JP2005278644A - 改変プロモーター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列に対して、SigA及びSigEで認識されるように改変してなるプロモーターDNA;当該プロモーターDNAを含有する発現ベクター、当該発現ベクターを含む組換え微生物、当該組換え微生物を培養することを特徴とするタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【選択図】 なし
Description
ここで、配列番号1で示される塩基配列はバチルス エスピーKSM−S237株(FERM BP-7875)由来アルカリセルラーゼ遺伝子の上流に存在するものであり、配列番号2で示される塩基配列はバチルス エスピーKSM−64株(FERM BP-2886)由来アルカリセルラーゼ遺伝子の上流に存在するものであって、両者は95.6%の同一性を有している。
本発明における最も好ましいプロモーターDNAは、配列番号7で示される、配列番号1を改変した塩基配列や、配列番号8で示される、配列番号2を改変した塩基配列が挙げられる。
すなわち、枯草菌により異種タンパク質またはポリペプチドを組換え生産させる際に、当該プロモーターDNAを目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に連結することにより、該遺伝子が栄養増殖期においてSigAと会合したRNAポリメラーゼにより転写されることに加え、栄養増殖期につづく胞子形成期においてはSigEと会合したRNAポリメラーゼにより転写され、胞子形成期においても該遺伝子の転写が維持される。従って、当該プロモーターDNAを含有する発現ベクターを導入した組換え枯草菌は、SigEで認識されるプロモーター配列を新たに構築する前の天然のプロモーターを用いる場合に比べ、著量の目的タンパク質またはポリペプチドを生産することができる。
図2に示す様に、アルカリセルラーゼ遺伝子上流領域へのSigE認識プロモーター配列の導入を行なった。即ち、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)をコードするDNA断片(3.1kb)が挿入された組換えプラスミドpHY−S237を鋳型とし、表1に示した237UB1とEP1UPrのプライマーセットを用いてアルカリセルラーゼ遺伝子の上流領域0.4kb断片(A)を調製した。同様に表1に示したEP1DNfとS237RVのプライマーセットを用いてアルカリセルラーゼ遺伝子の下流領域2.7kb断片(B)を調製した。次いで、得られた(A)(B)2断片を混合して鋳型とし、表1に示した237UB1とS237RVのプライマーセットを用いたSOE−PCRを行うことによって、2断片を(A)(B)の順になる様に結合させ3.1kbのDNA断片(C)を得た。プライマーEP1UPrとEP1DNfにはそれぞれ塩基置換が施してあり、図2に示す様にDNA断片(C)ではアルカリセルラーゼ遺伝子の翻訳開始部位から約150bp上流の領域にSigE認識プロモーター(配列)が新たに構築された。得られた3.1kbのDNA断片(C)をシャトルベクターpHY300PLKのSmaI制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドpHY−S237EP1を構築した。また組換えプラスミドpHY−S237を鋳型として、表1に示した237UB1とS237RVのプライマーセットを用いてアルカリセルラーゼ遺伝子全領域を含む3.1kb断片(D)を調製し、これをシャトルベクターpHY300PLKのSmaI制限酵素切断点に挿入して、組換えプラスミドpHY−S237Wを構築した。
実施例1にて得られた組換えプラスミドpHY−S237EP1、及び対照として組換えプラスミドpHY−S237Wを、プロトプラスト形質転換法によって枯草菌168株に導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表2に示した様に、組換えプラスミドとしてpHY−S237EP1を用いた場合、対照のpHY−S237W(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。このことから、pHY−S237EP1を用いた場合には、SigAで認識されるプロモーターからの転写に加え、新たに構築されたSigEで認識されるプロモーターからの転写が行なわれことにより、セルラーゼ分泌生産性が向上したものと推測された。
実施例1にて構築したプラスミドpHY−S237EP1を鋳型として、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、SigE認識プロモーター(配列)を導入したアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片(E)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表3に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するアルカリアミラーゼ(Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001))をコードする1.5kbのDNA断片(F)を増幅した。次いで、得られた(E)(F)の2断片を混合して鋳型とし、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、SigE認識プロモーター(配列)を導入したアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域とそれにつづく分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片(G)を得た。得られた2.2kbのDNA断片(G)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドpHY−K38(S237ps)EP1を構築した。また上記0.6kbのDNA断片(E)の増幅に用いた鋳型を実施例1にて構築したプラスミドpHY−S237Wに代えることにより、同様に組換えプラスミドpHY−K38(S237ps)Wを構築した。
組換えプラスミドpHY−K38(S237ps)EP1、及び対照としてpHY−K38(S237ps)Wを、プロトプラスト形質転換法によって枯草菌168株に導入した。これによって得られた菌株を実施例2と同様の条件で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表4に示した様に、組換えプラスミドとしてpHY−K38(S237ps)EP1を用いた場合、対照のpHY−K38(S237ps)W(野生型)の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。このことから、SigE認識プロモーター(配列)を導入したアルカリセルラーゼ遺伝子上流領域が種々のタンパク質又はポリペプチド生産において有効であることが示された。
Claims (15)
- SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列に対して、SigA及びSigEで認識されるように改変してなるプロモーターDNA。
- SigEで認識されるコンセンサス配列を構築することによって改変したものである請求項1のプロモーターDNA。
- SigEで認識されるコンセンサス配列が、ATAHTT(HはA又はC又はT)で表される-35領域と、その13若しくは14塩基後ろにつながるCATAYAHT(YはC又はT)で表される-10領域からなる塩基配列である請求項2のプロモーターDNA。
- SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列の塩基番号92〜552の塩基配列、配列番号2で示される塩基配列の塩基番号133〜589の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列に対して80%以上の同一性を有する塩基配列であってSigAのコンセンサス配列を有するもの及び/又は同一のプロモーター機能を有するものを含むものである請求項1〜3のいずれか1項記載のプロモーターDNA。
- SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列、配列番号2で示される塩基配列、又は当該塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列であってSigAのコンセンサス配列を有するもの及び/又は同一のプロモーター機能を有するものである請求項1〜3のいずれかに記載のプロモーターDNA。
- SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列が610bp以下のサイズである請求項4または5記載のプロモーターDNA。
- 請求項1〜6いずれかに記載のプロモーターDNAを2つ以上連結したプロモーターDNA。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載のプロモーターDNAを含有する発現ベクター。
- 請求項8記載の発現ベクターを含む組換え微生物。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載のプロモーターDNAをゲノム上に導入した組み換え微生物。
- 請求項9または10記載の組換え微生物を培養することを特徴とするタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- タンパク質がセルラーゼ又はアミラーゼである請求項11に記載の製造方法。
- セルラーゼが配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有し、かつアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質である請求項12に記載の製造方法。
- アミラーゼが配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有し、かつアルカリアミラーゼ活性を有するタンパク質である請求項12に記載の製造方法。
- SigAで認識されるプロモーター及びその近傍の塩基を含む塩基配列に対して、SigA及びSigEで認識されるように改変することを特徴とするプロモーターDNAの構築方法。
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