CN111019955B

CN111019955B - 烟草蛋白zr-1及其应用

Info

Publication number: CN111019955B
Application number: CN201911317415.0A
Authority: CN
Inventors: 翟妞; 周会娜; 郑庆霞; 徐国云; 刘萍萍; 张慧; 陈千思; 王晨; 许亚龙; 金立锋; 武明珠
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN111019955A

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草新蛋白ZR‑1基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示,烟草蛋白ZR‑1由139个氨基酸残基组成。该蛋白与植物叶片中谷氨酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中谷氨酸含量明显降低。本发明通过对特定烟草蛋白ZR‑1的初步研究，发现其与烟草谷氨酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中谷氨酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草蛋白ZR-1及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白ZR-1及其应用专利申请。

背景技术

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。

氨基酸在烟草生长发育过程中、氮的代谢和烟株抵御不良环境的影响中，都起到了相当重要的作用。而在烟叶复烤后的醇化过程中，氨基酸是引起烟叶褐变的主要影响因素之一，并由此易于导致烟叶使用价值降低。另一方面，氨基酸也会和烟叶中一些具有还原性的物质发生非酶棕化反应，生成对烟叶感官品质有改善作用的呋喃等化合物，从而可以提高烟叶的品质。

总之，随着烟草基因工程深入，结合氨基酸类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中氨基酸类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草中谷氨酸含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草蛋白ZR-1及其在烟草谷氨酸含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草蛋白ZR-1的编码基因ZR-1，由420个碱基组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因ZR-1在叶片谷氨酸含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草ZR-1蛋白表达量，来调节控制烟叶中谷氨酸含量情况。

所述编码基因ZR-1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtZR-1-F：5’- GACTGCTCCTCAACCTAAAG - 3’，

NtZR-1-R：5’- GCTCCACGGCTCTCTCACTA - 3’。

烟草蛋白ZR-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由139个氨基酸残基组成。

所述烟草蛋白ZR-1在叶片谷氨酸含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中谷氨酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中谷氨酸含量明显降低。

利用所述编码基因ZR-1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有ZR-1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得谷氨酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰ZR-1基因的表达使其沉默，ZR-1基因沉默植株中谷氨酸含量显著下降，进而获得谷氨酸含量下降的植物新品种。

换言之，一种培育低谷氨酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰ZR-1基因的表达使其沉默，ZR-1基因沉默的新烟草品种植株中谷氨酸物质含量显著下降。

氮素是烟草生长发育所必需的基本营养元素，在烟草生长发育和形态建成中起着重要的作用，而谷氨酰胺和谷氨酸则为烟草体内重要含氮化合物的合成提供所需的氮。基于烟叶中谷氨酸的重要作用，本申请中，发明人通过对特定烟草蛋白ZR-1的初步研究，发现其与烟草谷氨酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中谷氨酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和提供一定的参考借鉴。

附图说明

图1为与对照植株相比，NtZR-1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的谷氨酸含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtZR-1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草ZR-1基因基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关ZR-1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtZR-1-F：5’- GACTGCTCCTCAACCTAAAG - 3’，

NtZR-1-R：5’- GCTCCACGGCTCTCTCACTA - 3’；

以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得ZR-1基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2-NtZR-1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtZR-1。

需要说明的是，

烟草ZR-1基因，包括420个碱基，具体碱基序列为：

ATGGTCAGGACACGCACACCCTCATCTGCTGGACGTGGTACTACCCGGGGTGGCGGTCAAGTTGGGGTTCATCAAACTAGAAGAAAGACTGCTCCTCAACCTAAAGTTGGGAACATGGACGCAGTGGCAAGGTTATTGAATGTGTTAGAGGCATTGGTGCCTGCTCAGGATGGAAGTTCAGCTCGTCAGGCTACTTTACAGACACAAGCACCTGCACAGACTCAGACTTTCGGGAATAAGAAAGTATATCTACAAGAATTTCTGAAATTGAAATTACCAAAATTCACATGTTCCGATAATTCAGCAGATCCTCAAAGTTTCTTGGATGGGACACTTAAGGCATTACGTGCTCTTGGATGTTCTAGTGAGAGAGCCGTGGAGCTCATAGCATATAAACTAGAGGATATGGCCAACATATGA。

烟草蛋白ZR-1，包括139个氨基酸，具体氨基酸序列为：

MVRTRTPSSAGRGTTRGGGQVGVHQTRRKTAPQPKVGNMDAVARLLNVLEALVPAQDGSSARQATLQTQAPAQTQTFGNKKVYLQEFLKLKLPKFTCSDNSADPQSFLDGTLKALRALGCSSERAVELIAYKLEDMANI。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtZR-1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtZR-1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀=1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化可以看出，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功，相对应的TRV2-NtZR-1组烟草叶片颜色无变化。

进一步通过qRT-PCR对NtZR-1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtZR-1的侵染植株中，ZR-1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtZR-1浸染植株）和对照组（TRV2浸染植株）中的植物谷氨酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2所示。

可以看出，实验组中谷氨酸含量与对照组相比下降82%，这进一步表明，通过沉默NtZR-1基因，可对烟草叶片中植物关素谷氨酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草蛋白ZR-1及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggtcagga cacgcacacc ctcatctgct ggacgtggta ctacccgggg tggcggtcaa 60

gttggggttc atcaaactag aagaaagact gctcctcaac ctaaagttgg gaacatggac 120

gcagtggcaa ggttattgaa tgtgttagag gcattggtgc ctgctcagga tggaagttca 180

gctcgtcagg ctactttaca gacacaagca cctgcacaga ctcagacttt cgggaataag 240

aaagtatatc tacaagaatt tctgaaattg aaattaccaa aattcacatg ttccgataat 300

tcagcagatc ctcaaagttt cttggatggg acacttaagg cattacgtgc tcttggatgt 360

tctagtgaga gagccgtgga gctcatagca tataaactag aggatatggc caacatatga 420

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Val Arg Thr Arg Thr Pro Ser Ser Ala Gly Arg Gly Thr Thr Arg

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gln Val Gly Val His Gln Thr Arg Arg Lys Thr Ala Pro

20 25 30

Gln Pro Lys Val Gly Asn Met Asp Ala Val Ala Arg Leu Leu Asn Val

35 40 45

Leu Glu Ala Leu Val Pro Ala Gln Asp Gly Ser Ser Ala Arg Gln Ala

50 55 60

Thr Leu Gln Thr Gln Ala Pro Ala Gln Thr Gln Thr Phe Gly Asn Lys

65 70 75 80

Lys Val Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Lys Leu Lys Leu Pro Lys Phe Thr

85 90 95

Cys Ser Asp Asn Ser Ala Asp Pro Gln Ser Phe Leu Asp Gly Thr Leu

100 105 110

Lys Ala Leu Arg Ala Leu Gly Cys Ser Ser Glu Arg Ala Val Glu Leu

115 120 125

Ile Ala Tyr Lys Leu Glu Asp Met Ala Asn Ile

130 135

Claims

1.烟草蛋白ZR-1的编码基因ZR-1，其特征在于，该基因由420个碱基组成，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述编码基因ZR-1在烟草叶片谷氨酸含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调烟草ZR-1蛋白表达量，来下调烟叶中谷氨酸含量。

3.权利要求1所述编码基因ZR-1所编码的烟草蛋白ZR-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求3所述烟草蛋白ZR-1在烟草叶片谷氨酸含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中谷氨酸含量相关，降低该蛋白表达后，烟草叶片中谷氨酸含量明显降低。

5.利用权利要求1所述编码基因ZR-1的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默VIGS技术，构建含有ZR-1基因的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得谷氨酸含量下降的烟草新品种。

6.如权利要求5所述烟草新品种培育方法，其特征在于，构建含有ZR-1基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增获得ZR-1基因时，以烟草K326的cDNA为模板，以NtZR-1-F、NtZR-1-R为引物，进行PCR扩增；所述引物具体设计为：

NtZR-1-F：5’- GACTGCTCCTCAACCTAAAG - 3’，

NtZR-1-R：5’- GCTCCACGGCTCTCTCACTA - 3’。