KR102501259B1 - 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 cg2052의 분비신호 펩타이드 또는 cg1514의 분비신호 펩타이드의 기능이 억제되어, 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 재조합 미생물은 기존 불순물 분비를 유도하는 유전자를 제거하고 목적 단백질을 높은 순도와 효율로 분비할 수 있어, 목적 단백질을 세포 파쇄 없이 매우 손쉽게 생산할 수 있으므로, 산업적 적용에 유리하다.

Description

목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 {A recombinant Corynebacterium having enhanced secreted production efficiency of target protein}

본 발명은 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움에 관한 것으로, 더 상세하게는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 cg2052의 분비신호 펩타이드 또는 cg1514의 분비신호 펩타이드의 기능이 억제되어 있고, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 향상된 코리네박테리움 속 재조합 미생물에 관한 것이다.

코리네박테리움 속 미생물은 산업분야에서 주로 아미노산과 핵산 생산을 위해 사용되며, 안전성이 인정되어 여러 대사물질 및 식품 첨가물을 생산하는데도 이용되고 있다. 코리네박테리움 속 미생물은 내재적으로 분비시스템을 보유할 뿐만 아니라 프로테아제를 생성하지 않는다고 알려져 산업적으로 유용한 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다. 즉, 일반적으로 다른 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 경우, 생산된 재조합 단백질을 회수하기 위해서는 세포 파쇄 공정이 필요한 반면, 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 경우 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 분비시스템에 의해 별도의 파쇄 공정이 요구되지 않으므로, 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 산업적 공정으로 생산된 재조합 단백질은 용이하게 회수할 수 있어 경제적이고 효과적인 재조합 단백질 생산이 가능하다.

특정 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법으로 기존 숙주가 가지고 있는 분비시스템을 이용하기도 하지만 (Yim, S. S. et al., (2016). Biotechnology and bioengineering, 113(1), 163-172.), 목적 재조합 단백질의 효율적인 분비 생산을 유도하기 위한 균주를 개량하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구로는, 분비생산에 이용되는 분비 시그널 코돈을 최적화 하여 분비능을 증가시키거나 (한국 등록특허 1009197040000), 재조합 단백질을 분비 생산하는 플라스미드 시스템의 복제수를 증가시키거나 (Choi, J. W. et al., (2018). Applied microbiology and biotechnology, 102(2), 873-883.), 재조합 단백질의 코돈 최적화에 의한 발현양 증대를 이용한 방법(Wang, X. et al., (2010). Protein expression and purification, 72(1), 101-106.) 등이 있다.

그러나, 상기 방법들은 재조합 단백질의 발현에 초점을 맞춘 것으로, 발현된 재조합 단백질을 어떻게 효과적으로 세포 외 분비시킬 수 있는가에 대한 연구는 미흡하다.

본 발명에서는 세포 내 재조합 단백질 발현량이 증가한다고 해도 이를 효과적으로 세포 외로 분비시키지 못하는 경우 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 결국 세포 파쇄라는 별도의 공정이 요구된다는 문제점에 착안하여, 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 분비시스템을 어떻게 향상시켜 목적 재조합 단백질의 분비량을 향상시킬 수 있을지 및 분비 불순물을 감소시킬 수 있을지에 대해 연구하였고, 코리네박테리움 속 미생물의 변이를 유도하는 경우, 목적 재조합 단백질의 분비량과 순도를 현저히 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국 등록특허 10-09197040000

Yim, S. S. et al., (2016). Biotechnology and bioengineering, 113(1), 163-172 Choi, J. W. et al., (2018). Applied microbiology and biotechnology, 102(2), 873-883 Wang, X. et al., (2010). Protein expression and purification, 72(1), 101-106

본 발명은 목적 단백질의 세포 외 분비능이 개선된 신규한 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 cg2052의 분비신호 펩타이드 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 cg1514의 분비신호 펩타이드의 기능이 억제되어 있고,

목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 Cg2052 분비 신호 펩타이드, Cg1514 분비 신호 펩타이드, CgR0949 분비 신호 펩타이드, TorA 분비 신호 펩타이드, CspA 분비 신호 펩타이드, Prorin B(PorB) 분비 신호 펩타이드, CgR_2070 분비 신호 펩타이드 및 AprE 분비 신호 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 CgR0949 분비 신호 펩타이드 또는 TorA 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA, TatB 및 TatC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 CgR0949 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA 및 TatC 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법에 관한 것이다:

(a) 상기 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 유전자를 발현 및 분비·생산하는 단계: 및

(b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명에 따른 코리네박테리움 속 재조합 미생물은 기존 불순물 분비를 유도하는 유전자를 제거하여 목적 단백질을 높은 효율과 순도로 분비할 수 있도록 함으로써, 목적 단백질을 세포 파쇄 없이 매우 손쉽게 생산할 수 있으므로, 산업적 적용에 유리하다.

도 1은 분비 생산을 위한 시스템에 이용하기 위한 기본 플라스미드의 모식도이다. pHCP벡터에 분비 생산을 위한 CgR0949 신호 분비 펩타이드를 삽입한 플라스미드 pHCP_CgR 이다.
도 2는 pHCP_CgR_DagA 플라스미드의 모식도이다.
도 3은 pHCP_CgR_DagA_TatAC 플라스미드의 모식도이다.
도 4는 pHCP_CgR_DagA_TatACB 플라스미드의 모식도이다.
도 5는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 플라스크 배양후 beta-agarase(DagA)의 세포외 분비생산을 분석한 결과이다. 도 5a는 SDS-PAGE 결과이고, 도 5b는 Western blotting 결과이다. Lane M은 단백질 마커이고, Lane 1은 pHCP, Lane 2는 pHCP-CgR-DagA, Lane 3은 pHCP-CgR-DagA-TatAC, Lane 4는 pHCP-CgR-DagA-TatACB이다. 이 분비 발현 시스템은 WT의 C. glutamicum ATCC13032에서 확인하였다.
도 6은 pHCP_CgR_DagA_TatAC를 WT C. glutamicum ATCC13032에 형질전환하여 고농도 유가식 배양을 진행한 결과이다. 도 6a는 시간별 유가식배양 결과로서, ●는 성장곡선을 나타내며, ■는 글루코스 양, ▲는 분비생산된 DagA의 양을 나타낸다. 도 6b는 시간별 분비생산된 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. ◀는 분비된 DagA를 나타내고, ◁는 unknown 단백질을 나타낸다.
도 7은 도 6의 unknown 단백질을 분리하기 위해 시행한 FPLC 결과이다. 도 7a는 UV280에서 측정한 FPLC 결과이다. 도 7b는 도 7a의 각 fraction number에서 회수한 단백질의 SDS-PAGE결과이다. M lane 은 단백질 마커이다.
도 8은 도 7에서 얻은 13 fraction의 N-terminal amino acid 분석 결과이다. 이 분석방법을 이용하여 5개의 아미노산을 분석하였고, EEVSG의 N-terminal 을 가진 단백질이라는 결과를 얻을 수 있었으며, 이는 코리네박테리움이 가진 Cg2052 유전자라는 것을 확인하였다.
도 9는 Cg2052 유전자의 분비 신호 펩타이드를 제거한 C. glutamicum SP001를 이용한 DagA의 유가식 배양 결과이다. 도 9의 ●는 성장곡선을 나타내며, ■는 글루코스 양, ▲는 분비생산된 단백질의 양을 나타낸다. 도 9b는 시간별 분비생산된 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. ◀는 분비된 DagA를 나타내고, ◁는 2번째 unknown 단백질을 나타낸다.
도 10은 도 9의 2번째 unknown 단백질을 확인하기 위해 MALDI-TOF-MS를 시행한 결과이다.
도 11은 Cg1514 유전자와 Cg2052 유전자를 제거한 코리네박테리움 SP002 균주의 분비 발현 시스템을 모식화 한 것이다.
도 12는 C. glutamicum SP001에서 Cg1514 유전자의 분비 신호 펩타이드를 제거한 C. glutamicum SP002를 이용한 DagA의 유가식 배양 결과이다. 도 12a의 ●는 성장곡선을 나타내며, ■는 글루코스 양, ▲는 분비생산된 단백질의 양을 나타낸다. 도 12b는 시간별 분비생산된 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. ◀는 분비된 DagA를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

코리네박테리움 속 미생물은 내재적으로 단백질 분비 시스템을 가지고 있기 때문에, 산업적으로 유용한 재조합 단백질 생산에 광범위하게 활용된다. 그러나, 코리네박테리움 속 미생물을 추가로 개량하는 경우, 재조합 단백질의 순도와 생산량을 더욱 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물에서 일부 분비 신호 유전자는 강화시키고 일부 분비 신호 유전자는 약화시킴으로써 목적 단백질 분비량을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 cg2052의 분비신호 펩타이드 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 cg1514의 분비신호 펩타이드의 기능이 억제되어 있고, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움 속 재조합 미생물에 관한 것이다.

상기 Cg2052 및 Cg1514 분비 신호 펩타이드는 각각 목적 단백질이 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 통해 세포 외로 분비되는데 경쟁적으로 작용하는바, Cg2052 및/또는 Cg1514분비 신호 펩타이드 기능을 억제시키는 경우, 목적 단백질의 세포 외 분비 효과가 향상되고 분비된 목적 단백질의 순도가 개선되는 효과가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 Cg2052 분비 신호 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 Cg1514 분비 신호 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 TorA 분비 신호 펩타이드, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CspA 분비 신호 펩타이드, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 Prorin B(PorB) 분비 신호 펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CgR_2070 분비 신호 펩타이드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 AprE 분비 신호 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질의 분비를 유도할 수 있는 분비 신호 펩타이드는 제한없이 사용 가능함은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 TorA 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA, TatB 및 TatC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA 및 TatC 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, TatA, TatB, TatC 단백질은 CgR0949 분비 신호 펩타이드 또는 TorA 분비 신호 펩타이드의 세포 외 분비능을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자가 추가로 도입되어 있다는 것은 유전자가 플라스미드나 벡터의 형태로 숙주 미생물 게놈에 독립적으로 도입되어 있는 경우뿐만 아니라, 상기 유전자가 숙주 미생물에 도입되어 게놈 자체에 통합되어 있는 경우를 포함한다.

일 양태로서 본 발명에서는 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 하나의 재조합 벡터에 도입되는 것이 바람직하다. 상기 목적 단백질은 분비 신호 펩타이드와 작동 가능하게 연결되어 발현됨으로써 목적 단백질의 세포 외 분비가 촉진된다.

또한, 일 양태로서 본 발명에서는 TatA, Tat B 및 TatC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 이 경우, TatA를 코딩하는 유전자, TatB를 코딩하는 유전자 및 TatC를 코딩하는 유전자는 각각 별도의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 미생물에 도입될 수 있고, 둘 이상의 유전자가 하나의 벡터에 삽입된 형태로, 즉, 하나 또는 두 개의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 미생물에 도입될 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자의 도입을 위해 사용할 수 있는 벡터로는 pHCP, pTac15K, pBBR1MCS, pEKEx1, pXMJ19 및 pCES208로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법에 관한 것이다:

(a) 상기 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 유전자를 발현 및 분비·생산하는 단계: 및

(b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글구타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 다른 속의 코리네박테리움 미생물을 사용하는 경우, 상기 Cg2052 및 Cg1514 분비 신호 펩타이드를 지칭하는 명칭은 상이하나, 아미노산 서열의 상동성에 기초하여 판단할 때 상기 Cg2052 및 Cg1514 분비 신호 펩타이드에 상응하는 분비 신호 펩타이드는 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 이들 Cg2052 및 Cg1514 분비 신호 펩타이드에 상응하는 분비 신호 펩타이드의 기능이 억제되어 있는 코리네박테리움 속 재조합 미생물이 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 cg2052의 분비신호 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 cg1514의 분비신호 펩타이드는, 코리네박테리움 글루타미쿰 이외의 코리네박테리움 속 미생물에 있어서, 각각 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 이들 분비신호 펩타이드에 상응하는 분비 신호 펩타이드의 기능을 억제함으로써 본 발명의 효과를 달성할 수 있다.

본 발명에서 유전자가 도입 또는 증폭되어 있다는 것은, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질이 숙주 미생물에 없는 경우 이를 인위적으로 숙주 미생물에서 발현하도록 하여 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능을 갖도록 하는 것뿐만 아니라, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능이 내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형된 것을 포함한다.

본 발명에서 "내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형"되었다는 것은, 활성 또는 기능을 나타내는 유전자가 도입되거나 또는 당해 유전자의 카피수 증가(예를 들어, 유전자가 도입된 플라스미드를 이용한 발현), 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실 또는 발현조절 서열의 변형, 예를 들어 개량된 프로모터의 사용 등과 같이, 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성 또는 기능이 증가된 상태를 의미한다.

본 발명에서 "펩타이드 기능의 강화"란, 펩타이드 자체의 기능이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 기능의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현조절 서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자내 돌연변이에 의한 펩타이드 기능의 증가 등에 의해 그 기능이 증대되는 것을 포함한다.

본 발명에서, “펩타이드 기능의 억제”란 상기 펩타이드를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부가 결실되어 있거나, 유전자의 기능이 억제되어 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질이 숙주 미생물에서 제거하는 것뿐만 아니라, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질이 내재적 활성 또는 기능에 비하여 약화되도록 변형된 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 분비신호 펩타이드 기능의 억제는 해당 분비신호 펩타이드의 전부 또는 일부가 결실되거나 그 기능이 억제되어 있는 뿐만 아니라, 상기 분비신호 펩타이드에 의해 분비가 유도되는 펩타이드를 코딩하는 내재적 유전자의 전부 또는 일부가 결실되거나 그 기능이 억제됨으로써 상기 분비신호 펩타이드의 분비 기능이 제대로 작동하지 못하는 경우를 포함한다.

본 발명에서 "내재적 활성 또는 기능에 비하여 약화되도록 변형"되었다는 것은, 활성 또는 기능을 나타내는 유전자의 결실이나 유전자의 불활성화(예를 들어, 돌연변이 유전자로의 치환), 유전자 발현의 약화(예를 들어, 약한 프로모터로의 치환, siRNA, gRNA, sRNA 등의 도입, 시작 코돈을 ATG에서 GTG 등으로의 치환), 유전자에 의해 발현된 펩타이드의 기능 억제(예를 들어, 비경쟁적 억제자 또는 경쟁적 억제자 첨가) 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 기능에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 기능이 감소된 상태를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성 또는 기능"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소, 펩타이드, 단백질 등이 보유하는 활성 또는 기능을 의미하고, "내재적 활성 또는 기능에 비해 강화되도록 변형"된다는 의미는 변형 전 상태의 펩타이드 등의 활성 또는 기능과 비교할 때 당해 활성 또는 기능이 신규로 도입되거나 더 향상된 것을 의미하며, "내재적 활성 또는 기능에 비해 약화되도록 변형"된다는 의미는 변형 전 상태의 펩타이드 등의 활성 또는 기능과 비교할 때 당해 활성 또는 기능이 사라지거나 더 감소된 것을 의미한다.

본 발명에서 "결실"이란 해당유전자의 일부 또는 전체염기를 변이, 치환 또는 삭제시키는 방법을 통해 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 활성 또는 기능을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념이다.

본 발명에서 "과발현"이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.

본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 본 발명의 효과를 위해 추가적으로 변형될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원(Ori)을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 바람직하게는 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것이 바람직하다.

염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능 하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및/또는 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및/또는 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

아울러, 본 발명에서 도입된 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분비 생산 확인을 위한 모델 단백질의 분비 생산

코리네박테리움 속 균주에 내재되어 있는 분비시스템을 이용하여 단백질 분비 및 생산능을 비교하기 위한 모델 단백질로서 β(DagA)를 선정하여 실험을 진행하였다. 우선, 분비 생산을 향상시키기 위하여 pXD5 (S.S. Yim, et al., Biotechnology Journal 12(11) (2017) 1700040.) 로부터 CgR0949-F, CgR0949-R 프라이머(서열번호 16, 17) 를 이용하여 분비 신호 펩타이드인 CgR0949 (서열번호 3) 를 PCR로 증폭하하였다. PCR은 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 기기를 이용하였고, PrimeSTAR HS polymerase (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan)를 이용하여, 기재된 프라이머를 이용하여 pXD5로부터 유전자를 증폭하였다.

PCR 반응 조건은 98℃ 5분 1 Cycle, 98℃ 5분-55℃-20초-72℃-30초 25 Cycle, 72℃-5분 1Cycle로 시행하였다. PCR 산물을 pHCP 벡터(한국 공개 공보 10-2018-0092110, Choi, J. W., Yim, S. S., & Jeong, K. J. (2018). Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum. Applied microbiology and biotechnology, 102(2), 873-883.)에 BamHI, XbaI 제한효소를 이용하여 삽입하였고, 이는 pHCP_CgR이라 명명하였다 [도 1]. 우선 βagarase (X05811.1) 는 Streptomyces coelicolor A3로부터 유래한 유전자로 pUWL201PW-DagA (U. Temuujin et. al., Applied microbiology and biotechnology 92(4) (2011) 749-759.) 에서 DagA_F, DagA_R 프라이머(서열번호 18, 19)를 이용하여 PCR 증폭한 후, SfiI 제한효소를 이용하여 pHCP_CgR 벡터에 삽입하였다. 이를 pHCP-CgR-DagA라 명명하였다[도 2]. CgR0949 분비 신호 펩타이드를 이용한 효율적인 분비시스템을 위해 TatAC를 Co-expression하는 시스템과 TatABC를 Co-expression 하는 시스템을 추가로 구축하였다. TatAC(서열번호 9)는 C. glutamicum ATCC13032 (ATCC, USA) 에서 TatAC-F, TatAC-R 프라이머(서열번호 20, 21)를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR은 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 기기를 이용하였고, PrimeSTAR HS polymerase (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan)를 이용하여, 기재된 프라이머를 이용하여 pXD5로부터 유전자를 증폭하였다. PCR 반응 조건은 98℃ 5분 1 Cycle, 98℃ 5분-55℃-20초-72℃-1분 30초 25 Cycle, 72℃-5분 1Cycle로 시행하였다. PCR 산물을 pHCP-CgR-DagA의 NotI 제한효소 자리에 삽입하여 pHCP-CgR-DagA-TatAC 를 제작하였다[도 3]. 또한 TatB 유전자(서열번호 14) 는 TatB-F, TatB-R 프라이머(서열번호 22, 23)를 이용하여 증폭하였고, pHCP-CgR-DagA-TatAC의 BglII와 SpeI 자리에 삽입하였고, 이를 pHCP-CgR-DagA-TatACB 라고 명명하였다[도 4].

실시예 2: C. glutamicum ATCC13032에서의 Flask 배양

본 발명에서 구축한 발현 시스템을 이용하여 분비 생산을 진행하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 pHCP_CgR, pHCP-CgR-DagA,pHCP-CgR-DagA-TatAC, pHCP-CgR-DagA-TatABC로 형질전환한 후 (Van der Rest, M. E., Lange, C., & Molenaar, D. (1999). A heat shock following electroporation induces highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA. Applied Microbiology and Biotechnology, 52(4), 541-545 참조) 각 균주를 BHI (Brain heart infusion, BD) 배지에 접종하여 17시간 동안 30 ℃200rpm에서 배양하였다. 이후, 250mL flask의 신선한 BHI 배지 50 mL에 상기 배양된 균주를 1/100의 부피만큼 옮겨서 동일 조건으로 배양하였다. 24 시간 배양한 후, 코리네박테리움 글루타미쿰 배양액을 13000 rpm으로 10 분간 원심분리하여, 상등액을 취하고, 상등액과 아세톤을 동량 섞어 -20℃에서 1시간 보관 후, 13000rpm, 10분 원심분리 후, 침전된 단백질을 회수하는 아세톤 침전방법을 통해서 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질로 SDS-PAGE를 수행하여, 각각의 균주에서 생산된 β의 양을 비교하였다. 도 5 에서와 같이 pHCP-CgR-DagA-TatAC, pHCP-CgR-DagA-TatABC에서만 분비생산됨을 확인하였고, 그 중에서 pHCP-CgR-DagA-TatAC를 포함한 균주가 β를 더 많이 생산하는 것을 확인한 뒤, 고농도 유가식 배양에 이용하였다.

실시예 3: C. glutamicum ATCC13032를 이용한 고농도 유가식 배양

실시예 1에서 확인한 분비 발현 pHCP-CgR-DagA-TatAC 시스템을 이용하여 2L 고농도 유가식 배양을 진행하였다. BHI media 10mL에 overnight 배양하여 키운 것을 minimal media에 15g/L yeast extract, 7g/L casamino acid, 2g/L urea가 포함된 50mL flask 배양으로 옮겨 30 ℃ 조건에서 전배양 하였다. 이를 overnight 배양 후 발효기에 접종하여, 온도는 30℃, pH는 계속 모니터링하면서 13 N 암모니아를 넣어 pH 7.0을 유지하였으며 용존산소량은 rpm과 산소를 넣어주어 30 % (v/v)을 유지하였다. 글루코스는 YSI 2300 STAT Plus기기를 이용해서 분석하였고 OD_600nm에서 optical density를 분석하여 성장속도를 분석하였다 (도 6a). 단백질은 SDS-PAGE를 통해 분석하였다 (도 6b). 그 결과, 단백질인 DagA(36 kDa)가 1.5 g/L 분비됨을 확인하였고, SDS-PAGE image 분석 프로그램인 ImageJ를 통해서 DagA는 전체 분비된 단백질 중에서 약 54%에 해당됨을 확인하였다. 그러나 DagA 단백질보다 작은 크기의 약 27 kDa의 약 45%에 해당되는 단백질을 확인하였다.

실시예 4: Unknown 단백질 확인을 위한 FPLC 분석 시행

실시예 2에서 관찰된 unknown 단백질을 확인하기 위해 발효물의 상층액만을 회수하여 FPLC를 이용하여 정제하였다. 도 7에서와 같이 각 Fraction 숫자에 해당하는 샘플을 취하였고, SDS-PAGE를 분석한 결과, 13번 Fraction에서 unknown 단백질과 동일한 크기의 단백질을 정제할 수 있었고, 이를 이용하여 N-terminal amino acid 분석을 통한 5개 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 도 8와 같이 EEVSG의 아미노산 서열을 확인하였고, 이는 C. glutamicum ATCC13032가 가지고 있는 Cg2052 유전자(CAF20211.1)의 일부분인 것을 확인하였다. 높은 순도의 목적 단백질 분비생산을 위해 Cg2052 유전자를 C. glutamicum ATCC13032 에서 제거하기로 하였다. Cg2052 단백질의 분비신호서열을 SignalP-5.0 프로그램을 통해서 분석한 후, 분비신호서열(서열번호 1)만 제거하기 위해 분비신호서열 앞 500 bp를 Cg2052A-F, Cg2052A-R (서열번호 24, 25)으로 증폭하고, 분비신호서열 뒤 500 bp를 Cg2052B-F, Cg2052B-R (서열번호 26, 27)를 통해 증폭하여 다시 오버래핑(Overlapping) PCR 방법으로 연결하여 pK19mobSacB (Life Science Market) 에 SalI과 BamHI 제한효소를 이용하여 재조합용 pK19-Cg2052ss를 제작하였다. 이 벡터를 최소 1 ug/ul 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 전기천공법을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때 전기천공한 균주를 카나마이신(kanamycin)이 20ug/ul 포함되는 LB 한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주는 다시 2차 재조합을 유도하기 위해 10% 수크로오스(sucrose)를 함유한 LB 한천액체배지에 하룻밤 배양하여 동일 농도의 수크로오스 한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리된 콜로니 중 항생제 카나마이신(kanamycin) 내성 여부를 확인한 후 항생제 내성이 없는 균주들 중 Cg2052 유전자가 결실되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 제작된 균주를 C. glutamicum SP001 균주라고 명명하였다.

실시예 5: C. glutamicum SP001 균주를 이용한 고농도 유가식 배양

동일한 pHCP-CgR-DagA-TatAC를 이용하여 C. glutamicum SP001 균주에 형질전환 후, 2L 고농도유가식 배양을 진행하였다. 방법은 실시예 2의 유가식 배양과 동일하게 진행하였고, 도 9a와 같이 성장속도와, 글루코스 소모, 분비 발현 단백질 양을 측정하였다. 그러나 도 9b와 같이 단백질인 DagA(36 kDa)외에 또 27 kDa 크기의 2번째 unknown 단백질이 전체 분비된 단백질의 약 33%를 차지하는 양으로 분비됨을 확인하였다.

실시예 6: C. glutamicum SP002 균주의 제작

실시예 4에서 확인한 2번째 unknown 단백질을 규명하기 위하여 MALDI-TOF-MS를 이용한 분석을 시행한 결과, 도10과 같은 결과를 얻을 수 있었고, 이는 C. glutmaicum ATCC13032가 가지고 있는 Cg1514 단백질(CAF21351.1) 임을 확인할 수 있었다. C. glutamicum SP001 균주를 이용한 유가식 배양에서도 목적 단백질 외에 높은 양의 Cg1514 단백질이 분비생성됨을 확인하였고, 이에 대한 영향을 제거하기 위해 추가로 Cg1514의 분비신호서열 유전자를 제거하기로 하였다. Cg1514 단백질의 분비신호서열(서열번호 2)을 SignalP-5.0 프로그램을 통해서 분석한 후, 분비신호서열만 제거하기 위해 분비신호서열 앞 500 bp를 Cg1514A-F, Cg1514A-R (서열번호 28, 29)으로 증폭하고, 분비신호서열 뒤 500 bp를 Cg1514B-F, Cg1514B-R (서열번호 30, 31)를 통해 증폭하여 다시 오버래핑(Overlapping) PCR 방법으로 연결하여 pK19mobSacB에 SalI과 BamHI 제한효소를 이용하여 재조합용 pK19-Cg1514ss를 제작하였다. 이 후 과정은 실시예 3에서 시행한 방법과 동일한 방법을 통하여 C. glutamicum SP001 균주에서 Cg1514 유전자가 추가로 제거된 C. glutamicum SP002를 제조하였다.

실시예 7: C. glutamicum SP002 균주를 이용한 고농도 유가식 배양

최종적으로 구축한 SP002균주를 이용하여 모델 단백질인 DagA의 분비생산을 고농도 유가식 배양을 통해 확인하였다. 유가식 배양은 실시예 3에 기술한 바와 동일하게 진행하였고, 단백질 분석은 농축과정 없이 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 도 12와 같이 분비된 DagA의 농도가 2.0 g/L이고, 순도는 93%로 확인하였다. 이는 개량된 SP002 균주가 분비생산에 있어서 순도 높은 분비를 가능하게 하여 고농도의 분비가 가능한 분비에 적합한 균주라는 것을 확인할 수 있는 결과이다.

실시예 8: 서열정보

Cg2052 분비 신호 아미노산 서열(서열번호 1)

MLRKTVTGGIVALIATATLMNSVSSA

Cg1514 분비 신호 아미노산 서열(서열번호 2)

MLNRVSRIAGASAITLCIGLTTILSPTSTAQS

CgR0949 분비 신호 아미노산 서열 (서열번호 3)

MQINRRGFLKATAGLATIGAASMFMPKANALGA

TorA 분비 신호 펩타이드 아미노산 서열 (Escherichia coli str. K-12 유래, AYG19906.1) (서열번호 4)

MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA

CspA 분비 신호 펩타이드 아미노산 서열 (Corynebacterium ammoniagenes 유래, BAB62413.1) (서열번호 5)

MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATA

PorB 분비 신호 펩타이드 아미노산 서열 (Corynebacterium glutamicum ATCC13032 유래, DAA01140.1) (서열번호 6)

MKLSHRIAAMAATAGITVAAFAAPASA

CgR_2070 분비 신호 펩타이드 아미노산 서열 (Corynebacterium glutamicum R유래, BAF55069.1) (서열번호 7)

MGKHRRNNSNATRKAVAASAVALGATAAIASPAQA

AprE 분비 신호 펩타이드 아미노산 서열 (Bacillus subtilis 유래, WP_014479360.1) (서열번호 8)

MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQA

서열번호 9 -TatAC

ATGTCCATTGTTGAGCACATCAAAGAGTTTCGACGCCGACTTCTTATCGCTCTGGCGGGCATCCTCGTGGGCACCATTATCGGCTTTATTTGGTACGATTTCTCATTTTGGCAGATCCCCACTTTGGGCGAGCTGCTGAGGGATCCGTACTGTTCTCTGCCTGCTGAATCCCGCTGGGCCATGAGCGACTCAGAGGAATGTCGACTGCTCGCAACCGGCCCGTTTGATCCATTCATGCTTCGCCTTAAAGTAGCGGCGTTGGTGGGTATGGTTCTTGGCTCACCCGTGTGGCTGAGCCAGCTGTGGGGCTTTATCACCCCAGGTTTGATGAAGAATGAGCGCCGTTACACCGCAATCTTCGTCACGATTGCTGTTGTGCTGTTTGTCGGCGGTGCTGTTCTTGCGTACTTCGTCGTTGCATATGGTTTGGAGTTCCTCCTTACCATTGGTGGAGACACCCAGGCAGCGGCCCTGACTGGTGATAAGTACTTCGGATTCTTGCTCGCGTTGTTGGCGATTTTCGGCGTGAGCTTCGAAGTTCCACTGGTGATCGGCATGCTCAACATTGTGGGTATCTTGCCTTACGATGCCATTAAAGATAAGCGACGCATGATCATCATGATTTTGTTCGTGTTCGCTGCTTTCATGACACCCGGCCAGGATCCTTTCACCATGTTGGTGTTGGCGCTTTCACTCACCGTTCTGGTAGAGCTTGCCCTGCAGTTCTGTCGTTTCAACGACAAACGCCGGGACAAGAAGCGCCCAGAATGGCTTGATGGCGATGACCTCTCTGCATCACCACTGGATACTTCTGCTGGTGGAGAAGATGCTCCAAGCCCAGTCGAAACCCCAGAGGCGGTGGAGCCTTCGCGGATGCTGAACCCAAGTGGGGAGGCGTCGATAAGCTATAAACCCGGGCGCGCCGACTTCGGTGACGTGCTCTAA

서열번호 10-TatA (뉴클레오티드 서열)

ATGTCCCTCGGACCATGGGAAATTGGAATCATTGTCCTGCTGATCATCGTGCTGTTCGGCGCGAAGAAGCTGCCTGATGCAGCTCGTTCCATCGGCCGTTCCATGCGCATCTTCAAGTCTGAAGTCAAAGAAATGAACAAGGACGGCGATACCCCAGAACAACAGCAGCAGCCTCAGCAGCAGATTGCGCCCAACCAGATCGAGGCTCCTCAGCCAAACTTTGAGCAGCACTACCAGGGACAGCAGGTTCAGCAGCCTCAGAACCCTCAGACCCCTGACTACCGTCAGAACTACGAGGATCCAAACCGCACCTCTTAA

서열번호 11-TatA (아미노산 서열)

MSLGPWEIGIIVLLIIVLFGAKKLPDAARSIGRSMRIFKSEVKEMNKDGDTPEQQQQPQQQIAPNQIEAPQPNFEQHYQGQQVQQPQNPQTPDYRQNYEDPNRTS*

서열번호12-TatC (뉴클레오티드 서열)

ATGTCCATTGTTGAGCACATCAAAGAGTTTCGACGCCGACTTCTTATCGCTCTGGCGGGCATCCTCGTGGGCACCATTATCGGCTTTATTTGGTACGATTTCTCATTTTGGCAGATCCCCACTTTGGGCGAGCTGCTGAGGGATCCGTACTGTTCTCTGCCTGCTGAATCCCGCTGGGCCATGAGCGACTCAGAGGAATGTCGACTGCTCGCAACCGGCCCGTTTGATCCATTCATGCTTCGCCTTAAAGTAGCGGCGTTGGTGGGTATGGTTCTTGGCTCACCCGTGTGGCTGAGCCAGCTGTGGGGCTTTATCACCCCAGGTTTGATGAAGAATGAGCGCCGTTACACCGCAATCTTCGTCACGATTGCTGTTGTGCTGTTTGTCGGCGGTGCTGTTCTTGCGTACTTCGTCGTTGCATATGGTTTGGAGTTCCTCCTTACCATTGGTGGAGACACCCAGGCAGCGGCCCTGACTGGTGATAAGTACTTCGGATTCTTGCTCGCGTTGTTGGCGATTTTCGGCGTGAGCTTCGAAGTTCCACTGGTGATCGGCATGCTCAACATTGTGGGTATCTTGCCTTACGATGCCATTAAAGATAAGCGACGCATGATCATCATGATTTTGTTCGTGTTCGCTGCTTTCATGACACCCGGCCAGGATCCTTTCACCATGTTGGTGTTGGCGCTTTCACTCACCGTTCTGGTAGAGCTTGCCCTGCAGTTCTGTCGTTTCAACGACAAACGCCGGGACAAGAAGCGCCCAGAATGGCTTGATGGCGATGACCTCTCTGCATCACCACTGGATACTTCTGCTGGTGGAGAAGATGCTCCAAGCCCAGTCGAAACCCCAGAGGCGGTGGAGCCTTCGCGGATGCTGAACCCAAGTGGGGAGGCGTCGATAAGCTATAAACCCGGGCGCGCCGACTTCGGTGACGTGCTCTAA

서열번호13 -TatC (아미노산 서열)

MSIVEHIKEFRRRLLIALAGILVGTIIGFIWYDFSFWQIPTLGELLRDPYCSLPAESRWAMSDSEECRLLATGPFDPFMLRLKVAALVGMVLGSPVWLSQLWGFITPGLMKNERRYTAIFVTIAVVLFVGGAVLAYFVVAYGLEFLLTIGGDTQAAALTGDKYFGFLLALLAIFGVSFEVPLVIGMLNIVGILPYDAIKDKRRMIIMILFVFAAFMTPGQDPFTMLVLALSLTVLVELALQFCRFNDKRRDKKRPEWLDGDDLSASPLDTSAGGEDAPSPVETPEAVEPSRMLNPSGEASISYKPGRADFGDVL*

서열번호 14-TatB (뉴클레오티드 서열)

ATGTTTTCTAGCGTGGGTTGGGGAGAGATCTTCCTCTTAGTCGTTGTGGGCCTTGTTGTCATCGGCCCGGAACGGTTGCCTCGTTTGATCCAGGACGCACGCGCTGCGCTGCTCGCTGCACGTACCGCTATCGACAATGCAAAGCAGTCGTTGGACAGTGATTTTGGTTCGGAATTTGATGAAATCCGAAAGCCACTAACCCAGGTTGCACAGTACAGCCGGATGAGCCCCAAGACGGCCATCACTAAGGCGTTATTTGATAATGATTCCTCGTTCCTGGATGACTTTGATCCAAAGAAGATCATGGCCGAAGGAACAGAAGGCGAAGCTCAGCGCAACAAGCAGGCAGCTGACAACAATGCGAATGTGGTGGAACGTCCAGCTGATGGTTCCACCGCACGCCCAACGCAAAACGATCCAAAAGACGGCCCGAATTACTCAGGTGGCGTCTCTTGGACCGATATTATTTAG

서열번호15-TatB (아미노산 서열)

MFSSVGWGEIFLLVVVGLVVIGPERLPRLIQDARAALLAARTAIDNAKQSLDSDFGSEFDEIRKPLTQVAQYSRMSPKTAITKALFDNDSSFLDDFDPKKIMAEGTEGEAQRNKQAADNNANVVERPADGSTARPTQNDPKDGPNYSGGVSWTDII*

프라이머 서열

Primer	Sequences (5′ to 3′)	서열번호
CgR0949-F	gcatgggatccatgcaaataaaccgccgaggcttcttaaaagc	16
CgR0949-R	tgggcctctagatgctccaagggcgttggcctttggc	17
DagA_F	CTAGAGGCCCAGCCGGCCAAGCAGACCTCGAATGGGAAC	18
DagA_R	ggccgcggcccccgaggccctatttgtcatcgtcatctttataatccacggcctgatacgtcctgacccagcggtagta	19
TatAC-F	ggggccgcggccgcaagaaggagatataatgtccctcggaccatgg	20
TatAC-R	aggcagcggccgcaactagtgtgtcagatctttagagcacgtcaccgaagtcggcgcgcccgg	21
TatB-F	ctctaaagatcttttttaatccttatttacattttctgaaagaccggtc	22
TatB-R	cggccgcaactagtctaaataatatcggtccaagagacgccacctgagtaat	23
Cg2052A-F	TGACAGTCGACAGGTCACGACACAGAGT	24
Cg2052A-R	CAACAGTGTTTCAAACTAAAAAACGACGGGATTCCTTTCTGTTTTGC	25
Cg2052B-F	GCAAAACAGAAAGGAATCCCGTCGTTTTTTAGTTTGAAACACTGTTG	26
Cg2052B-R	TGTCAGGATCCAAAACTTCTTCGAGATCACTCTTTTG	27
Cg1514A-F	TAGACGTCGACCATCAACAACGCAAAATACTGGAT	28
Cg1514A-R	AGGGGTGATCTGTTCGAGCAAAAAGAGCTCCTGATCATGTA	29
Cg1514B-F	TACATGATCAGGAGCTCTTTTTGCTCGAACAGATCACCCCT	30
Cg1514B-R	TGTCAGGTACCATTGTCTCGTGGTTTGTTGC	31

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A recombinant Corynebacterium having enhanced secreted production efficiency of target protein <130> P20-B251 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Leu Arg Lys Thr Val Thr Gly Gly Ile Val Ala Leu Ile Ala Thr 1 5 10 15 Ala Thr Leu Met Asn Ser Val Ser Ser Ala 20 25 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Leu Asn Arg Val Ser Arg Ile Ala Gly Ala Ser Ala Ile Thr Leu 1 5 10 15 Cys Ile Gly Leu Thr Thr Ile Leu Ser Pro Thr Ser Thr Ala Gln Ser 20 25 30 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Gln Ile Asn Arg Arg Gly Phe Leu Lys Ala Thr Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Thr Ile Gly Ala Ala Ser Met Phe Met Pro Lys Ala Asn Ala Leu Gly 20 25 30 Ala <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala 35 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 5 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Lys Leu Ser His Arg Ile Ala Ala Met Ala Ala Thr Ala Gly Ile 1 5 10 15 Thr Val Ala Ala Phe Ala Ala Pro Ala Ser Ala 20 25 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 Met Gly Lys His Arg Arg Asn Asn Ser Asn Ala Thr Arg Lys Ala Val 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Val Ala Leu Gly Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Pro 20 25 30 Ala Gln Ala 35 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 8 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala 20 25 <210> 9 <211> 945 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 9 atgtccattg ttgagcacat caaagagttt cgacgccgac ttcttatcgc tctggcgggc 60 atcctcgtgg gcaccattat cggctttatt tggtacgatt tctcattttg gcagatcccc 120 actttgggcg agctgctgag ggatccgtac tgttctctgc ctgctgaatc ccgctgggcc 180 atgagcgact cagaggaatg tcgactgctc gcaaccggcc cgtttgatcc attcatgctt 240 cgccttaaag tagcggcgtt ggtgggtatg gttcttggct cacccgtgtg gctgagccag 300 ctgtggggct ttatcacccc aggtttgatg aagaatgagc gccgttacac cgcaatcttc 360 gtcacgattg ctgttgtgct gtttgtcggc ggtgctgttc ttgcgtactt cgtcgttgca 420 tatggtttgg agttcctcct taccattggt ggagacaccc aggcagcggc cctgactggt 480 gataagtact tcggattctt gctcgcgttg ttggcgattt tcggcgtgag cttcgaagtt 540 ccactggtga tcggcatgct caacattgtg ggtatcttgc cttacgatgc cattaaagat 600 aagcgacgca tgatcatcat gattttgttc gtgttcgctg ctttcatgac acccggccag 660 gatcctttca ccatgttggt gttggcgctt tcactcaccg ttctggtaga gcttgccctg 720 cagttctgtc gtttcaacga caaacgccgg gacaagaagc gcccagaatg gcttgatggc 780 gatgacctct ctgcatcacc actggatact tctgctggtg gagaagatgc tccaagccca 840 gtcgaaaccc cagaggcggt ggagccttcg cggatgctga acccaagtgg ggaggcgtcg 900 ataagctata aacccgggcg cgccgacttc ggtgacgtgc tctaa 945 <210> 10 <211> 318 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10 atgtccctcg gaccatggga aattggaatc attgtcctgc tgatcatcgt gctgttcggc 60 gcgaagaagc tgcctgatgc agctcgttcc atcggccgtt ccatgcgcat cttcaagtct 120 gaagtcaaag aaatgaacaa ggacggcgat accccagaac aacagcagca gcctcagcag 180 cagattgcgc ccaaccagat cgaggctcct cagccaaact ttgagcagca ctaccaggga 240 cagcaggttc agcagcctca gaaccctcag acccctgact accgtcagaa ctacgaggat 300 ccaaaccgca cctcttaa 318 <210> 11 <211> 105 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 11 Met Ser Leu Gly Pro Trp Glu Ile Gly Ile Ile Val Leu Leu Ile Ile 1 5 10 15 Val Leu Phe Gly Ala Lys Lys Leu Pro Asp Ala Ala Arg Ser Ile Gly 20 25 30 Arg Ser Met Arg Ile Phe Lys Ser Glu Val Lys Glu Met Asn Lys Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Pro Glu Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Ile Ala Pro 50 55 60 Asn Gln Ile Glu Ala Pro Gln Pro Asn Phe Glu Gln His Tyr Gln Gly 65 70 75 80 Gln Gln Val Gln Gln Pro Gln Asn Pro Gln Thr Pro Asp Tyr Arg Gln 85 90 95 Asn Tyr Glu Asp Pro Asn Arg Thr Ser 100 105 <210> 12 <211> 945 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 12 atgtccattg ttgagcacat caaagagttt cgacgccgac ttcttatcgc tctggcgggc 60 atcctcgtgg gcaccattat cggctttatt tggtacgatt tctcattttg gcagatcccc 120 actttgggcg agctgctgag ggatccgtac tgttctctgc ctgctgaatc ccgctgggcc 180 atgagcgact cagaggaatg tcgactgctc gcaaccggcc cgtttgatcc attcatgctt 240 cgccttaaag tagcggcgtt ggtgggtatg gttcttggct cacccgtgtg gctgagccag 300 ctgtggggct ttatcacccc aggtttgatg aagaatgagc gccgttacac cgcaatcttc 360 gtcacgattg ctgttgtgct gtttgtcggc ggtgctgttc ttgcgtactt cgtcgttgca 420 tatggtttgg agttcctcct taccattggt ggagacaccc aggcagcggc cctgactggt 480 gataagtact tcggattctt gctcgcgttg ttggcgattt tcggcgtgag cttcgaagtt 540 ccactggtga tcggcatgct caacattgtg ggtatcttgc cttacgatgc cattaaagat 600 aagcgacgca tgatcatcat gattttgttc gtgttcgctg ctttcatgac acccggccag 660 gatcctttca ccatgttggt gttggcgctt tcactcaccg ttctggtaga gcttgccctg 720 cagttctgtc gtttcaacga caaacgccgg gacaagaagc gcccagaatg gcttgatggc 780 gatgacctct ctgcatcacc actggatact tctgctggtg gagaagatgc tccaagccca 840 gtcgaaaccc cagaggcggt ggagccttcg cggatgctga acccaagtgg ggaggcgtcg 900 ataagctata aacccgggcg cgccgacttc ggtgacgtgc tctaa 945 <210> 13 <211> 314 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 13 Met Ser Ile Val Glu His Ile Lys Glu Phe Arg Arg Arg Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Ile Leu Val Gly Thr Ile Ile Gly Phe Ile Trp Tyr 20 25 30 Asp Phe Ser Phe Trp Gln Ile Pro Thr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Asp 35 40 45 Pro Tyr Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ser Arg Trp Ala Met Ser Asp Ser 50 55 60 Glu Glu Cys Arg Leu Leu Ala Thr Gly Pro Phe Asp Pro Phe Met Leu 65 70 75 80 Arg Leu Lys Val Ala Ala Leu Val Gly Met Val Leu Gly Ser Pro Val 85 90 95 Trp Leu Ser Gln Leu Trp Gly Phe Ile Thr Pro Gly Leu Met Lys Asn 100 105 110 Glu Arg Arg Tyr Thr Ala Ile Phe Val Thr Ile Ala Val Val Leu Phe 115 120 125 Val Gly Gly Ala Val Leu Ala Tyr Phe Val Val Ala Tyr Gly Leu Glu 130 135 140 Phe Leu Leu Thr Ile Gly Gly Asp Thr Gln Ala Ala Ala Leu Thr Gly 145 150 155 160 Asp Lys Tyr Phe Gly Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ile Phe Gly Val 165 170 175 Ser Phe Glu Val Pro Leu Val Ile Gly Met Leu Asn Ile Val Gly Ile 180 185 190 Leu Pro Tyr Asp Ala Ile Lys Asp Lys Arg Arg Met Ile Ile Met Ile 195 200 205 Leu Phe Val Phe Ala Ala Phe Met Thr Pro Gly Gln Asp Pro Phe Thr 210 215 220 Met Leu Val Leu Ala Leu Ser Leu Thr Val Leu Val Glu Leu Ala Leu 225 230 235 240 Gln Phe Cys Arg Phe Asn Asp Lys Arg Arg Asp Lys Lys Arg Pro Glu 245 250 255 Trp Leu Asp Gly Asp Asp Leu Ser Ala Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ala 260 265 270 Gly Gly Glu Asp Ala Pro Ser Pro Val Glu Thr Pro Glu Ala Val Glu 275 280 285 Pro Ser Arg Met Leu Asn Pro Ser Gly Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Lys 290 295 300 Pro Gly Arg Ala Asp Phe Gly Asp Val Leu 305 310 <210> 14 <211> 471 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 14 atgttttcta gcgtgggttg gggagagatc ttcctcttag tcgttgtggg ccttgttgtc 60 atcggcccgg aacggttgcc tcgtttgatc caggacgcac gcgctgcgct gctcgctgca 120 cgtaccgcta tcgacaatgc aaagcagtcg ttggacagtg attttggttc ggaatttgat 180 gaaatccgaa agccactaac ccaggttgca cagtacagcc ggatgagccc caagacggcc 240 atcactaagg cgttatttga taatgattcc tcgttcctgg atgactttga tccaaagaag 300 atcatggccg aaggaacaga aggcgaagct cagcgcaaca agcaggcagc tgacaacaat 360 gcgaatgtgg tggaacgtcc agctgatggt tccaccgcac gcccaacgca aaacgatcca 420 aaagacggcc cgaattactc aggtggcgtc tcttggaccg atattattta g 471 <210> 15 <211> 156 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 15 Met Phe Ser Ser Val Gly Trp Gly Glu Ile Phe Leu Leu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Val Ile Gly Pro Glu Arg Leu Pro Arg Leu Ile Gln Asp 20 25 30 Ala Arg Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Thr Ala Ile Asp Asn Ala Lys 35 40 45 Gln Ser Leu Asp Ser Asp Phe Gly Ser Glu Phe Asp Glu Ile Arg Lys 50 55 60 Pro Leu Thr Gln Val Ala Gln Tyr Ser Arg Met Ser Pro Lys Thr Ala 65 70 75 80 Ile Thr Lys Ala Leu Phe Asp Asn Asp Ser Ser Phe Leu Asp Asp Phe 85 90 95 Asp Pro Lys Lys Ile Met Ala Glu Gly Thr Glu Gly Glu Ala Gln Arg 100 105 110 Asn Lys Gln Ala Ala Asp Asn Asn Ala Asn Val Val Glu Arg Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Ser Thr Ala Arg Pro Thr Gln Asn Asp Pro Lys Asp Gly Pro 130 135 140 Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Trp Thr Asp Ile Ile 145 150 155 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CgR0949-F <400> 16 gcatgggatc catgcaaata aaccgccgag gcttcttaaa agc 43 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CgR0949-R <400> 17 tgggcctcta gatgctccaa gggcgttggc ctttggc 37 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DagA_F <400> 18 ctagaggccc agccggccaa gcagacctcg aatgggaac 39 <210> 19 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DagA_R <400> 19 ggccgcggcc cccgaggccc tatttgtcat cgtcatcttt ataatccacg gcctgatacg 60 tcctgaccca gcggtagta 79 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TatAC-F <400> 20 ggggccgcgg ccgcaagaag gagatataat gtccctcgga ccatgg 46 <210> 21 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TatAC-R <400> 21 aggcagcggc cgcaactagt gtgtcagatc tttagagcac gtcaccgaag tcggcgcgcc 60 cgg 63 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TatB-F <400> 22 ctctaaagat cttttttaat ccttatttac attttctgaa agaccggtc 49 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TatB-R <400> 23 cggccgcaac tagtctaaat aatatcggtc caagagacgc cacctgagta at 52 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg2052A-F <400> 24 tgacagtcga caggtcacga cacagagt 28 <210> 25 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg2052A-R <400> 25 caacagtgtt tcaaactaaa aaacgacggg attcctttct gttttgc 47 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg2052B-F <400> 26 gcaaaacaga aaggaatccc gtcgtttttt agtttgaaac actgttg 47 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg2052B-R <400> 27 tgtcaggatc caaaacttct tcgagatcac tcttttg 37 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg1514A-F <400> 28 tagacgtcga ccatcaacaa cgcaaaatac tggat 35 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg1514A-R <400> 29 aggggtgatc tgttcgagca aaaagagctc ctgatcatgt a 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg1514B-F <400> 30 tacatgatca ggagctcttt ttgctcgaac agatcacccc t 41 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cg1514B-R <400> 31 tgtcaggtac cattgtctcg tggtttgttg c 31

Claims (6)

1. 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 cg2052의 분비 신호 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 cg1514의 분비 신호 펩타이드의 기능이 억제되어 있고,
   목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 도입되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 Cg2052 분비 신호 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 Cg1514 분비 신호 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 TorA 분비 신호 펩타이드, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CspA 분비 신호 펩타이드, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 Prorin B(PorB) 분비 신호 펩타이드, 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CgR_2070 분비 신호 펩타이드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 AprE 분비 신호 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 TorA 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA, TatB 및 TatC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CgR0949 분비 신호 펩타이드이고, 상기 재조합 미생물은 TatA 및 TatC 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
   
6. 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법:
   (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 유전자를 발현 및 분비·생산하는 단계: 및
   (b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계.

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