筛选经转化的宿主细胞以增加POI表达的方法，所述方法包括：
(i)用包含异源工程化杂合启动子的分离的核酸转化宿主细胞，所述异源工程化杂合启动子与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接，其中所述杂合启动子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列，
(ii)用包含其天然启动子的分离的核酸转化宿主细胞，所述天然启动子与编码和步骤(i)相同的POI的核酸有效地连接，其中在步骤(i)和(ii)中被转化的宿主细胞是属于相同属种且具有相同遗传背景的宿主细胞，和
(iii)在表达所述POI的条件下培养所述经修饰的细胞，
其中步骤(i)中POI编码序列的表达相对于步骤(ii)中相同POI编码序列的表达的增加表明POI的表达增加。
14.一种用于在宿主细胞中增加POI的表达的方法，所述方法包括：
(i)通过将包含与编码目的蛋白质(POI)的核酸有效地连接的工程化杂合启动子的核酸引入宿主细胞来修饰所述宿主细胞，其中所述杂合启动子包含SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中任一个的核苷酸序列，和保留启动子活性的SEQ ID NO:65-80和90-97的子序列，以及
(ii)在表达所述POI的条件下培养所述经修饰的宿主细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及嗜热脂肪土芽孢杆菌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述POI是酶，所述酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、支链淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括分离并纯化所产生的POI。
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