BR122021009930B1 - Produto de tabaco - Google Patents
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Abstract
a presente invenção divulga plantas de tabaco geneticamente modificados e produtos de tabaco derivados de tais plantas, compreendendo uma diminuição de pelo menos um teor de aminoácido de modo que, após o aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco ou uma fração da mesma gera níveis reduzidos de um composto derivado de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma porção da mesma. em uma modalidade, o tabaco gera níveis reduzidos de acrilamida e/ou acrilonitrila por meio de aquecimento e/ou queima do tabaco em comparação com uma linhagem de tabaco de origem não modificada. estas plantas são úteis para melhorar os produtos de tabaco.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir plantas com um fenótipo alterado, pela seleção de mutantes no estágio quimérico M0. As modalidades da presente invenção fornecem plantas de tabaco com um nível mais baixo do que a média de pelo menos um aminoácido. Estas plantas são úteis para o desenvolvimento de produtos de tabaco que geram menores quantidades de determinados produtos químicos não naturais, mediante aquecimento e/ou queima.
[002] A biossíntese de aminoácidos em plantas é altamente regulada (Lea et al., 1985, The Biosynthesis of Amino Acids in Plant, Em: Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, G. C. Barrett, ed., Chapman & Hill, Londres, páginas 197-226). Devido à conveniência geral por aminoácidos essenciais em grãos e outros alimentos, várias abordagens foram desenvolvidas para melhorar o teor de aminoácidos em plantas (consulte, por exemplo, G. Galili e B.A. Larkins, 1999, Enhancing the Content of Essential Amino Acids Lysine and Threonine in Plants, Em: Plant Amino Acids in Biochemistry and Biotechnology, B.K. Singh, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, páginas 487-507). Além disso, no tabaco, certos aminoácidos podem ser uma importante fonte para a produção de flavor e aroma.
[003] No entanto os aminoácidos sofrem as degradações da reação de Maillard e de Stecker no tabaco e produzem pirazinas e outros compostos contendo nitrogênio, alguns dos quais podem não ser benéficos. O perfil do aminoácido afeta não só o rendimento, mas também o tipo de pirazinas formadas (Lu, G., et. al, 1997, J. Agric. Food Chem., 45: 233-236; J. Chen e C-T. Ho, 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 643-647). Assim, embora tenha havido um foco no aumento dos níveis de aminoácidos no tabaco, também pode haver uma necessidade de produzir plantas de tabaco e produtos de tabaco derivados de tais plantas, tendo quantidades reduzidas de certos aminoácidos. Certos aminoácidos podem estar associados com a produção de produtos químicos potencialmente prejudiciais mediante o aquecimento e/ou a queima do tabaco. Por exemplo, o fumo de tabaco pode incluir acrilamida, que foi caracterizada como uma substância cancerígena do grupo 2A pela Agência Internacional de Pesquisas do Câncer (IARC). Também, a acrilonitrila é um carcinógeno do grupo B1 da IARC encontrado no fumo de cigarro.
[004] Assim, há uma necessidade geral para os métodos que podem fornecer linhagens de plantas que compreendem biossíntese reduzida de aminoácidos particulares. Os métodos devem ser projetados de modo que eles possam ser usados mesmo para espécies de plantas como o tabaco, que são grandes, a fim de exigir extensas instalações para cultivo, e que têm um genoma complexo e, portanto, podem exigir a triagem de um grande número de eventos de mutação para isolar a mutação de interesse.
[005] A invenção fornece métodos para fazer plantas com nível reduzido pelo menos um aminoácido endógeno. Em certos aspectos, a invenção compreende as plantas de tabaco, ou linhagens de tabaco derivadas de tais plantas, com um nível reduzido pelo menos um aminoácido endógeno. Em certas modalidades, a invenção compreende produtos de tabaco feitos a partir de plantas de tabaco tendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno.
[006] Em uma modalidade, a invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada compreendendo gerar uma planta de tabaco com nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno, de modo que a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma porção da mesma, da qual a planta modificada é derivada.
[007] Além disso, em certas modalidades, a invenção pode compreender um método para produzir uma planta de tabaco modificada que compreende um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno em comparação com uma planta de tabaco não modificada, compreendendo as etapas de: incubar pelo menos uma semente da planta do tabaco não modificada em uma solução que compreende um agente mutagênico; lavar pelo menos uma semente livre do agente mutagênico; expor pelo menos uma semente de tabaco M0 a um agente de seleção; germinar pelo menos uma semente e crescer pelo menos uma muda de tabaco M0 na presença de um agente de seleção; crescer pelo menos uma muda de tabaco M0 para gerar pelo menos uma planta de tabaco M0 compreendendo sementes de tabaco M1, em que as sementes de tabaco M1 da planta de tabaco M0 compreendem pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese; e germinar pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese para selecionar para uma planta de tabaco M1 modificada compreendendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido em comparação com a planta de tabaco não modificada da qual a planta modificada é derivada.
[008] Em ainda outras modalidades, a invenção pode incluir uma planta de tabaco modificada ou uma parte da mesma compreendendo uma diminuição do nível pelo menos um aminoácido endógeno em comparação com uma planta de tabaco não modificada ou porção da mesma, da qual a planta é derivada.
[009] Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma parte da mesma gera um nível reduzido de um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma. Por exemplo, em certas modalidades, a invenção pode compreender uma planta de tabaco modificada ou uma parte da mesma, que compreende uma diminuição nos níveis de acrilamida e/ou nos níveis de acrilonitrila mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou porção da mesma.
[0010] Em ainda outras modalidades, a invenção pode compreender um produto do tabaco derivado de uma planta de tabaco modificada da invenção, o produto de tabaco compreendendo um tabaco modificado tendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno em comparação com uma planta de tabaco não modificada da qual a planta de tabaco modificada é derivada. Em uma modalidade, o produto do tabaco gera um nível reduzido de um composto derivado de pelo menos um aminoácido, em comparação com um produto de tabaco que compreende uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma porção da mesma. Por exemplo, a invenção pode compreender um produto de tabaco modificado tendo um nível reduzido de acrilamida e/ou acrilonitrila mediante aquecimento e/ou queima do produto de tabaco em comparação com tabaco não modificado.
[0011] Várias características, aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes com referência à seguinte descrição, reivindicações em anexo e desenhos associados.
[0012] A figura 1 é uma representação esquemática ilustrando um método para gerar linhagens de tabaco com um nível reduzido de pelo menos um aminoácido, de acordo com uma modalidade da invenção.
[0013] A figura 2 mostra uma correlação entre o nível de asparagina medido em miligramas (mg) por grama de tabaco e o nível de acrilamida medido como microgramas (μg) por material particulado total (TPM) de tabaco, de acordo com uma modalidade da invenção. A cepa controle (10N-3) é mostrada como um quadrado; valores para as diversas variedades de experimentais são mostrados como símbolos em formato de diamantes.
[0014] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações, as formas no singular “um”, “uma”, “pelo menos um/uma” e “o/a” incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente estabeleça de outra forma. Também os termos "semente(s)" e "muda(s)" incluem referências no singular e no plural. Referência a "porcentagem em peso seco" ou "à base de peso seco" refere- se ao peso com base nos ingredientes secos (ou seja, todos os ingredientes exceto água).
[0015] O termo "endógeno" refere-se aos compostos (por exemplo, aminoácidos) que são gerados pela planta como resultado de reações bioquímicas normais. Estes compostos endógenos não incluem compostos que são adicionados à planta de uma fonte externa (por exemplo, compostos aplicados nas superfícies das folhas e similares).
[0016] O termo "não natural" refere-se aos compostos que não são naturalmente ingeridos e/ou sintetizados no corpo de uma planta ou um animal, mas que podem ser derivados dos compostos endógenos. Em alguns casos, o composto não natural pode ser um agente cancerígeno. Ou o composto não natural pode ter outros efeitos potencialmente prejudiciais ou não benéficos quando ingerido pelos seres humanos.
[0017] Conforme definido neste documento, os meios podem compreender composições que são adequadas para a manutenção ou o crescimento de tecido biológico. Os meios podem compreender água, soluções tamponadas, ágar ou um meio de crescimento, tal como, mas sem se limitar, aos meios descritos nos exemplos neste documento. Geralmente, qualquer composição que é biologicamente compatível com a planta de interesse pode ser adequada para uso como um meio ou parte de um meio.
[0018] Também conforme definido neste documento, mutagênese compreende um processo que resulta em uma modificação de uma sequência de DNA. O termo "mutagênese" refere-se ao uso de um agente mutagênico para induzir mutações genéticas em uma população de indivíduos. Uma população a sofrer mutagênese pode incluir plantas, partes de plantas ou sementes. Para as populações que sofreram mutagênese, a dosagem da substância química ou radiação mutagênica pode ser determinada experimentalmente para cada tipo de tecido vegetal, de modo que uma frequência de mutação que está abaixo de um nível limiar caracterizado pela letalidade ou esterilidade reprodutiva é obtida. O número de sementes da geração M1 ou o tamanho das populações de planta M1 resultante dos tratamentos mutagênicos pode ser estimado com base na frequência de mutações esperada.
[0019] Os tipos de mutações que podem ser induzidos em um gene incluem, por exemplo, mutações pontuais, deleções, inserções, duplicações e inversões. A mutagênese pode incluir transições, transversões, adições ou deleções de base que causam deslocamentos de estrutura, ou a reticulação de nucleotídeos, assim como a modificação/substituição de bases, de modo que a ligação de proteínas ao DNA (por exemplo, fatores de transcrição) é alterada. Também são incluídos os híbridos feitos de tais mutantes, bem como cruzamentos interespecíficos e intraespecíficos.
[0020] Além dos métodos descritos em detalhes neste documento, em algumas modalidades, a mutagênese pode ser induzida pelo crescimento de células vegetais em cultura de tecido, que pode resultar na produção de variantes somaclonais. Alternativamente, a aplicação de metodologias de cultura de protoplasto padrão desenvolvidas para a produção de plantas híbridas usando a fusão de protoplastos também é útil para gerar plantas com expressão genética variante. Deste modo, os protoplastos podem ser gerados a partir de uma primeira e uma segunda planta com expressão genética variante. Os calos podem ser cultivados a partir de fusões de protoplastos bem sucedidas e de plantas regeneradas. Plantas híbridas de progenia resultantes podem ser identificadas e selecionadas para a expressão genética variante, de acordo com os métodos descritos neste documento e podem ser usadas em um protocolo de reprodução descrito neste documento. Também são incluídos os métodos que compreendem engenharia genética, como mutagênese direcionada ao sítio.
[0021] As plantas incluídas na presente invenção também incluem plantas (e/ou linhagens de tabaco derivadas de tais plantas) que podem ser geneticamente modificadas usando DNA que não seja de tabaco em um lócus distinto dos genes relacionados com a produção do aminoácido de interesse (ou seja, o aminoácido para o qual a concentração reduzida no tabaco é o resultado final). Por exemplo, plantas que são geneticamente modificadas para serem resistentes a pesticidas e que também são modificadas por mutagênese do DNA gnômico do tabaco pelas técnicas da invenção (por exemplo, na asparaginase, asparagina sintetase ou outros locais de biossíntese de aminoácido para tornarem-se produtoras de baixas quantidades de asparagina) são incluídas na presente invenção. Em uma modalidade, as plantas da presente invenção compreendem plantas tendo essencialmente o mesmo perfil de resistência a antibióticos que a linhagem original da planta não modificada, de modo que as plantas modificadas não compreendem uma nova resistência a antibióticos em comparação com a linhagem original não modificada.
[0022] Um agente mutagênico é definido como uma substância (ou tratamento) que pode alterar (modificar) o DNA em uma célula. Agentes mutagênicos adequados incluem, por exemplo, agentes mutagênicos químicos e radiação ionizante. Agentes mutagênicos químicos típicos incluem, mas não se limitam, ao metanossulfonato de etila (EMS), ácido nitroso, 5-bromouracila, metilnitrosoguanidina, azida de sódio, laranja de acridina, brometo de etídio e agentes mutagênicos de mudança de estrutura, como proflavina e similares. As mutações também podem ser geradas por radiação, tal como UV, de raios-x, raios—Y, irradiação de nêutrons rápidos e similares. Os agentes mutagênicos também incluem elementos genéticos como vetores virais, transponsons e similares, que podem facilitar a inserção do DNA estrangeiro no genoma do tabaco.
[0023] Geralmente, a primeira geração tratada com um agente mutagênico compreende a geração M0 (ou Mo). As gerações subsequentes são então descritas como M1 (ou Mi) (ou seja, uma geração após o evento de mutagênese), M2 (duas gerações após o evento de mutagênese) e similares. Assim, conforme usado neste documento, M0 refere-se às células vegetais (e plantas desenvolvidas a partir das mesmas) expostas a um agente mutagênico, enquanto que M1 refere-se às sementes produzidas por plantas M0 autopolinizadas e plantas cultivadas a partir de tais sementes. M2 é a descendência (sementes e plantas) das plantas autopolinizadas M1, M3 é a descendência das plantas autopolinizadas M2 e M4 é a descendência das plantas autopolinizadas M3. M5 é a descendência das plantas autopolinizadas M4. Deste modo, cada geração Mn+1 (ou Mn + i) é a descendência das plantas autopolinizadas da geração Mn (ou Mn) anterior.
[0024] Conforme utilizado na presente invenção, uma “planta modificada”, ”planta de tabaco modificada” ou “tabaco modificado” inclui plantas, plantas de tabaco e tabaco que é geneticamente modificado (ou seja, modificado) de modo a ter um genótipo e fenótipo diferente da planta não modificada (por exemplo, tabaco), da qual a planta modificada é derivada.
[0025] Conforme utilizado na presente invenção, a “planta não modificada da qual a planta modificada é derivada” refere-se à linhagem de planta original usada para gerar linhagens de plantas mutantes. Conforme utilizado na presente invenção, a geração M0 seria a planta não modificada, da qual a planta M1 modificada é derivada.
[0026] Conforme definido neste documento, a aparência física de um organismo compreende o seu fenótipo, enquanto que a composição genética de um organismo compreende o seu genótipo. Heterozigotos são definidos como genomas que possuem alelos (ou seja, sequências de DNA) diferentes em um local de interesse. Por exemplo, uma mutação heterozigótica seria uma planta com uma sequência modificada em apenas um alelo. Deste modo, os heterozigotos têm dois alelos distintos para um gene, cada um dos quais podendo ser transmitido para a próxima geração. Homozigotos são definidos como organismos com alelos idênticos em um ou mais loci. Assim, homozigotos carregam os mesmos alelos (por exemplo, duas mutações ou duas sequências normais) em um lócus de interesse e, portanto, os alelos idênticos serão transmitidos para toda a descendência.
[0027] Desse modo, as modalidades da presente invenção fornecem métodos para fazer plantas de tabaco (ou linhagens de tabaco derivadas de plantas) com nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno. Em uma modalidade, a invenção compreende as plantas do tabaco, ou suas partes, tendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno. Em certas modalidades, a invenção compreende produtos de tabaco feitos a partir de plantas de tabaco modificadas, ou partes das mesmas, tendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno.
[0028] Em certas modalidades de cada um dos métodos, plantas, linhagens de planta ou produtos de tabaco da invenção, o aminoácido com níveis reduzidos é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzido é o ácido glutâmico. Ou os níveis dos outros aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, cisteína, glicina, selenocisteína, tirosina, arginina, ornitina, taurina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano ou valina) podem ser reduzidos.
[0029] Verificou-se que a acrilamida pode ser gerada por meio do tratamento térmico e/ou queima do tabaco (por exemplo, fumo) (consulte, por exemplo, a Publicação de Patente Norte-Americana No. 2011/0048434, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade neste documento). Da mesma forma, a acrilonitrila é um agente cancerígeno do grupo B1 da IARC encontrado no fumo de cigarro
[0030] Em certas modalidades, a diminuição dos níveis de asparagina no tabaco resulta em níveis reduzidos de acrilamida, acrilonitrila e/ou outra formação de composto não natural no fumo derivada do tabaco (ou seja, por exemplo, após o aquecimento e/ou queima de um produto do tabaco compreendendo o tabaco). Da mesma forma, em certas modalidades, a redução dos níveis de pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina no tabaco resulta em níveis reduzidos de acrilamida e/ou acrilonitrila e/ou outra formação de composto não natural na fumaça derivado do tabaco (ou seja, por exemplo, mediante o aquecimento e/ou queima de um produto do tabaco compreendendo o tabaco). Da mesma forma, pequenas quantidades de acrilamida e/ou acrilonitrila podem ser geradas por cura por aquecimento do tabaco. Assim, em certas modalidades, os métodos e/ou plantas de tabaco da invenção podem ser usados para gerar produtos de tabaco com quantidade de acrilamida, acrilonitrila e/ou outros produtos químicos não naturais reduzida que são produzidos a partir de certos aminoácidos.
[0031] A presente invenção pode ser apresentada em uma variedade de maneiras diferentes.
[0032] Em uma modalidade, a invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada compreendendo gerar uma planta do tabaco que compreende um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno em comparação com uma planta não modificada da qual a planta modificada é derivada. Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma parte da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido, em comparação com a planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma.
[0033] Em uma modalidade, o composto derivado do aminoácido com níveis reduzidos é um agente cancerígeno em potencial. Ou, o composto derivado do aminoácido com níveis reduzidos pode ser outro tipo de composto que não é potencialmente benéfico para um consumidor do produto de tabaco. Por exemplo, em certas modalidades, ao aquecer e/ou queimar, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de acrilamida e/ou acrilonitrila em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma. Ou, outros compostos potencialmente não benéficos podem ser reduzidos.
[0034] Em uma modalidade, o tabaco modificado é feito pelas etapas de incubação de pelo menos uma semente de tabaco de uma planta de tabaco não modificada em uma solução compreendendo um agente mutagênico; lavar a pelo menos uma semente livre do agente mutagênico; expor a pelo menos uma semente a um agente de seleção; germinar a pelo menos uma semente e cultivar pelo menos uma muda de tabaco M0 na presença do agente de seleção; cultivar a pelo menos uma muda de tabaco para gerar pelo menos uma planta de tabaco M0, compreendendo pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese; e germinar a pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese para selecionar pelo menos uma planta de tabaco M1 modificada compreendendo um nível reduzido de pelo menos um aminoácido, em comparação com a planta de tabaco não modificada.
[0035] Uma variedade de aminoácidos pode ser alvejada usando os métodos da invenção. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis endógenos reduzidos compreende pelo menos um de asparagina ou ácido glutâmico. Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada compreende pelo menos uma redução de 50% nos níveis de asparagina. Adicionalmente ou alternativamente, a planta de tabaco modificada pode compreender uma redução de pelo menos 40% nos níveis de ácido glutâmico.
[0036] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum.
[0037] A presente invenção também pode compreender um método para fazer uma planta de tabaco modificada com um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco não modificada da qual a planta de tabaco modificada é derivada. Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma. Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno que tem um nível reduzido em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma, após aquecimento e/ou queima do tabaco.
[0038] Por exemplo, em certas modalidades, a invenção pode compreender um método para produzir uma planta de tabaco modificada que compreende um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco não modificada da qual a planta de tabaco modificada é derivada, compreendendo as etapas de: incubar uma semente ou sementes (ou seja, semente(s)) (ou seja, pelo menos uma semente) da planta de tabaco não modificada em uma solução que compreende um agente mutagênico; lavar a(s) semente(s) livres do agente mutagênico; expor a(s) semente(s) M0 a um agente de seleção; germinar a(s) semente(s) e cultivar pelo menos uma muda ou mudas de tabaco M0 (ou seja, muda(s)) na presença de um agente de seleção; cultivar a(s) muda(s) de tabaco M0 para gerar pelo menos uma planta de tabaco M0 compreendendo semente(s) de tabaco M1, em que a(s) semente(s) de tabaco M1 da planta de tabaco M0 compreende(m) pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese; e germinar pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese para selecionar pelo menos uma planta de tabaco M1 modificada que compreende níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com a planta de tabaco não modificada. Em certas modalidades, o método pode ainda compreender as etapas de: cultivar a pelo menos uma planta de tabaco M1 para gerar sementes de tabaco M2, em que a elo menos uma planta de tabaco M2 é um homozigoto para uma mutação que confere a capacidade de crescer na presença do agente de seleção. As plantas M0, M1 e/ou M2 podem, em certas modalidades, ser cultivadas na presença de um agente de seleção.
[0039] Uma variedade de agentes de seleção pode ser utilizada para cada um dos métodos, plantas e composições (por exemplo, os produtos de tabaco) da invenção. Em uma modalidade, o agente de seleção é um aminoácido. Por exemplo, o agente de seleção pode ser leucina. Ou, outros aminoácidos podem ser usados como um agente de seleção. Em certas modalidades, o agente de seleção é um aminoácido diferente de lisina e/ou treonina.
[0040] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum.
[0041] Em certas modalidades, as plantas de tabaco modificadas feitas pelos métodos da invenção podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9, em que uma amostra representativa de sementes para estas linhagens foram depositadas na Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Va 201 10-2209) em 22 de dezembro de 2011, sob as condições previstas pelo Tratado de Budapeste, e que terão todas as restrições na acessibilidade das sementes irrevogavelmente removidas mediante emissão de uma patente. Às sementes depositadas foram atribuídos os números de registro ATCC PTA-12339 (10NH-23), PTA-12340 (10NH-34), PTA- 12341 (10NH-18), PTA- 12342 (10NH-27) e PTA- 12343 (10NH-9), respectivamente. Ou outras plantas, como aquelas descritas neste documento, podem ser feitas pelos métodos da invenção.
[0042] Em ainda outras modalidades, a invenção pode compreender uma planta de tabaco modificada ou uma parte da mesma compreendendo uma diminuição em pelo menos um aminoácido endógeno em comparação com uma planta de tabaco não modificada ou porção da mesma, da qual a planta é derivada. Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno com níveis reduzidos, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma. Em uma modalidade, mediante aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco ou uma parte da mesma gera um nível reduzido de pelo menos um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno com níveis reduzidos, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma.
[0043] Em uma modalidade, o genoma da planta de tabaco não modificada compreende um genoma aloploide. Além disso, em uma modalidade, o genoma da planta de tabaco modificada compreende uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de um excesso de um agente de seleção (por exemplo, como um aminoácido). Em uma modalidade, o genoma do tabaco modificado tem uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de leucina.
[0044] Em uma modalidade, a planta pode compreender uma redução de asparagina e/ou ácido glutâmico endógeno em comparação com uma planta não modificada. Ou, conforme descrito neste documento, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0045] A redução do aminoácido pode resultar na redução dos níveis de composto feito a partir do aminoácido. Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de acrilamida e/ou acrilonitrila em comparação com a planta do tabaco não modificada ou uma porção da mesma, mediante aquecimento e/ou queima. Por exemplo, a planta ou parte da mesma pode compreender pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de redução em acrilamida e/ou acrilonitrila mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou de uma parte da mesma, comparação com uma planta não modificada.
[0046] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Em algumas modalidades, as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou podem ser utilizadas outras linhagens, incluindo aquelas descritas neste documento.
[0047] Em outras modalidades, a presente invenção compreende uma planta de tabaco modificada ou uma porção da mesma que compreende uma diminuição no nível de pelo menos um de acrilamida e/ou acrilonitrila, em comparação com um tabaco não modificado do qual a planta é derivada. Em algumas modalidades, a planta de tabaco modificada compreende uma redução na acrilamida e/ou acrilonitrila mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou de uma parte da mesma em comparação com a planta não modificada. Adicionalmente e/ou alternativamente, a planta pode compreender uma redução do nível pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com a planta não modificada. Por exemplo, a planta modificada pode compreender uma redução de asparagina e/ou ácido glutâmico, em comparação com a planta não modificada.
[0048] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Em algumas modalidades, as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou outras linhagens podem ser utilizadas.
[0049] Em algumas modalidades, a planta de tabaco modificada é gerada por mutagênese. O método pode, em certas modalidades, compreender as etapas de: incubar uma semente ou sementes da planta de tabaco não modificada em uma solução que compreende um agente mutagênico; lavar a semente ou sementes livres do agente mutagênico; expor a pelo menos uma semente de tabaco M0 a um agente de seleção (por exemplo, adicionando o agente de seleção ao solo ou a um meio no qual a semente é pelo menos parcialmente imersa); germinar a semente ou sementes na presença do agente de seleção e cultivar pelo menos uma muda de tabaco M0; cultivar a pelo menos uma muda de tabaco M0 para gerar pelo menos uma planta de tabaco M0 que compreende sementes de tabaco M1, em que as sementes de tabaco M1 da planta de tabaco M0 compreendem pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese; e germinar a pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese para selecionar uma planta de tabaco M1 modificada que compreende níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com a planta de tabaco não modificada (ou seja, a planta M0) da qual a planta modificada (ou seja, M1) planta é derivada. Em certas modalidades, o método pode compreender germinar as plantas M1 e/ou M2, derivadas de pelo menos uma planta M1 em um meio que compreende um agente de seleção. Em certas modalidades, o aminoácido com um nível reduzido do aminoácido é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido que tem nível reduzido é asparagina. Em outra modalidade, o aminoácido que tem nível reduzido é o ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0050] Em ainda outras modalidades, a invenção pode compreender um produto de tabaco que compreende um tabaco modificado de uma planta que tem um nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com uma planta de tabaco não modificada, da qual a planta de tabaco modificada é derivada. Em certas modalidades, a planta modificada é gerada usando os métodos descritos neste documento. Em uma modalidade, o produto de tabaco gera um nível reduzido de um composto derivado de pelo mens um aminoácido endógeno em comparação com um produto que compreende uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma. Em uma modalidade, ao aquecer e/ou queimar, o produto de tabaco gera um nível reduzido de um composto derivado de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com um produto que compreende uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma.
[0051] Em uma modalidade, o genoma do tabaco modificado usado no produto de tabaco compreende um genoma aloploide. Além disso, em uma modalidade, o genoma da planta de tabaco modificada compreende uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de um excesso de um agente de seleção de aminoácido como, por exemplo, leucina.
[0052] Em certas modalidades, o produto de tabaco pode compreender um tabaco modificado que compreende uma diminuição nos níveis de acrilamida e/ou nos níveis de acrilonitrila. Os níveis de acrilamida e/ou de acrilonitrila reduzidos podem ocorrer por meio de aquecimento e/ou queima do tabaco, em comparação com um tabaco sem modificações. Por exemplo, a planta ou parte da mesma pode compreender pelo menos uma redução de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de redução em acrilamida e/ou acrilonitrila com aquecimento e/ou queima do produto de tabaco, em comparação com um produto de tabaco com tabaco da planta não modificada.
[0053] Em certas modalidades, o tabaco compreende uma redução dos níveis endógenos de pelo menos um aminoácido. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis reduzidos é asparagina e/ou ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos como alanina, glutamina e/ou prolina podem ser reduzidos. Ou outros aminoácidos como histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina podem ser reduzidos. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0054] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Em algumas modalidades, as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou outras linhagens podem ser utilizadas.
[0055] Em certas modalidades, a invenção pode também compreender um produto do tabaco que compreende o tabaco de uma planta de tabaco modificada, o tabaco tendo um nível reduzido de acrilamida, acrilonitrila e/ou outros produtos químicos não naturais em comparação com um tabaco não modificado, do qual a planta é derivada. Em certas modalidades, a planta modificada é gerada usando os métodos descritos neste documento. Em certas modalidades, a invenção também pode compreender um produto de tabaco que compreende tabaco de uma planta de tabaco modificada, o tabaco tendo uma diminuição nos níveis de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais em comparação com um tabaco não modificado do qual a planta é derivada por meio de aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou de uma fração da mesma.
[0056] Em uma modalidade, o genoma do tabaco modificado usado no produto de tabaco compreende um genoma aloploide. Além disso, em uma modalidade, o genoma da planta de tabaco modificada compreende uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de um excesso de um agente de seleção de aminoácido como, por exemplo, leucina.
[0057] Em certas modalidades, o produto de tabaco pode compreender um tabaco modificado que compreende uma diminuição nos níveis de acrilamida e/ou nos níveis de acrilonitrila. Os níveis de acrilamida e/ou de acrilonitrila reduzidos podem ocorrer por meio de aquecimento e/ou queima do tabaco, em comparação com um tabaco sem modificações. Por exemplo, a planta ou parte da mesma pode compreender pelo menos uma redução de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de redução em acrilamida e/ou acrilonitrila com aquecimento e/ou queima do produto de tabaco, em comparação com um produto de tabaco com tabaco da planta não modificada.
[0058] Em certas modalidades, o tabaco compreende uma redução dos níveis endógenos de pelo menos um aminoácido. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis reduzidos é asparagina e/ou ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos como alanina, glutamina e/ou prolina podem ser reduzidos. Ou outros aminoácidos como histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina podem ser reduzidos. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0059] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Em certas modalidades, as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH- 18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou outras linhagens podem ser utilizadas.
[0060] Em ainda outras modalidades, a invenção compreende tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou o tabaco modificado pode compreender tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou tabaco de outras linhagens aqui descritas ou feito pelos métodos da invenção pode ser usado.
[0061] Assim, em algumas modalidades, apresente invenção compreende produtos de tabaco feitos a partir de plantas e linhagens de tabaco da invenção. Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção compreende produtos de tabaco compreendendo um tabaco modificado de plantas de tabaco com nível reduzido de substâncias químicas não naturais, em comparação com um tabaco não modificado. Em certas modalidades, a presente invenção compreende produtos de tabaco compreendendo um tabaco modificado de uma planta de tabaco com nível reduzido de acrilamida, acrilonitrila e/ou substâncias químicas não naturais por meio de aquecimento e/ou queima do tabaco em comparação com um tabaco não modificado. Da mesma forma, os produtos de tabaco da invenção podem compreender um produto de tabaco compreendendo um tabaco modificado com nível reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno, em comparação com um tabaco não modificado, do qual o tabaco modificado é derivado. Em uma modalidade, o aminoácido com um nível reduzido é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido que tem nível reduzido é asparagina. Adicionalmente ou alternativamente, o aminoácido com nível reduzido é ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0062] A redução de certos aminoácidos pode estar associada com uma redução de substâncias químicas não naturais que podem ser geradas por meio de aquecimento e/ou queima (por exemplo, fumo) do tabaco.
[0063] Por exemplo, a acrilamida é um agente cancerígeno que pode ser encontrado na fumaça do cigarro. Em certas modalidades, a redução dos níveis de asparagina no tabaco pode ser correlacionada com níveis reduzidos de formação de acrilamida na fumaça. Deste modo, em certas modalidades, os métodos e/ou plantas de tabaco, e/ou produtos de tabaco da invenção podem ser usados para fazer produtos de tabaco que, por meio de aquecimento e/ou queima, geram níveis reduzidos de acrilamida e/ou outras substâncias químicas que podem ser pirossintetizadas a partir de aminoácidos.
[0064] Em outras modalidades, a redução dos níveis de pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina pode estar associada a uma redução de outro agente cancerígeno potencial, acrilonitrila. Em uma modalidade, redução do ácido glutâmico pode ser associada com uma redução na acrilonitrila. Deste modo, em certas modalidades, os métodos e/ou plantas de tabaco, e/ou produtos de tabaco da invenção podem ser usados para fazer produtos de tabaco que, por meio de aquecimento e/ou queima, geram níveis reduzidos de acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas que podem ser pirossintetizadas a partir de aminoácidos.
[0065] Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada que compreende níveis reduzidos de asparagina endógena, de modo que, mediante o aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco ou uma parte da mesma gera níveis reduzidos de acrilamida em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma parte da mesma.
[0066] Da mesma forma, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada que compreende um nível reduzido de pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina endógena, de modo que a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de acrilonitrila em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, ou uma parte da mesma.
[0067] Por exemplo, em certas modalidades, as plantas e/ou produtos de tabaco da presente invenção têm folhas de tabaco ou outras porções da planta que, após tratamento térmico, produzem cerca de 0,33 micrograma (μg) de asparagina por miligrama de peso da planta seca, ou uma diminuição de cerca de 70% ou mais sobre as plantas de tabaco de origem das quais a planta de tabaco modificada é derivada.
[0068] Também, em certas modalidades, a quantidade de acrilamida na fumaça gerada a partir das folhas de tabaco ou outras porções das plantas de tabaco modificadas da presente invenção é de cerca de 50% ou menos, em comparação com a fumaça do cigarro gerada a partir de outros tipos de folhas de tabaco geralmente utilizadas para plantas de produtos de tabaco e/ou plantas das quais a planta de tabaco modificada é derivada.
[0069] Por exemplo, em certas modalidades, as plantas de tabaco e/ou produtos da presente invenção têm folhas de tabaco ou outras porções da planta que, após tratamento térmico, produzem menos de cerca de 0,110 micrograma (μg) de ácido glutâmico por miligrama de peso de planta seca, ou uma redução de cerca de 40% ou mais em comparação com as plantas de tabaco originais das quais a planta de tabaco modificada é derivada.
[0070] Da mesma forma, em certas modalidades, a quantidade de acrilonitrila na fumaça gerada a partir das folhas de tabaco ou outras porções das plantas de tabaco modificadas da presente invenção é de cerca de 50%, em comparação com a fumaça do cigarro gerada a partir de outros tipos de folhas de tabaco geralmente utilizadas para produtos e/ou plantas de tabaco dos quais a planta de tabaco modificada é derivada.
[0071] Conforme descrito mais detalhadamente neste documento, em certas modalidades para cada um dos métodos, plantas e produtos de tabaco da invenção, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Ou outras plantas ou tabacos podem ser utilizados.
[0072] Em certas modalidades, o tabaco modificado usado nos produtos de tabaco da invenção pode compreender tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 1ONH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou o tabaco modificado pode compreender tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou tabaco de outras linhagens aqui descritas ou feito pelos métodos da invenção pode ser usado. Métodos para Fazer Tabaco com Teor Reduzido de Pelo Menos um Aminoácido
[0073] As modalidades da presente invenção fornecem métodos para fazer plantas com um nível significativamente reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para fazer plantas de tabaco (ou linhagens de tabaco derivadas de tais plantas) tendo um nível significativamente reduzido de pelo menos um aminoácido.
[0074] Em certas modalidades, o aminoácido endógeno com um nível reduzido é pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido endógeno com nível reduzido é asparagina. Adicionalmente ou alternativamente, o aminoácido endógeno com nível reduzido é ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0075] Em uma modalidade, o aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de um composto derivado do aminoácido alvejado para redução, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, ou uma porção da mesma. Em certas modalidades, a planta de tabaco modificada ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais (por exemplo, mediante aquecimento e/ou queima) em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma porção da mesma.
[0076] Deste modo, em uma modalidade, a presente invenção compreende um método para produzir uma planta modificada (ou uma linhagem derivada da planta) compreendendo um fenótipo alterado de uma redução significativa nos níveis de um aminoácido particular por seleção para uma mutação de interesse na geração M0. O método pode compreender incubar sementes ou tecido vegetal da planta de interesse em uma solução que compreende um agente mutagênico. O método também pode compreender lavar as sementes livres do agente mutagênico. Ou as sementes podem ser modificadas por outros métodos (por exemplo, irradiação) e, em seguida, seguir as etapas do método realizado.
[0077] O método pode ainda compreender germinar a semente ou sementes e cultivar pelo menos uma muda M0. Em uma modalidade, o agente de seleção é adicionado à semente neste momento. O método pode compreender ainda adicionar um agente de seleção à muda ou mudas, em que o agente de seleção seleciona uma planta M0 quimérica, em que a planta M0 quimérica compreende, pelo menos parcialmente, o fenótipo alterado predeterminado. O método pode, então, compreender o cultivo da planta quimérica M0 para gerar sementes M1, em que as sementes M1 podem compreender sementes M1 que não sofreram mutagênese e pelo menos uma semente M1 que sofreu mutagênese compreendendo o fenótipo alterado predeterminado, e germinar as sementes M1 para selecionar as plantas M1 que compreendem o fenótipo alterado predeterminado. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda cultivar as planas M1 para gerar sementes M2, em que pelo menos uma das plantas M2 é um homozigoto para uma mutação, fazendo com que o fenótipo alterado e a germinação das sementes M2 identifiquem pelo menos uma planta M1 homozigótica. Em certas modalidades, o método pode compreender germinar as plantas M1 e/ou M2, derivadas das plantas M1 em um meio e/ou solo que compreende um agente de seleção.
[0078] Em modalidades alternativas, a planta modificada (ou uma linhagem derivada da planta) tem pelo menos uma redução de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% em pelo menos um aminoácido. Em modalidades alternativas, a planta modificada tem pelo menos uma redução de 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes em pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade o aminoácido com níveis reduzidos é asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzido é o ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0079] Em uma modalidade, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de um composto derivado do aminoácido alvejado para redução, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, ou uma porção da mesma. Por exemplo, em certas modalidades, o método compreende gerar plantas de tabaco modificadas que, mediante aquecimento e/ou queima, geram níveis reduzidos de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais em comparação com plantas de tabaco de origem não modificadas.
[0080] Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada compreendendo gerar uma planta de tabaco compreendendo níveis reduzidos de asparagina endógena, de modo que, mediante aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco modificada ou uma parte da mesma gera níveis reduzidos de acrilamida em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma fração da mesma.
[0081] Em outras modalidades, a presente invenção compreende um método para produzir uma planta de tabaco modificada que compreende gerar uma planta de tabaco que compreende níveis reduzidos de pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina, de modo que, mediante aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco modificada ou uma porção da mesma gera níveis reduzidos de acrilonitrila em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, ou uma porção da mesma.
[0082] Para os vários métodos de mutagênese da invenção, a planta de tabaco compreende pelo menos uma redução de 10% nos níveis de acrilamida mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma parte da planta de tabaco. Por exemplo, em modalidades alternativas, um produto feito de pelo menos uma porção da planta de tabaco modificada, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta, tem pelo menos uma diminuição de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de acrilamida ao aquecer e/ou queimar (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco). Em modalidades alternativas, a linhagem de tabaco modificada tem uma redução de pelo menos 1,2. 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes de acrilamida mediante aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco).
[0083] Em certas modalidades dos métodos da invenção, o aminoácido com níveis reduzidos é ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos selecionados podem ser reduzidos. Por exemplo, a planta de tabaco pode compreender uma redução de pelo menos 10% nos níveis de ácido glutâmico. Da mesma forma, em modalidades alternativas, um produto feito a partir de pelo menos uma porção da planta de tabaco modificada, ou uma linhagem derivada da planta do tabaco tem, pelo menos, uma diminuição de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% nos níveis de ácido glutâmico.
[0084] Também, em modalidades alternativas, um produto feito de pelo menos uma porção da planta de tabaco modificada, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta, tem pelo menos uma diminuição de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de acrilonitrila ao aquecer e/ou queimar (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco). Em modalidades alternativas, a linhagem de tabaco modificada tem uma redução de pelo menos 1,2. 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes de acrilonitrila mediante aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco).
[0085] Em modalidades para o método de produção de uma planta de tabaco modificada, que compreende um nível reduzido de pelo menos um aminoácido, e/ou de produção de plantas de tabaco modificadas que , mediante aquecimento e/ou queima, a planta ou uma parte da mesma gera um nível reduzido de acrilamida e/ou acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais em comparação com plantas de tabaco não modificadas, o método pode compreender as etapas de: incubar pelo menos uma semente de tabaco pelo uma planta de tabaco não modificada em uma solução compreendendo um agente mutagênico; lavar a pelo menos uma semente livre do agente mutagênico; expor a pelo menos uma semente a um agente de seleção; germinar a pelo menos uma semente e cultivar pelo menos uma muda de tabaco M0 em um meio que compreende um agente de seleção; cultivar a pelo menos uma muda de tabaco M0 para gerar pelo menos uma planta de tabaco M0 compreendendo as sementes de tabaco de M1, em que as sementes de tabaco M1 compreendem pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese; e germinar pelo menos uma semente de tabaco M1 que sofreu mutagênese para selecionar uma planta de tabaco M1 modificada compreendendo níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido, em comparação com a planta de tabaco não modificada. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda cultivar pelo menos uma planta de tabaco M1 para gerar sementes de tabaco M2, em que a pelo menos uma planta de tabaco M2 é homozigota para uma mutação que causa o fenótipo alterado e germinar as sementes de tabaco M2 para identificar pelo menos uma planta de tabaco M1 homozigota. Em certas modalidades, o método pode compreender germinar pelo menos uma planta M1 e/ou pelo menos uma planta M2 derivada das plantas M0 ou M1 no solo ou em outro tipo de meio que compreende um agente de seleção.
[0086] Também em certas modalidades dos métodos da invenção, um meio que compreende pelo menos um agente de seleção é adicionado às mudas M0 em certos estágios de desenvolvimento, como durante um período de tempo predeterminado após a germinação. Para o tabaco (por exemplo, Nicotiama tabacum) um meio que compreende pelo menos um agente de seleção pode ser adicionado às mudas M0 7 a 14 dias após a germinação. Por exemplo, o segundo meio que compreende pelo menos um agente de seleção pode ser adicionado às mudas M0 cerca de 10 dias após a germinação. Em modalidades alternativas, a seleção pode estar continuamente presente durante o crescimento das mudas M0.
[0087] Como discutido adicionalmente neste documento, uma variedade de plantas pode ser modificada usando os métodos da invenção. Em certas modalidades, a planta compreende um genoma aloploide. Em certas modalidades, a planta é tabaco. Em certas modalidades preferidas, o tabaco é do gênero Nicotiana. Mais preferencialmente, o tabaco pode compreender a espécie Nicoticma tabacum. Ou, conforme descrito neste documento, qualquer um do gênero Nicotiana ou misturas do mesmo podem ser utilizadas. Tais membros são descritos nas Publicações de Patente Norte-Americana Nos. 2006/0185686 e 2011/0174323, as divulgações das quais sendo incorporadas por referência em suas totalidades neste documento. Ou outros tabacos podem ser utilizados.
[0088] Em certas modalidades, o agente mutagênico é metanossulfonato de etila (EMS). Em algumas modalidades, o EMS compreende uma concentração final de 0,01 a 2%. Ou o EMS pode compreender uma concentração final de 0,05 a 1%. Ou o EMS pode compreender uma concentração final de 0,2 a 0,7%. Por exemplo, em certas modalidades, uma concentração de 0,5% pode ser usada. Ou outros agentes mutagênicos químicos (ou irradiação) podem ser usados.
[0089] Em certas modalidades, as sementes que sofreram mutagênese são suspensas em placas de ágar solidificado contendo o agente de seleção. Em outras modalidades, as sementes podem ser suspensas em um meio nutritivo e aplicadas a uma superfície semipermeável para crescimento antes da adição do agente de seleção. Ou a seleção pode ser realizada usando um sistema hidropônico ou no solo.
[0090] Assim, as modalidades da presente invenção compreendem métodos para mutagênese de planta que incluem uma etapa de seleção no estágio quimérico M0. Por exemplo, em um aspecto, a presente invenção compreende a seleção de plantas com resistência a grandes quantidades (por exemplo, potencialmente letais) de leucina como um agente de seleção. Ou outros agentes de seleção (por exemplo, outros aminoácidos) podem ser utilizados. Ou outros compostos que regulam a síntese de aminoácidos ou o metabolismo de aminoácidos poderiam ser usados.
[0091] Em algumas modalidades, o agente de seleção (por exemplo, leucina) está presente em uma concentração que varia de 0,3 a 20 mM ou, o agente de seleção (por exemplo, leucina) pode estar presente em uma concentração que varia de 0,5 a 10 mM. Ou o agente de seleção (por exemplo, leucina) pode estar presente em concentrações que variam de 2,0 a 10,0 mM.
[0092] A planta quimérica M0 compreenderá, em certas modalidades, uma subpopulação de células resistentes ao agente de seleção; estas células podem conferir viabilidade a toda a planta quando esta é cultivada na presença de um agente de seleção como, mas sem se limitar, a níveis elevados de leucina. A presente invenção pode, deste modo, eliminar o crescimento de uma grande população de plantas M0 para produzir sementes M1, reduzindo, deste modo, substancialmente o número de descendência que deve ser testado no estágio M1, para fornecer uma programa de reprodução vegetal] barato para plantas grandes, ou plantas que compreendem genomas complexas, como o tabaco. O método utilizado neste documento é diferente do método de seleção utilizado para produzir as linhagens de N. tabacum, compreendendo um teor de aminoácido significativamente maior, conforme descrito nas Patentes Norte-Americanas Nos. 6.730.832, 7.173.170 e 7.825.305, cujas divulgações são incorporadas por referência em suas totalidades neste documento.
[0093] As modalidades da invenção também podem incluir sementes derivadas de plantas modificadas que foram geradas usando os métodos da invenção, em que as sementes são capazes de propagar as linhagens de plantas modificadas com níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis reduzidos é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzidos pode ser ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0094] Também, conforme discutido em mais detalhes neste documento, a invenção compreende produtos de tabaco derivados de plantas e/ou de linhagens de plantas geradas usando os métodos da invenção, como folhas para mascar tabaco, folhas secas ao ar quente para fumar tabaco e outros produtos de tabaco conhecidos. Em certas modalidades, a presente invenção compreende métodos para reduzir os níveis de um composto não natural que podem estar presentes no tabaco e/ou gerados mediante aquecimento e/ou queima de tabaco, e/ou melhorando o flavor de um produto de tabaco, compreendendo gerar uma planta de tabaco modificada com uma diminuição na concentração de pelo menos um aminoácido, misturar o tabaco modificado com tabaco não modificado e induzir a mistura em um produto de tabaco. Preferencialmente, a planta de tabaco modificada é feita pela mutagênese de sementes de tabaco e seleção de plantas quiméricas que sofreram parcialmente mutagênese. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis reduzidos é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzido é o ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[0095] Deste modo, as modalidades da presente invenção referem-se ao uso de um método para produzir plantas com um fenótipo alterado pela seleção, no estágio quimérico M0, e o uso desse método para produzir plantas com uma diminuição em pelo menos um aminoácido. A mutagênese tem sido usada como um método de reprodução convencional para desenvolver cultivares melhoradas de várias culturas, incluindo tabaco (consulte, por exemplo, A. M. van Harten, Mutation Breeding: Theory and Practical Applications, páginas 1-63, Cambridge Univ. Press, New York, N.Y., 1998). Geralmente, os materiais vegetais alvo usados para desenvolver o mutante desejado usando agentes mutagênicos químicos são classificados em duas categorias: (1) sementes e (2) cultura de células ou tecido.
[0096] Por exemplo, as sementes podem ser tratadas com agentes mutagênicos específicos, e as sementes sobreviventes foram cultivadas para produzir suas descendências (por exemplo, Heremans and Jacobs, 1995). A geração que cresce a partir da semente que sofreu mutagênese chama-se geração M0, e a progenia coletada das plantas M0 é a geração M1, da qual os mutantes desejados são geralmente selecionados. A seleção adicional de plantas que são homozigotas para a mutação de interesse pode ser feita pela descendência sendo cultivada das plantas M1 (ou seja, a geração M2) sob condições seletivas.
[0097] Embora a mutagênese e a seleção sejam muito mais fáceis de realizar em células de cultura de tecido (por exemplo, Cattoir-Reynaerts et al, 1983; Dotson et al, 1990; Hibberd et al, 1980), as células ou tecidos mutantes devem ser regenerados para plantas férteis. O estabelecimento de um sistema para a regeneração de uma planta fértil a partir do genótipo de interesse pode ser demorado, caro e requer um elevado nível de conhecimentos técnicos. Além disso, a variação somaclonal indesejada frequentemente ocorre em mutantes regenerados de interesse, como resultado de duplicações cromossômicas autossômicas.
[0098] A engenharia genética também tem sido usada para produzir plantas transgênicas. Por exemplo, a expressão de uma AK bacteriana em tabaco (N. tabacum) pode resultar em uma superprodução de treonina livre em (O. Shaul e G. Galili, 1992, Plant Physiol, 700: 1157-1163; Karchi, H., et al, 1993, Plant J., 3: 721-727), canola, soja e milho (Falco, S.C., et al, 1995, Biotechnology 13: 577-582; Falco, S.C., et al, 1997, SIM News 47: 53-57). Além disso, esta abordagem pode ser tecnicamente exigente, requer a introdução de DNA estrangeiro no genoma e não gera a grande variedade de mutantes necessária para a propagação de uma cultura em diferentes ecossistemas. Além disso, os efeitos das culturas transgênicas produzidas por engenharia genética sobre a estabilidade a longo prazo dos ecossistemas não são conhecidos (N.C. Ellstrand, 2001, Plant Physiol, 125: 1543-1545). Finalmente, as culturas transgênicas não foram amplamente aceitas pelo público, especialmente em países europeus.
[0099] É, portanto, um objeto da presente invenção utilizar um método de triagem pelo qual a triagem é, pelo menos em parte, realizada usando plantas M0. Referindo-se agora à Figura 1, em um aspecto, a invenção fornece um método de produção de linhagens de tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacum) tendo uma quantidade reduzida de pelo menos um aminoácido endógeno. Em uma modalidade, o método compreende as etapas de: (a) modificar as sementes de tabaco 2 em uma solução contendo o agente mutagênico metanossulfonato de etila (EMS) 4 em uma concentração de cerca de 0,5% durante 20 h; (b) lavar as sementes que sofreram mutagênese em água 6; (c) esterilizar as sementes 2 com etanol 70% seguido por alvejante Chlorox 20% 8 em um agitador sob agitação 10; (d) enxaguar com água estéril 6; (e) suspender as sementes 2 em meio nutriente com ágar 0,1% (uma suspensão coloidal semissólida) 12; (f) aplicar cerca de 0,750 mL da suspensão com cerca de 50 sementes 2 em uma placa de fitoágar solidificada contendo o agente de seleção 16; (g) germinar as sementes e cultivar as mudas 18 em uma sala de cultura de tecidos a 25 °C com um fotoperíodo de 16 h de lâmpadas fluorescentes brancas frias; (h) transplantar as mudas M0 saudáveis 18 no solo e cultivá-las como plantas M0 22 em uma estufa; e (i) plantar sementes M1 individuais 23 a partir das plantas M0 22 em um campo para cultivar plantas M1 24; (j) testar as plantas M1 quanto a níveis abaixo da média de pelo menos um aminoácido (por exemplo, asparagina); (k) cultivar sementes M2 25 das plantas M1 com um baixo nível de pelo menos um aminoácido e testar as linhagens M2 26 que produzem níveis abaixo da média de pelo menos um aminoácido (por exemplo, asparagina ou outro aminoácido). Estas plantas de tabaco não quiméricas geralmente são uma mistura de heterozigotos e homozigotos. Uma etapa de seleção adicional pode ser adicionada para selecionar as linhagens de tabaco com base na análise química dos níveis de aminoácidos.
[00100] Essas plantas modificadas e/ou linhagens também fornecem a base para a produção de linhagens híbridas, utilizando-se como uma ou ambas as origens, as novas linhagens da presente invenção. Também estão no escopo da presente invenção os clones, somaclones e derivados das novas linhagens.
[00101] Em certas modalidades, as plantas de tabaco modificadas feitas pelos métodos da invenção podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9, em que uma amostra representativa de sementes para estas linhagens foram depositadas na Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Va 201 10-2209) em 22 de dezembro de 2011, sob as condições previstas pelo Tratado de Budapeste, e que terão todas as restrições na acessibilidade das sementes irrevogavelmente removidas mediante emissão de uma patente. Às sementes foram atribuídos os números de registro ATCC PTA-12339 (10NH-23), PTA-12340 (10NH-34), PTA- 12341 (10NH-18), PTA-12342 (10NH- 27) e PTA- 12343 (10NH-9), respectivamente. Ou outras plantas podem ser feitas pelos métodos da invenção. Plantas de Tabaco com Níveis Reduzidos de pelo Menos um Aminoácido
[00102] Em certas modalidades, a invenção compreende plantas com um nível significativamente reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno. Em certas modalidades, o aminoácido com um nível reduzido do aminoácido é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido endógeno com nível reduzido é asparagina. Adicionalmente ou alternativamente, o aminoácido com nível reduzido é ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[00103] Em uma modalidade, mediante aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco ou uma porção da mesma gera um nível reduzido de um composto derivado daquele aminoácido, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou uma porção da mesma. Por exemplo, em certas modalidades, as plantas de tabaco da invenção têm níveis reduzidos de acrilamida, acrilonitrila e/ou outros produtos químicos não-naturais após o tratamento térmico da planta ou de uma parte da mesma.
[00104] Como discutido em outras partes neste documento, uma variedade de plantas pode ser modificada. Em certas modalidades, a planta compreende um genoma aloploide. Em certas modalidades, a planta é tabaco. Em certas modalidades preferidas, o tabaco é do gênero Nicotiana a. Mais preferencialmente, o tabaco pode compreender a espécie Nicoticma tabacum. Ou, em certas modalidades, qualquer um do gênero Nicotiana ou outros tipos de tabaco podem ser usados. Tais tabacos são descritos nas Publicações de Patente Norte-Americana Nos. 2006/0185686 e 2011/0174323, cujas divulgações são incorporadas por referência em suas totalidades neste documento. Ou outros tabacos podem ser utilizados.
[00105] Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção pode compreender uma planta de tabaco que compreende um tabaco modificado tendo níveis reduzidos de pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina em comparação com uma planta de tabaco não modificada, da qual a planta modificada é derivada. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzido é o ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[00106] Adicionalmente ou alternativamente, a presente invenção pode compreender uma planta de tabaco que compreende um nível reduzido de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco não modificada, da qual a planta modificada é derivada, em que o genoma da planta de tabaco modificada compreende um genoma aloploide que tem uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de um agente de seleção, como um aminoácido (por exemplo, leucina ou outro aminoácido). Adicionalmente ou alternativamente, a presente invenção pode compreender uma planta de tabaco modificada que compreende uma diminuição nos níveis de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais (por exemplo, mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma parte da mesma) em comparação com um tabaco não modificado do qual a planta é derivada, em que o genoma da planta de tabaco modificado compreende um genoma aloploide que tem uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de um agente de seleção, como um aminoácido (por exemplo, leucina ou outro aminoácido).
[00107] As plantas (por exemplo, plantas de tabaco) incluídas na presente invenção também incluem plantas (e/ou linhagens derivadas dessas plantas) que podem ser geneticamente modificadas usando DNA estrangeiro (por exemplo, que não seja de tabaco) em um lócus diferente dos genes relacionados com a produção do aminoácido de interesse (ou seja, o aminoácido para o qual a concentração reduzida no tabaco é o resultado final). Por exemplo, plantas de tabaco que são geneticamente modificadas para serem resistentes a pesticidas e que também são modificadas por mutagênese do DNA gnômico do tabaco (por exemplo, na asparaginase, asparagina sintetase para plantas com teor de asparagina reduzido, ou outras biossínteses de aminoácidos ou loci metabólicos) para tornarem-se produtoras de pequenas quantidades de asparagina e/ou para compreender uma quantidade reduzida de acrilamida e/ou acrilonitrila após aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma parte da mesma, estão incluídas na presente invenção.
[00108] Desta forma, as modalidades da presente invenção podem compreender uma planta de tabaco modificada, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta com quantidade menor de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada e/ou linhagem de tabaco da qual a planta modificada é derivada, em que o genoma da planta de tabaco modificada consiste, ou consiste essencialmente no DNA da planta. Preferencialmente, o genoma da planta de tabaco modificada consiste, ou consiste essencialmente em DNA de tabaco. Ainda mais preferencialmente, os genes da planta de tabaco modificada relacionados à biossíntese e/ou metabolismo do aminoácido alvejado para redução (por exemplo, asparaginase e/ou asparagina sintetase para plantas com níveis de asparagina reduzidos ou outros loci metabólicos ou de biossíntese de aminoácidos) consistem em, ou consistem essencialmente em DNA gnômico de tabaco.
[00109] A presente invenção também inclui uma planta de tabaco modificada e/ou uma linhagem de tabaco derivada da planta com uma quantidade reduzida de pelo menos um aminoácido e/ou uma quantidade reduzida de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais (por exemplo, mediante aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma porção da mesma) em comparação com uma linhagem de tabaco de origem não modificada, da qual a planta modificada é derivada, em que a planta modificada consiste em, ou consiste essencialmente na mesma resistência a antibióticos que a linhagem de origem não modificada. Em certas modalidades, o aminoácido com níveis reduzidos é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzidos pode ser ácido glutâmico. Ou, outros aminoácidos podem ser reduzidos.
[00110] Em ainda outro aspecto, a presente invenção compreende uma planta de tabaco modificada, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta com uma quantidade abaixo da média de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, em que o genoma da planta de tabaco modificada consiste, ou consiste essencialmente em DNA vegetal, ou em que a planta de tabaco modificada é produzida pelas etapas de mutagênese do DNA gnômico do tabaco e seleção de plantas M0 com uma mutação de interesse. Por exemplo, a presente invenção compreende uma planta de tabaco modificada e/ou uma linhagem de tabaco derivada da planta com uma quantidade abaixo da média de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada ou linhagem de planta, em que os genes da planta de tabaco modificada relacionados com a biossíntese e/ou o metabolismo do aminoácido alvo de redução (por exemplo, asparaginase e/ou asparagina sintetase para plantas com asparagina reduzida) consiste em, ou consiste essencialmente em DNA gnômico de tabaco. Mais preferencialmente, o gene da asparaginase da planta de tabaco modificada consiste, ou consiste essencialmente em DNA gnômico de tabaco.
[00111] Em outro aspecto, a presente invenção compreende uma planta de tabaco modificada e/ou uma linhagem de tabaco derivada da planta do tabaco com uma quantidade reduzida de pelo menos um aminoácido em comparação com uma linhagem de tabaco de origem não modificada, em que a planta de tabaco é produzida por mutagênese do DNA gnômico do tabaco e seleção de plantas M0 com uma mutação de interesse. Em uma modalidade, a planta de tabaco é produzida pelas etapas de: submeter a mutagênese a(s) semente(s) de tabaco; expor as sementes M0 a um agente de seleção; germinar a(s) semente(s) que sofreram mutagênese na presença do agente de seleção (por exemplo, leucina) e cultivar pelo menos uma muda M0; cultivar pelo menos uma planta M0 quimérica para gerar sementes M1, em que as sementes M1 da planta M0 podem compreender sementes M1 que não sofreram mutagênese e pelo menos uma semente M1 que sofreu mutagênese; e germinar as sementes M1 em meio para selecionar as plantas M1 que sofreram mutagênese. Em certas modalidades, o método de preparação da planta modificada inclui as etapas de cultivar as plantas de tabaco M1 para gerar as sementes M2, em que pelo menos uma das plantas M1 é homozigota para uma mutação que confere a capacidade de crescer na presença de um agente de seleção (por exemplo, leucina); e germinar as sementes M2 para identificar pelo menos uma planta M2 homozigota. Em certas modalidades, o método pode compreender germinar pelo menos uma planta M1 e/ou pelo menos uma planta M2 derivada das plantas M1 em um meio (ou solo) compreendendo um agente de seleção.
[00112] Em modalidades alternativas, a planta modificada (ou uma linhagem derivada da planta) tem pelo menos uma redução de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% em pelo menos um aminoácido. Em modalidades alternativas, a planta modificada tem pelo menos uma redução de 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes em pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade, o aminoácido apresentando níveis reduzidos é pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzido é o ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos podem apresentar uma redução.
[00113] Em certas modalidades para cada uma das plantas da invenção, a planta de tabaco modificada compreende pelo menos uma redução de 10% nos níveis de acrilamida, acrilonitrila e/ou de substâncias químicas não naturais após o aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou de uma parte da planta de tabaco. Além disso, em modalidades alternativas, a planta de tabaco modificado, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta tem pelo menos uma diminuição de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% em acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após aquecimento e/ou queima da planta ou uma porção da planta (por exemplo, na fumaça produzida das folhas de uma planta de tabaco modificada da invenção). Em modalidades alternativas, a planta de tabaco modificada ou uma porção da mesma tem uma redução de pelo menos 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após o aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco).
[00114] Além disso, para cada uma das plantas e/ou linhagens de tabaco, as modalidades da invenção podem compreender sementes capazes de propagar as plantas e/ou linhagens modificadas com uma quantidade reduzida de pelo menos um aminoácido e/ou uma redução de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após aquecimento e/ou queima da planta, ou de uma porção da mesma. Tais sementes, e depósitos de tais sementes, são divulgados neste documento.
[00115] Deste modo, em certas modalidades, a presente invenção fornece plantas e/ou linhagens de tabaco derivadas de tais plantas que sofreram mutação de modo a produzir níveis reduzidos (ou seja, concentração) de pelo menos um aminoácido.
[00116] Em certas modalidades, essas novas linhagens produzem de 0,332 a 0,810 microgramas (μg) de asparagina por miligrama de peso seco de tabaco em uma folha curada. Isto pode representar uma diminuição de 1,2 a 3,35 vezes de asparagina em relação ao N. tabacum seco ao ar quente não modificado original, que normalmente produz um máximo de cerca de 1,158 μg de asparagina por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de um aminoácido específico pode depender do processamento da folha, ou do estágio de desenvolvimento da planta.
[00117] Em certas modalidades, essas novas linhagens de tabaco produzem <0,11 microgramas (μg) de ácido glutâmico por miligrama de peso seco de tabaco em uma folha curada. Isto pode representar uma diminuição de pelo menos 1,3 vez de ácido glutâmico em relação ao N. tabacum seco ao ar quente não modificado original, que normalmente produz um máximo de cerca de 0,15 μg por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de um aminoácido específico pode depender do processamento da folha, ou do estágio de desenvolvimento da planta.
[00118] Ou estas novas linhagens podem produzir cerca de 0,358 micrograma (μg) de glutamina por miligrama de peso seco de tabaco na folha curada. Isto pode representar uma diminuição de cerca de 2,5 vezes de ácido glutâmico em relação ao N. tabacum seco ao ar quente não modificado original, em comparação com um valor controle de cerca de 0,9 μg por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de um aminoácido específico pode depender do processamento da folha, ou do estágio de desenvolvimento da planta.
[00119] Ou estas novas linhagens podem produzir cerca de 0,5 micrograma (μg) de alanina por miligrama de peso seco de tabaco na folha curada. Isso pode representar uma diminuição de 1,25 vez de alanina em relação ao N. tabacum seco ao ar quente não modificado original, que normalmente produz um máximo de cerca de 0,63 μg por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de um aminoácido específico pode depender do processamento da folha, ou do estágio de desenvolvimento da planta.
[00120] Ou estas novas linhagens podem produzir cerca de 5 microgramas (μg) de prolina por miligrama de peso seco de tabaco na folha curada. Isso pode representar uma diminuição de cerca de 1,4 vez de prolina em relação ao N. tabacum seco ao ar quente não modificado original, que normalmente produz um máximo de cerca de 7,1 μg por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de um aminoácido específico pode depender do processamento da folha, ou do estágio de desenvolvimento da planta.
[00121] Em uma modalidade, a planta de tabaco modificada é a espécie Nicotiana tabacum. Em certas modalidades, as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou as plantas de tabaco modificadas podem compreender pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou podem ser utilizadas outras linhagens, incluindo aquelas descritas neste documento. Produtos de tabaco da Invenção
[00122] Em certas modalidades, a invenção compreende produtos feitos a partir de plantas com um nível significativamente reduzido de pelo menos um aminoácido endógeno.
[00123] Em uma modalidade, o aminoácido com um nível reduzido é pelo menos um de alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido que tem nível reduzido é asparagina. Adicionalmente ou alternativamente, o aminoácido com nível reduzido pode ser ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos podem apresentar uma redução.
[00124] Em uma modalidade, após aquecimento e/ou queima, a planta de tabaco ou uma parte da mesma gera níveis reduzidos de um composto derivado do aminoácido alvejado para redução, em comparação com uma planta de tabaco de origem não modificada, ou uma porção da mesma. Por exemplo, em certas modalidades, as plantas e/ou produtos feitos a partir das plantas têm níveis reduzidos de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após tratamento térmico e/ou queima da planta ou de uma porção da mesma.
[00125] Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção pode compreender um produto de tabaco que compreende tabaco modificado de uma planta de tabaco modificada, a planta de tabaco modificada possuindo níveis reduzidos de asparagina em comparação com uma planta de tabaco não modificada, da qual a planta de tabaco modificada é derivada. Adicionalmente ou alternativamente, em certas modalidades, a presente invenção pode compreender um produto de tabaco que compreende tabaco modificado de uma planta de tabaco modificada, a planta de tabaco modificada possuindo níveis reduzidos de acrilamida após aquecimento e/ou queima do tabaco, em comparação com um tabaco não modificado do qual a planta de tabaco modificada é derivada.
[00126] Adicionalmente ou, alternativamente, a presente invenção pode compreender um produto de tabaco que compreende tabaco modificado de uma planta de tabaco modificada, a planta de tabaco modificada possuindo níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta de tabaco não modificada, da qual a planta de tabaco modificada é derivada, em que o genoma da planta de tabaco modificada compreende um genoma aloploide. Em uma modalidade, o tabaco modificado pode ter uma mutação que exibe um fenótipo dominante de resistência ao crescimento na presença de leucina (ou outro agente de seleção). Em uma modalidade, o aminoácido apresentando níveis reduzidos é pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzidos pode ser ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos podem apresentar uma redução.
[00127] Adicionalmente ou alternativamente, a presente invenção pode compreender um produto de tabaco feito de uma planta de tabaco modificada que compreende uma diminuição dos níveis de acrilamida, acrilonitrila e/ou de outras substâncias químicas não naturais após o aquecimento e/ou queima da planta de tabaco ou uma parte da mesma, em comparação com uma planta de tabaco não modificada da qual a planta modificada é derivada, em que o genoma da planta de tabaco modificada compreende um genoma aloploide com uma mutação que exibe um fenótipo de resistência dominante para crescimento na presença de leucina (ou outro agente de seleção).
[00128] Em modalidades alternativas, o produto de tabaco tem pelo menos uma diminuição de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% em pelo menos um aminoácido em comparação com o tabaco não modificado. Em modalidades alternativas, o produto de tabaco tem pelo menos uma redução de 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes a redução em pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade, o aminoácido apresentando níveis reduzidos é pelo menos um dentre alanina, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, prolina, histidina, lisina, fenilalanina e/ou serina. Em uma modalidade, o aminoácido com níveis reduzidos é a asparagina. Além disso ou alternativamente, o aminoácido com níveis reduzidos pode ser ácido glutâmico. Ou outros aminoácidos podem apresentar uma redução.
[00129] Em certas modalidades, o produto de tabaco compreende uma redução de pelo menos 10% nos níveis de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após aquecimento e/ou queima do tabaco. Da mesma forma, em modalidades alternativas, o produto de tabaco tem uma redução de pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após aquecimento e/ou queima do tabaco. Em modalidades alternativas, o produto de tabaco tem pelo menos uma redução de 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes do teor de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais após aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco).
[00130] Nas modalidades dos produtos da invenção, o aminoácido com níveis reduzidos é asparagina. Ou, outros aminoácidos selecionados podem ser reduzidos. Por exemplo, o produto de tabaco pode compreender uma redução de pelo menos 10% nos níveis de asparagina. Da mesma forma, em modalidades alternativas, um produto feito a partir de pelo menos uma porção da planta de tabaco modificada, ou uma linhagem derivada da planta de tabaco tem, pelo menos, uma diminuição de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% nos níveis de asparagina.
[00131] Em certas modalidades, o produto pode compreender uma redução de pelo menos 10% nos níveis de acrilamida após aquecimento e/ou queima do produto. Por exemplo, em modalidades alternativas, um produto feito de pelo menos uma porção da planta de tabaco modificada, ou uma linhagem de tabaco derivada da planta, tem pelo menos uma diminuição de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 99% do teor de acrilamida após aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco). Em modalidades alternativas, o produto feito de uma planta de tabaco modificada tem uma redução de pelo menos 1,2, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ou 100 vezes do teor de acrilamida após aquecimento e/ou queima (por exemplo, na fumaça produzida a partir do tabaco).
[00132] Como discutido adicionalmente neste documento, uma variedade de plantas de tabaco pode ser modificada para gerar os produtos da invenção. Em certas modalidades, a planta compreende um genoma aloploide. Em certas modalidades, a planta é tabaco. Em certas modalidades preferidas, o tabaco é do gênero Nicotiana. Mais preferencialmente, o tabaco pode compreender a espécie Nicoticma tabacum. Ou, em certas modalidades, qualquer um dos gêneros de nicotiana ou outros tabacos pode ser utilizado nos produtos de tabaco da presente invenção. Tais tabacos são descritos nas Publicações de Patente Norte- Americana Nos. 2006/0185686 e 2011/0174323, cujas divulgações são incorporadas por referência em suas totalidades neste documento. Ou outros tabacos e misturas podem ser utilizados nos produtos de tabaco da presente invenção. São também incluídos todos os híbridos intraespecíficos e interespecíficos das espécies Nicoticma.
[00133] Em certas modalidades da invenção, diferentes partes da planta e/ou notas de tabaco individuais podem ser avaliadas quanto ao nível de acrilamida, acrilonitrila e/ou outras substâncias químicas não naturais no fumo. Por exemplo, em certas modalidades, os graus do talo superior podem gerar mais acrilamida do que os graus do talo inferior. Da mesma forma, os graus Burley e oriental podem gerar mais acrilamida do que os graus quando secos ao ar quente.
[00134] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição de tabaco tratada termicamente. Conforme utilizado na presente invenção, os termos "aquecido", "aquecimento", ou "tratado termicamente", em relação ao tabaco, referem-se a um material de tabaco foi termicamente processado a uma temperatura elevada, tal como uma temperatura de pelo menos 60 °C, mais tipicamente de pelo menos cerca de 100 °C, por um tempo suficiente para alterar o caráter ou a natureza da composição de tabaco, tais como, por exemplo, cerca de 10 minutos. Em alguns casos, o processo de tratamento térmico altera as características químicas ou sensoriais (por exemplo, o sabor e o aroma) da composição de tabaco. O processo de tratamento térmico da invenção pode ser uma versão modificada dos processos de tratamento convencionais do tabaco, tais como processos adaptados par formar compostos de flavor e aromáticos (por exemplo, produtos da reação de Maillard), processos adaptados para pasteurização de composições de tabaco, processos para preparar produtos de embalagem do tabaco, processos de tabaco reconstituído (por exemplo, processos de fundição de folhas e de fabricação de papel para tabaco reconstituído), processos de extração de tabaco, processos de reordenação, processos de torrefação, processos com vapor e processos de secagem.
[00135] Produtos de tabaco aquecidos ou termicamente tratados que podem ser gerados usando as plantas de tabaco e/ou linhagens de tabaco da presente invenção são descritos na Publicação de Patente Norte-Americana No. 2011/0048434, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade neste documento. Deste modo, as composições de tabaco termicamente tratado da invenção podem ser usadas como um aditivo para um artigo de fumo, ou como uma composição de tabaco sem fumaça, como rapé úmido solto, rapé seco solto, tabaco de mascar, pedaços de tabaco peletizado, tiras, pedaços, bastões (rods) ou bastões (sticks) de tabaco extrusado ou formado, pós finamente divididos, aglomerados moídos ou finamente divididos de pedaços e componentes em pó, pedaços como flocos, pedaços de tabaco processados por moldagem, pedaços de tabaco contendo goma, rolos de filmes tipo fita, filmes ou tiras prontamente dissolvíveis em água ou materiais tipo cápsula.
[00136] Tabacos utilizados nos produtos de tabaco da invenção podem variar e, geralmente, os métodos da invenção podem ser usados geralmente em tabacos selvagens ou em tabacos que foram geneticamente modificados de alguma maneira. Por exemplo, os tabacos utilizados nos produtos do tabaco da invenção podem incluir a maioria dos tipos de tabacos, como tabaco seco ao ar quente, tabaco burley, tabaco curado no sol (por exemplo, tabaco oriental ou Indian Kurnool), tabaco Maryland, tabaco escuro, tabaco defumado e escuro, tabaco curado ao ar (por exemplo, tabacos passanda, cubano, jatin e bezuki) ou curados com ar leve (por exemplo, tabacos do norte de Wisconsin e galpoa) e tabacos Rustica, bem como outros tabacos raros ou especiais, ou mesmo tabacos verdes ou não curados. Tabacos orientais representativos incluem os tabacos katerini, prelip, komotini, xanthi e yambol.
[00137] Os produtos de tabaco utilizados na presente invenção, incluindo composições de tabaco destinadas a serem usadas em uma forma sem fumaça, podem incorporar um único tipo de tabaco (por exemplo, em uma forma chamada "grau direto"). Por exemplo, o tabaco em um produto de tabaco pode ser composto apenas de um tabaco seco ao ar quente (por exemplo, todos do tabaco podem ser compostos ou derivados de lâminas de tabaco secas ao ar quente, ou de uma mistura de lâminas de tabaco secas ao ar quente e de caule do tabaco seco ao ar quente). O tabaco em um produto do tabaco também pode ter uma forma denominada "misturada". Por exemplo, o tabaco em um produto de tabaco da presente invenção pode compreender uma mistura de partes ou pedaços de um tabaco seco ao ar quente da invenção misturado com tabacos burley (por exemplo, tabaco Malawi burley) e oriental (por exemplo, como o tabaco composto ou derivado de lâmina de tabaco, ou uma mistura de lâmina de tabaco e haste de tabaco). Por exemplo, uma mistura representativa pode incorporar cerca de 30 a cerca de 70 partes de tabaco burley (por exemplo, lâmina ou lâmina e haste), e cerca de 30 a cerca de 70 partes de um tabaco seco ao ar quente geneticamente modificado da invenção (por exemplo, haste, lâmina ou lâmina e haste) em uma base de peso seco. Outras misturas de tabaco exemplares incorporam cerca de 75 partes de tabaco seco ao ar quente, cerca de 15 partes de tabaco burley e cerca de 10 partes de tabaco Oriental; ou cerca de 65 partes de tabaco seco ao ar quente, cerca de 25 partes de tabaco burley e cerca de 10 partes de tabaco Oriental; ou cerca de 65 partes de tabaco seco ao ar quente, cerca de 10 partes de tabaco burley e cerca de 25 partes de tabaco Oriental; em uma base de peso seco. Outras misturas de tabaco exemplares incorporam cerca de 20 a cerca de 30 partes de tabaco oriental e cerca de 70 a cerca de 80 partes de tabaco seco ao ar quente. Ou outros tabacos ou misturas de tabaco, como aqueles descritos nas Publicações de Patentes Norte-Americanas Nos. 2006/0185686 e 2011/0174323, cujas divulgações que são incorporadas por referência em suas totalidades neste documento podem ser usados. Ou, outras misturas podem ser usadas.
[00138] A quantidade relativa de tabaco dentro do produto de tabaco pode variar. Preferencialmente, a quantidade de tabaco no produto de tabaco varia de pelo menos cerca de 10 por cento ou pelo menos cerca de 25 por cento em relação a uma base de peso seco. Em certos casos, as quantidades de outros componentes no produto de tabaco podem exceder cerca de 40 por cento em relação ao peso seco. Uma faixa típica de material de tabaco no produto de tabaco pode variar de cerca de 10 a cerca de 60 por cento em peso, com mais frequência de cerca de 20 a cerca de 40 por cento em peso em base seca. Por exemplo, o produto de tabaco pode incluir flavorizantes, enchimentos, aglutinantes, agentes tamponantes, corantes e umectantes adicionais.
[00139] Os produtos de tabaco da presente invenção podem ser formulados como vários artigos de fabricação. Para produtos de tabaco sem fumaça, as composições de tabaco da invenção podem ser formadas nas formas de produto desejadas. O método e aparelho utilizado para formar o produto de tabaco dependerá da forma desejada. Por exemplo, o produto de tabaco pode ter a forma de péletes de tabaco compactados, pedaços extrusados com múltiplas camadas, bastões ou hastes extrusados ou formados, composições com um tipo de formulação de tabaco circundada por um tipo diferente de formulação de tabaco, rolos de filmes tipo fita, filmes ou tiras prontamente dissolvíveis em água ou dispersáveis em água ou materiais tipo cápsula possuindo uma cobertura exterior (por exemplo, uma cobertura exterior flexível ou dura que pode ser de natureza transparente, incolor, translúcida ou altamente colorida) e uma região interna possuindo tabaco ou o flavor do tabaco.
[00140] Os produtos de tabaco da invenção podem ser úteis como aditivos para a fabricação de artigos de fumo. O tabaco da invenção pode ser incorporado nas misturas de tabaco, componentes do cigarro representativos e em cigarros representativos fabricados a partir disso. Por exemplo, as folhas de tabaco da presente invenção podem ser incorporadas em um artigo de fumar como parte da carga de material fumável. Ou o tabaco da invenção pode ser incorporado em um filtro de cigarro (por exemplo, no tampão do filtro, no envoltório do filtro ou no papel de filtro) ou incorporado no papel de embrulho do cigarro, preferencialmente na superfície interna, durante o processo de fabricação do cigarro.
[00141] Em certas modalidades dos produtos de tabaco da invenção, o artigo de fumar resultante é caracterizado por níveis reduzidos de acrilamida, acrilonitrila e/ou de substâncias químicas não naturais na fumaça inalada pelo fumante durante o uso. Por exemplo, o artigo de fumar pode ser caracterizado por uma redução no teor de acrilamida, acrilonitrila e/ou de outras substâncias químicas não naturais na fumaça inalada pelo fumante em relação a um artigo de fumar controle não tratado (ou seja, um artigo de fumar comparável, exceto sem tabaco geneticamente modificado de acordo com a invenção) de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30 por cento, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% ou mais. Em outras palavras, o artigo de fumar da invenção, como um cigarro, contendo a composição de tabaco geneticamente modificada da invenção pode produzir uma quantidade reduzida de acrilamida, acrilonitrila e/ou de outras substâncias químicas não naturais em peso na fumaça inalada pelo fumante em comparação com um artigo de fumar controle não modificado usando a mesma máquina de fumo e sob as mesmas condições de fumo, tais como as máquinas de fumo definidas na ISO 3308: 1991 e ISO 4387: 1991, todas as quais sendo incorporadas por referência neste documento.
[00142] Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção fornece produtos feitos a partir do tabaco que foram modificados de modo a produzir um nível reduzido (ou seja, concentração) de acrilamida. Especificamente, estes produtos de tabaco podem produzir, ao fumar, de 0,038 a 0,045 microgramas (μg) de acrilamida por miligrama de peso seco de tabaco na folha curada. Isto pode representar uma redução de cerca de 1,5 a 1,8 de acrilamida no tabaco seco ao ar quente não modificado, que normalmente produz um máximo de cerca de 0,067 μg por miligrama de peso seco de tabaco. A quantidade absoluta de acrilamida gerada pode depender do processamento da folha, do estágio de desenvolvimento da planta e/ou do regime de cura.
[00143] Da mesma forma, em certas modalidades, a presente invenção fornece produtos feitos a partir do tabaco que foram modificados de modo a produzir um nível reduzido (ou seja, concentração) de acrilamida. Especificamente, estes produtos de tabaco podem produzir, ao fumar, cerca de 0,146 microgramas (μg) de acrilonitrila por miligrama de peso seco de tabaco na folha curada. Isso pode representar uma redução de até 2,2 vezes de acrilonitrila em relação ao tabaco seco ao ar quente não modificado, que normalmente produz um máximo de cerca de 0,331 μg por miligrama de peso seco de tabaco.
[00144] A quantidade absoluta de acrilamida gerada pode depender do processamento da folha, do estágio de desenvolvimento da planta e/ou do regime de cura.
[00145] Em certas modalidades, o tabaco modificado usado nos produtos de tabaco da invenção pode compreender tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-5, 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou o tabaco modificado pode compreender tabaco de pelo menos uma das linhagens 10NH-18, 10N-23, 10NH-27, 10NH-34 ou 10NH-9. Ou tabaco de outras linhagens aqui descritas ou feito pelos métodos da invenção pode ser usado.
[00146] A presente invenção pode ser mais bem compreendida por referência aos seguintes exemplos não limitadores. EXEMPLO 1 - Mutação do Tabaco
[00147] A presente invenção tem sido usada para preparar diversas linhagens de N. tabacum com quantidades reduzidas de certos aminoácidos.
[00148] A produção de linhagens de reprodução que sofreram mutagênese para EMS com aumento do teor de treonina foi descrita anteriormente (consulte a Patente Norte-Americana No. 6.730.832). Sementes de um tabaco seco ao ar quente representativo (ou seja, Sp227) sofreram mutagênese com 0,5% de EMS e foram designadas como M0. Para gerar o tabaco com concentração de aminoácidos reduzida, vários (ou seja, cerca de 10 alíquotas separadas) de sementes de N. tabacum Sp227 foram incubadas em uma solução contendo metanossulfonato de etila (EMS) em uma concentração de cerca de 0,5% para 20 abetos. Tanto as sementes K326 quanto as sementes Sp227 que não sofreram mutagênese foram usadas como controle. As sementes tratadas foram em seguida lavadas com água Milli-Q (purificada com um sistema NANO pure II; Barnstead/Thermolyne Corp.; Dubuque, IA) durante 30 minutos e esterilizadas com etanol 70% durante 30 segundos, seguido por Clorox 20% durante 20 min em um agitador sob agitação.
[00149] As populações mutantes M0 foram em seguida testadas nos meios de cultura de tecido contendo diferentes níveis de leucina (2 a 10 mM). Assim, após rinsar com água MiliQ estéril por pelo menos 5 vezes, as sementes (cerca de 50 sementes por placa) foram suspensas em placas com fitoágar solidificado com 1/2 meio Murashige e sal Skoog (MSS) + 1,5% de sacarose, 5 g de fitoágar e um agente de seleção (leucina). O meio MSS é descrito na Tabela 1 da patente Norte-Americana No. 7.173.170; a descrição deste meio é incorporada por referência neste documento em sua totalidade. As sementes germinaram em uma sala de cultura de tecidos, a 25 °C com um fotoperíodo de 16 h usando lâmpadas fluorescentes brancas frias (Sylvania, Danvers, MA) com intensidade de cerca de 80 μE m-2s-1. Após 10 dias, o meio de crescimento foi removido e o mesmo meio contendo leucina na concentração de 2 a 5 mM foi adicionado às mudas. As plantas sobreviventes foram a seguir transplantadas para o solo e cultivadas em uma estufa para o desenvolvimento das linhagens de N. tabacum resistentes a altos níveis de leucina.
[00150] As plantinhas M0 sobreviventes selecionadas em meio rico em leucina foram resgatadas e transferidas para o solo em um recinto de crescimento. Posteriormente, essas plantas M0 foram transferidas para a estufa e autossemeadas, tendo sido coletadas de cada planta e designadas como M1. As linhagens M1 foram cultivadas em condições de campo normais. Cada linhagem M1 foi seca ao ar quente de acordo com as práticas tradicionais.
[00151] As linhagens de reprodução da mutação EMS selecionadas como sendo capazes de se desenvolver em grandes quantidades de leucina foram isoladas e caracterizadas. Os núcleos das folhas foram removidos de cada amostra de folha seca ao ar quente e foram submetidas ao processamento da folha para cortar o tabaco de enchimento. As folhas do talo superior e médio foram analisadas quanto aos aminoácidos, nicotina, açúcares redutores e açúcares totais. Os resultados destas análises estão apresentados nas Tabelas 1 a 6. As linhagens de tabaco (por exemplo, 10NH-5, 10NH-18 e 10NH-23) com níveis reduzidos de asparagina em comparação com o controle são mostradas em negrito na Tabela 1. Pode-se observar que várias das linhagens de tabaco também apresentam reduções nos teores de outros aminoácidos. Tabela 1 Folhas do talo superior secas ao ar quente (Ala-Gly)
Tabela 2 Folhas do talo superior secas ao ar quente (His-Ser) 
Tabela 3 Folhas do talo superior secas ao ar quente (Thr-Val, aminoácidos totais, nicotina e açúcares) 
Tabela 4 Folhas do talo médio secas ao ar quente (Ala-Gly) 
EXEMPLO 2 - Tabaco com Teor de Asparagina Reduzido Produz Acrilamida Reduzida
[00152] Cigarros para testes foram feitos usando um aparelho de laboratório como descrito na Publicação do Pedido de Patente Norte-Americana No. US 20070006888. Uma folha de tabaco seca ao ar quente (talo médio e superior) foi usada para fazer os cigarros e foi testada quanto aos níveis de acrilamida e acrilonitrila. Da mesma forma, uma mistura de tabaco comercial foi testada como controle, para determinar a precisão e a exatidão do teste por excisão da mistura dos cigarros comerciais e fazendo cigarros com esta mistura.
[00153] Três cigarros foram fumados de cada tabaco e a fumaça foi coletada usando uma máquina de fumo Cerulean SM 450 (Cerulean, Linford Wood East, MK14 6LY, Reino Unido). Os fluxos de ar da máquina foram ajustados para as condições ISO (ISO 3308: Routine analytical cigarette smoking machine-definitions and standard conditions; Número de Referência ISO 3308: 1991 (E) International Organization for Standards, Genebra, Suíça, 1991; ISO 4387: Cigarette-Determination of total and nicotine free dry particulate matter using a routine analytical smoking machine; Número de Referência ISO 4387: 1991 (E) International Organization for Standards, Genebra, Suíça, 1991).
[00154] O tabagismo foi realizado em um regime único, usando volume de sopro de 35 mL, aspiração durante 2 segundos e intervalo entre de 60 segundos entre aspirações (indicado como ISO). As análises de acrilamida foram realizadas usando os procedimentos descritos anteriormente (S.C. Moldoveanu e A. R. Gerardi, Acrylamide analysis in tobacco, alternative tobacco products, and cigarette smoke, J. Chromatogr. Sci., 49: 234-242, 2011). Todas as análises foram realizadas em triplicata (inclusive o tabagismo).
[00155] Os resultados para as análises dos tabacos quanto aos níveis de asparagina, nicotina (Nic), açúcares redutores e açúcares totais estão resumidos nas Tabelas 7 e 8. Os dados dos Exemplos estão mostrados na Tabela 7. Pode- se observar que várias das linhagens (por exemplo, 10NH-5, 10NH-18 e 10NH-23) têm níveis significativamente reduzidos de asparagina (ASN). Tabela 7 Nível dos compostos principais nos tabacos de talo superior secos ao ar quente
[00156] A fumaça de três grupos de cigarros foi adicionalmente analisada quanto aos teores de monóxido de carbono (CO), material particulado total (TPM) e acrilamida. Um grupo foi um controle feito com uma mistura de tabaco comercial. Verificou-se que o nível de precisão para o procedimento de teste foi inferior a 5% em relação ao desvio-padrão (RSD) (dados não mostrados). O segundo grupo (Tabela 8) incluía cigarros feitos com tabacos do talo superior, e o terceiro grupo (Tabela 9) incluía os cigarros feitos com os tabacos do talo médio. As análises foram randomizadas em relação a ambas as amostras do talo superior e inferior, bem como as replicatas da mesma amostra. Os resultados são apresentados abaixo separadamente para cada grupo, como as médias das três análises separadas. Quanto à mistura comercial, para a análise de TPM e acrilamida, as replicatas indicaram menos de 5% de desvio-padrão relativo (% RSD). Tabela 8 Resultados da análise do fumo, incluindo níveis de acrilamida nos tabacos de talo superior secos ao ar quente
[00157] Tabacos com razão reduzida de acrilamida/TPM em comparação com o controle (por exemplo, 10NH-5, 10NH-18 e10NH-23) são mostrados em negrito. Tabela 9 Resultados da análise do fumo, incluindo níveis de acrilamida nos tabacos de talo médio secos ao ar quente
[00158] Os resultados das Tabelas 8 e 9 indicam que vários tabacos EMS modificados levaram à formação de uma faixa de níveis de acrilamida no fumo do cigarro. Várias linhagens de tabaco EMS (10NH-5, 10NH-18 e 10NH-23) apresentaram um nível inferior de acrilamida no fumo que o encontrado em três tabacos do talo superior e um tabaco do talo médio (dados não mostrados).
[00159] Os dados das amostras de talo superior foram analisados utilizando um este T de student unidirecional. Verificou-se que cada uma das plantas era significativamente diferente do controle (Tabela 8). Conforme mostrado na Tabela 8, as amostras representadas por uma letra diferente (por exemplo, A, B, C etc.) tinham valores diferentes estatisticamente significativos em relação à média de acrilamida.
[00160] Este resultados indicam que redução de acrilamida no fumo do cigarro pode ser alcançada usando a modificação por mutagênese da planta. A Figura 2 ilustra que o aumento ou diminuição do nível de acrilamida foi alcançado pela modificação do teor de aminoácidos na planta. Deste modo, uma excelente correlação entre o nível de asparagina e acrilamida no fumo pode ser observada para tabacos de talo superior. A cepa controle (10NH-3) é mostrada como um quadrado; valores para as várias cepas experimentais são mostrados como símbolos em formato de diamante. EXEMPLO 3 - Tabaco com Teor de Acrilonitrila Reduzido
[00161] As Tabelas 10 e 11 fornecem resultados para os níveis de acrilonitrila (ANI) dos cigarros feitos com os tabacos do talo superior (Tabela 10) e os cigarros feitos com os tabacos do talo médio (Tabela 11). O teor de acrilonitrila foi medido de acordo com os procedimentos anteriormente publicados (S.C. Moldoveanu, 2010, Beitr. Tabakforsch. Int., 24: 145-156). Novamente, as análises foram randomizadas em relação a ambas as amostras do talo superior e inferior, bem como as replicatas da mesma amostra. Os resultados são apresentados abaixo separadamente para cada grupo, como as médias das três análises separadas. Quanto à mistura comercial, para a análise de TPM e acrilonitrila, as replicatas indicaram menos de 5% de desvio-padrão relativo (% RSD). Os resultados para o número de tragadas do cigarro, CO, TPM e acrilonitrila para os cigarros feitos com talo superior feito com tabacos que sofreram mutagênese EMS são mostrados na Tabela 10 e aqueles para o talo médio são mostrados na Tabela 11. Tabela 10 Resultados da análise do fumo, incluindo níveis de acrilonitrila nos tabacos de talo superior secos ao ar quente
Tabela 11 Resultados da análise do fumo, incluindo níveis de acrilonitrila nos tabacos de talo médio secos ao ar quente 
[00162] Pode-se observar que, quando comparado ao controle, para as folhas do talo superior, o nível de acrilonitrila mais baixo de plantas que sofreram mutagênese EMS foi apenas 47% em relação à planta original, e para as folhas do talo médio, o nível de acrilonitrila mais baixo foi de apenas 59% em relação à planta original. Os dados das amostras de talo superior foram analisados utilizando um este T de student unidirecional. Verificou-se que cada uma das plantas era significativamente diferente do controle (Tabela 10). Como mostrado na Tabela 10, as amostras representadas por uma letra diferente (por exemplo, A, B, C, etc.) apresentaram valores estatisticamente significativos da média para a acrilonitrila. As três linhagens apresentando teores reduzidos de acrilonitrila e acrilamida (10NH-5, 10-NH-18 e 10NH-23) são mostradas em itálico na Tabela 10. Da mesma forma, as linhagens 10NH-27, 10NH-34 e 10NH-9 apresentaram baixos níveis de acrilonitrila. Trabalhos adicionais foram realizados para tentar identificar um precursor do aminoácido importante para a geração de acrilonitrila. Os coeficientes de correlação R entre o nível de aminoácidos indicado nas Tabelas 1 a 3 a folha do talo superior em mg/g de tabaco e acrilonitrila/TPM, μg/mg) são mostrados na Tabela 12. Os mesmos resultados para os tabacos do talo médio com os resultados analíticos apresentados nas Tabelas 4 a 6 são mostrados na Tabela 13. Alguns dos resultados para os aminoácidos foram relatados como "menor que" com base no limite de quantificação (LOQ) do método analítico. Como os cálculos de correlação precisam de um número, o valor do LOQ foi usado para os aminoácidos onde um nível efetivo não foi conhecido. Tabela 12 Coeficientes de correlação R entre o nível de aminoácido nos tabacos de talo superior, em mg/g, e acrilonitrila/TPM (μg/mg)
Tabela 13 Coeficientes de correlação R entre os níveis de aminoácidos nos tabacos feitos com talo médio em mg/g e acrilonitrila/TPM (μg/mg) 
[00163] Conforme observado a partir das Tabelas 12 e 13, os coeficientes de correlação para os tabacos de talo superior e para os tabacos de talo médio apresentam valores de R mais altos para o ácido glutâmico, histidina, lisina, fenilalanina e serina. O ácido glutâmico mostrou ser um contribuinte para a formação de acrilonitrila.
[00164] Deste modo, os métodos da presente invenção utilizam um método de mutagênese rápido e econômico para o desenvolvimento de linhagens de plantas com níveis reduzidos de pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade, a planta é tabaco. A invenção fornece um método pelo qual as sementes do tabaco que sofreu mutagênese são deixadas germinar sob condições seletivas e, em seguida, as plantas quiméricas que possuem pelo menos parcialmente um fenótipo resistente a altas concentrações de leucina são selecionadas. São incluídas na presente invenção as linhagens de tabaco modificadas com uma diminuição no teor de asparagina e/ou de ácido glutâmico. Tais tabacos formam quantidades reduzidas da acrilamida ou acrilonitrila potencialmente cancerígena, mediante aquecimento e/ou queima. Estas linhagens de tabaco geneticamente modificadas podem ser usadas como germoplasma para desenvolver novas variedades de tabaco com perfis de aminoácidos modificados e/ou podem ser misturadas com outras cepas de tabaco para produzir uma mistura com aroma e sabor melhorados.
[00165] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência em suas totalidades.
Claims (3)
1. Produto de tabaco CARACTERIZADO por compreender um tabaco modificado, originário da planta de tabaco modificada, selecionada a partir da linhagem 10NH-27 (número de registro ATCC PTA-12342), da linhagem 10NH-34 (número de registro ATCC PTA-12340) e da linhagem 10NH-9 (número de registro ATCC PTA-12343), e contendo goma, rolos de filmes tipo fita, filmes ou tiras prontamente dissolvíveis em água ou materiais tipo cápsula, artigos para fumar, cigarros, filtros para cigarros e papéis para embalagem de cigarros.
2. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ao aquecer e/ou queimar, o tabaco modificado gera níveis reduzidos de acrilonitrila em comparação com uma planta de tabaco não modificado ou uma porção dela.
3. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a redução de acrilonitrila é de pelo menos 10%, ou opcionalmente de pelo menos 20%, ou opcionalmente de pelo menos 30% ou opcionalmente de pelo menos 40%.
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