KR101175725B1 - 신규한 그람 양성균 박테리아 발현 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 그람 양성균 박테리아 발현 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 유래 신규 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물은 특정한 유도물질의 첨가없이 목적단백질을 효율적으로 과발현시킬 수 있다.

프로모터, 대장균, 코리네박테리움

Description

신규한 그람 양성균 박테리아 발현 시스템{Novel Gram-positive Bacteria Expression System}

본 발명은 신규한 그람 양성균 박테리아 발현 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 유래 신규 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

코리네형 미생물은 아미노산과 핵산물질이 코리네박테리움(Corynebacterium)에 의해 생산되는 것 이외에도, 치즈생산, 스테로이드 전환체, 항생제, 항암제, 탄화수소물의 분해 등의 분야에서 폭넓게 활용되고 있는 화학물질을 생산하는 미생물이다. 이외에도 이들 균주를 위한 숙주-벡터 시스템의 개발과 함께, 외부유전자 발현을 위한 숙주세포로서 코리네박테리움을 사용한 사례가 보고되었다.

재조합 DNA 기술을 이들 균주에 적용하기 위한 선결 조치로서 이들 코리네형 미생물에 대한 숙주-벡터 시스템의 개발은 필수적이다. 숙주-벡터 시스템은 DNA를 세포 내로 도입하기 위한 형질 전환법, 유전자 운반체로서의 벡터 개발, DNA 수용체로서의 숙주 세포의 개발 등을 포함하고 있다.

코리네형 세균에서 유전자를 발현시키기 위해서는, 일반적으로 자체 유전자들이 원래 갖고 있던 프로모터를 사용하는 것이 일반적이었다 (Vasicova, P., et al., J. Bacteriol., 181:6188-6191, 1999 등). 한편, 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업용 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum)의 플라스미드인 pAM330의 프로모터와, 트리메토프림 (trimetoprim)과 같은 항생제 내성 유전자의 프로모터를 이용하는 발현 벡터 개발이 현재까지의 실정이며, 대장균의 유발성 프로모터인 lacUV5, tac, P_RP_L 프로모터들의 유발성이 보고된 바가 있다. 이 밖에도 B. lactofermentum 파아지로부터 유래된 cos 부위를 도입한 cosmid 벡터에 관한 보고도 있지만, 실제 사용여부는 불투명하다.

특히, 대장균의 유발성 프로모터들은 목적 유전자의 발현을 위해서 특정한 발현 유도 인자를 첨가하여야 하기 때문에, 산업적인 대량 생산 시스템에서의 비용적으로나 안전성의 검증 문제로 인해 사용하기에 적합하지 않다. 따라서, 기존에 개발된 프로모터의 서열들은 유전자 발현의 선택성 및 발현효율 등의 측면에서 여전히 개선의 여지를 안고 있다.

이에, 본 발명자들은 코리네박테리움에서 목적 유전자를 과발현시킬 수 있는 강력한 프로모터를 탐색하던 중, 바실러스 서브틸리스 유래의 신규 프로모터가 코리네박테리움에서 목적유전자를 발현시킬 수 있고, 다양한 유전자로 형질전환된 형질전환체에서 목적유전자들이 특정한 유도물질의 첨가 없이 과발현됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 염기서열을 가지는 프로모터 및 상기 프로모터 및 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열 중 24번부터 68번까지의 염기서열을 함유하고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 염기서열을 가지는 프로모터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되, 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프로모터 또는 이를 함유하는 재조합 벡터가 삽입되어 있는 재조합 미생물은 특정한 유도물질의 첨가없이 목적 단백질을 과발현시킴으로써, 목적 단백질의 대량생산에 유용하다.

본 발명은, 일 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열 중 24번부터 68번까지의 염기서열을 함유하고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 염기서열을 가지는 프로모터에 관한 것으로, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세틸트렌스퍼라제 (acetyltransferase) 관련 프로모터로서, 바실러스 및 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터이다.

본 발명에서 "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, "프로모터"란, 전사개시점 (+1) 부터 20~30 염기에 대해 상류에 있고, 정확한 위치로부터 RNA 폴리머라아제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만, 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에, 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함해도 된다.

일반적으로 프로모터는 RNA 중합효소가 결합하여 전사개시를 유도하는 부분을 포함하며, 프로모터의 염기서열에 따라 RNA 합성 정도가 결정되기 때문에 프로모터에 따라 유전자의 발현 강도가 다를 수 있다. 또한, 프로모터는 두 가지 군으로 분류될 수 있고, 그 중 하나인 "유도성 프로모터 (inducible promoter)"는 유도성 물질(inducer)이 존재하는 경우에 상기 프로모터의 조절 하에 놓인 유전자의 발현을 촉진할 수 있는데, 이와 같이 유도성 프로모터를 이용하여 유전자를 발현시키는 경우에 값비싼 유도성 물질이 이용되어야만 하며, 경우에 따라 유도성 물질은 인체 또는 특정 숙주세포에 독성을 일으키는 문제가 있다. 또한, 유도성 물질을 투입하는 시간 및 배지내 유도성 물질의 농도 등 배양과정 중에 고려하여야 할 사항이 많다는 단점이 있다. 이와는 대조적으로 "구성성 프로모터 (constitutive promoter)"는 어떠한 특정 조건 없이, 즉 유도성 물질 없이 그의 조절하에 놓인 유전자의 전사를 촉진할 수 있다.

본 발명에서 "프로모터 활성" 이란, 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류에 위치하여 유전자의 발현을 개시 및 조절할 수 있는 능력을 갖는 것을 말한다. 즉, 프로모터의 하류에 발현가능한 상태로 유전자를 배치하여 얻어진 구축물을 숙주에 도입했을 때, 숙주내 또는 숙주외에서 이 유전자의 발현산물을 생산하는 능력 및 기능을 갖는 것을 말한다. 이러한, 프로모터 활성은 예컨대 프로모터 서열을 갖는 것으로 추정되는 서열을 확인이 용이한 단백질을 코딩하는 유전자(또는, 리포터 유전자라고도 함)의 상류에 연결하고, 숙주에 도입했을 때, 숙주내 또는 숙주외에서 이 유전자의 유전자 산물의 발현을 확인함으로써 실시할 수 있고, 여기에서 발 현이 관찰된 경우, 그 프로모터는 도입한 숙주에서 프로모터 활성을 갖는 것의 지표가 된다.

본 발명의 프로모터는, 또한 서열번호 1 또는 2의 염기서열에 있어서, 적어도 하나의 염기, 구체적으로는 한 개 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 또는 부가를 가지는 염기서열을 갖고, 또한 상기와 같은 구성성 프로모터 활성을 갖는 DNA도 포함되는 것이다. 일반적으로, 짧은 서열을 갖는 DNA에 있어서, 적어도 1개의 염기에 변이 (치환, 결실 또는 부가)를 가지는 DNA는, 그 활성이 변화되는 경우도 있지만, 상기 기재된 프로모터 활성을 확인하는 방법에 의해 프로모터 활성이 관찰된 "변이를 갖는 DNA" 또한, 본 발명에 포함된다.

구체적으로, 본 발명에 따른 프로모터 중 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터는 바실러스 서브틸리스 염색체로부터 아세틸트렌스퍼라제 관련 유전자 단편을 클로닝한 부분의 프로모터이며, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 프로모터는 상기 서열번호 1의 프로모터 서열 상류에 대장균의 rrnBP1 프로모터의 up element(-40 에서 -60 지역의 서열)를 붙인 좀 더 강력한 개량 프로모터이다. 그리하여, 서열번호 1과 서열번호 2의 공통된 서열(서열번호 1 및 2의 24번째 염기부터 68번째 염기까지)은 프로모터 활성에 있어 중요한 요소이며, 서열번호 1과 서열번호 2의 서열 동일성은 68%이다.

이로부터, 본 발명의 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 일부분만으로도, 바람직하게는, 상기 공통된 서열을 포함하고 있는 경우에는 서열번호 1 또는 2에 나타난 염기서열로 구성된 프로모터로서의 기능을 발휘 할 수 있다. 즉, 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 70% 이상 서열 동일성을 가지는, 바람직하게는, 적어도 80% 서열 동일성을 가지는, 보다 바람직하게는 90% 서열 동일성을 가지는, 보다 더 바람직하게는 95% 서열 동일성을 가지는 염기서열로 구성될 수 있다. 이러한 프로모터는, 서열번호 1 또는 2에 기재된 염기서열을 참조하여 화학적으로 합성하거나, 코리네박테리움의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 또는 2의 일정 부분에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로모터를 이용하여 PCR을 수행함으로써 제조할 수도 있다.

상기 "서열 동일성"이란, 2개의 폴리뉴클레오티드간 잔기의 서열 유사성을 말한다. 상기 "서열 동일성"은 비교대상의 염기서열의 영역에 걸쳐, 최적한 상태로 얼라인먼트된 2개의 염기서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 여기에서, 비교대상의 폴리뉴클레오티드는, 2개의 서열의 최적한 얼라인먼트를 위한 참고서열 (예컨대 컨센서스 서열 등)과 비교하여, 부가 또는 결실 (예컨대, 갭, 오버행 등)을 갖고 있어도 된다. 서열 동일성의 수치는 양방의 서열에 존재하는 동일한 핵산염기를 결정하여, 적합부위의 수를 결정하고, 이어서, 비교대상의 서열 영역내의 염기의 총수로, 상기 적합부위의 수를 나누어, 얻어진 수치에 100을 곱함으로써, 산출될 수 있다. 핵산 사이의 서열 동일성은, 예컨대, 서열 해석 소프트, 구체적으로는 BLASTN, FASTA 등을 사용하여 측정된다. 상기 BLASTN은, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/에서 일반적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 프로모터는 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있 고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.

본 발명에서는, 구체적으로, 바실러스 서브틸리스 유래 염색체 DNA를 기초로, 이들로부터 1차적으로 프로모터 활성을 나타내는 단편을 얻기 위해, 탐색용 벡터를 이용한다. 본 발명에서 이용가능한 프로모터 탐색용 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 공지의 항생제 저항성 유전자를 포함하면서도 상기 항생제 저항성 유전자의 프로모터를 포함하지 않는 셔틀벡터를 사용할 수도 있다. 공지된 항생제 저항성 유전자로는 암피실린 저항성 유전자 (Amp), 에리스로마이신 저항성 유전자 (Em), 카나마이신 저항성 유전자 (Km) 등이 있으며, 이들을 포함하는 벡터는 프로메가 (promega), NEB, RoChe, TAKARA 등에서 상업적으로 용이하게 구입할 수 있다. 상기 항생제 저항 유전자를 포함하는 벡터에서 상기 항생제 저항성 유전자의 상류에 위치한 프로모터의 제거는 적절한 제한 효소의 처리에 의해 용이하게 수행할 수 있으며, 상기 프로모터가 제거된 자리에 프로모터 활성이 있는지 여부를 판정하고자 하는 DNA 단편의 삽입도 적절한 제한효소 및 연결 효소의 처리에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명에서, 일 실시예로, 상업적으로 사용되고 있는 대장균 벡터인 pACE(제노포커스사) 벡터를 탐색 벡터로 사용한다. 또한, 여기에, 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다제 유전자를 증폭하여 삽입하고, 프로모터 제거한 다음, 후보 단편들을 그 자리에 삽입함으로써, 베타 갈락토시다제 활성에 의한 X-gal 반응을 이용하여 본 발명에 따른 프로모터를 선별한다.

본 발명에 따른 프로모터는 앞서 주지된 바와 같이 유도성 물질 없이도 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 강력하게 발현시키므로 목적 단백질을 제조하는데 유용하게 이용될 수 있다.

목적 단백질을 제조하기 위해서는 본 발명에 따른 프로모터와 이에 작동가능하게 연결된 목적 단백질의 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조가 선행되어야 한다. 이러한 재조합 발현 벡터가 본 발명의 한 측면을 구성한다. 상기 재조합발현 벡터는 공지되거나 상업적으로 입수 가능한 벡터를 이용하여 제조될 수 있는데, 이를 위하여 상기 벡터에 본래 포함된 프로모터와 본 발명에 따른 프로모터를 치환하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 프로모터와 벡터에 통상적으로 함유되는 조절 서열을 포함하도록 조합하여 제조할 수도 있다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 구체적으로는, 상기 프로모터 및 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되, 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터는 발현 벡터 즉, 적당한 숙주세포에서 목적단백질을 발현 할 수 있도록 전사를 가능하게 하는 프로모터, 프로모터의 다운 스트림에 목적 단백질을 발현하는 유전자, 미생물 내에 자가 복제가 가능한 유전자 및 목적하는 벡터를 선별하기 위한 항생물질의 유전자 등을 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 목적 유전자를 제외한 상기 유전자들은 벡터의 백본(backbone) 및 선택된 숙주에 따라 달라질 수 있으며, 벡터 제작이 있어서 상기 최소한으로 필요한 유전자들은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 유전자 발현 조건 및 목적에 따라 용이하게 선택 할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 또는 바이러스 벡터가 이용가능하며, 일 실시예로써, 상기 벡터의 백본으로서 pUC19를 이용할 수 있다.

추가적으로, 상기 재조합 벡터는 상기 목적단백질의 발현을 조절하는 조절서열을 포함할 수 있다. "조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 발현 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 상기 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈 내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다. 여기서, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

또한, 벡터가 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 그리고, 벡터는 선택마커 (selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다.

상기 벡터로 삽입 가능한 목적단백질을 코딩하는 유전자로는 특별히 제한되지 않으나, 본 발명의 프로모터와 기원이 같거나, 다른 유전자, 본 발명의 프로모터 또는 숙주세포에 이질적인 유전자까지 모두 포함한다. 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 효소, 사이토카인 또는 항체와 같은 단백질을 코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 베타 갈락토시다제(beta-galactosidase), 카탈라제(catalase), 녹색형광단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 등이 있으며, 그 외에도 β-글루쿠로니다제, 디하이드로폴레이트 환원효소, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 루시퍼라아제 유전자, 인터루킨 1 내지 12 유전자, 인터페론 α, β 및 γ 유전자, 면역글로블린 유전자, 혈압강하 펩타이드, 항암 펩타이드, 혈소판 응집 저해 펩타이드 등을 들 수 있다.

여기서, 베타 갈락토시다제는, 락타아제라고도 하며, 알릴 및 아릴-D-갈락토시드 외에 락토오스에도 작용하여 갈락토오스를 생성하는 효소이다. 베타 갈락토시다제는 락토오스와 같은 베타-D-갈락토피라노시드에서 비환원 말단 베타-D-갈락토오스를 가수분해하거나, 갈락토오스의 전이반응을 촉매하며 여러종류의 미생물을 비롯하여 식물과 동물에서 두루 발견된다. 이 효소의 가수분해 활성과 당 전이 활성은 모두 산업적 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분 해하며, 유당 불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 비피도박테리아의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당의 제조에 이용된다.

여기서, 카탈라제는 과산화수소가 분해되어 물과 산소가 만들어지는 반응을 촉매하는 효소이다. 카탈라제는 식물에서 광호흡과 지방산의 산화과정에서 생성되는 과산화수소를 포획함으로서 환경요인 뿐만 아니라 생리학적인 산화스트레스에 대해 중요한 방어기능을 수행하고 있다. 과산화수소는 표백제, 산화제, 유도제 제조 등에 광범위하게 사용되는 화학물질로서 최근에는 인쇄기판 에칭용, 반도체 제조용으로 사용함으로, 사용된 과산화수소의 효소적 방법으로의 제거를 위하여 카탈라제를 사용한다. 또한, 카탈라제 유전자는 다양한 스트레스에 대한 지표 유전자로 제시되고 있다.

여기서, 녹색형광단백질(GFP)은 2.6kb의 3개의 exon으로 구성된 238-residue polypeptide이다. 열이나, 극한의 pH, 화학적 변성제 등의 거친 자극하에서도 그 활성을 잃지 않으며, 포름알데히드에 고정된 후에도 계속적으로 형광을 발하는 성질을 가진 단백질이다. 녹색형광단백질은 밝은 녹색의 형광을 내기 때문에, 특정한 단백질 분자에 녹색형광단백질을 첨가하면 표적처럼 빛나서 세포가 어떻게 움직이고 성장하는가를 손에 쥐듯 알 수 있다. 의학이나 생명공학 분야의 연구에 널리 이용되며, 의약품 개발 등에 빠질 수 없는 기본적인 지표가 되고 있다.

여기서, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제는 항생제 클로람페니콜에 저항성을 가지는 박테리아 효소이다. 이 효소는 생명공학 분야에서 다양한 벡터의 구축시 항 생제 내성 마커로 사용되고 있으며, 의학에서는 미생물 감염에 투여시 미생물의 리보솜의 50S 서브유닛(subunit)과 결합해서 세균의 단백질 합성을 저해하는 역할을 한다.

상기 목적단백질을 코딩하는 유전자의 기원으로는 이에 한정되지 않으나 미생물, 식물, 곤충 및 동물이 포함되며, 이외에도 인공적으로 합성된 유전자가 포함될 수 있다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 신규 프로모터 또는 재조합 벡터가 삽입된, 다시 말해, 상기 신규 프로모터가 염색체 상에 삽입되거나, 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다. 상기 형질전환된 재조합 미생물은, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032와 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 양태로서, 과발현시키고자 하는 목적 유전자가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 상기한 바와 같은 미생물에 제한되는 것은 아니다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 본 발명의 구체적인 양태에서는 전기천공법을 사용한다.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 목적 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현하는 단계; 및 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 목적 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 적절한 배지와 목적 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수 가능하고, 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성 비율에 따라 만들 수도 있다. 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 회분식 또는 유가식 배양으로 배양될 수 있다.

"회분식 배양"은 모든 영양소가 발효 초기에 첨가되는 배양 방식 중의 하나를 의미한다. 회분식 배양에서 숙주세포는 배지 내의 필수 영양소 중 하나가 고갈 될 때까지, 또는 발효에 더 이상 바람직하지 않은 조건(예, pH가 미생물 성장을 저해하는 값으로 감소되는 경우)이 형성될 때까지 증식할 수 있다.

"유가식 배양"은 하나 이상의 영양소를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소가 배양물로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급하는 방식의 배양을 의미한다. 유가식 배양에서는 예컨대 pH 조절을 이용하여 바람직한 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 기준을 정하고, 필수 영양소를 배양물에 공급하여 1종 이상의 필수 영양소의 고갈을 방지한다. 영양소 공급 속도에 의해 결정되는 성장 속도로 효모 숙주세포는 계속 증식할 것이다. 일반적으로 단일 영양소, 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 다른 종류의 영양소 제한을 이용할 수도 있는데, 예를 들면 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 비타민 또는 아미노산과 같은 특정 영양소에 의한 제한(미생물이 그 화합물에 대한 영양요구성인 경우), 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한 등이 있다.

상기 배양된 재조합 미생물로부터의 단백질 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 신규 프로모터 확보

1) 바실러스 서브틸리스 염색체에서의 프로모터 후보 단편의 탐색

바실러스 서브틸리스로부터 프로모터를 선별하기 위해, LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl) 배지에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168을 배양하였고, 배양된 세포를 원심분리로 회수하여 분리된 세포는 염색체 DNA 추출 키트(RBC사)를 사용하여 최종적으로 염색체 DNA 500㎍을 분리하였다.

분리된 염색체 DNA 10 ㎍에 제한효소 HindIII 20 유닛(unit)을 가하여 완전히 절단하였고, 상기 제한효소에 의해 무작위로 생성된 염색체 DNA 단편들 중 약 500 bp 미만의 크기를 갖는 후보 단편들을 전기영동한 후 아가로스 젤을 절단하고, 회수용 키트(RBC사)로 회수하였다.

상기에 회수된 후보 단편들 중 프로모터 기능을 가지는 단편을 1차적으로 선별하기 위하여, 기존에 상업적으로 사용되는 대장균 벡터인 pACE(GenoFocus사) 벡터를 탐색용 벡터로 사용하였고, 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans ATCC31382) 유래의 베타 갈락토시다제(β-galactosidase; BgaC) 유전자를 서열번호 3 및 4의 프라이머로 PCR(polymerase chain reaction) 증폭하고, 제한효소 HindIII 와 EcoRI으로 절단하고, 동일 제한효소들로 절단된 상기 벡터에 삽입하였다. 상기 제한효소 처리에 의하여 pACE 벡터의 자체 프로모터는 제거된다. 베타 갈락토시다제가 삽입된 상기 탐색용 벡터를 제한효소 HindIII를 처리하고, 상기에서 제한효소 HindIII로 분리된 500 bp 미만의 후보 단편들을 기존의 프로모터 부위에 각각 삽입하고, T4 리가제 처리하여 결찰하였다.

서열번호 3: 5`-ATGTCACAATTAACGTATGATG-3`

서열번호 4: 5`- TCAAGGTGTTTTTGGTATTG-3`

상기 구축된 탐색용 벡터를 열충격 등의 방법으로 형질전환이 가능하게 만든 대장균 JM109에 도입시켰다. 상기 형질전환된 균주를 엠피실린 100 ㎍/ml, X-gal 50 ㎍/ml이 포함된 LB 한천배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl, 1.5% 한천)에 도말하여, 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 베타 갈락토시다제 활성에 의해 X-gal과의 반응으로 녹색을 띠는 대장균 콜로니를 프로모터가 작동하는 것으로 인식하고, 최종 가장 색깔이 진한 1개 콜로니를 선택하였다.

2) 신규 프로모터 ("200 프로모터") 확보

상기 선택한 콜로니로부터 프로모터의 염기서열을 생거(Sanger)등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467, 1977)에 따라 종래에 알려진 염기서열 결정키트 또는 결정프로토콜에 따라, (주) 솔젠트에 의뢰하여, 하기와 같은 염기서열을 가지는 프라이머(서열번호 5)를 사용하여, 염기서열이 신규한 프로모터를 함유한 pACE 벡터에서 결정하였다.

서열번호 5: 5`-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3`

그 결과, 348 bp의 단편을 확인하여 서열번호 6에 나타내었으며, 상기 348 bp의 단편 내에 프로모터 부분을 확인하여, 서열번호 1의 염기서열을 확인하고 이를 "200 프로모터"로 명명하였다.

3) 개량 프로모터 ("201 프로모터") 제작

션 (Shawn) 등의 연구(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 9761-9766, 1998)에서는 대장균 프로모터들에 특이적으로 일치하는 UP element 염기서열을 확인한 바가 있다. 상기 서열번호 1의 프로모터 서열 상류(5`-cttaacagcccatcctttttgta-3`)를 대장균의 rrnBP1 프로모터의 up element(-40에서 -60 지역서열; 5`-agaaaattattttaaatttcctc-3`) 서열로 치환하여 프로모터의 강도가 강해진 개량된 프로모터를 제작하였고, 이를 서열번호 2에 나타내었고, 이를 "201 프로모터"로 명명하였다. 상기 200 프로모터와 201 프로모터를 나타내는 서열번호 1 및 2의 염기서열 상동성(homology)은 66%이며, 이들 프로모터들의 공통된 서열은 프로모터 활성을 나타내는 부분이다.

상기 201 프로모터 또한 상기 기재한 방법과 동일한 방법으로 pACE 벡터로 이식하여 베타 갈락토시다제 활성을 확인하여 프로모터로서의 기능을 확인하였다.

실시예 2: 신규 프로모터 서열을 함유하는 재조합 벡터의 제조

상기 실시예 1에 따른 200 프로모터 및 201 프로모터에 의해 발현 유도되는 코리네박테리움/대장균 셔틀 벡터 (Corynebacterium /E. coli shuttle vector)를 제조하기 위해, 벡터의 백본(backbone)으로 pUC19(New England Biolab사)을 이용하였다.

상기 실시예 1에 따른 200 프로모터와 201 프로모터는 KpnI과 ClaI을 양 말단에 부착시켜 올리고 합성(BioNeer사)으로 제작한 후 제한효소 KpnI과 ClaI 처리를 하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머로 PCR을 수행하여 벡터의 복제 개시를 위한 염기서열 부위(Replication origin)를 증폭하였다. 또한, pKK223-3(Pharmacia사)벡터로부터 서열번호 9과 서열번호 10의 프라이머로 rrnB T1 종결자(terminator)를 pUB110(Sigma사)로부터 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머로 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 증폭하였다. 복제 개시 서열 부위는 제한효소 BglII와 DraI을 처리하였으며, 벡터 종결자는 제한효소 Xbal과 SalI으로 처리하였으며, 카나마이신 저항성 유전자는 제한효소 AatII와 SpeI으로 처리하였다. 벡터의 제한효소 동일 부위를 처리하고, T4 리가아제를 이용하여 pUC19 벡터에 순차적으로 삽입하였다. 이렇게 제조된 발현벡터 중 200 프로모터가 삽입된 발현벡터를 pSG200, 201 프로모터가 삽입된 발현벡터를 pSG201 이라고 명명하였다.

서열번호 7: AAAAACGGTGATCGGATTTT

서열번호 8: GATCTTTGGGAGCAGTCCTT

서열번호 9: GCTTAAATAAAACGAAAGGC

서열번호 10: AAAGAGTTTGTAGAAACGCA

서열번호 11: GTGAATGGACCAATAATAAT

서열번호 12: TCAAAATGGTATGCGTTTTG

실시예 3: 신규 프로모터를 이용한 재조합 GFP 발현벡터의 제조

상기 실시예 2에서 확보된 pSG200 벡터와 pSG201 벡터를 이용하여, 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)을 발현하기 위해, pSG200, pSG201 벡터를 제한효소 EcoRV와 NotI으로 절단하였다. 그리고, GFP가 삽입되어져 상용적으로 판매 되는 pEGFP-C1(Clontech사) 벡터에서 GFP를 주형으로 서열번호 13과 서열번호 14의 프라미어를 사용하여 GFP유전자를 증폭하였다.

서열번호 13: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

서열번호 14: TTATCTAGATCCGGTGGATC

증폭된 유전자를 제한효소 EcoRV와 NotI으로 절단하고, 동일 제한효소들로 절단된 pSG200, pSG201 벡터에 삽입하여 pSG200-GFP, pSG201-GFP를 완성하였다.

실시예 4: 신규 프로모터를 이용한 재조합 카탈라제 발현벡터의 제조

상기 실시예 2에서 제작된 pSG200 벡터와 pSG201 벡터를 이용하여 카탈라제(Catalase)를 발현하기 위해 pSG200, pSG201 벡터를 제한효소 XmaI과 XbaI으로 절단하였다. 그리고, 대장균 (E. coli K12) 유래의 게놈을 주형으로 서열번호 15과 서열번호 16의 프라미어를 사용하여 카탈라제 유전자(Genbank accession number: M55161)를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 제한효소 XmaI과 XbaI으로 절단하 고, 동일 제한효소들로 절단된 pSG200, pSG201 벡터에 삽입하여 pSG200-KatE, pSG201-KatE를 완성하였다.

서열번호 15: ATGTCGCAACATAACGAAAA

서열번호 16: TCAGGCAGGAATTTTGTCAA

실시예 5: 신규 프로모터를 이용한 재조합 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제 발현벡터의 제조

상기 실시예 2에서 제작된 pSG200 벡터와 pSG201 벡터를 이용하여, 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제 (Chloramphenicol acetyltransferase)를 발현하기 위해, pSG200, pSG201 벡터를 제한효소 XmaI과 XbaI으로 절단하였다. 그리고, 상용적으로 판매되는 pHT01(MoBiTec사) 벡터에 항생제 마커로 삽입되어 있는 스타필로코커스 오레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제 유전자(Genbank accession number: NC010427)를 주형으로 서열번호 17과 서열번호 18의 프라미어를 사용하여 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 제한효소 XmaI과 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소들로 절단된 pSG200, pSG201 벡터에 삽입하여 pSG200-cat, pSG201-cat를 완성하였다.

서열번호 17: ATGAACTTTAATAAAATTGA

서열번호 18: TTATAAAAGCCAGTCATTAG

실시예 6: 재조합 발현 벡터를 이용한 재조합 미생물의 제조

실시예 3 내지 5에서 제조된 각각의 재조합 발현 벡터를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032와 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872을 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하였다.

구체적으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 균주들은 LBG (1% 트립톤, 1% NaCl, 0.5 효모추출물, 2% 포도당) 배지 5 ml에 접종하여 30℃에서 하룻밤 배양한 다음, 100 ml의 Epo (1% 트립톤, 1% NaCl, 0.5% 효모추출물, 2.5% 글리신, 0.1% Tween 80, 0.4% 이소니코틴산) 배지에 2 ml의 종균을 접종하고 18℃에서 균의 생육이 OD₆₀₀에 0.8이 될 때까지 배양하였다. 그리고, 4℃에서 4,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 50 ml의 냉각 10% 글리세롤로 현탁하여 동일한 조건으로 원심분리하고, 다시 50 ml의 10% 글리세롤로 같은 과정을 반복하여 최종부피가 200 ㎕가 되는 컴피턴트 세포를 만들었다.

상기 컴피턴트 세포 200 ㎕와 실시예 3 내지 5에 따른 재조합 벡터 10 ㎍을 각각 섞어 0.2 cm 전기천공용 큐벳 (electroporation cuvette)에 넣고, 얼음에서 5 분간 정치 후 2500 volt, 600 Ω, 25 μF에서 전기천공 (electroporation)을 하여 각각 형질전환시켰다. 그 후, 즉시 1 mL의 LBHIS (0.5% 트립톤, 0.5% NaCl, 0.5% 효모추출물, 1.85% BHI(Brain Heart Infusion), 9.1% 솔비톨)를 붓고, 멸균된 마이크로 원심분리 튜브 (microcentrifuge tube)에 옮긴 후 46℃에서 6 분간 열충격을 가한 다음, 30℃에서 1 시간 동안 배양후 카나마이신 30 ㎍/ml, X-gal 50 ㎍/ml의 농도로 포함된 LBHIS 한천배지에 적당량을 깔았다.

실시예 7: 신규 프로모터의 발현 활성 측정

상기 실시예 6에서 수득된 형질전환 미생물들은 프로모터 서열의 활성측정을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

2% BHI(Brain Heart Infusion) 배지 100 ml이 담긴 1 L 코너-바플 플라스크에 밤새 LB (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl) 배지에 키운 실시예 6의 형질전환된 코리네박테리움 균주들을 5 ml 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양 하였다.

배양 종료 후 원심분리에 의해 균체를 회수하여 멸균 증류수에 현탁한 뒤 초음파 파쇄법으로 세포를 파괴하고 다시 고속원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 이용해 효소활성 및 단백질 전기영동을 수행하였다. 브래드포드 분석법(Bradford analysis)을 이용하여, 수득된 세포 추출물의 단백질 양을 측정하였다.

(1) GFP 발현 정도를 이용한 프로모터 서열의 발현 활성 측정

Laure Gory 등의 방법(Laure Gory, et al, FEMS Microbiology Letters, 194:127-33, 2001)을 이용하여, 동일 양의 세포 추출물에 대해 400 nm에서 여기광(pump laser)을 조사한 다음, 510 nm 발출광을 측정함으로써 GFP 단백질을 코딩하는 gfp 유전자의 발현 정도를 측정하였다.

상기 GFP 유전자의 발현에 의한 형광광도를 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 2 종류(코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 균주)의 재조합 미생물과 2종류(200 프로모터 및 201 프로모터)의 프로모터의 상관관계를 비교해 보았을 때, 201 프로모터를 사용한 pSG201-gfp 벡터가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰에서 GFP 단백질의 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.

(2) 단백질 전기영동을 위한 프로모터 서열의 발현 활성 측정

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 세퍼레이팅 젤(separating gel)이 아크릴아미드 (acrylamide)의 농도가 10%가 되도록 만들었고, 스태킹 젤 (stacking gel)은 아크릴아미드의 농도가 8%가 되도록 만들었다. SDS-PAGE 완충액은 25 mM Tris-base, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, pH8.3을 사용하였고, 세포 파쇄물의 상등액은 5×sample buffer (60mM Tris-HCl pH6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)와 혼합하여 100℃, 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치는 Bio-Rad, Mini-ProteanⅡ apparatus를 이용하였다.

실시예 6에서 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰과 재조합 코리네박테리움 암모니아게네스에서 상기 200 프로모터와 201 프로모터에 의한 카탈라제(Catalase)의 발현 양상을 단백질 전기영동으로 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 카탈라제는 전체 단백질 밴드에서 메인에 해당하는 양(화살표로 표시)으 로 나타났고, 코리네박테리움 암모니아게네스에서 201 프로모터를 사용시 가장 좋은 양상을 나타내는 것으로 보였다. 대조군은 상기 재조합 벡터가 형질전환되지 않은 코리네박테리움 암모니아게네스 또는 코리네박테리움 글루타미쿰을 의미한다.

또한, 실시예 6에서 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에서 200 프로모터와 201 프로모터에 의한 클로람페니콜아세틸트렌스퍼라제(Chloramphenicol acetyltransferase)의 발현 양상을 단백질 전기영동으로 간접적으로 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 클로람페니콜아세틸트렌스퍼라제는 200 프로모터와 201 프로모터에 의한 발현이 비슷한 양상을 나타내었다. 대조군은 상기 재조합 벡터가 형질전환되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 프로모터가 삽입된 재조합 벡터의 구축 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 프로모터에 의해 유도된 GFP의 발현 활성을 형광광도로 확인한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 프로모터에 의해 유도된 카탈라제의 발현양상을 단백질 전기영동으로 나타낸 결과이다 (a: 재조합 코리네박테리움 암모니아게네스 및 b: 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰).

도 4는 본 발명에 따른 프로모터에 의해 유도된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 클로람페니콜아세틸트렌스퍼라제의 발현 양상을 단백질 전기영동으로 나타낸 결과이다.

<110> GenoFocus Inje University <120> Promoter derived from Bacillus subtilis and Use thereof <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> 200 promoter <400> 1 cttaacagcc catccttttt gtattgaaaa aaacagaatc atcgctataa tgggtaaaaa 60 aggaaaga 68 <210> 2 <211> 68 <212> DNA <213> 201 promoter <400> 2 agaaaattat tttaaatttc ctcttgaaaa aaacagaatc atcgctataa tgggtaaaaa 60 aggaaaga 68 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of beta-galactosidase gene <400> 3 atgtcacaat taacgtatga tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of beta-galactosidase gene <400> 4 tcaaggtgtt tttggtattg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequencing primer for putative promoter search <400> 5 agcggataac aatttcacac agga 24 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213> A sequence region containing 200 promoter from Bacillus subtilis <400> 6 gatccaagaa tataaggatg ggcttaacag cccatccttt ttgtattgaa aaaaacagaa 60 tcatcgctat aatgggtaaa aaaggaaaga gggcgaggca atgttcactt gcaaggtaaa 120 tgagcacatc accatccgat tattggagcc gaaggatgcg gagcggctgg ccgaactcat 180 tatccaaaat cacgcacgcg gcttggcaag tggctgtttt ttgcggaaaa tccaagcagc 240 gctgacacgt accgagaaac aatcattcca gattggcggc gccagtatgc cgacctgaac 300 ggcattgagg cgggtctcct ttatgacggc agcctatgcg gcatgatc 348 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of Corynebacterium ori gene <400> 7 aaaaacggtg atcggatttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of Corynebacterium ori gene <400> 8 gatctttggg agcagtcctt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of rrnB T1 terminator gene <400> 9 gcttaaataa aacgaaaggc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of rrnB T1 terminator gene <400> 10 aaagagtttg tagaaacgca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of kanamycin gene <400> 11 gtgaatggac caataataat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of kanamycin gene <400> 12 tcaaaatggt atgcgttttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of gfp gene <400> 13 atggtgagca agggcgagga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of gfp gene <400> 14 ttatctagat ccggtggatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of catalase gene <400> 15 atgtcgcaac ataacgaaaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of catalase gene <400> 16 tcaggcagga attttgtcaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A forward primer for PCR of chloramphenicol acetyltransferase gene <400> 17 atgaacttta ataaaattga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A reverse primer for PCR of chloramphenicol acetyltransferase gene <400> 18 ttataaaagc cagtcattag 20

Claims (7)

1. 서열번호 2 또는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터.
2. 제1항의 프로모터와 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되, 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터.
3. 서열번호 2 또는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되, 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 목적단백질은 GFP, 카탈라제 및 클로람페니콜아세틸트렌스퍼라제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 제1항의 프로모터 또는 제3항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움 속인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
7. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현하는 단계; 및 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법.

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