CN111808834B - 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 - Google Patents
在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111808834B CN111808834B CN202010665839.2A CN202010665839A CN111808834B CN 111808834 B CN111808834 B CN 111808834B CN 202010665839 A CN202010665839 A CN 202010665839A CN 111808834 B CN111808834 B CN 111808834B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- amylase
- signal peptide
- temperature resistant
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α‑淀粉酶的方法、重组启动子以及应用。本发明提供了一系列能高效表达耐高温α‑淀粉酶的组合启动子和信号肽，相对于对照启动子和信号肽组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α‑淀粉酶相对酶活均有一定的提高，杂合启动子与不同信号肽组合的高温α‑淀粉酶酶活力提高幅度更大，为工业化生产耐高温α‑淀粉酶奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用。
背景技术
α-淀粉酶是一种内切型淀粉酶，随机切割淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内部的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是我国目前用途最广、产量最大的工业酶制剂种类之一，同时也是淀粉工业中最为重要的水解酶之一，广泛应用于淀粉加工、纸浆制造、纺织工业、酒精酿造及饲料加工等领域。α-淀粉酶根据作用的温度不同可分为耐高温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和低温α-淀粉酶三种类型。在淀粉糖工业制备中，由于一般是在105～118℃的高温环境下进行淀粉喷射液化，所以α-淀粉酶的热稳定性对下游产业的应用极为重要，目前，产耐高温α-淀粉酶的菌株主要是芽胞杆菌属的微生物，如地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌等。
工业上生产α-淀粉酶的主要菌种有解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉，其中，芽孢杆菌是耐高温α-淀粉酶的主要生产菌株。目前，耐高温淀粉酶的生产中还普遍存在发酵酶活力较低，生产成本高等问题。将耐高温淀粉酶进行异源表达是提高耐高温淀粉酶发酵酶活力的有效方法之一。
相对于大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，枯草芽孢杆菌具有以下优点：枯草芽孢杆菌是食品级安全宿主，具有良好的外源蛋白分泌能力，成熟的发酵工艺及生产技术等。但它同时存在以下问题：枯草芽孢杆菌本身会分泌大量蛋白酶，导致外源蛋白的降解；质粒游离表达容易导致发酵后期质粒丢失，菌种发酵不稳定；启动子和信号肽的表达分泌效果不理想。
启动子是基因上游RNA聚合酶识别并结合的一段核苷酸序列，它控制基因的转录，进而调节基因的表达。用于枯草芽孢杆菌表达的启动子主要有组成型、诱导型、时期特异型和自身诱导型启动子。目前启动子的改造策略有以下几个方面：(1)从枯草芽孢杆菌或其它近缘芽孢杆菌基因组中挖掘新的优异的启动子，可以通过基因分析，根据基因功能及蛋白表达强弱，预测启动子的强弱及特点，最后通过表达模型酶进行验证。(2)对现有表达较好的启动子进行改造，对其关键区域如-10区、-16区、-35区、UP序列和核糖体结合位点(RBS)等进行理性改造，或者通过易错PCR对启动子整个序列进行改造，然后通过高通量筛选改造后酶活较高的启动子序列。(3)构建新型双启动子，根据RNA聚合酶σ因子的不同，可以通过构建所结合σ因子相同的两个启动子来强化启动子活性，也可以构建所结合σ因子不同的两个启动子来延长启动子启动时期，进而增强表达。
枯草芽孢杆菌中，有300种自身蛋白可以被分泌到细胞质膜外去执行各种生理功能。枯草芽孢杆菌中有四种类型的分泌途径：最主要的Sec分泌途径、Tat分泌途径、Com分泌途径和ABC分泌途径。大多数分泌到质膜外的蛋白都含有一段信号肽去引导这些蛋白的分泌。信号肽大都含有三个特征结构域：N端结构域、H结构域和C端结构域。根据分泌途径的不同，信号肽可以分为四种：Sec信号肽、Tat信号肽、Com信号肽和ABC信号肽。用于表达重组蛋白的信号肽通常是Sec和Tat信号肽。研究表明枯草芽孢杆菌中不同蛋白的最优信号肽不同。尽管众多研究者去寻找其中的规律，目前还没有找到所分泌蛋白和最优信号肽之间的关键联系，因此目前很难通过理性分析去获得一个重组蛋白的最优信号肽，随着基因操作技术和高通量筛选方法的成熟，建立信号肽筛选文库，然后进行高通量筛选成为筛选最优信号肽的有效方法。
发明内容
为了解决上述技术问题提出并完成了本发明。
本发明的目的是减少枯草芽孢杆菌中蛋白酶对重组耐高温α-淀粉酶的影响，提供了在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温淀粉酶的方法。
本发明的再一目的是提供在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的杂合启动子。
本发明的再一目的是提供能够高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株。
根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法包括以下步骤：
构建蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌BS-vtr，作为表达宿主；
构建包含启动子和信号肽和高温α-淀粉酶基因的重组表达载体；
将上述构建的重组表达在于转入所述蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌中，进行发酵培养，获得耐高温α-淀粉酶。
根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其中，所述启动子为选自地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子和/或来源苏云金杆菌的启动子中的一种或多种启动子。
根据本发明的具体实施方式，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示单启动子中的一种或多种。或者，所述启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19或SEQID NO.20所示的杂合启动子。
根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其中，所述信号肽为选自地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，运输蛋白信号肽，Sec分泌通道蛋白信号肽，β-葡聚糖酶信号肽，内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶信号肽，和来源地衣芽孢杆菌的几丁质酶信号肽的组中的一种或多种，
根据本发明的具体实施方式，所述信号肽序列如SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQID NO.15或SEQ ID NO.16所示信号肽的一种或多种。
因此，本发明提供了在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的高效杂合启动子，所述杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，或SEQID NO.20所示。
本发明还提供了可以高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株，所述重组菌株包含启动子和信号肽和高温淀粉酶基因的重组表达载体，其中，所述启动子为核苷酸序列如SEQID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示单启动子，或者，所述启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19或SEQID NO.20所示的杂合启动子，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，或SEQ ID NO.20所示。
根据本发明的高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株，所述重组菌株为重组枯草芽孢杆菌，即以构建的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌BS-vtr为宿主，分别组合优化了一系列的启动子和信号肽，得到高效表达高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌。
本发明提供了一系列能高效表达耐高温α-淀粉酶的组合启动子和信号肽，相对于对照启动子和信号肽组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α-淀粉酶相对酶活均有一定的提高，杂合启动子与不同信号肽组合的高温α-淀粉酶酶活力提高幅度更大，为工业化生产耐高温α-淀粉酶奠定了基础。
附图说明
图1为根据本发明的具体实施方式的表达载体Puc-VTR结构示意图；
图2为敲除整合载体Puc-Ats结构示意图。
具体实施方式
以下实施例中未做特殊说明的分子生物学实验操作均参照J.萨姆布鲁克的《分子克隆实验指南》(第三版)一书进行，或者按照所购试剂的说明书进行，所述实验材料或试剂如无特殊说明均可从商业途径获取。
根据本发明的具体实施方式，以构建好的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌BS-vtr为宿主菌，以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶为报告基因，以表达元件启动子P43+碱性蛋白酶信号肽S碱为对照组，分别组合优化启动子和信号肽。
所用启动子包括地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子P地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子P中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子P碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P枯，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P解，或来源苏云金杆菌的启动子P苏，所述启动子的序列如SEQ ID NO.1--SEQ ID NO.6所示。
所用信号肽包括地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽S地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽S中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽S碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S解，某运输蛋白信号肽S运，某Sec分泌通道蛋白信号肽S分，β-葡聚糖酶信号肽S葡，内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶信号肽S阿，或来源地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽S几，所述信号肽序列如SEQ ID NO.7--SEQ ID NO.16所示。
得到一系列优化后的启动子和信号肽组合，其分泌表达效率是对照组P43+S碱的100％-300％。
进一步，以P地、P中、P碱、P枯、P解、P苏6种不同启动子为模板，构建一批杂合启动子，进一步提高耐高温α-淀粉酶的分泌表达量，所得到杂合启动子为对照组(P43+S碱)的300％-600％。杂合启动子序列如SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20所示。
具体地，SEQ ID NO.1:P地，SEQ ID NO.2:P中，SEQ ID NO.3:P碱，SEQ ID NO.4:P枯，SEQ ID NO.5:P解，SEQ ID NO.6:P苏，SEQ ID NO.7:S地，SEQ ID NO.8:S中，SEQ ID NO.9:S碱，SEQ ID NO.10:S淀，SEQ ID NO.11:S解，SEQ ID NO.12:S运，SEQ ID NO.13:S分，SEQ ID NO.14:S葡，SEQ ID NO.15:S阿，SEQ ID NO.16:S几，SEQ ID NO.17：P1，SEQ ID NO.18：P2，SEQ IDNO.19：P3，SEQ ID NO.20：P4，SEQ ID NO.212。
根据本发明的技术方案，所述耐高温α-淀粉酶可以为来自地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，古菌Pyrococcus、热球菌；furiosus等来源的高温α-淀粉酶。
实施例1、启动子和信号肽的克隆获取及重组载体的构建
分别设计引物扩增得到相应的启动子和信号肽，其中，启动子包括：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子P地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子P中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子P碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P枯，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P解，和来源苏云金杆菌的启动子P苏，启动子的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示。得到的信号肽包括：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽S地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽S中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽S碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S解，某运输蛋白信号肽S运，某Sec分泌通道蛋白信号肽S分，β-葡聚糖酶信号肽S葡，内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶信号肽S阿，和来源地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽S几，所述信号肽序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.16所示。
本实施例中，所使用的高温α-淀粉酶基因如SEQ ID NO.21所示。
采用重叠PCR方法，将不同启动子，信号肽和来源于嗜热芽孢杆菌的高温α-淀粉酶基因amyS融合至一起后，连接至公司前期构建好的表达载体Puc-VTR框架上，得到相应的重组载体，通过电转化方式将其转化至相应的表达宿主BS-vtr，挑取转化子于LB培养基中，37℃，200rpm后测定发酵液上清中高温α-淀粉酶活力，酶活测定参照国标GB/T24401-2009进行。
根据酶活测定结果，得到有效的启动子和信号肽组合，不同组合对耐高温α-淀粉酶的表达如表1所示，由表1可知，相对于P43+S碱组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α-淀粉酶相对酶活均有一定的提高。其中P解+S碱组合相对酶活力最高为对照组的292％，其次为P中+S淀，相对酶活达269％。
表1
实施例2、杂合启动子的构建及筛选
为进一步提高耐高温α-淀粉酶的表达量，组合优化筛选了一批杂合启动子，分别以强启动子P碱、P地、P解、P枯、P中和P苏进行了不同组合，分别筛选得到了四个高表达耐高温α-淀粉酶的杂合启动子，分别命名为P1，P2，P3，P4，其中P1由P碱+P中+P解组合而成；P2由P地+P枯+P苏组合而成；P3由P地+P解+P苏组合而成；P4由P枯+P解+P碱组合而成，这4个杂合启动子序列如SEQ IDNO:17至SEQ ID NO:20所示。杂合启动子与不同信号肽组合的高温α-淀粉酶酶活力如表2所示，发酵酶活力均有一定幅度的提高。
表2：
从上述表中结果可知：
(1)通过不同启动子组合相较于对照均有较大幅度的提高，表明通过组合不同启动子进行串联表达相较于单一启动子而言可有效提高表达量；
(2)同时在相同启动子的条件下，不同的信号肽对菌体胞外分泌高温淀粉酶能力亦有显著不同，其中组合P4+S碱对高温淀粉酶的表达分泌能力最强，是对照组的588％，其次P2+S碱和P3+S分提升效果亦十分显著。
(3)同时，发现杂合启动子P1和P3分别与S碱，S淀，S几进行组合时，本实验中的高温淀粉酶的表达分泌量相较于其它组合而言，并没有显著提升。通过组合上述启动子和信号肽，与考CN201710032183.9的技术方案相比(本发明的P1为P碱+P中+P解，相当于普鲁兰酶的杂合强启动子P4；P3为P地+P解+P苏，相当于普鲁兰酶的杂合强启动子P2)，发现本申请的杂合启动子P1和P3对普鲁兰酶的分泌表达有显著提升作用，对比实验结果表明，不同组合的启动子和信号肽对不同的外源蛋白分泌表达亦有显著不同，可能与外源分泌蛋白的分子结构有关。
实施例3、耐高温α-淀粉酶整合型枯草芽孢杆菌的构建
将实施例2获得的杂合启动子和信号肽的组合、耐高温α-淀粉酶基因以及部分中温淀粉酶序列作为上下游同源臂，融合插入到构建好的敲除整合载体Puc-Ats，构建重组整合载体。由于枯草芽孢杆菌自身具有较强的同源整合效率，有研究表明一般具有200-300bp的同源区，即可使枯草芽孢杆菌发生较高效率的重组，一般随着同源臂的加长，整合效率更高，为此我们选取了整合宿主中约500bp的中温淀粉酶核酸序列作为上下游同源，部分整合序列如SEQ ID NO.22所示。采用电转化方法将上述重组整合载体转化至表达宿主BS-vtr，采用卡那霉素抗性筛选阳性转化子，接着，通过45℃培养，同时添加相应的卡那霉素抗性，使重组质粒载体的复制子失活，筛选出重组载体整合至宿主基因组上的单交换重组工程菌。
将构建好的单交换重组菌，进行无抗传代培养，连续传代12次左右，进行点板实验，将在抗性平板上不长，无抗平板上生长的转化子初步确定为已进行双交换整合的工程菌，提取初步确定整合的双交换工程菌基因组，进行PCR扩增，测序，最终确定为相应的耐高温α-淀粉酶双交换整合型菌株。
序列表
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttctttgt gcttggaagc agagcccaat attatcccga aacgataaaa cggatgctga 60
aggaaggaaa cgaagtcggc aaccattcct gggaccatcc gttattgaca aggctgtcaa 120
acgaaaaagc gtatcaggag attaacgaca cgcaagaaat gatcgaaaaa atcagcggac 180
acctgcctgt acacttgcgt cctccatacg gcgggatcaa tgattccgtc cgctcgcttt 240
ccaatctgaa ggtttcattg tgggatgttg atccggaaga ttggaagtac aaaaataagc 300
aaaagattgt caatcatgtc atgagccatg cgggagacgg aaaaatcgtc ttaatgcacg 360
atatttatgc aacgtccgca gatgctgctg aagagattat taaaaagctg aaagcaaaag 420
gctatcaatt ggtaactgta tctcagcttg aagaagtgaa gaagcagaga ggctattgaa 480
taaatgagta gaaagcgcca tatcggcgct tttcttttgg aagaaaatat agggaaaatg 540
gtacttgtta aaaattcgga atatttatac aatatcatat gtttcacatt gaaaggggag 600
aggagaatc 609
<210> 2
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaagaagg gcagagcgaa atatctctgc ccttcttttt tgggaaaata agaacgaagc 60
accacataca agtttttgta tttttgatag gatgaagaaa aatggtagat tccaaaatag 120
gaaggatgtg gtgtt 135
<210> 3
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatttcttcc tccctctcaa taattttttc attctatccc ttttctgtaa agtttatttt 60
tcagaatact tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg ataatatcca ttgttctcac 120
ggaagcacac gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag gaatttgccg ggactcagga 180
gcatttaacc taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa catttactca tgtctatttt 240
cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac ggaaatagcg agagatgata 300
tacctaaata gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccatct 360
attacaataa attcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg 420
agagggtaaa ga 432
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagagtgatt gtgataattt taaatgtaag cgttaacaaa attctccagt cttcacatcg 60
gtttgaaagg aggaagcgga agaatgaagt aagagggatt tttgactccg aagtaagtct 120
tcaaaaaatc aaataaggag tgtcaaga 148
<210> 5
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaataccttg tctgtcatca gacagggtat tttttatgct gtccagactg tccgctgtgt 60
aaaaaatagg aataaagggg ggttgttatt attttactga tatgtaaaat ataatttgta 120
taagaaaatg agagggagag gaaac 145
<210> 6
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaaacgta agatgaaacc ttagataaaa gtgctttttt tgttgcaatt gaagaattat 60
taatgttaag cttaattaaa gataatatct ttgaattgta acgcccctca aaagtaagaa 120
ctacaaaaaa agaatacgtt atatagaaat atgtttgaac cttcttcaga ttacaaatat 180
attcggacgg actctacctc aaatgcttat ctaactatag aatgacatac aagcacaacc 240
ttgaaaattt gaaaatataa ctaccaatga acttgttcat gtgaattatc gctttattta 300
attttctcaa ttcaatatat aatatgccaa tacattgtta caagtagaaa ttaagacacc 360
cttgatagcc ttactatacc taacatgatg tagtattaaa tgaatatgta aatatattta 420
tgataagaag cgacttattt ataatcatta catatttttc tattggaatg attaagattc 480
caatagaata gtgtataaat tatttatctt gaaaggaggg atgcctaaaa acgaagaaca 540
ttaaaaacat atatttgcac cgtctaatgg atttatgaaa aatcatttta tcagtttgaa 600
aattatgtat tatgaaaag 619
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60
ttgctgcctc attctgcagc agcg 84
<210> 8
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60
gtttttgtaa cacatgcctc agct 84
<210> 9
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60
gcgttcagca acatgtctgc gcaggct 87
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60
tttcatttgg ttctggca 78
<210> 11
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60
tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcc 93
<210> 12
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaaaaaga aacaagtaat gctcgcttta acagctgccg caggactggg tttgacagca 60
cttcattccg ctcccgcagc aaaagct 87
<210> 13
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgagaatac agaaaagacg aacacacgtc gaaaacattc tccgtattct tttgccccca 60
attatgatac ttagcctaat cctcccaaca ccacccattc atgcagaa 108
<210> 14
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgccttatc tgaaacgagt gttgctgctt cttgtcactg gattgtttat gagtttgttt 60
gcagtcactg ctactgcctc agct 84
<210> 15
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgaaaaaga aaaaaacatg gaaacgcttc ttacactttt cgagtgcagc tctggctgca 60
ggtttgatat tcacttctgc tgctcccgca gaggca 96
<210> 16
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgttgatca acaaaagcaa aaagtttttc gttttttctt tcatttttgt tatgatgctg 60
agcctctcat ttgtgaatgg ggaagttgca aaagcc 96
<210> 17
<211> 712
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatttcttcc tccctctcaa taattttttc attctatccc ttttctgtaa agtttatttt 60
tcagaatact tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg ataatatcca ttgttctcac 120
ggaagcacac gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag gaatttgccg ggactcagga 180
gcatttaacc taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa catttactca tgtctatttt 240
cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac ggaaatagcg agagatgata 300
tacctaaata gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccatct 360
attacaataa attcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg 420
agagggtaaa gaaaaaagaa gggcagagcg aaatatctct gcccttcttt tttgggaaaa 480
taagaacgaa gcaccacata caagtttttg tatttttgat aggatgaaga aaaatggtag 540
attccaaaat aggaaggatg tggtgttaaa taccttgtct gtcatcagac agggtatttt 600
ttatgctgtc cagactgtcc gctgtgtaaa aaataggaat aaaggggggt tgttattatt 660
ttactgatat gtaaaatata atttgtataa gaaaatgaga gggagaggaa ac 712
<210> 18
<211> 1376
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttctttgt gcttggaagc agagcccaat attatcccga aacgataaaa cggatgctga 60
aggaaggaaa cgaagtcggc aaccattcct gggaccatcc gttattgaca aggctgtcaa 120
acgaaaaagc gtatcaggag attaacgaca cgcaagaaat gatcgaaaaa atcagcggac 180
acctgcctgt acacttgcgt cctccatacg gcgggatcaa tgattccgtc cgctcgcttt 240
ccaatctgaa ggtttcattg tgggatgttg atccggaaga ttggaagtac aaaaataagc 300
aaaagattgt caatcatgtc atgagccatg cgggagacgg aaaaatcgtc ttaatgcacg 360
atatttatgc aacgtccgca gatgctgctg aagagattat taaaaagctg aaagcaaaag 420
gctatcaatt ggtaactgta tctcagcttg aagaagtgaa gaagcagaga ggctattgaa 480
taaatgagta gaaagcgcca tatcggcgct tttcttttgg aagaaaatat agggaaaatg 540
gtacttgtta aaaattcgga atatttatac aatatcatat gtttcacatt gaaaggggag 600
aggagaatct agagtgattg tgataatttt aaatgtaagc gttaacaaaa ttctccagtc 660
ttcacatcgg tttgaaagga ggaagcggaa gaatgaagta agagggattt ttgactccga 720
agtaagtctt caaaaaatca aataaggagt gtcaagatcg aaacgtaaga tgaaacctta 780
gataaaagtg ctttttttgt tgcaattgaa gaattattaa tgttaagctt aattaaagat 840
aatatctttg aattgtaacg cccctcaaaa gtaagaacta caaaaaaaga atacgttata 900
tagaaatatg tttgaacctt cttcagatta caaatatatt cggacggact ctacctcaaa 960
tgcttatcta actatagaat gacatacaag cacaaccttg aaaatttgaa aatataacta 1020
ccaatgaact tgttcatgtg aattatcgct ttatttaatt ttctcaattc aatatataat 1080
atgccaatac attgttacaa gtagaaatta agacaccctt gatagcctta ctatacctaa 1140
catgatgtag tattaaatga atatgtaaat atatttatga taagaagcga cttatttata 1200
atcattacat atttttctat tggaatgatt aagattccaa tagaatagtg tataaattat 1260
ttatcttgaa aggagggatg cctaaaaacg aagaacatta aaaacatata tttgcaccgt 1320
ctaatggatt tatgaaaaat cattttatca gtttgaaaat tatgtattat gaaaag 1376
<210> 19
<211> 1373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccttctttgt gcttggaagc agagcccaat attatcccga aacgataaaa cggatgctga 60
aggaaggaaa cgaagtcggc aaccattcct gggaccatcc gttattgaca aggctgtcaa 120
acgaaaaagc gtatcaggag attaacgaca cgcaagaaat gatcgaaaaa atcagcggac 180
acctgcctgt acacttgcgt cctccatacg gcgggatcaa tgattccgtc cgctcgcttt 240
ccaatctgaa ggtttcattg tgggatgttg atccggaaga ttggaagtac aaaaataagc 300
aaaagattgt caatcatgtc atgagccatg cgggagacgg aaaaatcgtc ttaatgcacg 360
atatttatgc aacgtccgca gatgctgctg aagagattat taaaaagctg aaagcaaaag 420
gctatcaatt ggtaactgta tctcagcttg aagaagtgaa gaagcagaga ggctattgaa 480
taaatgagta gaaagcgcca tatcggcgct tttcttttgg aagaaaatat agggaaaatg 540
gtacttgtta aaaattcgga atatttatac aatatcatat gtttcacatt gaaaggggag 600
aggagaatca aataccttgt ctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg tccagactgt 660
ccgctgtgta aaaaatagga ataaaggggg gttgttatta ttttactgat atgtaaaata 720
taatttgtat aagaaaatga gagggagagg aaactcgaaa cgtaagatga aaccttagat 780
aaaagtgctt tttttgttgc aattgaagaa ttattaatgt taagcttaat taaagataat 840
atctttgaat tgtaacgccc ctcaaaagta agaactacaa aaaaagaata cgttatatag 900
aaatatgttt gaaccttctt cagattacaa atatattcgg acggactcta cctcaaatgc 960
ttatctaact atagaatgac atacaagcac aaccttgaaa atttgaaaat ataactacca 1020
atgaacttgt tcatgtgaat tatcgcttta tttaattttc tcaattcaat atataatatg 1080
ccaatacatt gttacaagta gaaattaaga cacccttgat agccttacta tacctaacat 1140
gatgtagtat taaatgaata tgtaaatata tttatgataa gaagcgactt atttataatc 1200
attacatatt tttctattgg aatgattaag attccaatag aatagtgtat aaattattta 1260
tcttgaaagg agggatgcct aaaaacgaag aacattaaaa acatatattt gcaccgtcta 1320
atggatttat gaaaaatcat tttatcagtt tgaaaattat gtattatgaa aag 1373
<210> 20
<211> 725
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagagtgatt gtgataattt taaatgtaag cgttaacaaa attctccagt cttcacatcg 60
gtttgaaagg aggaagcgga agaatgaagt aagagggatt tttgactccg aagtaagtct 120
tcaaaaaatc aaataaggag tgtcaagaaa ataccttgtc tgtcatcaga cagggtattt 180
tttatgctgt ccagactgtc cgctgtgtaa aaaataggaa taaagggggg ttgttattat 240
tttactgata tgtaaaatat aatttgtata agaaaatgag agggagagga aactatttct 300
tcctccctct caataatttt ttcattctat cccttttctg taaagtttat ttttcagaat 360
acttttatca tcatgctttg aaaaaatatc acgataatat ccattgttct cacggaagca 420
cacgcaggtc atttgaacga attttttcga caggaatttg ccgggactca ggagcattta 480
acctaaaaaa gcatgacatt tcagcataat gaacatttac tcatgtctat tttcgttctt 540
ttctgtatga aaatagttat ttcgagtctc tacggaaata gcgagagatg atatacctaa 600
atagagataa aatcatctca aaaaaatggg tctactaaaa tattattcca tctattacaa 660
taaattcaca gaatagtctt ttaagtaagt ctactctgaa tttttttaaa aggagagggt 720
aaaga 725
<210> 21
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccgcaccgt ttaacggcac catgatgcag tattttgaat ggtacttgcc ggatgatggc 60
acgttatgga ccaaagtggc caatgaagcc aacaacttat ccagccttgg catcaccgct 120
ctttggctgc cgcccgctta caaaggaaca agccgcagcg acgtagggta cggagtatac 180
gacttgtatg acctcggcga attcaatcaa aaagggaccg tccgcacaaa atatggaaca 240
aaagctcaat atcttcaagc cattcaagcc gcccacgccg ctggaatgca agtgtacgcc 300
gatgtcgtgt tcgaccataa aggcggcgct gacggcacgg aatgggtgga cgccgtcgaa 360
gtcaatccgt ccgaccgcaa ccaagaaatc tcgggcacct atcaaatcca agcatggacg 420
aaatttgatt ttcccgggcg gggcaacacc tactccagct ttaagtggcg ctggtaccat 480
tttgacggcg ttgattggga cgaaagccga aaattaagcc gcatttacaa attccgcggc 540
atcggcaaag cgtgggattg ggaagtagac acagaaaacg gaaactatga ctacttaatg 600
tatgccgacc ttgatatgga tcatcccgaa gtcgtgaccg agctgaaaaa ctgggggaaa 660
tggtatgtca acacaacgaa cattgatggg ttccggcttg atgccgtcaa gcatattaag 720
ttcagttttt ttcctgattg gttgtcgtat gtgcgttctc agactggcaa gccgctattt 780
accgtcgggg aatattggag ctatgacatc aacaagttgc acaattacat tacgaaaaca 840
aacggaacga tgtctttgtt tgatgccccg ttacacaaca aattttatac cgcttccaaa 900
tcagggggcg catttgatat gcgcacgtta atgaccaata ctctcatgaa agatcaaccg 960
acattggccg tcaccttcgt tgataatcat gacaccgaac ccggccaagc gctgcagtca 1020
tggtgcgacc catggttcaa accgttggct tacgccttta ttctaactcg gcaggaagga 1080
tacccgtgcg tcttttatgg tgactattat ggcattccac aatataacat tccttcgctg 1140
aaaagcaaaa tcgatccgct cctcatcgcg cgcagggatt atgcttacgg aacgcaacat 1200
gattatcttg atcactccga catcatcggg tggacaaggg aaggggtcac tgaaaaacca 1260
ggatccgggc tggccgcact gatcaccgat gggccgggag gaagcaaatg gatgtacgtt 1320
ggcaaacaac acgctggaaa agtgttctat gaccttaccg gcaaccggag tgacaccgtc 1380
accatcaaca gtgatggatg gggggaattc aaagtcaatg gcggttcggt ttcggtttgg 1440
gttcctagaa aaacgaccgt ttctaccatc gctcggccga tcacaacccg accgtggact 1500
ggtgaattcg tccgttggac cgaaccacgg ttggtggcat ggccttga 1548
<210> 22
<211> 578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacttttgcg ttggttgtat ccgtgtccgc aggcagcgtc agcgtgtaaa ttccgtctgc 60
atttttagtc attggttttc caggccaaga tccggtcaat tcaattactc ggctcccatc 120
aagtttatag atataagcat ttacctggct cccatgattc ggattttgat agccgatggt 180
tttggccgac gctggatctc ttttaacaaa actgtatttc tcggtcctcg ttacaccatc 240
actgttcgtt ccttttaaca tgatggtgta tgttttgcca aatggatctc cttttccgat 300
tgggaattga tctccatcct taaacgccgt ctctggtcca ttattgattt gataaacggc 360
ttttgttgta ttcgcatctg cacgcaaggt aatcgtcagt tgatcattga aagaatgtgt 420
tacacctgtt ttgtaattct caaggaaaac atgaggcgct tttgcaatat catcaggata 480
aagcacagct acagacctgg cattgatcgt gcctgtcagt ttaccatcgt tcacttgggt 540
accgagctcg aattcgataa gcttctaggc atgcgtcc 578
Claims (2)
1.在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌Bs-vtr作为表达宿主；
构建包含启动子、信号肽和耐高温α-淀粉酶基因的重组表达载体；
将上述构建的重组表达载体转入所述碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌Bs-vtr中，进行发酵培养，获得耐高温α-淀粉酶，所述耐高温α-淀粉酶基因如SEQ ID NO.21所示，
其中，所述启动子和所述信号肽选自以下组合：
所述启动子序列SEQ ID NO：17与所述信号肽序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQID NO .14的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：18与所述信号肽序列SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .12、SEQ ID NO .13、SEQ ID NO .14、SEQ ID NO .15或SEQ ID NO .16的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：19与所述信号肽序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO .14或SEQ ID NO .15的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：20与所述信号肽序列SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .12、SEQ ID NO .13、SEQ ID NO .14、SEQ ID NO .15或SEQ ID NO .16的组合。
2.高效表达耐高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失，并且包含耐高温α-淀粉酶基因以及适于耐高温α-淀粉酶基因表达的启动子和信号肽，所述耐高温α-淀粉酶基因如SEQ ID NO.21所示，
其中，所述启动子和所述信号肽选自以下组合：
所述启动子序列SEQ ID NO：17与所述信号肽序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQID NO .14的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：18与所述信号肽序列SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .12、SEQ ID NO .13、SEQ ID NO .14、SEQ ID NO .15或SEQ ID NO .16的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：19与所述信号肽序列SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO .14或SEQ ID NO .15的组合；
或，所述启动子序列SEQ ID NO：20与所述信号肽序列SEQ ID NO .9、SEQ ID NO .10、SEQ ID NO .12、SEQ ID NO .13、SEQ ID NO .14、SEQ ID NO .15或SEQ ID NO .16的组合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010665839.2A CN111808834B (zh) | 2020-07-12 | 2020-07-12 | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010665839.2A CN111808834B (zh) | 2020-07-12 | 2020-07-12 | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111808834A CN111808834A (zh) | 2020-10-23 |
| CN111808834B true CN111808834B (zh) | 2023-08-04 |
Family
ID=72843296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010665839.2A Active CN111808834B (zh) | 2020-07-12 | 2020-07-12 | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111808834B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113584057B (zh) * | 2021-07-26 | 2023-08-15 | 天津大学 | Iccg表达元件及表达载体、枯草芽孢杆菌重组菌株和降解pet或其单体的方法 |
| CN113957071B (zh) * | 2021-09-30 | 2023-07-18 | 华南理工大学 | 一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合dna片段及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992003561A1 (en) * | 1990-08-13 | 1992-03-05 | Alko Ltd. | HYBRID α-AMYLASE PROMOTERS |
| WO2014202782A1 (en) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having amylase activity and polynucleotides encoding same |
| CN104480087A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-01 | 天津科技大学 | 一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用 |
| CN105695435A (zh) * | 2014-11-28 | 2016-06-22 | 华东理工大学 | 一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用 |
| CN106754833A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-05-31 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌 |
| CN109837294A (zh) * | 2018-12-22 | 2019-06-04 | 广州睿辰生物科技有限公司 | 重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法及应用 |
| WO2019186371A1 (en) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Chimeric amylases comprising an heterologous starch binding domain |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK179660B1 (en) * | 2016-04-08 | 2019-03-13 | Novozymes A/S | Stabilized Alpha-Amylase Variants and use of the same |
-
2020
- 2020-07-12 CN CN202010665839.2A patent/CN111808834B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992003561A1 (en) * | 1990-08-13 | 1992-03-05 | Alko Ltd. | HYBRID α-AMYLASE PROMOTERS |
| WO2014202782A1 (en) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having amylase activity and polynucleotides encoding same |
| CN105695435A (zh) * | 2014-11-28 | 2016-06-22 | 华东理工大学 | 一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用 |
| CN104480087A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-01 | 天津科技大学 | 一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用 |
| CN106754833A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-05-31 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌 |
| WO2019186371A1 (en) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Chimeric amylases comprising an heterologous starch binding domain |
| CN109837294A (zh) * | 2018-12-22 | 2019-06-04 | 广州睿辰生物科技有限公司 | 重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 通过信号肽筛选优化耐高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌;刘金岚 等;《工业微生物》;20170222;第47卷(第1期);第17-23页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111808834A (zh) | 2020-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102375732B1 (ko) | 바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 조성물 및 방법 | |
| CA2452029C (en) | A group of .alpha.-amylases and a method for identification and production of .alpha.-amylases | |
| Wachi et al. | Escherichia coli cafA gene encodes a novel RNase, designated as RNase G, involved in processing of the 5′ end of 16S rRNA | |
| WO2018129980A1 (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌 | |
| US7585674B2 (en) | Host microorganisms | |
| JPH0829091B2 (ja) | ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター | |
| CN111808834B (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 | |
| JP2019511218A (ja) | 微生物におけるタンパク質産生のための遺伝子操作されたリボソームプロモーター | |
| JP2021510070A (ja) | タンパク質の産生増加のための変異及び遺伝子改変バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、並びにその方法 | |
| CN107759675A (zh) | 一种来源于枯草芽孢杆菌可提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| JP2016165269A (ja) | セルラーゼを含まない酵素組成物及びこれを生成するための宿主細胞 | |
| DK2451954T3 (en) | Modified promoter | |
| CN103114089B (zh) | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 | |
| CN112980753B (zh) | 用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统 | |
| US20180327711A1 (en) | Fermentation Processes With Reduced Foaming | |
| EP1721976B1 (en) | Modified promoter | |
| RU2747627C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pUSB2-AmQ, обеспечивающая синтез белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, и штамм Bacillus subtilis/pUSB2-AmQ - продуцент белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens | |
| CN107857801B (zh) | 一种可用于提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| CN107698667A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| WO2008060596A2 (en) | Enhanced protein production in t. reesei by co-expression of selected genes | |
| Aminov et al. | Expression of a celE gene from Clostridium thermocellum in Bacillus | |
| CN113785056A (zh) | 改善蛋白酶表达的手段和方法 | |
| KR101498012B1 (ko) | ＨｐＧＡＳ1 유전자 파쇄 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 | |
| JP2005278644A (ja) | 改変プロモーター | |
| López-Contreras et al. | Heterologous Expression of a Cellulose-Binding Protein by Clostridium acetobutylicum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |