CN113957071B - 一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合dna片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用，属于基因工程技术领域。本发明采用双启动子双信号肽Pcd‑P43‑SamyQ‑SBsGGT表达系统在枯草芽孢杆菌中合成γ‑谷氨酰胺转肽酶，其效果显著较双启动子单信号肽Pcd‑P43‑SamyQ表达系统的单位酶活力提高至161.45％，而Pcd‑P43‑SBsGGT‑SamyQ表达效果微弱。不需要添加诱导剂进行蛋白的诱导表达，为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件；不仅能够简化生产工艺流程，降低生产成本，同时能使制备的蛋白酶产品达到符合食品安全级别酶制剂的要求。

Description

一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及 其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用，特别涉及一种不同芽孢杆菌来源的启动子重组的双启动子和信号肽重组的双信号肽片段Pcd-P43-SamyQ-SBsggt及其在制备丝氨酸蛋白酶(SplB)或谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ-GT)中的应用。
背景技术
酶制剂是一种具有专一性、高催化活性的生物催化剂，不仅在在生物研究技术领域用途十分广泛，在食品、药品、护肤品等工业生产方面也深受偏爱。在传统生产方法中，人们经常采用从动物和植物的组织中分离提取获得酶，而目前通过微生物发酵的方式，由于其具有微生物种类多、繁殖快的特点，且产生的酶特异性强、pH适应性较广、稳定性较强、能胞外分泌，因此适合在工业中大量生产应用。此外，微生物产酶不受季节波动的限制，可在廉价的培养基上有规律的生长，因此与传统方法相比其生产过程更稳定，生产成本也更低，在工程菌株内表达异源蛋白逐渐成为发酵行业生产的热门途径。
枯草芽孢杆菌作为宿主，在人类食品酶的生产中有着悠久且安全的工业应用历史，被广泛认为是在许多食品中发现的一种无害污染物，不是人类病原体，也不产毒素。而一部分酶的来源微生物如金黄色葡萄球菌是一种能引起临床感染的常见致病菌，可导致皮肤和软组织感染和危及生命的侵袭性病理，如肺炎、骨髓炎、关节炎、心内膜炎和脓毒症等。枯草芽孢杆菌生产菌株是表达生产异源蛋白酶的安全菌株，使用基因编辑技术可使编码致病菌的酶的基因在枯草芽孢杆菌宿主内表达，满足安全生产要求。
当前工业应用上对蛋白的需求量日益增加，因此，研究如何通过改造载体上的关键元件——启动子和信号肽功能对于实现异源蛋白的高效表达具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有双重启动子功能的DNA片段。
本发明的另一目的在于提供一种具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段。
本发明的另一目的在于提供一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段。
本发明的再一目的在于提供上述DNA片段的应用。
本发明针对现有异源蛋白高表达的需求，提供一种双启动子表达系统，利用来源于枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和解淀粉芽孢杆菌强启动子Pcd进行融合得到双启动子Pcd-P43的转录表达系统；提供一种双信号肽表达系统，利用来源于枯草芽孢杆菌淀粉酶信号肽SamyQ和GGT信号肽SBsGGT进行融合得到双信号肽SamyQ-SBsGGT的转录表达系统；还提供一种双启动子双信号肽表达系统，将上述双启动子Pcd-P43的转录表达系统与双信号肽SamyQ-SBsGGT的转录表达系统连接得到。
本发明还提供具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在质粒构建及其在异源金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B(SplB)及谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ-GT)表达中的应用，能实现外源基因的高表达，为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种不同芽孢杆菌来源的启动子重组的具有双重启动子功能的DNA片段，优选强启动子如解淀粉芽孢杆菌的启动子Pcd与枯草芽孢杆菌的启动子P43，所述DNA片段为如下任一序列：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补序列；
(b)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或其互补序列。
所述的具有双重启动子功能的DNA片段在蛋白表达中的应用。
一种具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段，优选枯草芽孢杆菌来源的淀粉酶amyQ信号肽(SamyQ)和谷氨酰胺转肽酶GGT信号肽组成双信号肽SamyQ-SBsGGT，所述氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；
所述DNA片段为如下任一序列：
(a)编码如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；
(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；
(c)对如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或其互补序列。
所述具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段在蛋白表达中的应用。
一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段，包括所述的具有双重启动子功能的DNA片段以及具有双重分泌信号功能的DNA片段(Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT)。
所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在蛋白表达中的应用。
一种双启动子通用载体，包含上述具有双重启动子功能的DNA片段的序列。
一种双启动子表达质粒，包含所述的包含上述具有双重启动子功能的DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
一种双启动子双信号肽通用载体，包含上述具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列；
一种双启动子双信号肽表达质粒，包含所述的包含上述具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
所述的异源蛋白质核苷酸序列为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)编码的丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的核苷酸序列，或为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编码的谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ-GT)的核苷酸序列。
所述丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
编码的丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中的1-612bp所示。
所述谷氨酰胺转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
编码的谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ-GT)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一种重组工程细胞，为上述的载体或质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞株。
所述的宿主细胞为芽孢杆菌。
所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌；进一步为枯草芽孢杆菌ATCC6051。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用双启动子Pcd-P43表达系统在枯草芽孢杆菌中合成金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B(SplB)，其效果显著优于单启动子P43表达的效果，单位酶活力提高至134.93％，而双启动子P43-Pcd表达系统无表达效果。双启动子Pcd-P43表达系统为异源蛋白在工业大规模生产的应用提供了一种高表达的启动子工具。
(2)本发明采用双启动子双信号肽Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT表达系统在枯草芽孢杆菌中合成γ-谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ-GT)，其效果显著较双启动子单信号肽Pcd-P43-SamyQ表达系统的单位酶活力提高至161.45％，而Pcd-P43-SBsGGT-SamyQ表达效果微弱。为提高异源蛋白的分泌效率提供了一种高效的双信号肽表达系统。
(3)本发明采用的双启动子双信号肽表达系统由组成型启动子及pBE载体构成，不需要添加诱导剂进行蛋白的诱导表达，不仅能够简化生产工艺流程，降低生产成本，同时能使制备的蛋白酶产品达到符合食品安全级别酶制剂的要求。
(4)SplB蛋白在金黄色葡萄球菌中的表达量不高，且该菌株为致病菌，难以在生产上大规模应用。本发明使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主，不仅具有非致病性，且表达系统较稳定。在目的基因前添加枯草芽孢杆菌源信号肽后，能够达到分泌外源蛋白的目的。
(5)本发明采用的双信号肽SamyQ-SBsGGT，在枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主中，能够充分利用宿主的蛋白分泌途径，使蛋白质加工转运更加高效。
附图说明
图1是实施例1中扩增SamyQ的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为SamyQ扩增产物。
图2是实施例1中扩增SplB+Fc+Ter的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为SplB+Fc+Ter扩增产物。
图3是实施例1中扩增Pcd、P43、pBE载体、SamyQ+SplB+Fc+Ter的PCR产物电泳图；其中，泳道M1和M2为DNA marker，泳道1为Pcd的PCR扩增产物，泳道2为P43的PCR扩增产物，泳道3为pBE载体的PCR扩增产物，泳道4为SamyQ+SplB+Fc+Ter的PCR扩增产物。方框内为对应产物条带。
图4是实施例1中扩增Pcd+P43片段电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为Pcd+P43扩增产物。
图5是实施例1表达质粒pBE-P43-SamyQ-SplB-Fc的示意图。
图6是实施例1表达质粒pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc的示意图。
图7是实施例1中扩增电泳图，其中，泳道M为DNA marker，从左至右的泳道1分别为SamyQ-SplB-Fc-Ter载体、P43、Pcd和P43+Pcd的扩增产物。
图8是实施例1表达质粒pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc的示意图。
图9是实施例1及实施例2酶活计算对硝基苯胺浓度标准曲线图。
图10是实施例1对比所述单启动子P43和双启动子Pcd-P43、双启动子P43-Pcd不同重组工程菌发酵27h后的SplB合成酶的酶活力柱状图；其中，P43-SplB-Fc指单启动子重组枯草芽孢杆菌，Pcd-P43-SplB-Fc、P43-Pcd-SplB-Fc指双启动子重组枯草芽孢杆菌。
图11是实施例1B.subtilis ATCC6051(pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc)转化子表达的SDS-PAGE电泳胶图；其中，泳道1和2均为枯草芽孢杆菌B.subtilis ATCC6051(pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc)胞外分泌蛋白，泳道3为B.subtilis ATCC6051野生型胞外分泌蛋白，泳道M为蛋白marker26616，箭头表示目的蛋白SplB的位置。
图12是实施例2中扩增pBE-Pcd-P43通用载体片段的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为PCR扩增产物。
图13是实施例2表达质粒pBE-Pcd-P43通用载体的示意图。
图14是实施例2中扩增SBsGGT+BsGGT和SamyQ的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为SBsGGT+BsGGT的PCR扩增产物，泳道2为SamyQ的PCR扩增产物。
图15是实施例2中表达质粒pBE-Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT-BsGGT的构建过程示意图。
图16是实施例2中扩增pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT片段的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为PCR扩增产物。
图17是实施例2中表达质粒pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT的示意图。
图18是实施例2中pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT质粒酶切产物及SBsGGT片段的PCR产物电泳图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT质粒酶切产物，泳道2为SBsGGT的扩增产物。
图19是实施例2中表达质粒pBEPcd-P43-SBsGGT-SamyQ-BsGGT的示意图。
图20是实施例2对比所述单信号肽Pcd-P43-SamyQ和双信号肽Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT、Pcd-P43-SBsGGT-SamyQ不同重组工程菌发酵27h后的BsGGT合成酶的酶活力柱状图；其中，SamyQ-BsGGT指单信号肽重组枯草芽孢杆菌，SamyQ-SBsGGT-BsGGT和SBsGGT-SamyQ-BsGGT指双信号肽重组枯草芽孢杆菌。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,JanssenK,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。
实施例1
双启动子在SplB酶中的应用
(1)细菌的培养及基因组提取：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensXH7：CP002927)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购于广东省微生物菌种保藏中心)分别从-80℃甘油管取出划线于LB固体平板上37℃培养14～16h，挑取单菌落于10mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h，按照试剂盒说明书步骤提取细菌基因组。
(2)基因片段PCR扩增：以菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensXH7)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的基因组DNA、SplB+Fc+Ter(中间带有Link连接片段，由金斯瑞基因公司合成)及pBE2-R大肠枯草芽孢杆菌穿梭载体为模板，引物分别进行扩增DNA片段，使其带有与相连片段约20bp的同源片段。SamyQ为93bp(见图1，具体序列见SEQ ID NO.3中的1-93bp)，SplB+Fc+Ter为1377bp(见图2，具体序列见SEQ ID NO.5)，pBE载体为5616bp(见图3泳道3)，与目的产物大小相符，对于有杂带的PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，其余柱回收。
所述引物序列如下：(下划线部分为与连接片段的重叠部分)
SamyQ-F1：5’-GGAATGTACACATGATTCAAAAACGAAAGCGGACA-3’；
SamyQ-R1：5’-CATTATTTTCTGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAG-3’；
SplB+Fc+Ter-F：5’-AACATCAGCAGAAAATAATGTTACGAAAGTTAAAGAT-3’；
SplB+Fc+Ter-R：5’-CCTCTGACACATTGAAAAACAAAACCTTGAAGAATGC-3’；
pBE载体-F：5’-GTTTTGTTTTTCAATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTC-3’；
pBE载体-R：5’-GATGAGTAAACGAATTCCTTAAGGAACGTACAGAC-3’；
以SamyQ和SplB+Fc+Ter回收后的产物为模板，以引物SamyQ-F1和SplB+Fc+Ter-R进行重叠PCR，获得SamyQ+SplB+Fc+Ter片段，大小为1470bp(见图3泳道4)。
(3)SplB单启动子pBE-P43-SamyQ-SplB-Fc表达载体的构建：用如下引物：
P43-F1：5’-CCTTAAGGAATTCGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGC-3’；
P43-R：5’-CGTTTTTGAATCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTAT-3’；
扩增P43(148bp，具体序列见SEQ ID NO.1中的136-283bp)见图3泳道2，回收PCR产物。用In-fusion方法(具体操作方法见NEBuilder公司的Hi Fi DNA Assembly MasterMix)将P43，SamyQ+SplB+Fc+Ter，pBE载体三个片段进行连接，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取得到pBE-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒(见图5)。
(4)SplB双启动子pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc表达载体的构建：用如下引物：
Pcd-F：5’-CCTTAAGGAATTCGTTTACTCATCTTCTTGCCGAAAAT-3’；
Pcd-R：5’-CAAAAAAATAAGTAAACCACCTTTATCCTGTATGATACCGC-3’；
P43-F2：5’-GATAAAGGTGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGC-3’；
P43-R：5’-CGTTTTTGAATCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTAT-3’；
分别扩增Pcd(去掉RBS位点，135bp)，P43(148bp)，见图3泳道1、2，回收PCR产物。将Pcd(去掉RBS位点)和P43用引物Pcd-F和P43-R进行重叠PCR得到Pcd+P43(283bp，具体序列见SEQ ID NO.1)，见图4，回收PCR产物。
用In-fusion方法将Pcd+P43，SamyQ+SplB+Fc+Ter，pBE载体三个片段进行连接，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取得到pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒(见图6)。
(5)SplB双启动子pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc表达载体的构建：以pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒为模板，用如下引物：(下划线部分为与连接片段的重叠部分)
载体无尾-R：5’-GAATTCCTTAAGGAACGTACAGAC-3’；
P43-载体-F：5’-GTACGTTCCTTAAGGAATTCGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGC-3’；
P43-Pcd-R：5’-CGGCAAGAAGATGAGTAAACCTATAATGGTACCGCTATCACTTT-3’；
Pcd无尾-F：5’-GTTTACTCATCTTCTTGCCGAAAAT-3’；
Pcd-载体-R：5’-CGCTTTCGTTTTTGAATCATGTGTACTTATTCCTCTCTTACCTTT-3’；
SamyQ无尾-F：5’-ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACA-3’；
分别扩增SamyQ-SplB-Fc-Ter载体(7086bp)，P43(去掉RBS位点，129bp，具体序列见SEQ ID NO.2中的1-129bp)，Pcd(154bp，具体序列见SEQ ID NO.2中的130-283bp)，回收PCR产物。将P43(去掉RBS位点)和Pcd用引物P43-载体-F和Pcd-载体-R进行重叠PCR得到P43+Pcd(283bp，具体序列见SEQ ID NO.2)，见图7，回收PCR产物。
用In-fusion方法将P43+Pcd，SamyQ-SplB-Fc-Ter-载体两个片段进行连接，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取得到pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc质粒(见图8)。
(6)SplB质粒的表达：将pBE-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒、pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒和pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc质粒分别用电转化法(2500V，4.2-5.6ms)将质粒转入枯草芽孢杆菌ATCC6051感受态细胞中，经含卡那霉素的LB固体平板筛选，制得单启动子重组枯草芽孢杆菌、或者双启动子重组枯草芽孢杆菌。
挑取单启动子重组枯草芽孢杆菌、或者双启动子重组枯草芽孢杆菌单菌落至3mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220rpm发酵27h。
(7)SplB酶活测定按如下方法进行：
发酵液10000rpm离心2min取上清液，获得粗酶液。设计底物：Trp-Glu-Leu-Gln-pNA(WELQ-pNA)，由南京肽业生物科技有限公司合成。
a)取四个EP管，每管加入200μL粗酶液，分别为实验组三管和对照组一管，对照组加入100μL 50％乙酸溶液使SplB酶失活。
b)实验组与对照组均在40℃水浴保温5min，实验组加入750μL Tris-HCl(100mM，PH8.0)后，再在实验组与对照组中分别加入50μL 10mM的WELQ-pNA溶液，吹吸混匀。
c)将实验组与对照组皆置于40℃水浴反应30min(时间可变)，取出反应液，在实验组中加入100μL 50％乙酸溶液，终止反应。
d)反应液10000rpm离心2min吸取200μL上清液于酶标板，每个反应测三组，用酶标仪测405nm下的吸光值。
活力单位(U)定义为每分钟水解底物WELQ-PNA产生1μg对硝基苯胺所需的酶量，即1个酶活单位。
酶活计算方法如下：
其中，A——实验组与对照组平均吸光值差对应标准曲线(见图9)计算得到的对硝基苯胺浓度；
138.12——对硝基苯胺的相对分子质量；
N——发酵液稀释的倍数；
1100/200——反应总体系对酶液的稀释倍数(即对应每1mL的粗酶液)；
T——反应时间，min。
经测定，重组枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高SplB酶活见图10。结果表明启动子P43、Pcd-P43和P43-Pcd启动丝氨酸类蛋白酶B表达最高酶活分别为2.72U/mL、3.67U/mL和0U/mL，且在载体构建过程中P43-Pcd顺序的双启动子总是会出现有100bp～200bp的外来片段随意插在启动子前、后、中间，或信号肽中间的现象。说明P43-Pcd顺序的双启动子不可行，而顺序为Pcd-P43的启动的效果增加至134.93％，优势显著。
(8)SDS-PAGE：将27h发酵液离心取上清，上清液跑SDS-PAGE电泳，与野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis ATCC6051作为对照，蛋白胶图显示在55～40KDa有条带和SplB-Fc蛋白大小一致，而野生型对照在此大小范围内无条带，实验结果说明SplB-Fc蛋白酶得到表达(见图11)。
实施例2
双启动子双信号肽在BsGGT酶中的应用
(1)从实施例1构建的pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒中去除SamyQ+SplB+Fc部分，以pBEPcd-P43-SamyQ-SplB-Fc质粒为模板，用引物F和R进行PCR扩增5927bp大小的基因片段(见图12)，同时引入BamHⅠ酶切位点，与目的产物大小相符，将PCR产物进行回收。
所述引物序列如下：
F：5’-GGATCCAGCCCGGGGTCGACCACCGGGCAAATAGTCTAGAAAC-3’；
R：5’-GTCGACCCCGGGCTGGATCCATTCCTCTCTTACCTATAATGGTAC-3’；
(2)双启动子通用载体的构建：用In-fusion方法将片段进行自连，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取质粒得到pBE-Pcd-P43通用载体(见图13)。
(3)双启动子双信号肽pBE-Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT-BsGGT质粒的构建：以菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的基因组DNA为模板，引物分别扩增SamyQ、BsGGT和SBsGGT+BsGGT DNA片段，使其带有与相连片段约20bp的同源片段。SBsGGT+BsGGT为1764bp(其中，SBsGGT为84bp，具体序列见SEQ ID NO.3中的94-177bp；BsGGT的序列见SEQ IDNO.8)，SamyQ为93bp(见图14)，与目的产物大小相符，对PCR产物进行回收。
所述引物序列如下：(下划线部分为与连接片段的重叠部分)
SamyQ-F2：5’-GGTAAGAGAGGAATGGATCCATGATTCAAAAACGAAAGCGGAC-3’；
SamyQ-R2：5’-TTCTTTTCATTGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAG-3’；
SBsGGT+BsGGT-F：5’-AACATCAGCAATGAAAAGAACGTGGAACGTCTGT-3’；
SBsGGT+BsGGT-R：5’-CGGTGGTCGACCCCGGGCTGTTATTTACGTTTTAAATTAATGCCGAT-3’；
(4)用BamHⅠ快切酶对pBE-Pcd-P43通用载体进行酶切，用In-fusion方法将酶切回收后的载体片段与SamyQ和SBsGGT+BsGGT进行连接，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取质粒得到pBE-Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT-BsGGT质粒(构建过程示意图见图15)。
(5)双启动子单信号肽pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT质粒的构建：以pBE-Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT-BsGGT质粒为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增7742bp大小的基因片段(见图16)，与目的产物大小相符，将PCR产物进行回收。
所述引物序列如下：
F2：5’-AACATCAGCAAAAAAACCGCCCAAAAGCTACGAT-3’；
R2：5’-GCGGTTTTTTTGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAG-3’；
用In-fusion方法将片段进行自连，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取得到pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT质粒(见图17)。
(6)双启动子双信号肽pBE-Pcd-P43-SBsGGT-SamyQ-BsGGT质粒的构建：用如下引物：
SBsGGT-F：5’-GGTAAGAGAGGAATGGATCCATGAAAAGAACGTGGAACGTCTGT-3’；
SBsGGT-R：5’-CGCTTTCGTTTTTGAATCATAGCTTCCGCGTGAAAAGGGAC-3’；
PCR扩增SBsGGT(84bp)，将构建好的双启动子单信号肽pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT质粒用BamH1进行酶切，在P43和SamyQ之间产生缺口，见图18，将PCR产物和酶切产物回收。
用In-fusion方法将SBsGGT和pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT两个片段进行连接，采用热激法将In-fusion产物转入大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞中，经含氨苄青霉素的LB培养基培养、筛选和基因测序获得含正确序列质粒的转化子，提取得到pBEPcd-P43-SBsGGT-SamyQ-BsGGT质粒(见图19)。
(7)GGT质粒的表达：将pBE-Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT-BsGGT、pBE-Pcd-P43-SamyQ-BsGGT和pBE-Pcd-P43-SBsGGT-SamyQ-BsGGT质粒分别用电转化法(2500V，4.2-5.6ms)将质粒转入枯草芽孢杆菌ATCC6051感受态细胞中，经含卡那霉素的LB固体平板筛选，制得双信号肽重组枯草芽孢杆菌、单信号肽重组枯草芽孢杆菌。
挑取单信号肽和双信号肽重组枯草芽孢杆菌单菌落分别接至3mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220rpm发酵27h。
(8)GGT酶活测定按如下方法进行：
发酵液10000rpm离心2min取上清液，获得粗酶液。
a)取四个EP管，每管加入100μL粗酶液，分别为实验组三管和对照组一管，对照组加入500μL乙酸溶液(1.5mol/L)使GGT酶失活，实验组加入300μL Tris-HCl(100mM，PH10.0)。
b)在实验组与对照组中加入100μLγ-L-谷氨酰对硝基苯胺(5mmol/L)，吹吸混匀。
c)将实验组与对照组皆置于37℃水浴反应10min，取出反应液，在实验组中加入500μL乙酸溶液(1.5mol/L)，终止反应。
d)反应液10000rpm离心2min吸取200μL上清液于酶标板，每个反应测三组，用酶标仪测410nm下的吸光值。
活力单位(U)定义为每分钟水解底物γ-L-谷氨酰对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量，即1个酶活单位。
酶活计算方法如下：
A＝(ΔA-0.0573)/2.3029
其中，A——实验组与对照组平均吸光值差对应标准曲线(见图9)计算得到的对硝基苯胺浓度；
ΔA——在410nm下实验组和对照组吸光值的差值；
1——反应液总体积为1mL；
1000/100——对应每1mL的粗酶液；
N——发酵液稀释的倍数；
10——反应时间为10min。
经测定，Pcd-P43-SamyQ表达系统所表达的BsGGT酶活最高为0.83U/mL，Pcd-P43-SBsGGT-SamyQ表达系统所表达的酶活最高为0.08U/mL，而Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT表达系统所表达的酶活最高为1.34U/mL(见图20)。
结果表明双启动子双信号肽表达系统能够实现γ-谷氨酰胺转肽酶的高效分泌表达，在于该技术将两种高效转录的强组成型启动子Pcd和启动子P43融合启动转录，再串联双信号肽SamyQ-SBsGGT提高目的蛋白的分泌速率，使其转录水平较单个信号肽提高至161.45％以上，而SBsGGT-SamyQ分泌的效果很弱，由此可知SamyQ串联在SBsGGT之前的组合双信号肽分泌促进作用更强。SamyQ及SBsGGT两个信号肽均为宿主细胞枯草芽孢杆菌的自身信号肽，因此在分泌过程中能够充分利用宿主内的分泌途径，提高分泌效率。因此，本发明技术的利用是实现γ-谷氨酰胺转肽酶高效分泌表达的重要体现。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 283
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pcd-P43
<220>
<222> (1)..(135)
<223> Pcd
<220>
<222> (136)..(283)
<223> P43
<400> 1
gtttactcat cttcttgccg aaaatatgtt agcagaagat tcttacaatt attttacatt 60
gccaaaaatg ggcgtgaaaa accaatcata attatgtaaa ataaaagtga cagcggtatc 120
atacaggata aaggtggttt acttattttt ttgccaaagc tgtaatggct gaaaattctt 180
acatttattt tacattttta gaaatgggcg tgaaaaaaag cgcgcgatta tgtaaaatat 240
aaagtgatag cggtaccatt ataggtaaga gaggaatgta cac 283
<210> 2
<211> 283
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-Pcd
<220>
<222> (1)..(129)
<223> P43
<220>
<222> (130)..(283)
<223> Pcd
<400> 2
ggtttactta tttttttgcc aaagctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat 60
ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt gatagcggta 120
ccattatagg tttactcatc ttcttgccga aaatatgtta gcagaagatt cttacaatta 180
ttttacattg ccaaaaatgg gcgtgaaaaa ccaatcataa ttatgtaaaa taaaagtgac 240
agcggtatca tacaggataa aggtaagaga ggaataagta cac 283
<210> 3
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-SBsGGT
<220>
<222> (1)..(93)
<223> SamyQ
<220>
<222> (94)..(177)
<223> SBsGGT
<400> 3
atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacactgctg 60
tttgtttcac tgccgattac aaaaacatca gcaatgaaaa gaacgtggaa cgtctgttta 120
acagctctgc ttagtgttct gttagtcgct ggaagtgtcc cttttcacgc ggaagct 177
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-SBsGGT
<400> 4
Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met
1 5 10 15
Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Met
20 25 30
Lys Arg Thr Trp Asn Val Cys Leu Thr Ala Leu Leu Ser Val Leu Leu
35 40 45
Val Ala Gly Ser Val Pro Phe His Ala Glu Ala
50 55
<210> 5
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SplB+Fc+Ter
<220>
<222> (1)..(612)
<223> SplB
<220>
<222> (613)..(660)
<223> Link
<220>
<222> (661)..(1332)
<223> Fc
<220>
<222> (1333)..(1377)
<223> 带有XbaⅠ酶切位点的Ter终止子
<400> 5
gaaaataatg ttacgaaagt taaagataca aatatttttc cgtatacggg cgttgttgca 60
tttaaatcag caacgggctt tgtggttggc aaaaatacga ttctgacaaa taaacatgtt 120
tcaaaaaatt ataaagttgg cgatagaatt acagcacatc cgaactcaga caaaggcaat 180
ggcggcattt attcaattaa aaaaattatt aactatccgg gcaaagaaga tgtttcagtt 240
attcaagttg aagaaagagc aattgaaaga ggcccgaaag gctttaattt taatgataat 300
gttacaccgt ttaaatatgc agcgggcgca aaagcgggcg aaagaattaa agttattggc 360
tatccgcatc cgtataaaaa taaatatgtt ctgtatgaat caacgggccc ggttatgtca 420
gttgaaggct catcaattgt ttattcagca catacagaaa gcggcaatag cggctcaccg 480
gttctgaatt caaataatga actggttggc attcattttg catcagatgt taaaaatgat 540
gataatagaa acgcatacgg agtttatttt acaccggaaa ttaaaaaatt tattgcagaa 600
aatatcgata agggaagcgg cggaggcagc ggcggaggcg gaagcggcgg aggcggctca 660
gttgaatgcc cgccgtgccc ggcaccgccg gttgcgggcc cgtcagtttt tctgtttccg 720
ccgaaaccga aagatacact gatgatttca agaacaccgg aagttacatg cgttgtggtt 780
gatgtttcac atgaagatcc ggaagttcaa tttaattggt atgttgatgg cgttgaagtt 840
cataatgcaa aaacaaaacc gagagaagaa caattcaatt caacatttag agttgtttca 900
gttctgacag ttgttcatca agattggctg aatggcaaag aatataaatg caaagtttca 960
aataaaggcc tgccggcatc aattgaaaaa acaatttcaa aaacaaaagg acaaccgaga 1020
gaaccgcaag tttatacact gccgccgtca agagaagaaa tgacaaaaaa tcaagtttca 1080
ctgacatgcc tggttaaagg cttttatccg tcagatattg cagttgaatg ggaatcaaat 1140
ggccaacctg agaataatta taaaacaaca ccgccgatgc tggattcaga tggctcattt 1200
tttctgtatt caaaactgac agttgataaa tcaagatggc aacaaggcaa tgttttttca 1260
tgctcagtta tgcatgaagc actgcataat cattatacac aaaaatcact gtcactgtca 1320
ccgggcaaat agtctagaaa ccttgaagaa tagcattctt caaggttttg tttttca 1377
<210> 6
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 丝氨酸类蛋白酶B的氨基酸序列
<400> 6
Glu Asn Asn Val Thr Lys Val Lys Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Thr
1 5 10 15
Gly Val Val Ala Phe Lys Ser Ala Thr Gly Phe Val Val Gly Lys Asn
20 25 30
Thr Ile Leu Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asn Tyr Lys Val Gly Asp
35 40 45
Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Ser Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr
50 55 60
Ser Ile Lys Lys Ile Ile Asn Tyr Pro Gly Lys Glu Asp Val Ser Val
65 70 75 80
Ile Gln Val Glu Glu Arg Ala Ile Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn
85 90 95
Phe Asn Asp Asn Val Thr Pro Phe Lys Tyr Ala Ala Gly Ala Lys Ala
100 105 110
Gly Glu Arg Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro His Pro Tyr Lys Asn Lys
115 120 125
Tyr Val Leu Tyr Glu Ser Thr Gly Pro Val Met Ser Val Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ile Val Tyr Ser Ala His Thr Glu Ser Gly Asn Ser Gly Ser Pro
145 150 155 160
Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Leu Val Gly Ile His Phe Ala Ser Asp
165 170 175
Val Lys Asn Asp Asp Asn Arg Asn Ala Tyr Gly Val Tyr Phe Thr Pro
180 185 190
Glu Ile Lys Lys Phe Ile Ala Glu Asn Ile Asp Lys
195 200
<210> 7
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 谷氨酰胺转肽酶的氨基酸序列
<400> 7
Lys Lys Pro Pro Lys Ser Tyr Asp Glu Tyr Lys Gln Val Asp Val Gly
1 5 10 15
Lys Asp Gly Met Val Ala Thr Ala His Pro Leu Ala Ser Glu Ile Gly
20 25 30
Ala Asp Val Leu Lys Lys Gly Gly Asn Ala Ile Asp Ala Ala Val Ala
35 40 45
Ile Gln Phe Ala Leu Asn Val Thr Glu Pro Met Met Ser Gly Ile Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Phe Met Met Val Tyr Asp Gly Lys Thr Lys Asp Thr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asp Ser Arg Glu Arg Ala Pro Ala Gly Ala Thr Pro Asp Met
85 90 95
Phe Leu Asp Glu Asn Gly Lys Ala Ile Pro Phe Ser Glu Arg Val Thr
100 105 110
Lys Gly Thr Ala Val Gly Val Pro Gly Thr Leu Lys Gly Leu Glu Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Trp Gly Thr Arg Ser Met Lys Gln Leu Ile Thr Pro
130 135 140
Ser Ile Lys Leu Ala Glu Lys Gly Phe Pro Ile Asp Ser Val Leu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Ser Asp Tyr Gln Glu Lys Leu Ser Arg Thr Ala Ala Lys
165 170 175
Asp Val Phe Leu Pro Asn Gly Glu Pro Leu Lys Glu Gly Asp Thr Leu
180 185 190
Ile Gln Lys Asp Leu Ala Lys Thr Phe Lys Leu Ile Arg Ser Lys Gly
195 200 205
Thr Asp Ala Phe Tyr Lys Gly Lys Phe Ala Lys Thr Leu Ser Asp Thr
210 215 220
Val Gln Asp Phe Gly Gly Ser Met Thr Glu Lys Asp Leu Glu Asn Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Thr Ile Asp Glu Pro Ile Trp Gly Asp Tyr Gln Gly Tyr Gln
245 250 255
Ile Ala Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ile Phe Leu Leu Gln
260 265 270
Met Leu Lys Ile Leu Asp His Phe Asn Leu Ser Gln Tyr Asp Val Arg
275 280 285
Ser Trp Glu Lys Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Thr Met His Leu Ser Tyr
290 295 300
Ala Asp Arg Ala Ser Tyr Ala Gly Asp Pro Glu Phe Val Asn Val Pro
305 310 315 320
Leu Lys Gly Leu Leu His Pro Asp Tyr Ile Lys Glu Arg Gln Gln Leu
325 330 335
Ile Asn Leu Asp Gln Val Asn Lys Lys Pro Lys Ala Gly Asp Pro Trp
340 345 350
Lys Tyr Gln Glu Gly Ser Ala Asn Tyr Lys Gln Val Glu Gln Pro Lys
355 360 365
Asp Lys Val Glu Gly Gln Thr Thr His Phe Thr Val Ala Asp Arg Trp
370 375 380
Gly Asn Val Val Ser Tyr Thr Thr Thr Ile Glu Gln Leu Phe Gly Thr
385 390 395 400
Gly Ile Met Val Pro Asp Tyr Gly Val Ile Leu Asn Asn Glu Leu Thr
405 410 415
Asp Phe Asp Ala Ile Pro Gly Gly Ala Asn Glu Val Gln Pro Asn Lys
420 425 430
Arg Pro Leu Ser Ser Met Thr Pro Thr Ile Leu Phe Lys Asp Asp Lys
435 440 445
Pro Val Leu Thr Val Gly Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile Ile Ser Ser
450 455 460
Val Leu Gln Thr Ile Leu Tyr His Ile Glu Tyr Gly Met Glu Leu Lys
465 470 475 480
Ala Ala Val Glu Glu Pro Arg Ile Tyr Thr Asn Ser Met Ser Ser Tyr
485 490 495
Arg Tyr Glu Asp Gly Val Pro Lys Asp Val Leu Ser Lys Leu Asn Gly
500 505 510
Met Gly His Lys Phe Gly Thr Ser Pro Val Asp Ile Gly Asn Val Gln
515 520 525
Ser Ile Ser Ile Asp His Glu Asn Gly Thr Phe Lys Gly Val Ala Asp
530 535 540
Ser Ser Arg Asn Gly Ala Ala Ile Gly Ile Asn Leu Lys Arg Lys
545 550 555
<210> 8
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码的谷氨酰胺转肽酶的核苷酸序列
<400> 8
aaaaaaccgc ccaaaagcta cgatgagtac aaacaagtag atgttggaaa agacggcatg 60
gttgcgaccg cacatcctct tgcttctgaa atcggtgctg atgtgctgaa aaaaggagga 120
aatgctattg acgcagcggt tgccattcaa tttgcactca atgtaacaga gccgatgatg 180
tcaggtattg gcggcggcgg ttttatgatg gtgtatgacg gaaaaacgaa ggatacaacg 240
ataatcgaca gccgtgagcg tgctccagca ggcgcaactc ctgatatgtt tctggacgaa 300
aacggcaaag caattccttt ctctgaacgt gtaacaaaag gtactgccgt tggtgttcca 360
ggcactctga aagggctgga agaagccttg gataaatggg gaacccgttc gatgaagcaa 420
ttaattaccc cttctattaa actcgctgaa aaaggctttc cgattgattc ggtgttggca 480
gaggccattt ctgattatca ggaaaagctt tcacggactg ccgcaaaaga tgtattttta 540
ccaaatggcg aaccgcttaa agaaggagat acccttattc aaaaggattt ggctaaaaca 600
tttaagctta ttcgctccaa aggcactgac gctttttata aaggaaaatt cgccaagacg 660
ctttctgaca ctgtccagga tttcggcgga tcaatgacag aaaaagattt agaaaattac 720
gacattacaa ttgatgaacc gatttgggga gattatcaag gctatcaaat cgctactact 780
cctcctccaa gctccggcgg tattttctta ttgcaaatgc tgaaaatcct tgatcatttt 840
aacctttcac aatacgatgt ccgctcatgg gaaaaatatc agctgcttgc tgaaacgatg 900
catttgtcat atgccgaccg tgcgtcttac gcaggtgatc ccgaatttgt aaatgttcct 960
ctcaaaggcc tgcttcaccc cgattatatt aaagaacgcc agcaattaat caacctagat 1020
caagtgaata aaaaaccgaa agccggtgac ccttggaaat accaagaagg atcagcaaac 1080
tataaacaag ttgaacagcc gaaagacaaa gtagaaggcc aaacaaccca ctttacagtt 1140
gctgaccgtt ggggaaatgt tgtttcttat acaacaacaa tcgaacagct attcggaacg 1200
ggtattatgg tccctgatta cggtgttatt ttaaacaatg aattaacgga ttttgatgcg 1260
ataccaggcg gagctaacga agtacagcca aacaaacggc ctttaagcag catgaccccg 1320
acgattttat ttaaggatga caagcctgtc ctcacggttg gatctcctgg cggggccaca 1380
attatttcat ccgttttgca aaccattctc taccacattg aatatggtat ggaattaaaa 1440
gcagctgttg aagagccgag aatttacaca aacagcatga gctcttaccg ttacgaagac 1500
ggagttccta aagatgtcct cagcaagcta aacggcatgg gccacaaatt cggcacaagt 1560
ccggtggata tcggaaacgt gcaaagtata tcgatcgacc atgaaaacgg cacctttaaa 1620
ggtgtagctg attcaagcag aaacggcgcg gcgatcggca ttaatttaaa acgtaaataa 1680
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-F1
<400> 9
ggaatgtaca catgattcaa aaacgaaagc ggaca 35
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-R1
<400> 10
cattattttc tgctgatgtt tttgtaatcg gcag 34
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SplB+Fc+Ter-F
<400> 11
aacatcagca gaaaataatg ttacgaaagt taaagat 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SplB+Fc+Ter-R
<400> 12
cctctgacac attgaaaaac aaaaccttga agaatgc 37
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pBE载体-F
<400> 13
gttttgtttt tcaatgtgtc agaggttttc accgtc 36
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pBE载体-R
<400> 14
gatgagtaaa cgaattcctt aaggaacgta cagac 35
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-F1
<400> 15
ccttaaggaa ttcggtttac ttattttttt gccaaagc 38
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-R
<400> 16
cgtttttgaa tcatgtgtac attcctctct tacctat 37
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pcd-F
<400> 17
ccttaaggaa ttcgtttact catcttcttg ccgaaaat 38
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pcd-R
<400> 18
caaaaaaata agtaaaccac ctttatcctg tatgataccg c 41
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-F2
<400> 19
gataaaggtg gtttacttat ttttttgcca aagc 34
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 载体无尾-R
<400> 20
gaattcctta aggaacgtac agac 24
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-载体-F
<400> 21
gtacgttcct taaggaattc ggtttactta tttttttgcc aaagc 45
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P43-Pcd-R
<400> 22
cggcaagaag atgagtaaac ctataatggt accgctatca cttt 44
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pcd无尾-F
<400> 23
gtttactcat cttcttgccg aaaat 25
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pcd-载体-R
<400> 24
cgctttcgtt tttgaatcat gtgtacttat tcctctctta ccttt 45
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ无尾-F
<400> 25
atgattcaaa aacgaaagcg gaca 24
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F
<400> 26
ggatccagcc cggggtcgac caccgggcaa atagtctaga aac 43
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R
<400> 27
gtcgaccccg ggctggatcc attcctctct tacctataat ggtac 45
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-F2
<400> 28
ggtaagagag gaatggatcc atgattcaaa aacgaaagcg gac 43
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SamyQ-R2
<400> 29
ttcttttcat tgctgatgtt tttgtaatcg gcag 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SBsGGT+BsGGT-F
<400> 30
aacatcagca atgaaaagaa cgtggaacgt ctgt 34
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SBsGGT+BsGGT-R
<400> 31
cggtggtcga ccccgggctg ttatttacgt tttaaattaa tgccgat 47
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F2
<400> 32
aacatcagca aaaaaaccgc ccaaaagcta cgat 34
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R2
<400> 33
gcggtttttt tgctgatgtt tttgtaatcg gcag 34
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SBsGGT-F
<400> 34
ggtaagagag gaatggatcc atgaaaagaa cgtggaacgt ctgt 44
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SBsGGT-R
<400> 35
cgctttcgtt tttgaatcat agcttccgcg tgaaaaggga c 41

Claims (15)

1.一种具有双重启动子功能的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补序列。
2.一种具有双重启动子和单重分泌信号功能的组合DNA片段，其特征在于，包括权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段以及编码具有单重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段；
所述编码具有单重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段为编码如SEQ ID NO.4中第1～31位所示氨基酸序列的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的具有双重启动子和单重分泌信号功能的组合DNA片段，其特征在于，所述编码具有单重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段为如SEQ ID NO.3中第1～93位所示的核苷酸序列。
4.一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段，其特征在于：包括权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段以及编码具有双重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段；
所述的编码具有双重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段为编码如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段。
5.根据权利要求4所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段，其特征在于：所述的编码具有双重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段、权利要求2～3任一项所述的具有双重启动子和单重分泌信号功能的组合DNA片段或权利要求4～5任一项所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在蛋白表达中的应用。
7.一种双启动子通用载体，其特征在于：
所述的双启动子通用载体包含权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段的序列。
8.一种双启动子单信号肽通用载体或双启动子双信号肽通用载体，其特征在于：
所述的双启动子单信号肽通用载体包含权利要求2或3所述的具有双重启动子和单重分泌信号功能的组合DNA片段；
所述的双启动子双信号肽通用载体包含权利要求4或5所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列。
9.一种双启动子表达质粒，其特征在于：
所述的双启动子表达质粒包含权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
10.一种双启动子单信号肽表达质粒或双启动子双信号肽表达质粒，其特征在于：
所述的双启动子单信号肽表达质粒包含权利要求2或3所述的具有双重启动子和单重分泌信号功能的组合DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列；
所述的双启动子双信号肽表达质粒包含权利要求4或5所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的质粒，其特征在于：
所述的异源蛋白核苷酸序列为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)编码的丝氨酸类蛋白酶B的核苷酸序列，或为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编码的谷氨酰胺转肽酶的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的质粒，其特征在于：
所述丝氨酸类蛋白酶B的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述谷氨酰胺转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
13.根据权利要求12所述的质粒，其特征在于：
编码丝氨酸类蛋白酶B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中的1-612bp所示；
编码谷氨酰胺转肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
14.一种重组工程细胞，其特征在于：为权利要求7～8任一项所述的载体或权利要求9～13任一项所述的质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞株；
所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
15.根据权利要求14所述的重组工程细胞，其特征在于：
所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌ATCC6051。
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