CN108220288A - 一种聚核苷酸、转化子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚核苷酸，还涉及一种转化子。一种聚核苷酸，所述聚核苷酸的序列包含一个启动子所述启动子中含有原核生物σ^s因子的识别位点，优选地还包括该启动子的操纵序列，且所述启动子操纵包含λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点。一种转化子，所述转化子包含如上文所述的聚核苷酸。本发明还涉及该聚核苷酸、转化子的应用，特别是在发酵生产多肽，尤其是利用发酵生产的多肽产物生产1,5‑戊二胺方面的应用。本发明对λCI调控的λPR或λPL启动子的σ因子识别位点进行了修改，使其所控制的重组表达主要集中在生长稳定期，优选地，并让修改后的启动子保留了可诱导型，并且当在生长稳定期诱导时其重组表达优于野生型启动子。

Description

一种聚核苷酸、转化子及其应用

技术领域

本发明涉及一种聚核苷酸，还涉及一种转化子；本发明还涉及该聚核苷酸、转化子的应用，特别是在发酵生产多肽，尤其是利用发酵生产的多肽产物生产1,5-戊二胺方面的应用。

背景技术

在以表达重组蛋白为目的的发酵中，通常使用组成型启动子或诱导型启动子(又称可诱导启动子)来启动重组基因的表达。组成型启动子的表达为持续性表达，无需调控。诱导型启动子又分为阻遏型启动子和激活型启动子。阻遏型启动子与阻遏蛋白(或称转录抑制蛋白)结合，受到抑制；在诱导条件下，阻遏蛋白与启动子序列解离，解除抑制。对于阻遏型启动子而言，当阻遏蛋白缺失时，可视为处于持续诱导状态，也可当成组成型启动子。例如lac启动子受阻遏蛋白LacI抑制，是诱导型启动子。但lac启动子在不能表达LacI蛋白的宿主菌中可以组成型表达。激活型启动子在非诱导条件下不能表达或表达效率低；诱导条件下，激活蛋白被激活，并与激活型启动子结合，促使其表达。例如P_BAD启动子受激活蛋白AraC的激活。

根据重组发酵的实际需求，需要对启动表达的时间点做不同的调控。近来，自调控启动子(或称自诱导启动子)受到研究者的关注。这里所说的自调控启动子，是指在发酵的生长指数期末期或生长稳定期自动启动表达的启动子。这种启动子的优势是在发酵的前期无表达或表达较低，对宿主生长有利；而在发酵中后期无需添加诱导剂即可启动表达，节省成本。例如，研究者们通过筛选天然启动子或改造天然启动子，得到了一些在枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌宿主中主要在生长稳定期表达的启动子(见Guan等，“Construction anddevelopment of an auto-regulatory gene expression system in Bacillussubtilis”，Microbial Cell Factories(2015)14:150；Kim等，“Development of apotential stationary-phase specific gene expression system by engineering ofSigB-dependent cg3141 promoter in Corynebacterium glutamicum”，ApplliedMicrobiology and Biotechnology(2016)Volume 100，Issue10，pp4473-4483)。

原核生物的启动子中有两个关键性元件，-10元件和-35元件，分别位于转录起始点上游约-35和-10碱基位置，是σ因子识别位点。σ因子是原核生物RNA聚合酶全酶(包括RNA聚合酶核心酶和σ因子)中的辅助因子，在转录起始阶段起重要作用。不同的σ因子有不同的识别位点，因此RNA聚合酶核心酶可以与不同的σ因子结合，启动不同基因的转录。

以大肠杆菌为例，在大肠杆菌生长指数期中起主要作用的是σ⁷⁰因子。σ⁷⁰识别的-35元件的保守序列为T_-35TGACA_-30，-10元件的保守序列为T_-12ATAAT_-7，其中A_-11和T_-7保守程度最高(碱基的下标数字代表该碱基处于转录起始点上游的位置)。在天然启动子中，上述识别位点的位置和序列与保守序列相比都有一定程度上的变动。大肠杆菌中的σ^s因子主要在普遍应激反应和生长稳定期起作用。σ^s因子所识别的序列与σ⁷⁰因子所识别的序列在很大程度上相同，主要区别在于-10元件的保守序列有7个碱基，在-13位置有一个保守的C碱基。Weber等人分析了大肠杆菌基因组中在生长稳定期表达的基因的启动子序列，发现了位于启动子-14至-4核苷酸序列的保守序列：T_-14CTATACTTAA_-4，其中C_-13，T_-12，A_-11，和T_-7保守程度高(见“Genome-wide analysis of the general stress response network inEscherichia coli:σ^s-dependent genes,promoters,and sigma factor selectivity”，Journal of Bacteriology(2005)，Volume187，Issue 5，pp1591-1603)。

λ噬菌体阻遏蛋白CI(简称λCI、λCI蛋白)通过操纵位点控制λ噬菌体基因组中L(简称λP_L)和R启动子(简称λP_R)的表达。λ噬菌体基因组中共有6个λCI操纵位点，分别是OL1(TATCACCGCCAGTGGTA)，OL2(CAACACCGCCAGAGATA)，OL3(TATCACCGCAGATGGTT)，OR1(TACCTCTGGCGGTGATA)，OR2(TAACACCGTGCGTGTTG)，OR3(TATCACCGCAAGGGATA)。野生型λP_L和λP_R启动子的-10元件和-35元件分别与两个λCI操纵位点(OL1和OL2，或OR1和OR2)部分重合(见图1)，因此λCI与操纵位点的结合会阻碍RNA聚合酶与启动子的结合，抑制转录。λCI与各操纵位点的结合对启动子的活性都有一定的影响。对于λP_R来说，当OR1与OR2协同作用时，所起的抑制作用最大；OR1与OR3协同作用所起的抑制作用次之；而OR2与OR3协同作用或各操纵位点单独作用所起的抑制作用更弱。对于λP_L来说，也是OL1与OL2或与OL3协同作用所起的抑制作用最大。而远距离的操纵位点对于启动子的活性，例如OL位点对于λP_R，或OR位点对于λP_L(相距2.3kb)，亦有轻微的影响(见Lewis等，“New insights into the phagegenentic switch:Effects of bacteriophage lambda operator mutations on DNAlooping and regulation of P_R,P_L,and P_RM”,Journal of Molecular Biology(2016)，doi:10.1016/j.jmb.2016.08.027)。

野生型λCI可以被RecA蛋白诱导自切，解除对所控启动子的抑制。RecA蛋白的表达和活性受宿主菌DNA断裂所引起的SOS反应激活。因此能够造成宿主菌DNA断裂的条件，如化学诱导剂丝裂霉素C或萘啶酮酸，或UV辐射，都可以诱导λCI所控制的启动子的表达。

与野生型λCI相比，在重组表达上得到广泛应用的是λCI的热不稳定突变型CI857(见Valdez-Crus等，“Production of recombinant proteins in E.coli by the heatinducible expression system based on the phage lambda pL and/or pRpromoters”，Microbial Cell Factories(2010)9:18)。热不稳定的λCI蛋白在较低温度能够抑制λP_L或λP_R启动子的转录，而当温度升高时则失去抑制活性，因而其所控制的启动子具有热诱导的特性。λCI的热不稳定突变型还包括：I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E(见Jana等，“Amino acid changes in the repressor of bacteriophagelambda due to temperature-sensitive mutations in its cI gene and thestructure of a highly temperature-sensitive mutant repressor”，ProteinEngineering(1999)Volume 12，Issue 3，pp225-233)

本发明人通过实验发现，λ噬菌体启动子λP_R、λP_L在诱导条件下其表达主要集中在生长指数期。本案发明人要解决的技术问题是通过对启动子序列的改变将其改造成主要在生长稳定期表达的启动子，并且在某些技术方案中，该启动子仍保留可诱导性。

发明内容

本发明的第一方面目的在于提供一种聚核苷酸，该聚核苷酸包含一个启动子和该启动子的操纵序列，该启动子启动的重组表达主要集中在生长稳定期，以解决目前的技术问题。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的第一方面目的。

一种聚核苷酸，所述聚核苷酸包含启动子，所述启动子中含有原核生物σ^s因子的识别位点。优选地，所述原核生物σ^s因子的识别位点是大肠杆菌σ^s因子的识别位点。

优选地，所述聚核苷酸还包含该启动子的操纵序列，且所述启动子的操纵序列包含λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点(简称λCI操纵位点)

进一步，所述原核生物σ^s因子的识别位点含有如下保守序列：CTANNNT，其中N代表A、T、G、C四种碱基的任意一种。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述原核生物σ^s因子的识别位点含有如下序列：CTATACT。所述原核生物σ^s因子的识别位点位于转录起始点上游-13至-7区域。当然，所述原核生物σ_s因子的识别位点也可以向上游或向下游移动1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基位置。

本发明还提供了上述启动子的操纵序列。

在上述任一技术方案中，所述启动子的操纵序列中含有1个、2个、3个、4个、5个或6个λCI操纵位点。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述λCI操纵位点重复或不重复地选自λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3、上述操纵位点的突变型组成的集合。在上述任一技术方案中，所述λCI操纵位点可以与启动子序列重合(部分重合或完全重合)，可以在启动子上游，也可以在启动子下游。在一个实施例中，所述启动子的操纵序列包含至少一个λCI操纵位点，该λCI操纵位点与所述启动子转录起始点重合或位于所述启动子的转录起始点下游。

在上述任一技术方案中，所述启动子通过将λP_L或λP_R的σ⁷⁰因子的识别位点修改为σ^s因子的识别位点得到。

优选地，所述聚核苷酸的序列包含如SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26所示的序列，或如SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25，SEQ ID NO26所示序列的碱基互补序列。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述启动子是热诱导启动子、化学诱导启动子(或称化合物诱导启动子)或辐射诱导启动子；优选是热诱导启动子。

所述聚核苷酸可以是表达盒、质粒载体、质粒、噬菌体基因组、转座子或者是一段在宿主基因组中的聚核苷酸。

所述聚核苷酸包含一段作为RNA转录模板的聚核苷酸，所述RNA的转录受所述启动子控制。所述RNA包括编码RNA和非编码RNA。编码RNA指mRNA(信使RNA)，携带遗传信息，能指导多肽合成。非编码RNA包括rRNA(核糖体RNA)，tRNA(转运RNA)和sRNA(small RNA，smallregulatory RNA)等。sRNA通过与mRNA或DNA碱基互补结合，对基因表达起调节作用，例如siRNA(small interfering RNA)或CRISPR-CAS体系中的sgRNA(small guidance RNA)。

进一步，所述聚核苷酸包含一段mRNA转录模板，所述mRNA指导多肽的合成。

又进一步，所述质粒包含一段编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。

更进一步，所述多肽包括酶和多肽类药物。所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶中的至少一种。又更进一步，所述裂合酶是脱羧酶，特别是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。多肽类药物包括激素、抗体、生长因子等中的至少一种。在一个实施例中，表达的多肽是胰岛素原。

再更进一步，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段、haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：序列如SEQ ID NO 1所示的DNA，序列如SEQ ID NO 2所示的DNA，序列如SEQ ID NO 3所示的DNA，序列如SEQ ID NO 1所示的DNA的片段，序列如SEQ ID NO 2所示的DNA的片段，序列如SEQ ID NO 3所示的DNA的片段。本发明的第二方面目的在于提出一种转化子，所述转化子启动的重组表达主要集中在生长稳定期，以解决目前的技术问题。

一种转化子，所述转化子包含如上文任一技术方案所述的启动子和所述启动子的操纵序列，或者说包含如上文任一技术方案所述的聚核苷酸。

优选地，所述转化子包含上文任一项技术方案所述的聚核苷酸，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子表达λ噬菌体阻遏蛋白CI(简称λCI)或其突变型。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子中含有一段编码λCI或其突变型的聚核苷酸。又进一步，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在质粒上。更进一步，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸与所述编码多肽的聚核苷酸在同一个质粒上。或者，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在宿主基因组中。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子的宿主为原核生物细胞。更进一步，所述转化子的宿主选自埃希氏菌属(Escherichia)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种。

本发明的第三方面目的在于提出一种发酵生产多肽的方法及一种多肽，所述发酵生产多肽的方法中，转化子启动的重组表达主要集中在生长稳定期，以解决目前的技术问题。

一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

优选地，所述一种发酵生产多肽的方法是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子在诱导条件下启动重组表达，诱导条件为热诱导、化学诱导或辐射诱导。

在上述任一技术方案的基础上进一步，诱导条件为热诱导，所述诱导条件指温度为32℃～48℃。

本发明的第四方面目的在于提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，该方法使用的转化子启动的重组表达主要集中在生长稳定期，以解决目前的技术问题。

一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

I)按照上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；

II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。

本发明对λCI调控的λP_R或λP_L启动子的σ因子识别位点进行了修改，使其所控制的重组表达主要集中在生长稳定期，优选地，并让修改后的启动子保留了可诱导型，并且当在生长稳定期诱导时其重组表达优于野生型启动子。

附图说明

图1是λP_R和λP_L及其操纵序列图，其中λCI操纵位点OR1、OR2、OR3、OL1、OL2、OL3用实线方框标记；启动子中的-35元件和-10元件用括号标记；转录起始点用+1标记。

图2是实施例1中所述的pPR2-cadA重组表达质粒的结构示意图。

图3是实施例1～3中所述的重组表达质粒pPR2-cadA、pPRS-cadA、pPRS3-cadA、pPRS4-cadA、和pPRS6-cadA在cadA基因上游的序列片段。其中λP_R启动子的转录起始点用+1标记，其上游序列的碱基位置用-10、-20、-30标记；各启动子序列中-14至-4碱基序列用虚线方框标记；λCI操纵位点OR1用实线方框标记；cadA基因的起始密码子ATG用灰色字母表示；cadA基因上游的核糖体结合位点(用RBS表示)用下划线标记。

图4是实施例1～3中所述的重组表达菌株JM109/pPR2-cadA(泳道1-9)、JM109/pPRS-cadA(泳道10-18)、JM109/pPRS3-cadA(泳道19-27)、JM109/pPRS4-cadA(泳道28-36)和JM109/pPRS6-cadA(泳道37-45)等体积菌液的菌体蛋白电泳图。

具体实施方式

下面结合附图，详细说明本发明。

λP_R启动子位于-14至-4的核苷酸序列是G_-14TGATAATGGT_-4；λP_L启动子位于-14至-4的核苷酸序列是G_-14TGATACTGAG_-4。上述序列均符合σ⁷⁰识别的-10元件序列(分别为G_{- 12}ATAAT_-7和G_-12ATACT_-7)，但与σ^s因子识别的保守序列不符，尤其-13位置的碱基不是C。

本发明所述的聚核苷酸包含一个启动子及其操纵序列。所述启动子中含有原核生物RNA聚合酶σ^s因子的识别位点。所述σ^s因子的识别位点含有如下保守序列：CTANNNT，其中N代表A，T，G，C四种碱基的任意一种。在优选的实施例中，所述σ^s因子的识别位点含有如下序列：CTATACT。所述σ^s因子的识别位点位于转录起始点上游-13至-7碱基位置。当然，所述σ^s因子的识别位点也可以向上游或向下游移动1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基位置。

所述启动子的操纵序列中含有1个、2个、3个、4个、5个或6个λCI操纵位点。所述λCI操纵位点选自λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1，OL2，OL3，OR1，OR2，OR3，和上述操纵位点的突变型组成的集合。

本发明所述启动子及其操纵序列可以由天然启动子、天然启动子的突变型和人工构建的合成启动子构建得到。在某些实施例中，所使用的启动子为天然启动子的突变型，如在天然启动子核苷酸序列中出现一个或多个碱基置换、插入或删除。在某些实施例中，所使用的启动子为λP_R的突变型λPR A-32G或λPR T-41C。在某些实施例中，所使用的启动子为人工构建的合成启动子，包含将1个，2个，3个，4个，5个，6个λCI操纵位点序列与任一具有转录启动功能的启动子序列结合所构建的合成启动子。

所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。进一步地，所述诱导型启动子的诱导方式包括热诱导、化学诱导或辐射诱导。优选是热诱导。

本发明的优选的具体实施方式所述的聚核苷酸，包含如前文任一技术方案所述的启动子及其操纵序列，其中，在所述的启动子的转录起始点下游含有一个λCI操纵位点。所述λCI操纵位点可以是OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3之中的任意一个，或它们中任意一个发生碱基置换、插入或删除的突变型。所述λCI操纵位点可以在所述启动子所控制的表达基因的核糖体结合位点(RBS)上游，也可以在RBS下游。

所述聚核苷酸是质粒。当然，所述聚核苷酸也可以是表达盒、质粒载体、噬菌体基因组，转座子，或者是一段在宿主基因组中的核苷酸序列。所述质粒是在能够在宿主中复制的任何一种质粒载体的基础上构建的。质粒载体包括但不限于pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pSC101质粒，和它们的衍生质粒。进一步，所述质粒还包含一段编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。优选地，所述多肽包括酶和多肽类药物。所指的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种。更进一步，所述裂合酶是脱羧酶，特别是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。多肽类药物包括激素，抗体，生长因子等。在一个实施例中，表达的多肽是胰岛素原。在另一个实施例中，所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。又更进一步优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：cadA基因，ldcC基因，haldc基因及cadA基因、ldcC基因、haldc基因的片段。或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是序列如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3所示的DNA，或序列如SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3所示的DNA的片段。

本发明优选的具体实施方式包含一种转化子，所述转化子包含如上文任一技术方案所述的启动子及其操纵序列，或者包含如上文任一技术方案所述的聚核苷酸。优选地，所述转化子包含上文任一项技术方案所述的聚核苷酸，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。

在一个实施例中，所述转化子还包含λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型。在优选的实施例中，所述的λ阻遏蛋白CI是热不稳定突变型。本发明所述的热不稳定突变型λCI蛋白包括但不限于CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。CI857与野生型相比第66位氨基酸残基由丙氨酸变为苏氨酸。在本发明的某些实施例中，CI857还可进一步包含其他氨基酸残基位点的突变，所述其他氨基酸残基位点的突变不影响其第66位氨基酸残基突变所导致的热不稳定性。

在一个实施例中，所述转化子中含有一段编码λCI或其突变型的聚核苷酸。进一步地，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在质粒上。更进一步地，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸与所述编码多肽的聚核苷酸在同一个质粒上。或者，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在宿主基因组中。

所述转化子的宿主为原核生物细胞。进一步，所述转化子的宿主选自埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，哈夫尼菌属中的菌种。

本发明的优选的一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

优选地，所述一种发酵生产多肽的方法是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

在优选的实施例中，发酵过程中使用了诱导条件。所述的诱导条件为热诱导，化学诱导，或辐射诱导。优选地，诱导条件为热诱导，所述诱导条件指温度为32℃-48℃。

本发明还提供了一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

I)按照上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；

II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。

实施例1.

本实施例中提到的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。

1.1含有受CI857调控的λP_R启动子的表达质粒的构建

以λ-HindIII digest DNA(购自宝生物工程(大连)有限公司)为模板，用引物1和2(引物1的序列见SEQ ID NO 4，引物2的序列见SEQ ID NO 5)扩增含部分cI857基因的序列；用引物3和4(引物3的序列见SEQ ID NO 6，引物4的序列见SEQ ID NO 7)扩增含部分cI857基因和R启动子的序列。再用overlap PCR方法，以上述两PCR产物为模板，用引物1和4扩增含有cI857基因和R启动子的序列，用内切酶BamHI和BglII(均购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切该overlap PCR产物。以pPlac-cadA质粒(制备方法见中国发明专利申请CN201210177392.X的实施例1，公开号CN102851307A，公开日2013-01-02)为模板，用引物5和6(引物5的序列见SEQ ID NO 8，引物6的序列见SEQ ID NO 9)扩增含质粒载体骨架和cadA基因的序列，同样用BamHI和BglII酶切。将两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109(购自北京博迈德基因技术有限公司)，得到质粒pPR-cadA。

为了去除质粒pPR-cadA上cadA基因上游的BglII酶切位点，以pPR-cadA为模板，用引物7和8(引物7的序列见SEQ ID NO 10，引物8的序列见SEQ ID NO 11)进行PCR复制。用内切酶DpnI(购自宝生物工程(大连)有限公司)和BglII处理PCR产物。将PCR产物转化JM109。提取转化子质粒，用引物9(引物9的序列见SEQ ID NO 12)对cadA基因上游序列测序。测序检验正确(去除BglII位点)的质粒命名为pPR2-cadA(图2)。

1.2含有置换的σ^s因子识别位点的突变型λP_R启动子的表达质粒的构建

以pPR2-cadA质粒为模板，用引物10和11(引物10的序列见SEQ ID NO 13，引物11的序列见SEQ ID NO 14)扩增含cI857基因和部分R启动子的序列；以pPR2-cadA质粒为模板，用引物12和13(引物12的序列见SEQ ID NO 15，引物13的序列见SEQ ID NO 16)扩增含部分R启动子和部分cadA基因的序列。用overlap PCR方法，以上述两种PCR产物为模板，用引物10和13扩增得到含σ^s因子识别位点的R启动子的PCR产物。用BamHI和XhoI(购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切该overlap PCR产物。用BamHI和XhoI酶切pPR2-cadA质粒，琼脂糖凝胶电泳纯化(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，购自康宁生命科学(吴江)有限公司)～4.5kb DNA片段。将上述两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109，得到质粒pPRS-cadA。经测序，质粒pPRS-cadA中cadA基因上游修改后的序列见图3。

1.3含有突变型λP_R启动子和完整OR1位点的表达质粒的构建

以pPR2-cadA质粒为模板，用引物10和14(引物14的序列见SEQ ID NO 17)扩增含cI857基因和部分R启动子的序列；以pPR2-cadA质粒为模板，用引物15和13(引物15的序列见SEQ ID NO 18)扩增含部分R启动子和部分cadA基因的序列。用overlap PCR方法，以上述两种PCR产物为模板，用引物10和13扩增得到含修改后的R启动子的PCR产物。用BamHI和XhoI酶切该overlap PCR产物。用BamHI和XhoI酶切pPR2-cadA质粒，电泳纯化4.5kb DNA片段。将上述两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109，得到质粒pPRS3-cadA。经测序，质粒pPRS3-cadA中cadA基因上游修改后的序列见图3。

以pPR2-cadA质粒为模板，用引物10和16(引物14的序列见SEQ ID NO 19)扩增含cI857基因和部分R启动子的序列；以pPR2-cadA质粒为模板，用引物17和13(引物17的序列见SEQ ID NO 20)扩增含部分R启动子和部分cadA基因的序列。用overlap PCR方法，以上述两种PCR产物为模板，用引物10和13扩增得到含修改后的R启动子序列的PCR产物。用BamHI和XhoI酶切该overlap PCR产物。用BamHI和XhoI酶切pPR2-cadA质粒，电泳纯化4.5kb DNA片段。将上述两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109，得到质粒pPRS4-cadA。经测序，质粒pPRS4-cadA中cadA基因上游修改后的序列见图3。

以pPR2-cadA质粒为模板，用引物10和18(引物16的序列见SEQ ID NO 21)扩增含cI857基因和部分R启动子的序列；以pPR2-cadA质粒为模板，用引物19和13(引物19的序列见SEQ ID NO 22)扩增含部分R启动子和部分cadA基因的序列。用overlap PCR方法，用引物10和13扩增得到含修改后的R启动子的PCR产物。用BamHI和XhoI酶切overlap PCR产物。用BamHI和XhoI酶切pPR2-cadA质粒，电泳纯化4.5kb DNA片段。将上述两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109，得到质粒pPRS6-cadA。经测序，质粒pPRS6-cadA中cadA基因上游修改后的序列见图3。

1.4野生型和突变型λP_R调控的重组表达质粒在大肠杆菌宿主中的表达

将JM109/pPR2-cadA、JM109/pPRS-cadA、、JM109/pPRS3-cadA、JM109/pPRS4-cadA和JM109/pPRS6-cadA单菌落接种于LB/Amp液体中(氨苄青霉素浓度为100mg/L，下同)，30℃摇床培养过夜(大于12小时)。将菌液以1％v/v接种于新鲜LB/Amp中，30℃摇床培养3hr(生长指数中期)。将每份菌液分为3份，分别在30℃、37℃和42℃摇床中培养3hr(生长指数期结束)，取1ml菌液，离心收集菌体。剩余菌液在上述3个温度继续培养过夜(生长稳定期结束)。取1ml菌液，离心收集菌体。

向上述过夜菌液中添加1/4v/v新鲜LB/Amp液体，将每份菌液分为3份，分别在30℃、37℃和42℃摇床中培养过夜(生长稳定期)。取1ml菌液，离心收集菌体。

制备SDS-PAGE分离胶，组份包含：10％w/v丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺(29/1)，0.375MTris-HCl(pH8.8)，0.1％w/v SDS，0.1％w/v过硫酸铵，0.04％v/v TEMED。将收集的菌体用600μl无菌水悬浮。取15μl悬浮液，加入5μl 4XSDS-PAGE上样液(购自宝生物工程(大连)有限公司)混匀，沸水浴中加热5min。将上述20μl样品全部上样电泳。蛋白分子量用宝生物工程(大连)有限公司的蛋白分子量标准(宽)指示。电泳胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色，其组份包含：0.1％w/v考马斯亮蓝R-250，25％v/v异丙醇，10％v/v冰醋酸。

电泳图见图4。重组表达蛋白CadA在电泳图中的位置用黑色箭头指示。其中泳道1、10、19、28、37是各重组菌接种以后在30℃培养6hr后所收集菌体的蛋白；泳道2、11、20、29、38是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到37℃，继续培养3hr后所收集菌体的蛋白；泳道3、12、21、30、39是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到42℃，继续培养3hr后所收集菌体的蛋白；泳道4、13、22、31、40是各重组菌接种以后在30℃培养培养3hr，并在30℃继续培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道5、14、23、32、41是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到37℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道6、15、24、33、42是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到42℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道7、16、25、34、43是各重组菌接种以后在30℃培养过夜后，向菌液中添加1/4体积新鲜LB/Amp，在30℃继续培养过夜后收集菌体的蛋白；泳道8、17、26、35、44是各重组菌接种以后在30℃培养过夜后，向菌液中添加1/4体积新鲜LB/Amp，在37℃继续培养过夜后收集菌体的蛋白；泳道9、18、27、36、45是各重组菌接种以后在30℃培养过夜后，向菌液中添加1/4体积新鲜LB/Amp，在42℃继续培养过夜后收集菌体的蛋白。

由图4可见，含有野生型λP_R的质粒pPR2-cadA无论在生长指数期诱导还是在生长稳定期诱导，其CadA表达量均随温度升高而提高(对比图4泳道1-3,4-6,7-9)，在42℃诱导最充分。当在生长指数期中期进行诱导时，在最佳诱导条件(42℃)的前3个小时所表达的重组蛋白(图4泳道3)可达到诱导过夜(超过12小时)表达总量(图4泳道6)的约一半。因此野生型λP_R受诱导表达最强的时期是生长指数期(诱导后的前3个小时)。

质粒pPRS-cadA热诱导效果不明显。当在生长指数期诱导时表达效果最好的是37℃，而不是42℃(对比图4泳道10-12,13-15)。从电泳图中可以看出42℃诱导过夜收获的菌体蛋白量(泳道15)明显较30℃和37℃(泳道13和14)少，因此42℃诱导过夜的CadA表达量受到菌体生长情况影响，未能准确反映启动子在该温度下的表达强度。从37℃诱导的CadA表达量来看，前3个小时(泳道11)的表达量约为诱导过夜(泳道14)表达量的1/4或更低，说明表达主要集中在生长稳定期。当在生长稳定期诱导时，在不同温度的表达量基本相同(图4泳道16-18)，说明缺失OR1位点的λP_R突变型启动子失去了温控效应。

质粒pPRS3-cadA在各温度条件下表达情况与pPRS-cadA基本相同(对比图4泳道10-18和19-27)。表达主要集中在生长稳定期，但失去了温控效应。

质粒pPRS4-cadA和pPRS6-cadA保留了野生型λP_R受温度调控的特性，其重组蛋白表达量随温度升高而升高(对比图4泳道28-30，31-33，34-36，37-39，40-42，43-45)。

与野生型不同的是，pPRS4-cadA在生长指数期诱导时，在前3个小时其重组蛋白表达量约为诱导过夜表达总量的1/4或更低(对比图4泳道30和33)。而pPRS6-cadA在42℃诱导过夜的菌体蛋白量(泳道42)明显较30℃和37℃(泳道40和41)少，因此42℃诱导过夜的CadA表达量受到菌体生长情况影响，未能准确反映启动子在该温度下的表达强度。但尽管如此，其在42℃诱导前3个小时(泳道39)的表达量仍然低于诱导过夜(泳道42)表达量的一半。说明这两种突变型的λP_R启动子在生长指数期表达较弱，其表达主要集中在生长稳定期。

质粒pPRS4-cadA在生长稳定期诱导时，其CadA表达量与pPR2-cadA基本相同(对比图4泳道9和36)。而pPRS6-cadA在生长稳定期诱导时，其CadA表达量高于pPR2-cadA(对比图4泳道9和45)。这说明pPRS6-cadA质粒在生长稳定期的表达效果优于含有野生型λP_R的质粒。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 凯赛生物产业有限公司

<120> 一种聚核苷酸、转化子及其应用

<130> 123456789

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2148

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 2

<211> 2142

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgaacatca ttgccattat gggaccgcat ggcgtctttt ataaagatga gcccatcaaa 60

gaactggagt cggcgctggt ggcgcaaggc tttcagatta tctggccaca aaacagcgtt 120

gatttgctga aatttatcga gcataaccct cgaatttgcg gcgtgatttt tgactgggat 180

gagtacagtc tcgatttatg tagcgatatc aatcagctta atgaatatct cccgctttat 240

gccttcatca acacccactc gacgatggat gtcagcgtgc aggatatgcg gatggcgctc 300

tggttttttg aatatgcgct ggggcaggcg gaagatatcg ccattcgtat gcgtcagtac 360

accgacgaat atcttgataa cattacaccg ccgttcacga aagccttgtt tacctacgtc 420

aaagagcgga agtacacctt ttgtacgccg gggcatatgg gcggcaccgc atatcaaaaa 480

agcccggttg gctgtctgtt ttatgatttt ttcggcggga atactcttaa ggctgatgtc 540

tctatttcgg tcaccgagct tggttcgttg ctcgaccaca ccgggccaca cctggaagcg 600

gaagagtaca tcgcgcggac ttttggcgcg gaacagagtt atatcgttac caacggaaca 660

tcgacgtcga acaaaattgt gggtatgtac gccgcgccat ccggcagtac gctgttgatc 720

gaccgcaatt gtcataaatc gctggcgcat ctgttgatga tgaacgatgt agtgccagtc 780

tggctgaaac cgacgcgtaa tgcgttgggg attcttggtg ggatcccgcg ccgtgaattt 840

actcgcgaca gcatcgaaga gaaagtcgct gctaccacgc aagcacaatg gccggttcat 900

gcggtgatca ccaactccac ctatgatggc ttgctctaca acaccgactg gatcaaacag 960

acgctggatg tcccgtcgat tcacttcgat tctgcctggg tgccgtacac ccattttcat 1020

ccgatctacc agggtaaaag tggtatgagc ggcgagcgtg ttgcgggaaa agtgatcttc 1080

gaaacgcaat cgacccacaa aatgctggcg gcgttatcgc aggcttcgct gatccacatt 1140

aaaggcgagt atgacgaaga ggcctttaac gaagccttta tgatgcatac caccacctcg 1200

cccagttatc ccattgttgc ttcggttgag acggcggcgg cgatgctgcg tggtaatccg 1260

ggcaaacggc tgattaaccg ttcagtagaa cgagctctgc attttcgcaa agaggtccag 1320

cggctgcggg aagagtctga cggttggttt ttcgatatct ggcaaccgcc gcaggtggat 1380

gaagccgaat gctggcccgt tgcgcctggc gaacagtggc acggctttaa cgatgcggat 1440

gccgatcata tgtttctcga tccggttaaa gtcactattt tgacaccggg gatggacgag 1500

cagggcaata tgagcgagga ggggatcccg gcggcgctgg tagcaaaatt cctcgacgaa 1560

cgtgggatcg tagtagagaa aaccggccct tataacctgc tgtttctctt tagtattggc 1620

atcgataaaa ccaaagcaat gggattattg cgtgggttga cggaattcaa acgctcttac 1680

gatctcaacc tgcggatcaa aaatatgcta cccgatctct atgcagaaga tcccgatttc 1740

taccgcaata tgcgtattca ggatctggca caagggatcc ataagctgat tcgtaaacac 1800

gatcttcccg gtttgatgtt gcgggcattc gatactttgc cggagatgat catgacgcca 1860

catcaggcat ggcaacgaca aattaaaggc gaagtagaaa ccattgcgct ggaacaactg 1920

gtcggtagag tatcggcaaa tatgatcctg ccttatccac cgggcgtacc gctgttgatg 1980

cctggagaaa tgctgaccaa agagagccgc acagtactcg attttctact gatgctttgt 2040

tccgtcgggc aacattaccc cggttttgaa acggatattc acggcgcgaa acaggacgaa 2100

gacggcgttt accgcgtacg agtcctaaaa atggcgggat aa 2142

<210> 3

<211> 2220

<212> DNA

<213> Hafnia alvei

<400> 3

atgaatatca ttgccatcat gaacgattta agcgcttatt ttaaggaaga acccctgcgc 60

gagctgcatc aagagttaga gaaggaaggc ttccgtattg cttatcccaa agaccgcaac 120

gatctgctga agctgattga aaacaactcc cgcctgtgtg gcgtcatttt cgactgggat 180

aaatataacc tcgaactcag cgctgaaatc agcgagctca acaaactgct gccaatttat 240

gccttcgcca atacctattc gacgcttgac gtcaacatga gcgacctgcg tcttaatgtt 300

cgcttctttg aatatgcatt aggcagcgcg caagacattg ccaccaagat ccgccaaagc 360

accgatcagt atattgatac cattctgcca ccgctgacca aggcgctgtt caaatacgtc 420

aaagaagaga aatacacagt ctgtacgccg gggcatatgg gcggaactgc gttcgataaa 480

agccctgtcg gtagcctgtt ctatgatttc ttcggtgaaa acaccatgcg ttcggatatc 540

tcgatctccg tatctgagct cggatcgctg ctcgatcata gcggcccaca ccgtgacgcc 600

gaagagtata tcgcgcgcac gttcaacgcc gatcgcagct atatcgtaac caacggaaca 660

tctacggcga ataaaattgt cggcatgtat tcatctcctg ccggtgccac tattctgata 720

gaccgtaact gccataaatc attgacccat ttgatgatga tgagcaacgt tgtccccgtc 780

tatctgcgcc caacccgtaa cgcctacggc attttaggcg ggataccgca aagcgagttc 840

acccgcgcca gcattgaaga gaaagtgaaa aatacgccca atgcgacatg gccggtgcat 900

gcggtagtca ccaactctac ctatgacggc ctgttctaca ataccgaata catcaaaaac 960

acgcttgatg ttaagtcgat tcacttcgat tcggcatggg tgccttacac caacttccat 1020

ccgatttacc aaggcaaagc agggatgagc ggtgaacgtg tgccggggaa aatcatctac 1080

gagactcagt ccacccacaa actgctggcg gcattctcgc aggcatcgat gatccacgtg 1140

aaaggtgaga tcaacgaaga aaccttcaat gaagcctata tgatgcatac ctcaacatca 1200

ccgcattacg ggatcgttgc gtcgacggaa accgcggcgg ctatgatgaa gggcaacgcc 1260

ggtaagcgtt taattaacgg ttcaattgaa cgagcgatcc gcttccgtaa agagatccgc 1320

cgcttacgta cagaatctga tggctggttc tttgacgtat ggcagccgga taacattgac 1380

gaggttgctt gctggccact caatccacgt aatgaatggc atggattccc gaacatcgac 1440

aacgatcata tgtatcttga tccgatcaaa gtcactctgc tgaccccagg tttaagcccc 1500

aatggcactc tggaagagga agggataccg gcgtcgatcg tgtcgaaata tctggatgag 1560

cacggcatca tcgtggaaaa aaccgggcca tataacctgc tcttcctgtt tagtatcggg 1620

atcgataaaa ccaaggcgtt gagcttgttg cgggcattaa ccgatttcaa acgcgtgtat 1680

gacctcaacc tgcgcgtgaa aaacgtgttg ccatcgctct ataacgaggc gcctgatttc 1740

tataaagaga tgcgaattca ggagttggct caggggattc atgctctggt gaaacaccac 1800

aatctaccag acctgatgta tcgtgcattt gaggtattac caaagctggt gatgacgccg 1860

catgatgcgt tccaagaaga agtgcgtggc aatattgagc catgtgcctt ggatgatatg 1920

ttagggaaag ttagcgccaa catgatcttg ccgtatcctc cgggtgttcc ggtggttatg 1980

ccgggagaaa tgctcactaa ggagagccgc cctgttctga gcttcttgca gatgctatgt 2040

gaaattggcg cacactatcc gggctttgaa acggatattc acggcgttca tcgtgatggt 2100

gcaacgggta aatacatggt cgtggtgctc aaacaaggcg cagatgaacc gggtgataaa 2160

ccgagtgata cggtgaagaa agcgccgggt aaaaaaccat cagcggcgaa gaagtcataa 2220

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 4

actgacggat cctcagccaa acgtctcttc ag 32

<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

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<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 6

aagcttggct tggagcctgt tggtgcggtc atggaattac c 41

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 7

actgacagat ctacctcctt agtacatgca accattatca ccgccag 47

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 8

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<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 9

actgacggat cccttcctcg ctcactgact cg 32

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 10

caatattgca ataacgttca tacaacctcc ttagtacatg caaccattat caccg 55

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 11

cggtgataat ggttgcatgt actaaggagg ttgtatgaac gttattgcaa tattg 55

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 12

caggcttaca tcgagagtgg 20

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 13

actgacggat cctcagccaa acgtctcttc ag 32

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 14

caacctcctt agtacatgca ttaagtatag acgccagagg taaaatagtc aac 53

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 15

cgtctatact taatgcatgt actaaggagg ttg 33

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 16

caggcttaca tcgagagtgg 20

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 17

caacctcctt agtacatgca ttaagtatag atatcaccgc cagaggtaaa atagtcaac 59

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 18

cggtgatatc tatacttaat gcatgtacta aggaggttg 39

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 19

gtacatgcat taagtataga cgccagaggt aaaatagtca acacg 45

<210> 20

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 20

cgtctatact taatgcatgt actatacctc tggcggtgat aaggaggttg tatgaacgtt 60

attgc 65

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 21

tcaccgccag aggtaacctc cttagtacat gcattaagta tagac 45

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 22

aggaggttac ctctggcggt gataatgaac gttattgcaa tattg 45

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> promoter

<400> 23

tacctctggc gtctatactt aatgca 26

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> prmoter

<400> 24

tacctctggc ggtgatatct atacttaatg ca 32

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> promoter

<400> 25

tacctctggc gtctatactt aatgcatgta ctatacctct ggcggtgata 50

<210> 26

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> promoter

<400> 26

tacctctggc gtctatactt aatgcatgta ctaaggaggt tacctctggc ggtgata 57

Claims (23)

1.一种聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸包含启动子，所述启动子中含有原核生物σ^s因子的识别位点，优选地，所述原核生物σ^s因子的识别位点是大肠杆菌σ^s因子的识别位点。

2.如权利要求1所述的一种聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸还包括所述启动子的操纵序列，所述启动子的操纵序列包含λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点。

3.如权利要求1或2所述的聚核苷酸，其特征在于，所述原核生物σ^s因子的识别位点含有如下保守序列：CTANNNT，其中N代表A、T、G、C四种碱基的任意一种；进一步优选地，所述原核生物σ^s因子的识别位点含有如下序列：CTATACT。

4.如权利要求1-3任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述原核生物σ^s因子的识别位点位于转录起始点上游-13至-7碱基位置。

5.如权利要求2-4任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述启动子的操纵序列中含有1个、2个、3个、4个、5个或6个λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点；进一步优选地，所述λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点选自λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3，和上述操纵位点的突变型组成的集合。

6.如权利要求2-5任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点与所述启动子重合、在所述启动子上游和/或在所述启动子下游；进一步优选地，所述启动子的操纵序列包含至少一个λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点，该操纵位点与所述启动子的转录起始点重合或位于所述启动子的转录起始点的下游。

7.如权利要求1-6任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述启动子通过将λP_L或λP_R的σ⁷⁰因子的识别位点修改为σ^s因子的识别位点得到。

8.如权利要求1-7任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸的序列包含如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26所示的序列，或如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26所示序列的碱基互补序列。

9.如权利要求1-8任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述启动子是热诱导启动子、化学诱导启动子或辐射诱导启动子。

10.如权利要求1-9任一项所述的聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸是表达盒、质粒载体、质粒、噬菌体基因组、转座子或者是在宿主基因组中的聚核苷酸。

11.如权利要求10所述的聚核苷酸，其特征在于，所述质粒包含作为RNA转录模板的聚核苷酸，所述RNA的转录受所述启动子控制，所述RNA包括编码RNA和非编码RNA，编码RNA指mRNA，非编码RNA包括rRNA、tRNA和sRNA；或者，所述质粒包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。

12.如权利要求11所述的聚核苷酸，其特征在于，所述多肽包括酶和多肽类药物；进一步优选地，酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。

13.如权利要求12所述的聚核苷酸，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列至少一种：cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段、haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：序列如SEQ ID NO 1所示的DNA，序列如SEQ ID NO 2所示的DNA，序列如SEQ ID NO 3所示的DNA，序列如SEQ ID NO 1所示的DNA的片段，序列如SEQ ID NO 2所示的DNA的片段，序列如SEQ IDNO 3所示的DNA的片段。

14.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含如权利要求1～13任一项所述的聚核苷酸。

15.如权利要求14所述的一种转化子，其特征在于，所述转化子包含如权利要求11～13任一项所述的聚核苷酸。

16.如权利要求15所述的一种转化子，其特征在于，所述转化子包含如权利要求13任一项技术方案所述的聚核苷酸。

17.如权利要求14-16任一项所述的转化子，其特征在于，所述转化子中含有编码λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型的聚核苷酸。

18.如权利要求17所述的转化子，其特征在于，所述编码λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型的聚核苷酸在质粒上，进一步优选地，所述编码λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型的聚核苷酸与所述编码多肽的聚核苷酸在同一个质粒上；或者，所述编码λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型的聚核苷酸在宿主基因组中。

19.如权利要求14-18任一项所述的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主为原核生物细胞；进一步优选地，所述转化子的宿主选自埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，哈夫尼菌属中的菌种。

20.一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)培养如权利要求15～19任一项所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

21.如权利要求20所述的一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如权利要求16～19任一项所述的转化子；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

22.根据权利要求20或21所述的发酵生产多肽的方法，其特征在于，所述转化子在诱导条件下启动重组表达，诱导条件为热诱导、化学诱导或辐射诱导；进一步优选地，所述诱导条件为热诱导，所述诱导条件指温度为32℃-48℃。

23.一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

I)按照权利要求21的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；

II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。