BR112020014200A2

BR112020014200A2 - composições e métodos para produzir plantas de tabaco e produtos tendo níveis de alcaloides alterados

Info

Publication number: BR112020014200A2
Application number: BR112020014200-0A
Authority: BR
Inventors: Sreepriya PRAMOD; Marcos Fernando de Godoy Lusso; Jesse Frederick; Andrew Carl ADAMS; Dongmei Xu
Original assignee: Altria Client Services Llc
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2021-03-02
Also published as: WO2019140312A1; CN111836539A; US20190246596A1; US11950563B2; WO2019140297A1; JP2021510509A; EP3737227A1; US20190216037A1

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUZIR PLANTAS DE TABACO E PRODUTOS TENDO NÍVEIS DE ALCALOIDES ALTERADOS. A presente divulgação fornece locus Nic1b de tabaco e genes associados (por exemplo, um grupo de genes ERF). Também são fornecidas plantas de tabaco com níveis alterados totais de alcaloide e nicotina e grau de folha comercialmente aceitável, seu desenvolvimento via abordagens de reprodução ou transgênicas e produção de produtos de tabaco destas plantas de tabaco. São ainda fornecidas composições e métodos para produzir plantas de tabaco tendo novas mutações ou alelos para reduzir os níveis de nicotina. Além disso, são fornecidos polimorfismos de sequência e marcadores moleculares para criar tabaco com nicotina ou alcaloides reduzidos, embora mantendo o grau de folha de tabaco e a qualidade do produto de tabaco.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PRODUZIR PLANTAS DE TABACO E PRODUTOS TENDO NÍVEIS DE ALCALOIDES ALTERADOS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. 62/616.959, depositado em 12 de janeiro de 2018, Pedido Provisório U.S 62/625.878, depositado em 2 de fevereiro de 2018 e Pedido Provisório U.S. 62/685.844, depositado em 15 de junho de 2018, todos os quais são incorporados por referência em sua totalidade aqui.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] Uma listagem de sequências contida no arquivo chamado "P34709WO00_SL.txt", com 2.780.525 bytes (medido no MS-Windows®) e criada em 11 de janeiro de 2019, é depositada eletronicamente e incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO

[0003] A presente divulgação fornece uma região de deleção cromossômica associada a um alcaloide baixo (região associada a LA), um locus de Nic1b de tabaco e genes dentro ou ao redor da região ou locus. Também são fornecidas plantas de tabaco com níveis alterados totais de alcaloide e nicotina e grau de folha comercialmente aceitável, seu desenvolvimento via abordagens de reprodução ou transgênicas e produção de produtos de tabaco destas plantas de tabaco.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] Quatro alcaloides principais são encontrados no tabaco: nicotina, nornicotina, anabasina e anatabina. A nicotina é o alcaloide predominante, geralmente representando mais de 90% do total de alcaloides em cultivares comerciais de tabaco. A biossíntese de nicotina ocorre predominantemente nas raízes do tabaco. As plantas de tabaco transportam nicotina através do feixe vascular para as folhas onde a nicotina é então armazenada nos vacúolos.

[0005] Uma variedade de fatores afeta os níveis de alcaloides do tabaco, incluindo genótipo, ambiente, fertilização e práticas agronômicas (por exemplo, a produção de nicotina é estimulada por danos causados por cobertura, ferimentos e herbívoros). Os traços de alcaloide baixo encontrados inicialmente nas variedades de tabaco de charuto Cubano foram introduzidos nas variedades de cigarro por meio de uma série de retrocessos. O germoplasma de tabaco com alcaloide baixo foi subsequentemente registrado no fundo genético da cultivar Burley 21 (Legg et al., Crop Science, 10:212 (1970)). Estudos genéticos usando as linhagens Burley 21 de alcaloide baixo (LA BU21) indicaram que dois loci não ligados contribuem para os níveis de nicotina na folha do tabaco. Esses dois loci são referidos como Nic1 e Nic2. Mutações nic1 e nic2 (o mesmo que nicotina 1 e nicotina 2, respectivamente) em LA BU21 são semidominantes. Eles mostram efeitos dependentes da dose nos níveis de nicotina, com os efeitos da nic1 cerca de 2,4 vezes mais fortes que os da nic2. A caracterização molecular do locus de Nic2foi relatada. Foi demonstrado que a mutação nic2 contém uma exclusão de um agrupamento de genes de fatores de transcrição da família de fatores de resposta ao etileno (ERF), por exemplo, ERF189,ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168 (Shoji et al., Plant Cell, (10):3390-409 (2010)).

[0006] Reduzir o teor total de alcaloides no tabaco pode ter muitos benefícios. Pode aumentar o valor do tabaco como recurso de biomassa. Aumentos no alcaloide nicotínico nas plantas de tabaco podem desempenhar um papel importante na proteção das plantas contra insetos e herbívoros.

[0007] Consistente com o papel dos alcaloides na defesa de insetos, LA BU21 foi relatado como extremamente suscetível a danos causados por insetos (Legg et al., Crop Science, 10:212 (1970)). Um estudo adicional comparando linhagens isogênicas de tabaco de combustão com baixa porcentagem de alcaloides totais (aproximadamente 0,20%) com seus parentais recorrentes "normais" (alcaloides totais de 1,85 a 2,70%) relatou que o rendimento, o índice de classificação, o N total e a redução do teor de açúcar nas linhagens de alcaloide baixo foram mais baixas do que nas cultivares normais de tratamento de combustão (Chaplin and Weeks, Crop Science, 16(3):416-18 (1976)).

[0008] É necessário identificar genes que regulam os níveis de nicotina do tabaco e desenvolver plantas e produtos de tabaco que contenham níveis alterados de nicotina (por exemplo, nicotina reduzida) enquanto mantém (se não deixa superior) a qualidade das folhas do tabaco.

SUMÁRIO

[0009] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, onde as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais.

[0010] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF e uma mutação no locus Nic2, onde as plantas do tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, tendo um valor de índice de grau USDA comparável àquele de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições de crescimento semelhantes, em que a referida planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a referida planta de tabaco, exceto a referida mutação.

[0011] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda plantas de tabaco não transgênicas, ou parte das mesmas, compreendendo um nível de nicotina selecionado do grupo que consiste em menos que 2,0%, onde as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, tendo um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais.

[0012] Em outro aspecto, a presente divulgação também fornece uma planta de tabaco, ou parte dela, compreendendo uma mutação não transgênica em um locus Nic1b_ERF, em que a mutação não transgênica reduz o nível de nicotina da planta de tabaco para cerca de 20% ou menos do nível de nicotina de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, onde a planta de tabaco é capaz de produzir folhas, quando curada, com um valor de índice grau USDA comparável ao valor de índice de grau USDA da planta de controle e onde a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico ao da planta de tabaco, exceto a mutação não transgênica.

[0013] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, em que a planta de tabaco compreende um nível semelhante de um ou mais compostos de aroma de tabaco selecionados do grupo que consiste em ácido 3-metilvalérico, ácido valérico, ácido isovalérico, um labdenoide, um cembrenoide, um éster de açúcar e um açúcar redutor, em comparação com uma planta de controle de tabaco quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0014] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, onde a mutação está ausente de LA Burley 21. Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma introgressão cromossômica mais curta no locus Nic1b em comparação com LA Burley 21. Em um outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas não compreendem deleção de um gene completo ou uma sequência de codificação gênica completa no locus Nic1b_ERF.

[0015] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 153, 154, 202, e 203, e fragmentos das mesmas. Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um ou mais alelos mutantes não naturais no locus Nic1b_ERF que reduzem ou eliminam uma ou mais atividade gênica do locus Nic1b_ERF. Em um aspecto, esses alelos mutantes resultam em níveis mais baixos de nicotina.

[0016] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência de codificação com pelo menos 80% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 38, 48, 49, 52 a 54, 158, 159, 204 e 205, e fragmentos das mesmas.

[0017] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade a uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181 206 e 207, e fragmentos das mesmas.

[0018] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1b de um gene compreendendo uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 153, 154, 202, e 203,, e fragmentos das mesmas, onde a sequência inibidora está operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula de planta e onde a sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência para um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos de sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 153, 154, 202, e 203, e fragmentos das mesmas.

[0019] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece construtos de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de se ligar a um RNA que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206, e 207, e framentos das mesmas, seus fragmentos e em que a molécula de RNA suprime a expressão do polipeptídeo.

[0020] Em um aspecto, a presente divulgação fornece construtos de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207 e fragmentos das mesmas.

[0021] A presente divulgação fornece ainda tabaco curado, misturas de tabaco, produtos de tabaco compreendendo material vegetal de plantasde tabaco, linhagens, variedades ou híbridos divulgados.

[0022] A presente divulgação também fornece métodos para a reprodução de linhagens, cultivares ou variedades de tabaco que compreendem um nível desejável de alcaloide total ou nicotina, por exemplo, baixo teor de nicotina ou sem nicotina. Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método de introgressão de um traço de nicotina baixa em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: (a) cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie; (b) genotipar uma ou mais plantas de tabaco de progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, onde o marcador polimórfico está em um intervalo cromossômico flanqueado por dois marcadores de SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ IDs 125 a 145 e 193 a 201, ou flanqueado por quaisquer dois loci com sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186; e (c) selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de nicotina baixa.

[0023] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método de introgressão de um traço de nicotina baixa em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: (a) cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie; (b) genotipar uma ou mais plantas de tabaco de progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, onde o marcador polimórfico está a 2 cM de qualquer um dos marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou qualquer locus com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186; e (c) selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de nicotina baixa. Em um aspecto, um marcador polimórfico é um marcador SNP selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201.

[0024] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa, o método compreendendo: (a) isolar ácidos nucleicos de uma coleção de germoplasma de tabaco; (b) ensaiar os ácidos nucleicos para um ou mais marcadores intimamente ligados ao locus Nic1b; e (c) selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa, com base no ensaio do marcador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] Figura 1: Esquema de reprodução para o desenvolvimento de linhagens F5 com alelos marcadores de deleção nic1 and nic2 (*(x) indica auto).

[0026] Figura 2: Variantes de junção alternativas potenciais em torno do locus do gene g31431 e do locus de gene g31432. Caixas mais escuras denotam transcrições detectadas, enquanto caixas mais claras representam modelos CDS gerados in-silico.

[0027] Figura 3: A superexpressão do ERF 16, mas não do ERF130, a região associada a LA excluída no LA BU21 (ou seja, SEQ ID No. 1, referenciada como “Nic1bΔ” que não contém gene anotado, consulte o Exemplo 2) ou g32081 (um gene semelhante a beta-glucosidase 18 ) resulta em aumento da nicotina e alcaloide total no LA BU21.

[0028] Figura 4: Suprimir Nic1b_ERFs individuais (ERFnew, ERF210, ERF199, ERF29, e ERF91L2) via microRNA artificial reduz os níveis de nicotina para aproximadamente 50% a 90% das plantas de controle. O nível médio de nicotina e os erros padrão são baseados nos dados da Tabela 7.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0029] SEQ ID No: 1 estabelece uma sequência de uma região associada a LA identificada a partir de um cruzamento TN90 x LA BU21.

[0030] SEQ ID No: 2 estabelece uma sequência da região Nic1b (incluindo a região associada a LA).

[0031] SEQ ID Nos: 3 a 37 estabelecem sequências de codificação genômica (gDNA que normalmente começa com ATG e termina com um códon de parada, mas em alguns casos também contém sequências da região não traduzida (UTR)) de 35 genes anotados(NCGs) na Região Nic1b.

[0032] SEQ ID Nos: 38 a 72 estabelecem sequências de cDNA de 35 genes anotados (NCGs) na Região Nic1b.

[0033] SEQ ID Nos: 73 a 107 estabelecem sequências de aminoácidos codificadas por 35 genes anotados (NCGs) na Região Nic1b.

[0034] SEQ ID Nos: 108 a 119 estabelecem sequências de miRNA artificiais maduras exemplificativas (sentido ou antissentido) para suprimir genes NCG selecionados.

[0035] SEQ ID Nos: 120 a 124 estabelecem sequências de RNA guia exemplificativas para editar genes NCG selecionados.

[0036] SEQ ID Nos: 125 a 145 estabelecem 21 sequências de marcadores SNP que abrangem ou flanqueiam a a Região Nic1b.

[0037] SEQ ID Nos: 146 a 148 apresentam as sequências de codificação genômica, cDNA e aminoácidos, respectivamente, do locus do gene g31432.

[0038] SEQ ID Nos: 149 a 151 apresentam as sequências de codificação genômica, cDNA e aminoácidos, respectivamente, do locus do gene g31446.

[0039] SEQ ID Nos: 152 a 156 apresentam as sequências de codificação genômicas de múltiplos genes de codificação de proteínas e um RNA não codificante da Região Nic1b. SEQ ID Nos: 157 a 161 apresentam as sequências de cDNA correspondentes. SEQ ID Nos: 162 a 183 apresentam as sequências proteicas correspondentes ou da molécula de RNA não codificante.

[0040] SEQ ID Nos: 184 a 186 apresentam as sequências de codificação genômica de múltiplos genes de fatores de transcrição que exibem expressão diferencial entre as linhagens de tabaco alcaloide normal e alcaloide reduzido. SEQ ID Nos: 187 a 189 apresentam as sequências de cDNA correspondentes. SEQ ID Nos: 190 a 192 apresentam as sequências proteicas correspondentes ou da molécula de RNA não codificante.

[0041] SEQ ID Nos: 193 a 201 apresentam sequências de marcadores SNP imediatamente ao lado de múltiplos genes ERF ou dentro de um gene que codifica um RNA não codificante da Região Nic1b.

[0042] SEQ ID Nos: 202 e 203 apresentam as sequências de codificação genômicas de dois genes ERF associados à Região Nic1b. SEQ ID Nos: 204 e 205 apresentam as sequências de cDNA correspondentes. As SEQ ID Nos: 206 e 207 apresentam as sequências proteicas correspondentes.

[0043] SEQ ID Nos: 208 a 214 apresentam as sequências de codificação genômicas de sete genes Nic2_ERF. SEQ ID Nos: 215 a 221 apresentam as sequências de cDNA correspondentes. SEQ ID Nos: 222 a 228 apresentam as sequências proteicas correspondentes.

[0044] Várias sequências incluem "N" nas sequências nucleotídicas ou "X" nas sequências de aminoácidos. "N" pode ser qualquer nucleotídeo, por exemplo, A, T, G, C ou uma deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, uma sequência de "N" é mostrada. O número de "N" não se correlaciona necessariamente com o número real de nucleotídeos indeterminados nessa posição. As sequências nucleotídicas reais podem ser mais longas ou mais curtas que o segmento mostrado de "N". Da mesma forma, "X" pode ser qualquer resíduo de aminoácido ou uma deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos. Novamente, o número de "X" não se correlaciona necessariamente com o número real de aminoácidos indeterminados nessa posição. As sequências de aminoácidos reais podem ser maiores ou menores que o segmento mostrado de "X".

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0045] A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Um versado na técnica reconhecerá que muitos métodos podem ser utilizados na prática da presente divulgação. De fato, a presente divulgação não se limita aos métodos e materiais descritos. Para fins da presente divulgação, os seguintes termos são definidos abaixo.

[0046] Quaisquer referências aqui citadas, incluindo, por exemplo, todas as patentes e publicações, são incorporadas por referência na sua totalidade.

[0047] Como utilizado neste documento, a forma singular "uma", "um" e "a/o" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.

[0048] O termo "cerca de" é aqui usado para significar aproximadamente, mais ou menos, em torno de, ou na região de. Quando o termo “cerca de” é usado em conjunto com uma faixa numérica, ele modifica essa escala estendendo as ligações acima ou abaixo dos valores numéricos estabelecidos.

[0049] Como usado neste documento, um "locus Nic1b" refere-se a qualquer posição ou localização cromossômica dentro ou intimamente ligada à Região Nic1b. "Região Nic1b" refere-se a um segmento cromossômico de cerca de 1,5 milhão de bps de comprimento, correspondendo à SEQ ID No. 2 de um genoma TN90 e tendo alelo(s) associado(s) a um traço de alcaloide baixo. Uma "mutaçãonic1b " refere-se a uma mutação em um locus Nic1b.

[0050] Como usado neste documento, Nic1b_ERF (ou a forma plural, Nic1b_ERFs) refere-se a qualquer um dos genes ou loci de ERF no ou perto de um locus Nic1b e inclui, por exemplo, ERF101, ERF110, ERFnew, ERF199, ERF19, ERF130, ERF16, ERF29, ERF210 e ERF91L2. Veja a Tabela 11 e Kajikawa et al., Plant physiol. 2017, 174:999-1011. Uma "mutaçãonic1b_erf" refere-se a uma mutação no gene Nic1b_ERF. Como usado neste documento, uma mutação ou alelo mutante é mostrada em minúsculas e itálico. Os nomes de genes, locus ou proteínas são mostrados em maiúsculas ou começando com maiúsculas e podem estar em itálico ou não em itálico.

[0051] Como usado neste documento, Nic2_ERF (ou a forma plural, Nic2_ERFs) refere-se a qualquer um dos genes ou loci de ERF no ou perto de um locus Nic2 e inclui, por exemplo, ERF221, ERF115, ERF168, ERF17, ERF179, ERF189. Veja a Tabela 12;Shoji et al., Plant Cell, (10):3390-409 (2010); and Kajikawa et al.,, Plant physiol. 2017, 174:999-1011.

[0052] Como usado neste documento, uma mutação refere-se a uma modificação genética herdável introduzida em um gene para alterar a expressão ou atividade de um produto codificado pelo gene. Essa modificação pode estar em qualquer região de sequência de um gene, por exemplo, em um promotor, 5' UTR, éxon, íntron, 3' UTR ou região terminadora. Em um aspecto, uma mutação reduz, inibe ou elimina a expressão ou atividade de um produto genético. Em outro aspecto, uma mutação aumenta, eleva, fortalece ou amplia a expressão ou atividade de um produto genético. Em um aspecto, mutações não são polimorfismos naturais que existem em uma variedade ou cultivar específica de tabaco. Como usado neste documento, um "alelo mutante" refere-se a um alelo de um locus onde o alelo compreende uma mutação. Como usado neste documento, "mutagênico" refere-se à geração de uma mutação sem envolver um transgene ou sem nenhum transgene relacionado à mutação permanecendo em um eventual mutante. Em um aspecto, mutagênico é cisgênico. Em outro aspecto, mutagênico é via edição de genes ou genoma. Em um aspecto adicional, mutagênico é via mutagênese aleatória, por exemplo, mutagênese química (por exemplo, EMS) ou física (irradiação r).

[0053] Como usado netse documento, uma planta de tabaco pode ser qualquer planta do gênero Nicotianaincluindo, mas não se limitando a Nicotiana tabacum, Nicotiana amplexicaulis PI 271989; Nicotiana benthamiana PI 555478; Nicotiana bigelovii PI 555485; Nicotiana debneyi; Nicotiana excelsior PI 224063; Nicotiana glutinosa PI 555507; Nicotiana goodspeedii PI 241012; Nicotiana gossei PI 230953; Nicotiana hesperis PI 271991; Nicotiana knightiana PI 555527; Nicotiana maritima PI 555535; Nicotiana megalosiphon PI 555536; Nicotiana nudicaulis PI 555540; Nicotiana paniculata PI 555545; Nicotiana plumbaginifolia PI 555548; Nicotiana repanda PI 555552; Nicotiana rustica; Nicotiana suaveolens PI 230960; Nicotiana sylvestris PI 555569; Nicotiana tomentosa PI 266379; Nicotiana tomentosiformis; e Nicotiana trigonophylla PI 555572. Em um aspecto, uma planta de tabaco descrita aqui é uma planta Nicotiana tabacum.

[0054] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, onde a planta de tabaco é capaz de produzir folhas, quando curada, com um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais.

Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma mutação em um gene ERF do locus Nic2. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma ou mais mutações em dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os sete genes selecionados do grupo que consiste em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e ERF168. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma ou mais mutações no ERF189, ERF115 ou ambos.

Em um aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA selecionado do grupo que consiste em 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA comparável ao de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições semelhantes, onde a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico ao da planta de tabaco exceto a mutação.

Em um aspecto adicional, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% do valor do índice de grau USDA de uma planta de controle quando cultivada em condições semelhantes, onde a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico à planta de tabaco, exceto a mutação.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA entre 65% e 130%, entre 70% e 130%, entre 75% e 130%, entre 80% e 130%, entre 85% e 130%, entre 90% e 130%, entre 95% e 130%, entre 100% e 130%, entre 105% e 130%, entre 110% e 130%, entre 115% e 130%, ou entre 120% e 130% do valor de índice de grau USDA da planta de controle.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA entre 70% e 125%, entre 75% e 120%, entre 80% e 115%, entre 85% e 110%, ou entre 90% e 100% do valor de índice de grau da planta de controle.

Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem nicotina em um nível abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico ao da planta de tabaco exceto a mutação.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco compreendem um nível total de alcaloides selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que 2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25%, menos que 2,0%, menos que 1,75%, menos que 1,5 %, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5%, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2 %, menos que 0,1% e menos que 0,05%. Em outro aspecto, as plantas de tabaco compreendem um nível de nicotina ou alcaloide total selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que

2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25%, menos que 2,0%, menos que 1,75%, menos que 1,5%, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5%, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2%, menos que 0,1% e menos que 0,05%. Em um aspecto adicional, as plantas de tabaco compreendem ainda um transgene ou mutação que suprime diretamente a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, A622, aspartato oxidase, agmatina desiminase (AIC), arginase, diamina oxidase, ornitina descarboxilase, arginina descarboxilase, permease de captação de nicotina (NUP) e transportador MATE.

[0055] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, onde as plantas do tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, tendo um valor de índice de grau USDA comparável àquele de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições semelhantes, em que a referida planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a referida planta de tabaco, exceto a referida mutação. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma mutação em um gene ERF do locus Nic2. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma ou mais mutações em dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os sete genes selecionados do grupo que consiste em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e ERF168. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda uma ou mais mutações no ERF189, ERF115 ou ambos. Em um outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA selecionado do grupo que consiste em 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA selecionado do grupo que consiste entre 50 e 95, entre 55 e 95, entre 60 e 95, entre 65 e 95, entre 70 e 95, entre 75 e 95, entre 80 e 95, entre 85 e 95, entre 90 e 95, entre 55 e 90, entre 60 e 85, entre 65 e 80, entre 70 e 75, entre 50 e 55, entre 55 e 60, entre 60 e 65, entre 65 e 70, entre 70 e 75, entre 75 e 80, entre 80 e 85, entre 85 e 90 e entre 90 e 95. Em um aspecto adicional, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% do valor do índice de grau USDA da planta de controle.

Em outro aspecto, as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA entre 70% e 125%, entre 75% e 120%, entre 80% e 115%, entre 85% e 110%, ou entre 90% e 100% do valor de índice de grau da planta de controle. Em outro aspecto, as plantas de tabaco compreendem nicotina ou alcaloides totais em níveis abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina ou alcaloides totais da planta de controle quando cultivados em condições de crescimento semelhantes. Em um outro aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda um transgene ou mutação que suprime diretamente a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, A622, aspartato oxidase, agmatina desiminase (AIC), arginase, diamina oxidase, ornitina descarboxilase, arginina descarboxilase, permease de captação de nicotina (NUP) e transportador MATE.

[0056] Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste na SEQ ID No. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico de menos que 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou 9000 nucleotídeos. Em outro aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico de pelo menos 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou 9000 nucleotídeos. Em um aspecto adicional, um locus Nic1b _ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 100 e 300, entre 100 e 400, entre 100 e 500, entre 100 e 600, entre 100 e 700, entre 100 e 800, entre 100 e 900, entre

100 e 1000, entre 100 e 1500, entre 100 e 2000, entre 100 e 3000, entre 100 e 4000, entre 100 e 5000, entre 100 e 6000, entre 100 e 7000, entre 100 e 8000 ou entre 100 e 9000 nucleotídeos. Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 50 e 100, entre 100 e 200, entre 200 e 300, entre 300 e 400, entre 400 e 500, entre 500 e 600, entre 600 e 700, entre 700 e 800, entre 800 e 900, entre 900 e 1000, entre 1000 e 1500, entre 1500 e 2000, entre 2000 e 3000, entre 3000 e 4000, entre 4000 e 5000, entre 5000 e 6000, entre 6000 e 7000, entre 7000 e 8000, ou entre 8000 e 9000 nucleotídeos.

[0057] Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico dentro de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000 ou 70000 nucleotídeos de um marcador SNP selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201. Em outro aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 100 e 300, entre 100 e 400, entre 100 e 500, entre 100 e 600, entre 100 e 700, entre 100 e 800, entre 100 e 900, entre 100 e 1000, entre 100 e 1500, entre 100 e 2000, entre 100 e 3000, entre 100 e 4000, entre 100 e 5000, entre 100 e 6000, entre 100 e 7000, entre 100 e 8000 ou entre 100 e 9000 nucleotídeos de um marcador SNP selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201. Em um aspecto adicional, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 50 e 100, entre 100 e 200, entre 200 e 300, entre 300 e 400, entre 400 e 500, entre 500 e 600, entre 600 e 700, entre 700 e 800, entre

800 e 900, entre 900 e 1000, entre 1000 e 1500, entre 1500 e 2000, entre 2000 e 3000, entre 3000 e 4000, entre 4000 e 5000, entre 5000 e 6000, entre 6000 e 7000, entre 7000 e 8000 ou entre 8000 e 9000 nucleotídeos de um marcador SNP selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201.

[0058] Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, e 202 a 205, e fragmentos dos mesmos. Em outro aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico dentro de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000 ou 70000 nucleotídeos de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto adicional, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 100 e 300, entre 100 e 400, entre 100 e 500, entre 100 e 600, entre 100 e 700, entre 100 e 800, entre 100 e 900, entre 100 e 1000, entre 100 e 1500, entre 100 e 2000, entre 100 e 3000, entre 100 e 4000, entre 100 e 5000, entre 100 e 6000, entre 100 e 7000, entre 100 e 8000 ou entre 100 e 9000 nucleotídeos de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou um segmento cromossômico entre 50 e 100, entre 100 e 200, entre 200 e 300, entre 300 e 400, entre 400 e 500, entre 500 e 600, entre 600 e 700, entre 700 e 800, entre 800 e 900, entre 900 e 1000, entre 1000 e 1500, entre 1500 e 2000, entre 2000 e 3000, entre 3000 e 4000, entre 4000 e 5000, entre 5000 e 6000, entre 6000 e 7000, entre 7000 e 8000 ou entre 8000 e 9000 nucleotídeos de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205.

[0059] Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou segmento cromossômico flanqueado por e não compreende nenhuma das duas sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205, e fragmentos dos mesmos. Em um aspecto, um locusNic1b_ERF compreende uma sequência ou segmento cromossômico flanqueado por e não compreendendo nenhum dos dois marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201. Em um aspecto, um locus Nic1b_ERF compreende uma sequência ou segmento cromossômico flanqueado por e não compreende nenhuma das duas sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205, e fragmentos dos mesmos.

[0060] Em um aspecto, a presente divulgação também fornece uma variedade, cultivar ou linhagem de tabaco compreendendo uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma mutação nic1b_erf, uma mutação nic2 e uma combinação das mesmas, onde a variedade, cultivar ou linhagem de tabaco tem um grau de folha comparável ao grau de folha de uma variedade, cultivar ou linhagem de controle de tabaco quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, onde a variedade de controle de tabaco compartilha um fundo genético essencialmente idêntico à variedade, cultivar ou linhagem de tabaco, exceto a mutação.

[0061] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda plantas de tabaco não transgênicas, ou parte das mesmas, compreendendo um nível de nicotina ou alcaloide total selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que 2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25 %, menos que 2,0%, menos que 1,75%, menos que 1,5%, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5 %, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2%, menos que 0,1% e menos que 0,05%, onde as plantas de tabaco são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA igual a 50 ou mais 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais. Em outro aspecto, essas plantas de tabaco não transgênicas compreendem um nível de nicotina inferior a 2,0% e são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA de 70 ou mais. Em um aspecto adicional, essas plantas de tabaco não transgênicas compreendem um nível de nicotina inferior a 1,0% e são capazes de produzir folhas, quando curadas, com um valor de índice de grau USDA de 70 ou mais.

[0062] Em um aspecto, a presente divulgação também fornece uma planta de tabaco, ou parte da mesma, compreendendo uma mutação não transgênica, em que a mutação não transgênica reduz o nível de nicotina ou alcaloide total da planta de tabaco para abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de

15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, onde a planta de tabaco é capaz de produzir folhas, quando curada, com um valor de índice de grau USDA comparável ao valor de índice de grau USDA da planta de controle e onde a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação não transgênica.

[0063] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b_ERF, onde a mutação está ausente de LA Burley 21. Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma introgressão cromossômica mais curta no locus Nic1b_ERF em comparação com LA Burley 21. Em um outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas não compreendem deleção de um gene completo ou uma sequência de codificação gênica completa no locus Nic1b_ERF. Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas são homozigotas no locus Nic1b_ERF. Em outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas são heterozigotas no locus Nic1b_ERF. Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma mutação Nic1b_ERF selecionada do grupo que consiste em uma mutação pontual, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão. Num aspecto, as mutações de Nic1b_ERF nas plantas de tabaco aqui fornecidas são introduzidas por uma abordagem selecionada a partir do grupo que consiste em mutagênese aleatória e mutagênese direcionada. Em outro aspecto, as mutações de Nic1b_ERF nas plantas de tabaco aqui fornecidas são introduzidas por uma abordagem de mutagênese direcionada selecionada do grupo que consiste em meganuclease, nuclease de dedo de zinco, TALEN e CRISPR.

[0064] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17 to 19, 153, 154, 202, 203, e 208 a 214, e fragmentos dos mesmos. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou atividade de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17 to 19, 153, 154, 202, 203, e 208 a 214, e fragmentos dos mesmos.

[0065] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 38, 48, 49, 52 a 54, 158, 159, 204, 205, e 215 a 221, e fragmentos dos mesmos. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou atividade de um ou mais genes compreendendo uma sequência de codificação com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 38, 48, 49, 52 to 54, 158, 159, 204, 205, e 215 a 221, e fragmentos dos mesmos.

[0066] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206, e 207, e 222 a 228, e fragmentos dos mesmos. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206, e 207, e 222 a 228, e fragmentos dos mesmos.

[0067] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 to 205, e 72, e fragmentos dos mesmos. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou a atividade de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos

97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205 e 72 e fragmentos das mesmas.

[0068] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49, 52, 53, 204, 205, e 54, e fragmentos das mesmas. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou atividade de um ou mais genes compreendendo uma sequência de codificação com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49, 52, 53, 204, 205, e 54, e fragmentos das mesmas.

[0069] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma ou mais mutações dentro de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 84, 87, 88, e 89, e fragmentos das mesmas. Em um aspecto, uma ou mais mutações reduzem a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 84, 87, 88, e 89, e fragmentos das mesmas.

[0070] LA Burley 21 (também referido como LA BU21) é uma linhagem de tabaco com alcaloide total baixo produzida pela incorporação de um ou mais genes de alcaloide baixo de uma variedade de charutos Cubanos na Burley 21 através de vários retrocessos (Legg et al. 1970). Possui aproximadamente 0,2% de alcaloides totais (peso seco) em comparação com os cerca de 3,5% (peso seco) de seu progenitor, Burley 21. LA BU21 tem um grau de folha bem abaixo dos padrões comercialmente aceitáveis. LA BU21 também exibe outros fenótipos foliares desfavoráveis, caracterizados por rendimentos mais baixos, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos e baixa qualidade do produto final após a cura (Chaplin e Weeks, Crop Sci. 16: 416–418 (1976); Legg et al. Crop. Sci. 10: 212 (1970); Chaplin and Burk, Crop Sci. 75: 133–136 (1983)). O LA BU21 deixa outros traços de exibição, como maior teor de poliamina, maior teor de clorofila e mais células de mesofila por unidade de área foliar.

[0071] A menos que especificado de outra forma, as medições dos níveis de alcaloide, poliamina ou nicotina (ou outra caracterização química ou de propriedade das folhas) ou os valores do índice de grau das folhas aqui mencionados para uma planta, variedade, cultivar ou linhagem de tabaco referem-se a medições médias, incluindo, por exemplo, uma média de múltiplas folhas de uma única planta representativa ou uma medição média de uma população representativa de plantas de tabaco de uma única variedade, cultivar ou linhagem. Salvo indicação em contrário, o nível de nicotina,

alcaloide ou poliamina (ou outra química das folhas ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco descrita aqui é medido duas semanas após a cobertura em uma amostra de folha agrupada coletada das folhas número 3, 4 e 5 após a cobertura.

Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química da folha ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido após a cobertura em uma folha com o nível mais alto de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra propriedade ou química da folha caracterização). Em um aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina de uma planta de tabaco é medido após a cobertura das folhas número 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30. Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química das folhas ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido após a cobertura em um conjunto de duas ou mais folhas com números consecutivos de folhas selecionados do grupo que consiste no número de folhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30. Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química da folha ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido após a cobertura de uma folha com um número de folha selecionado do grupo que consiste entre 1 e 5, entre 6 e 10, entre 11 e 15, entre 16 e 20, entre 21 e 25 e entre 26 e 30. Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química da folha ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido após a cobertura em um conjunto de duas ou mais folhas com número de folhas selecionado no grupo que consiste em 1 e 5, entre 6 e 10, entre 11 e 15, entre 16 e 20, entre 21 e 25 e entre 26 e 30. Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química da folha ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido após a cobertura em um grupo de três ou mais folhas com números de folhas selecionado do grupo que consiste entre 1 e 5, entre 6 e 10, entre 11 e 15, entre 16 e 20, entre 21 e 25 e entre 26 e 30.

[0072] Como usado neste documento, a numeração das folhas é baseada na posição da folha em um caule de tabaco, com a folha número 1 sendo a folha mais jovem (na parte superior) após a cobertura e o maior número de folhas atribuído à folha mais antiga (na parte inferior).

[0073] Uma população de plantas de tabaco ou uma coleção de folhas de tabaco para determinar uma medida média (por exemplo, nível de alcaloide ou nicotina ou classificação das folhas) pode ser de qualquer tamanho, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50. Os protocolos padrão aceitos pelo setor são seguidos para determinar medições médias ou valores de índice de grau.

[0074] Como usado neste documento, "cobertura" refere-se à remoção do ápice do caule, incluindo o SAM, flores e até várias folhas adjacentes, quando uma planta de tabaco está próxima da maturidade vegetativa e em torno do início do crescimento reprodutivo. Normalmente, as plantas de tabaco são cobertas no estágio do botão (logo após a flor começar a aparecer). Por exemplo, plantas de tabaco cultivadas em estufa ou em campo podem ser cobertas quando 50% das plantas têm pelo menos uma flor aberta. A cobertura de uma planta de tabaco resulta na perda de dominância apical e também induz o aumento da produção de alcaloides.

[0075] Normalmente, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química das folhas ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido cerca de 2 semanas após a cobertura. Outros pontos de tempo também podem ser usados. Em um aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química das folhas ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido cerca de 1, 2, 3, 4 ou 5 semanas após a cobertura. Em outro aspecto, o nível de nicotina, alcaloide ou poliamina (ou outra química da folha ou caracterização da propriedade) de uma planta de tabaco é medido cerca de 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 ou 21 dias após a cobertura.

[0076] Como usado neste documento, "condições de crescimento semelhantes" ou "condições de crescimento comparáveis" se referem a condições ambientais e/ou práticas agronômicas semelhantes para o cultivo e comparação significativa entre dois ou mais genótipos de plantas, de modo que nem as condições ambientais nem as práticas agronômicas contribuam ou expliquem qualquer diferença observada entre os dois ou mais genótipos de plantas. As condições ambientais incluem, por exemplo, luz, temperatura, água (umidade) e nutrição (por exemplo, nitrogênio e fósforo). As práticas agronômicas incluem, por exemplo, semeadura, recorte, subcotação, transplante, cobertura e trituração. Veja Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp 70-103.

[0077] "Alcaloides" são complexos, compostos contendo nitrogênio, que ocorrem naturalmente nas plantas e têm efeitos farmacológicos em humanos e animais. A “nicotina” é o alcaloide natural primário no tabaco de cigarro comercializado e representa cerca de 90% do teor de alcaloides na Nicotiana tabacum. Outros alcaloides principais do tabaco incluem cotinina, nornicotina, miosmina, nicotirina, anabasina e anatabina. Alcaloides secundários do tabaco incluem nicotina-n-óxido, N-metil anatabina, N-metil anabasina, pseudo-oxinicotina, 2,3 dipiridil e outros.

[0078] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível mais baixo de alcaloide total ou um alcaloide individual em comparação com uma planta de controle sem uma mutação nic1b_erfou um transgene direcionado a Nic1b_ERFquando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Em outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível mais baixo de um ou mais alcaloides selecionados do grupo que consiste em cotinina, nornicotina, miosmina, nicotirina, anabasina e anatabina, em comparação com uma planta de controle de tabaco quando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Em um aspecto, um nível mais baixo de alcaloide ou nicotina refere- se a um nível de alcaloide ou nicotina abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de alcaloide ou nicotina de uma planta de controle de tabaco. Em outro aspecto, um nível mais baixo de alcaloide ou nicotina refere-se a um nível de alcaloide ou nicotina entre cerca de 0,5% e 1%, entre 1% e

2%, entre 2% e 3%, entre 3% e 4%, entre 4% e 5%, entre 5% e 6%, entre 6% e 7%, entre 7% e 8%, entre 8% e 9%, entre 9% e 10%, entre 11% e 12%, entre 12% e 13%, entre 13% e 14%, entre 14% e 15%, entre 15% e 16%, entre 16% e 17%, entre 17% e 18%, entre 18% e 19%, entre 19% e 20%, entre 21% e 22%, entre 22% e 23%, entre 23% e 24%, entre 24% e 25%, entre 25% e 26%, entre 26% e 27%, entre 27% e 28%, entre 28% e 29%, ou entre 29% e 30% do nível de alcaloide ou nicotina de uma planta de controle de tabaco. Em um aspecto adicional, um nível mais baixo de alcaloide ou nicotina refere-se a um nível de alcaloide ou nicotina entre cerca de 0,5% e 5%, entre 5% e 10%, entre 10% e 20%, entre 20% e 30% do nível de alcaloide ou nicotina de uma planta de controle de tabaco.

[0079] Os níveis de alcaloides podem ser analisados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por quantificação com base em cromatografia gás-líquido, cromatografia líquida de alto desempenho, radioimunoensaios e ensaios de imunoabsorção enzimática. Por exemplo, os níveis de alcaloides nicotínicos podem ser medidos por um método GC-FID baseadoem nCORESTA Recommended Method No. 7, 1987 and ISO Standards (ISO TC 126N 394 E. See also Hibi et al., Plant Physiology 100: 826-35 (1992) para um método que utiliza cromatografia gás-líquido equipada com uma coluna capilar e um detector FID. Salvo indicação em contrário, todos os níveis de alcaloides aqui descritos são medidos usando um método de acordo com CORESTA Method No 62, Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by Gas Chromatographic Analysis, February 2005, e aqueles definidos em Centers for Disease Control and Prevention’s Protocol for Analysis of Nicotine, Total Moisture and pH in Smokeless

Tobacco Products, conforme publicado no Federal Register Vol. 64, No. 55, March 23, 1999 (e emendada em Vol. 74, No. 4, January 7, 2009).

[0080] Alternativamente, os alcaloides totais do tabaco podem ser medidos usando um método colorimétrico de fluxo segmentado desenvolvido para análise de amostras de tabaco, adaptado por Skalar Instrument Co (West Chester, PA) e descrito por Collins et al., Tobacco Science 13:79-81 (1969). Em resumo, as amostras de tabaco são secas, moídas e extraídas antes da análise dos alcaloides totais e dos açúcares redutores. O método, então, emprega uma extração de ácido acético/metanol/água e carvão para descoloração. A determinação dos alcaloides totais foi baseada na reação do cloreto de cianogênio com alcaloides da nicotina na presença de uma amina aromática para formar um complexo colorido medido a 460 nm. Salvo indicação em contrário, os níveis totais de alcaloides ou os níveis de nicotina mostrados aqui são com base no peso seco (por exemplo, percentual de alcaloide total ou percentual de nicotina).

[0081] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível mais baixo de nicotina em comparação com uma planta de controle sem uma mutação nic1b_erfou um transgene direcionando a Nic1b_ERFquando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Em um aspecto, um nível mais baixo de nicotina refere-se a um nível de nicotina abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina de uma planta de controle de tabaco. Em outro aspecto, um nível mais baixo de nicotina refere-se a um nível de nicotina médio entre cerca de 0,5% e 1%, entre 1% e 2%, entre 2% e 3%, entre 3% e 4%, entre 4% e 5%, entre 5% e 6%, entre 6% e 7%, entre 7% e 8%, entre 8% e 9%, entre 9% e 10%, entre 11% e 12%, entre 12% e 13%, entre 13% e 14%, entre 14% e 15%, entre 15% e 16%, entre 16% e 17%, entre 17% e 18%, entre 18% e 19%, entre 19% e 20%, entre 21% e 22%, entre 22% e 23%, entre 23% e 24%, entre 24% e 25%, entre 25% e 26%, entre 26% e 27%, entre 27% e 28%, entre 28% e 29%, ou entre 29% e 30% do nível de nicotina de uma planta de controle de tabaco. Em um aspecto adicional, um nível mais baixo de nicotina refere-se a um nível de nicotina médio entre cerca de 0,5% e 5%, entre 5% e 10%, entre 10% e 20%, entre 20% e 30% do nível de nicotina médio de uma planta de controle de tabaco.

[0082] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,75%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% e 9% com base no peso seco. Em outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01% e 0,02%, entre 0,02% e 0,05%, entre 0,05% e 0,75%, entre 0,75% e 0,1%, entre 0,1% e 0,15%, entre 0,15% e 0,2%, entre 0,2% e 0,3%, entre 0,3% e 0,35%, entre 0,35% e 0,4%, entre 0,4% e 0,5%, entre 0,5% e 0,6%, entre 0,6% e 0,7%,

entre 0,7% e 0,8%, entre 0,8% e 0,9%, entre 0,9% e 1%, entre 1% e 1,1%, entre 1,1% e 1,2%, entre 1,2% e 1,3%, entre 1,3% e 1,4%, entre 1,4% e 1,5%, entre 1,5% e 1,6%, entre 1,6% e 1,7%, entre 1,7% e 1,8%, entre 1,8% e 1,9%, entre 1,9% e 2%, entre 2 % e 2,1%, entre 2,1% e 2,2%, entre 2,2% e 2,3%, entre 2,3% e 2,4%, entre 2,4% e 2,5%, entre 2,5% e 2,6%, entre 2,6% e 2,7%, entre 2,7% e 2,8%, entre 2,8% e 2,9%, entre 2,9% e 3%, entre 3% e 3,1%, entre 3,1% e 3,2%, aposta entre 3,2% e 3,3%, entre 3,3% e 3,4%, entre 3,4% e 3,5% e entre 3,5% e 3,6% com base no peso seco. Em um aspecto adicional, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01% e 0,1%, entre 0,02% e 0,2%, entre 0,03% e 0,3%, entre 0,04% e 0,4%, entre 0,05% e 0,5%, entre 0,75% e 1%, entre 0,1% e 1,5%, entre 0,15% e 2%, entre 0,2% e 3% e entre 0,3% e 3,5% com base no peso seco.

[0083] A presente divulgação também fornece plantas de tabaco com níveis alterados de nicotina sem impactos negativos sobre outros traços do tabaco, por exemplo, valor do índice de grau das folhas. Em um aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina fornece tabaco curado de grau comercialmente aceitável. Os graus do tabaco são avaliadas com base em fatores que incluem, entre outros, a posição do caule, tamanho, cor, uniformidade e integridade das folhas, maturação, textura, elasticidade, brilho (relacionado à intensidade e profundidade da coloração da folha) bem como o brilho), higroscopicidade (a faculdade do tabaco deixa de absorver e reter a umidade do ambiente) e nuances ou tons de verde. O grau da folha pode ser determinado, por exemplo, usando um Grau Oficial Padrão publicado pelo Serviço de Marketing Agrícola do Departamento de Agricultura dos EUA (7 U.S.C. §511). Ver, por exemplo, Official Standard Grades for Burley Tobacco (U.S.

Type 31 and Foreign Type 93), em vigência a partir de 5 de novembro de 1990 (55 F.R. 40645); Official Standard Grades for Flue- Cured Tobacco (U.S.

Types 11, 12, 13, 14 and Foreign Type 92), em vigência a partir de 27 de março de 1989 (54 F.R. 7925); Official Standard Grades for Pennsylvania Seedleaf Tobacco (U.S.

Type 41), em vigência a partir de 8 de janeiro de 1965 (29 F.R. 16854); Official Standard Grades for Ohio Cigar-Leaf Tobacco (U.S.

Types 42, 43, and 44), em vigência a partir de 8 de dezembro de 1963 (28 F.R. 11719 and 28 F.R. 11926); Official Standard Grades for Wisconsin Cigar-Binder Tobacco (U.S.

Types 54 and 55), em vigência a partir de 20 de novembro de (34 F.R. 17061); Official Standard Grades for Wisconsin Cigar-Binder Tobacco (U.S.

Types 54 and 55), em vigência a partir de 20 de novembro de 1969 (34 F.R. 17061); Official Standard Grades for Georgia and Florida Shade-Grown Cigar-Wrapper Tobacco (U.S.

Type 62), em vigência a partir de abril de 1971. Um valor de índice de grau USDA pode ser determinado de acordo com um índice de grau aceito pelo setor.

Ver, por exemplo, Bowman et al, Tobacco Science, 32:39-40(1988); Legacy Tobacco Document Library (Bates Document #523267826-523267833, July 1, 1988, Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index); and Miller et al., 1990, Tobacco Intern., 192:55-57 (todas as referências anteriores são incorporadas por inferência na sua totalidade). Salvo indicação em contrário, um índice de classificação do USDA para qualquer planta descrita aqui é uma representação numérica de 0 a 100 da nota federal recebida e é uma média ponderada de todas as posições do caule. Um índice de grau mais alto indica maior qualidade. Alternativamente, o grau da folha pode ser determinado através de imageamento hiperespectral. Veja, por exemplo, WO 2011/027315 (publicado em 10 de março de 2011 e incorporado por inferência na sua totalidade).

[0084] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um nível semelhante de um ou mais compostos aromáticos de tabaco selecionados do grupo que consiste em ácido 3-metilvalérico, ácido valérico, ácido isovalérico, um labdenoide, um cembrenoide, um éster de açúcar e um açúcar redutor, em comparação com o controle de plantas de tabaco quando cultivada em condições de crescimento semelhantes. Em outro aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem uma mutação nic1b_erf, uma mutação nic2 ou uma combinação das mesmas com nenhum impacto sobre o nível de um ou mais compostos de aroma de tabaco selecionados do grupo que consiste em ácido 3-metilvalérico, ácido valérico, ácido isovalérico, um labdenoide, um cembrenoide, um éster de açúcar e um açúcar redutor.

[0085] Como usado neste documento, os compostos de aroma de tabaco são compostos associados ao sabor e aroma da fumaça do tabaco. Estes compostos incluem, mas não estão limitados a, ácido 3-metilvalérico, ácido valérico, ácido isovalérico, diterpenos cembrenoides e labdenoides e ésteres de açúcar. As concentrações de compostos de aroma de tabaco podem ser medidas por quaisquer métodos conhecidos de perfil de metabólitos na técnica, incluindo, sem limitação, espectrometria de massa por cromatografia em fase gasosa (GC-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear,

espectrometria de massa ligada à cromatografia líquida. Consulte The Handbook of Plant Metabolomics, edited by Weckwerth and Kahl, (Wiley-Blackwell) (May 28, 2013).

[0086] Como usado neste documento, "açúcar(es) redutor(es)" é qualquer açúcar (monossacarídeo ou polissacarídeo) que possui um grupo aldeído ou cetona livre ou potencialmente livre. A glicose e a frutose atuam como tampões de nicotina na fumaça do cigarro, reduzindo o pH da fumaça e efetivamente reduzindo a quantidade de nicotina desprotonada “livre”. A redução de açúcares equilibra o sabor da fumaça, por exemplo, modificando o impacto sensorial da nicotina e de outros alcaloides do tabaco. Foi relatada uma relação inversa entre o teor de açúcar e o teor de alcaloides nas variedades de tabaco, dentro da mesma variedade e dentro da mesma linhagem de planta causada pelas condições de plantio. A redução dos níveis de açúcar pode ser medida usando um método colorimétrico de fluxo segmentado desenvolvido para análise de amostras de tabaco como adaptado por Skalar Instrument Co (West Chester, PA) and described by Davis, Tobacco Science 20:139-144 (1976). Por exemplo, uma amostra é dialisada contra uma solução de carbonato de sódio. A neocuproína de cobre é adicionada à amostra e a solução é aquecida. O quelato de neocuproína de cobre é reduzido na presença de açúcares, resultando em um complexo colorido que é medido a 460 nm.

[0087] Em um aspecto, as plantas de tabaco aqui fornecidas compreendem um ou mais alelos mutantes não existindo naturalmente no locus Nic1b_ERF ou Nic2 que reduzem ou eliminam uma ou mais atividade gênica do locus Nic1b_ERF ou Nic2. Em um aspecto, esses alelos mutantes resultam em níveis mais baixos de nicotina. Os alelos Nic1b_ERF ou Nic2 mutantes podem ser introduzidos por qualquer método conhecido na técnica, incluindo abordagens de mutagênese aleatória ou direcionada.

[0088] Tais métodos de mutagênese incluem, sem limitação, tratamento de sementes com metilsulfato de etil (EMS) (Hildering and Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp. 317-320, 1965) ou irradiação UV, raios X e irradiação rápida com nêutrons (ver, por exemplo, Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19:197-203, 1971; e Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed), 1987), marcação de transposons (Fedoroff et al., 1984; Pat. U.S. 4.732.856 e Pat. U.S. 5.013.658), bem como metodologias de inserção de T-DNA (Hoekema et al., 1983; Pat. U.S. No. 5.149.645). A mutagênese induzida por EMSconsiste em induzir quimicamente mutações de pontos aleatórios ao longo do comprimento do genoma. A mutagênese rápida de nêutrons consiste em expor as sementes ao bombardeio de nêutrons, que causa grandes deleções devido à quebra do DNA de fita dupla. A marcação de transposon compreende inserir um transposon dentro de um gene endógeno para reduzir ou eliminar a expressão do gene. Os tipos de mutações que podem estar presentes em um gene do tabaco incluem, por exemplo, mutações pontuais, deleções, inserções, duplicações e inversões. Desejavelmente, tais mutações estão presentes na região de codificação de um gene do tabaco; no entanto, também podem ser desejáveis mutações na região promotora e no íntron ou em uma região não traduzida de um gene do tabaco.

[0089] Além disso, um método rápido e automatizável para a triagem de mutações induzidas quimicamente, o TILLING (Direcionando Lesões Locais Induzidas em Genomas), utilizando HPLC desnaturante ou digestão seletiva de endonucleases de produtos de PCR selecionados também é aplicável à presente divulgação. Ver, McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457. As mutações que afetam a expressão de gene ou que interferem na função dos genes podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Mutações insercionais em éxons de genes geralmente resultam em mutantes nulos. Mutações em resíduos conservados podem ser particularmente eficazes na inibição da função de uma proteína. Em um aspecto, as plantas de tabaco compreendem uma mutação sem sentido (por exemplo, códon de parada) é um ou mais genes de NCG aqui descritos.

[0090] É um aspecto, a presente divulgação também fornece linhagens de tabaco com níveis alterados de nicotina, mantendo a qualidade das folhas comercialmente aceitável. Essas linhagens podem ser produzidas através da introdução de mutações em um ou mais genes no locus Nic1b_ERF ou Nic2, por meio de tecnologias precisas de engenharia de genoma, por exemplo, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), meganuclease, nuclease de dedo de zinco e um sistema agrupado de repetições palidrômicas curtas inter-espaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9, um sistema CRISPR/Cpf1, um sistema CRISPR/Csm1 e uma combinação dos mesmos (consulte, por exemplo, a publicação do Pedido de Patente U.S. 2017/0233756). Ver, por exemplo, Gaj et al., Trends in Biotechnology, 31(7):397-405 (2013).

[0091] A triagem e seleção de plantas de tabaco mutagenizadas pode ser através de quaisquer metodologias conhecidas pelos versados na técnica. Exemplos de metodologias de triagem e seleção incluem, mas sem limitação, análise Southern, amplificação de PCR para detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção da RNase, extensão de iniciador, amplificação de RT-PCR para detecção de transcritos de RNA, sequenciamento Sanger, tecnologias de sequenciamento de Próxima Geração (por exemplo, Illumina, PacBio, Ion Torrent, 454), ensaios enzimáticos para detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Métodos para executar todas as técnicas referidas são conhecidos.

[0092] Em um aspecto, uma planta de tabaco ou genoma de planta aqui fornecido é mutada ou editada por uma nuclease selecionada do grupo que consiste em uma meganuclease, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease CRISPR/Cas9, uma nuclease CRISPR / Cpf1 ou uma nuclease CRISPR / Csm1.

[0093] Como usado neste documento, "edição" ou "edição de genoma" refere-se a mutagênese direcionada de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 nucleotídeos de uma sequência de ácido nucleico do genoma da planta endógena ou remoção ou substituição de uma sequência de ácido nucleico do genoma da planta endógena. Em um aspecto, uma sequência de ácido nucleico editada fornecida possui pelo menos 99,9%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 94%, pelo menos 93%, pelo menos 92%, pelo menos 91%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80% ou pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico endógena. Em um aspecto, uma sequência de ácido nucleico editada fornecida possui pelo menos 99,9%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 94%, pelo menos 93%, pelo menos 92%, pelo menos 91%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80% ou pelo menos 75% de identidade de sequência com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs : 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, 202 a 205 e 208 a 221, e fragmentos dos mesmos. Em outro aspecto, uma sequência de ácido nucleico editada fornecida possui pelo menos 99,9%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 94%, pelo menos 93%, pelo menos 92%, pelo menos 91%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80% ou pelo menos 75% de identidade de sequência com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, 202 a 205 e 208 a 221.

[0094] Meganucleases, ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1 e CRISPR/Cpf1 induzem uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo de uma sequência genômica que é então reparada pelos processos naturais de recombinação homóloga (HR) ou união de extremidade não homóloga (NHEJ). Modificações de sequência ocorrem nos sítios clivados, que podem incluir deleções ou inserções que resultam em rompimento de genes no caso de NHEJ ou integração de sequências de ácidos nucleicos de doadores por HR. Em um aspecto, um método fornecido compreende editar um genoma de planta com uma nuclease fornecida para mutar pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais que 10 nucleotídeos no genoma da planta via HR com um polinucleotídeo doador. Em um aspecto, uma mutação fornecida é causada pela edição do genoma usando uma nuclease. Em outro aspecto, uma mutação fornecida é causada por recombinação homóloga ou união de extremidade não homóloga.

[0095] Em um aspecto, uma mutação fornecida aqui fornece um mutante dominante que ativa a expressão ou atividade de um gene de interesse, por exemplo, um gene selecionado do grupo que consiste em uma enzima biossintética, um fator de transcrição reguladora, um transportador, uma enzima catabólica, ou uma combinação dos mesmos, para um ou mais antioxidantes.

[0096] As meganucleases, que são comumente identificadas em micróbios, são enzimas únicas com alta atividade e longas sequências de reconhecimento (> 14 bp), resultando na digestão específica de sítio do DNA alvo. Versões engenheiradas de meganucleases de ocorrência natural geralmente têm sequências de reconhecimento de DNA estendidas (por exemplo, 14 a 40 bp). A engenharia de meganucleases pode ser mais desafiadora que aquelas de ZFNs e TALENs, porque as funções de reconhecimento e clivagem de DNA das meganucleases estão entrelaçadas em um único domínio.

Métodos especializados de mutagênese e triagem de alto rendimento foram utilizados para criar novas variantes de meganucleases que reconhecem sequências únicas e possuem atividade aprimorada de nucleases.

[0097] As ZFNs são proteínas sintéticas que consistem em um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco engenheirado fundido ao domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI. As ZFNs podem ser concebidas para clivar quase qualquer trecho longo de DNA de cadeia dupla para modificação do domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco. ZFNs formam dímeros de monômeros compostos de um domínio de clivagem de DNA mão específico de FokI endonuclease fundida a uma matriz de dedos de zinco engenheirada para se ligar a uma sequência de DNA alvo.

[0098] O domínio de ligação ao DNA de uma ZFN é tipicamente composto por 3-4 matrizes de dedos de zinco. Os aminoácidos nas posições -1, +2, +3 e +6 em relação ao início da hélice ∞ do dedo de zinco, que contribuem para a ligação específica do sítio ao DNA alvo, podem ser alterados e personalizados para se ajustarem ao sequências específicas do alvo. Os outros aminoácidos formam a espinha dorsal de consenso para gerar ZFNs com diferentes especificidades de sequência. As regras para selecionar sequências alvo para ZFNs são conhecidas na técnica.

[0099] O domínio de Fokl nuclease requer dimerização para clivar o DNA e, portanto, dois ZFNs com suas regiões de C- terminal são necessários para se ligar às cadeias de DNA opostas do sítio de clivagem (separadas por 5-7 bp). O monômero de ZFN pode criar o sítio alvo se os sítios de ligação de dois ZFs forem palindrômicos. O termo ZFN, como usado aqui, é amplo e inclui um ZFN monomérico que pode clivar DNA de cadeia dupla sem a ajuda de outro ZFN. O termo ZFN também é usado para se referir a um ou ambos os membros de um par de ZFNs que são engenheirados para trabalhar em conjunto para clivar o DNA no mesmo sítio.

[0100] Sem estar limitado por nenhuma teoria científica, uma vez que as especificidades de ligação ao DNA dos domínios de dedo de zinco podem, em princípio, ser re-engenheirados utilizando um de vários métodos, ZFNs customizados podem, teoricamente, ser construídos para atingir praticamente qualquer sequência de gene. Os métodos publicamente disponíveis para engenharia de domínios de dedo de zinco incluem Montagem dependente de contexto (CoDA), Engenharia de piscina oligomerizada (OPEN) e Montagem modular.

[0101] TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão do domínio de ligação ao DNA efetor do tipo ativador de transcrição (TALE) a um domínio de FokI nuclease. Quando cada membro de um par TALEN se liga aos sítios de DNA que flanqueiam um sítio alvo, os monômeros FokI dimerizam e causam uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo. O termo TALEN, como usado neste documento, é amplo e inclui um TALEN monomérico que pode clivar o DNA de fita dupla sem a assistência de outro TALEN. O termo TALEN também é usado para se referir a um ou ambos os membros de um par de TALENs que trabalham em conjunto para clivar o DNA no mesmo sítio.

[0102] Os efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser engenheirados para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA. As proteínas TALE são domínios de ligação ao DNA derivados de vários patógenos bacterianos de plantas do gênero Xanthomonas. Os patógenos Xanthomonas secretam TALEs na célula da planta hospedeira durante a infecção. O TALE move-se para o núcleo, onde reconhece e se liga a uma sequência de DNA específica na região promotora de uma sequência específica de DNA na região promotora de um gene específico no genoma do hospedeiro. TALE possui um domínio central de ligação ao DNA composto por 13-28 monômeros repetidos de 33-34 aminoácidos. Os aminoácidos de cada monômero são altamente conservados, exceto os resíduos de aminoácidos hipervariáveis nas posições 12 e 13. Os dois aminoácidos variáveis são chamados di-resíduos de repetição variável (RVDs). Os pares de aminoácidos NI, NG, HD e NN dos RVDs preferencialmente reconhecem adenina, timina, citosina e guanina/adenina, respectivamente, e a modulação de RVDs pode reconhecer bases consecutivas de DNA. Essa relação simples entre a sequência de aminoácidos e o reconhecimento de DNA permitiu a engenharia de domínios de ligação a DNA específicos, selecionando uma combinação de segmentos de repetição contendo os RVDs apropriados.

[0103] Além do domínio de clivagem de FokI de tipo selvagem, variantes do domínio de clivagem de FokI com mutações foram projetadas para melhorar a especificidade de clivagem e a atividade de clivagem. As funções de domínio de FokI como um dímero, requerendo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação ao DNA de TALEN quanto o domínio de clivagem de FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para alcançar níveis elevados de atividade.

[0104] Uma relação entre a sequência de aminoácidos e o reconhecimento de DNA do domínio de ligação TALE permite proteínas projetáveis. Programas de software como o DNA Works podem ser usados para projetar construções TALE. Outros métodos de conceber construtos TALE são conhecidos dos versados na técnica. Veja Doyle et al. Nucleic Acids Research (2012)40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011). 39:e82; e tale-nt.cac.cornell.edu/about.

[0105] Um sistema CRISPR/Cas9, CRIPR/Csm1 ou um sistema CRISPR/Cpf1 são alternativas aos métodos baseados em FokIb ZFN e TALEN. Os sistemas CRISPR são baseados em nucleases engenheiradas guiadas por RNA que usam emparelhamento de bases complementares para reconhecer sequências de DNA nos sítios alvo.

[0106] Os sistemas CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1, e CRISPR/Cpf1 fazem parte do sistema imune adaptativo de bactérias e archaea, protegendo-os contra a invasão de ácidos nucleicos, como vírus, clivando o DNA estranho de maneira dependente de sequência. A imunidade é adquirida pela integração de pequenos fragmentos do DNA invasor conhecidos como espaçadores entre duas repetições adjacentes na extremidade proximal de um locus CRISPR. As matrizes de CRISPR, incluindo os espaçadores, são transcritas durante encontros subsequentes com DNA invasivo e são processados em pequenos RNAs de CRISPR interferentes (crRNAs) com aproximadamente 40 nt de comprimento, que combinam com o CRISPR RNA trans-ativador (tracrRNA) para ativar e orientar a Cas9 nuclease. Isto cliva sequências homólogas de DNA de cadeia dupla conhecidas como protoespaçadores no DNA invasor. Um pré-requisito para a clivagem é a presença de um motivo adjacente ao protoespaçador conservado (PAM) a jusante do DNA alvo, que geralmente tem a sequência 5'-NGG- 3′, mas menos frequentemente NAG. A especificidade é fornecida pela chamada “sequência de sementes”, aproximadamente 12 bases a montante do PAM, que deve coincidir entre o RNA e o DNA alvo. Cpf1 e Csm1 agem de maneira similar ao Cas9, mas Cpf1 e Csm1 não requerem um tracrRNA.

[0107] Ainda em outro aspecto, uma planta de tabaco fornecida compreende ainda uma ou mais mutações em um ou mais loci que codificam uma nicotina desmetilase (por exemplo, CYP82E4, CYP82E5, CYP82E10) que conferem quantidades reduzidas de nornicotina (ver Pat. U.S.

8.319.011; 8.124.851; 9.187.759; 9.228.194; 9.228.195;

9.247.706) em comparação com a planta de controle sem uma ou mais mutações em um ou mais loci que codificam uma nicotina desmetilase. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada descrita ainda compreende atividade reduzida de nicotina desmetilase em comparação com uma planta de controle quando cultivada e curada sob condições comparáveis.

[0108] A presente divulgação também fornece composições e métodos para inibir a expressão ou função de um ou mais polipeptídeos do locus Nic1b_ERF em uma planta, particularmente plantas do gênero Nicotiana, incluindo plantas de tabaco de várias variedades comerciais.

[0109] Em um aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1b_ERF de um gene compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, e 202 a 205, e fragmentos das mesmas, onde a sequência inibidora está operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal e em que a sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência com um fragmento de pelo menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos da sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, e 202 a 205, e fragmentos das mesmas.

Em outro aspecto, a presente divulgação fornece plantas de tabaco, ou parte das mesmas, compreendendo um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1b_ERF de um gene compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, e 202 a 205, e fragmentos dos mesmos, onde a sequência inibidora está operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal e em que a sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência com um fragmento de pelo menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos da sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159, e 202 a 205, e fragmentos das mesmas. Em um aspecto, uma sequência inibidora de Nic1b_ERF é capaz de ser transcrita como um polinucleotídeo inibidor selecionado do grupo que consiste em um polinucleotídeo de RNA de fita simples, um polinucleotídeo de RNA de fita dupla e uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, uma sequência inibidora de Nic1b_ERF compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 108 a 119.

[0110] Como usado neste documento, os termos "inibir", "inibição" e "inibindo" são definidos como qualquer método conhecido na técnica ou descrito aqui que diminui a expressão ou a função de um produto genético de interesse (por exemplo, um produto genético alvo). "Inibição" pode estar no contexto de uma comparação entre duas plantas, por exemplo, uma planta geneticamente alterada versus uma planta do tipo selvagem. Alternativamente, a inibição da expressão ou função de um produto genético alvo pode estar no contexto de uma comparação entre células vegetais, organelas, órgãos, tecidos ou partes de plantas dentro da mesma planta ou entre plantas diferentes e inclui comparações entre estágios de desenvolvimento ou temporais dentro da mesma planta ou parte da planta ou entre plantas ou partes da planta. "Inibição" inclui qualquer decréscimo relativo da função ou produção de um produto genético de interesse, incluindo a eliminação completa da função ou produção desse produto genético. O termo "inibição" abrange qualquer método ou composição que suprarregula a tradução e/ou transcrição do produto do gene alvo ou atividade funcional do produto do gene alvo. Em um aspecto, o nível de mRNA ou de proteína de um ou mais genes do locus Nic1b em uma planta modificada é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2% ou menor que 1% do nível de mRNA ou proteína do mesmo gene em uma planta que não é um mutante ou que não foi geneticamente modificada para inibir a expressão desse gene.

[0111] O termo "sequência inibidora" abrange qualquer sequência polinucleotídica ou polipeptídica capaz de inibir a expressão ou função de um gene envolvido na regulação da biossíntese de nicotina a partir do locus Nic1b_ERF em uma planta, como sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas de comprimento total, sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas truncadas, fragmentos de sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, variantes de sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, sequências nucleotídicas orientadas por sentido, sequências nucleotídicas orientadas por antissentido, o complemento de uma sequência nucleotídica orientada por sentido ou antissentido, regiões invertidas de sequências nucleotídicas, hairpins de sequências nucleotídicas,

sequências nucleotídicas de fita dupla, sequências nucleotídicas de fita simples, combinações das mesmas e semelhantes. O termo "sequência polinucleotídica" inclui sequências de RNA, DNA, ácidos nucleicos quimicamente modificados, análogos de ácidos nucleicos, combinações dos mesmos e semelhantes.

[0112] Sequências inibitórias são designadas pelo nome do produto do gene alvo. Assim, uma "sequência inibidora deNic1b_EFR " refere-se a uma sequência inibidora que é capaz de inibir a expressão de um gene envolvido na regulação da biossíntese de nicotina a partir do locus Nic1b_ERF em uma planta, por exemplo, no nível de transcrição e/ou tradução, ou que é capaz de inibir a função de um produto genético. Quando a frase "capaz de inibir" é usada no contexto de uma sequência inibidora de polinucleotídeo, pretende-se significar que a própria sequência inibidora exerce o efeito inibitório; ou, onde a sequência inibidora codifica uma molécula inibidora de nucleotídeo (por exemplo, RNA em hairpin, miRNA ou polinucleotídeo de RNA de fita dupla) ou codifica um polipeptídeo inibidor (por exemplo, um polipeptídeo que inibe a expressão ou a função do produto do gene alvo), após sua transcrição (por exemplo, no caso de uma sequência inibidora que codifica um RNA em hairpin, miRNA ou polinucleotídeo de RNA de fita dupla) ou sua transcrição e tradução (no caso de uma sequência inibidora que codifica um polipeptídeo inibidor), o produto transcrito ou traduzido, respectivamente, exerce o efeito inibidor no produto do gene alvo (por exemplo, inibe a expressão ou função do produto do gene alvo).

[0113] Uma sequência inibidora de Nic1b_ERF divulgada pode ser uma sequência que desencadeia o silenciamento de genes por qualquer via ou mecanismo de silenciamento conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, supressão de sentido/co-supressão, supressão antissentido, interferência de RNA de fita dupla (dsRNA), interferência de RNA em hairpin e interferência de RNA em hairpin contendo íntron, interferência mediada por amplicon, ribozimas, RNA interferente pequeno, microRNA artificial ou sintético e siRNA trans-ativador artificial.

Uma sequência inibidora de Nic1b_ERF pode variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 70 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos e até o polinucleotídeo de comprimento completo que codifica as proteínas da presente divulgação, dependendo do resultado desejado.

Em um aspecto, uma sequência inibidora de Nic1b_ERF pode ser um fragmento entre cerca de 50 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 70 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 325 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 90 e cerca de 275 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 400 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 350 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 325 nucleotídeos, entre cerca de 100 e cerca de 300 nucleotídeos, entre cerca de 125 e cerca de 300 nucleotídeos ou entre cerca de 125 e cerca de 275 nucleotídeos de comprimento.

Em algumas modalidades, um fragmento de um polinucleotídeo do citocromo P450 é de cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150,

cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 400 nucleotídeos de comprimento e outros valores entre 70 e cerca de 400 nucleotídeos. Em um aspecto, uma sequência inibidora de Nic1b_ERF pode compreender cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos.

[0114] O uso do termo "polinucleotídeo" não se destina a limitar a presente divulgação a polinucleotídeos que compreendem DNA. Os versados na técnica reconhecerão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Esses desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem moléculas que ocorrem naturalmente e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da presente divulgação também abrangem todas as formas de sequências, incluindo, entre outras, formas de fita simples, formas de fita dupla, formas de fita dupla, hairpins, estruturas de caule e laços e semelhantes.

[0115] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece construtos de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de se ligar a um RNA que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206, e 207, e 222 a 228, e fragmentos das mesmas, e onde a molécula de RNA suprime a expressão do polipeptídeo. Em um aspecto, a molécula de RNA é selecionada do grupo que consiste em um microRNA, um siRNA e um siRNA trans-ativador. Em outro aspecto, o construto de DNA recombinante codifica um RNA de fita dupla. Também são fornecidas plantas de tabaco transgênicas ou parte das mesmas, material de tabaco curado ou produtos de tabaco compreendendo essas construtos de DNA recombinante. Em um aspecto, essas plantas transgênicas, material de tabaco curado ou produtos de tabaco compreendem um nível mais baixo de nicotina em comparação com uma planta de controle de tabaco sem o construto de DNA recombinante. São ainda fornecidos métodos para reduzir o nível de nicotina de uma planta de tabaco, o método compreendendo transformar uma planta de tabaco com qualquer um desses construtos de DNA recombinante.

[0116] Como usado neste documento, "operavelmente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor) é um link funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operavelmente ligados podem ser contíguos ou não contíguos.

[0117] Conforme usado neste documento e quando usado em referência a uma sequência, "heterólogo" refere-se a uma sequência que se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa na composição e/ou no locus genômico por intervenção humana deliberada. O termo também é aplicável a construtos de ácido nucleico, também aqui referidos como "construtos polinucleotídicas" ou "construtos nucleotídicos". Dessa maneira, um construto de ácido nucleico “heterólogo” pretende significar um construto que se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa na composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Os construtos de ácidos nucleicos heterólogos incluem, mas não estão limitados a, construtos de nucleotídeos recombinantes que foram introduzidos em uma planta ou parte de planta da mesma, por exemplo, através de métodos de transformação ou subsequente reprodução de uma planta transgênica com outra planta de interesse. Em um aspecto, um promotor usado é heterólogo à sequência acionada pelo promotor. Em um outro aspecto, um promotor utilizado é heterólogo do tabaco. Em um aspecto adicional, um promotor usado é nativo do tabaco.

[0118] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada descrita é uma planta cisgênica. Conforme usado neste documento, "cisgênese" ou "cisgênico" refere-se à modificação genética de uma planta, célula vegetal ou genoma da planta em que todos os componentes (por exemplo, promotor, ácido nucleico do doador, gene de seleção) têm apenas origens vegetais (ou seja, nenhum componente de origem vegetal é usado). Em um aspecto, uma planta, célula vegetal ou genoma vegetal fornecido é cisgênico. Plantas cisgênicas, células vegetais e genomas vegetais fornecidos podem levar a linhas de tabaco prontas para uso. Em outro aspecto, uma planta de tabaco modificada fornecida não compreende material genético ou sequências que não sejam de tabaco.

[0119] Como usado neste documento, "expressão de gene" refere-se à biossíntese ou produção de um produto de gene, incluindo a transcrição e / ou tradução do produto de gene.

[0120] Também são fornecidas aqui composições e métodos para a super-expressão de um ou mais polipeptídeos do locus

Nic1b_ERF em uma planta, particularmente plantas do gênero Nicotiana, incluindo plantas de tabaco de várias variedades comerciais.

[0121] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece construtos de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206, e 207, e 222 a 228, e fragmentos das mesmas. Também são fornecidas plantas de tabaco transgênicas ou parte das mesmas, material de tabaco curado ou produtos de tabaco compreendendo esses construtos de DNA recombinante. Em um aspecto, essas plantas transgênicas, material de tabaco curado ou produtos de tabaco compreendem um nível elevado de nicotina em comparação com uma planta de controle de tabaco sem o construto de DNA recombinante. São ainda fornecidos métodos para elevar o nível de nicotina de uma planta de tabaco, o método compreendendo transformar uma planta de tabaco com qualquer um desses construtos de DNA recombinante.

[0122] Em um aspecto, para cada linhagem transgênica ou mutante que transporta um transgene ou mutação relacionada ao Nic1b_ERF, também é fornecida uma combinação dessa linhagem transgênica ou mutante com um evento de mutação ou transgene direcionado a um ou mais genes ERF do locus Nic2. Tais um ou mais genes Nic2 ERF incluem, mas não estão limitados a ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e

ERF168 (Shoji et al., Plant Cell, (10): 3390-409 (2010)). De interesse particular e fornecida aqui é uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou sete ou mais genes semelhantes a Nic1b ERF (por exemplo,NCG1, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16, NCG17, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130) e um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, quatro ou cinco ou mais genes de Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e ERF168). De interesse particular adicional e fornecida aqui é uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (por exemplo,NCG12, NCG15, NCG16, NCG17, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130) e supressão transgênica ou mutagênica de ERF189, ERF115, ou ambos.

Além disso, é fornecida aqui uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (por exemplo,NCG12, NCG15, NCG16, NCG17, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130) com supressão transgênica ou mutagênica de ERF189. Em outro aspecto, é fornecida aqui uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (por exemplo, NCG12, NCG15, NCG16, NCG17, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130) com supressão transgênica ou mutagênica de ERF115. De interesse particular e fornecida aqui é uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais genes semelhantes a Nic1b ERF (NCG1, NCG12,

NCG15, NCG16, NCG17) e um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). De interesse particular adicional e fornecida aqui é uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (NCG12, NCG15, NCG16, NCG17) e supressão transgênica ou mutagênica de ERF189, ERF115, ou ambos. É ainda fornecida aqui uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (NCG12, NCG15, NCG16, NCG17) com supressão transgênica ou mutagênica de ERF189. Em outro aspecto, é fornecida aqui uma planta com uma combinação de supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todos os quatro genes semelhantes a Nic1b ERF (NCG12, NCG15, NCG16, NCG17) com supressão transgênica ou mutagênica de ERF115.

[0123] Em um aspecto adicional, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de NCG12 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e ERF168). Em outro aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de NCG15 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 e ERF168). Em outro aspecto adicional, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de NCG16 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). Em outro aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de NCG17 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). Em outro aspecto adicional, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de ERF101 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). Em outro aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de ERF110 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). Em outro aspecto adicional, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de ERF16 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168). Em outro aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de ERF130 e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic2 ERF (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168).

[0124] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes

Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0125] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0126] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0127] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0128] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0129] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de seis ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de seis ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0130] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0131] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de menos que genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0132] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0133] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0134] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com supressão transgênica ou mutagênica de menos que seis genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que seis genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0135] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0136] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0137] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0138] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0139] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0140] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de seis ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de seis ou mais genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF.

[0141] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0142] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0143] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0144] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0145] Em um aspecto, é fornecida uma planta de tabaco com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que seis genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem a superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que seis genes Nic1b_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis ou menos que sete genes Nic2_ERF.

[0146] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, qualquer uma das plantas anteriores compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle que não possui essa supressão transgênica ou mutagênica de Nic2_ERF ou Nic1b_ERF sob condições comparáveis.

[0147] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic2_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic2_ERF e supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, qualquer uma das plantas anteriores compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle que não possui supressão transgênica ou mutagênica de Nic2_ERF ou Nic1b_ERF sob condições comparáveis.

[0148] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle que não possui essa superexpressão transgênica ou mutagênica Nic2_ERF ou Nic1b_ERF sob condições comparáveis.

[0149] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de menos que dois, menos que três, menos que quatro, menos que cinco, menos que seis genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de quatro ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de cinco ou mais genes Nic2_ERF e superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF. Em um aspecto, essa planta compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle que não possui superexpressão transgênica ou mutagênica Nic2_ERF ou Nic1b_ERF sob condições comparáveis.

[0150] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2 _ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90 %, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%

idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0151] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90 %, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0152] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0153] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de um ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0154] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0155] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de dois ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0156] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0157] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de três ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0158] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0159] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que dois genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0160] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0161] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que três genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0162] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0163] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que quatro genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0164] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0165] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com supressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com supressão transgênica ou mutagênica de menos que cinco genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa supressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0166] Em um aspecto, a supressão mutagênica de um gene Nic2_ERF não contém uma deleção de todo o gene Nic2_ERF ou de toda a região de codificação de Nic2_ERF. Em um aspecto, a supressão mutagênica de um gene Nic2_ERF contém uma deleção de todo o gene Nic2_ERF ou de toda a região de codificação Nic2_ERF. Em um aspecto, a supressão mutagênica de um gene Nic1b_ERF não contém uma deleção de todo o gene Nic1b_ERF ou de toda a região de codificação Nic1b_ERF. Em um aspecto, a supressão mutagênica de um gene Nic1b_ERF contém uma deleção de todo o gene Nic1b_ERF ou de toda a região de codificação Nic1b_ERF.

[0167] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2 _ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90 %, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, 87 a 89, 180, 181, 206 e 207. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0168] Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2 _ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em 208, 212, 215 e 219 e com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, e 54. Em um aspecto, uma planta de tabaco é fornecida com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou dois genes Nic2_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em 222 e 226 e ainda com superexpressão transgênica ou mutagênica de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes Nic1b_ERF que codificam um polipeptídeo compreendendo uma sequência pelo menos 90 %, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 73, 83, 84, e 87 a 89. Em um aspecto, uma planta descrita nesse parágrafo compreende um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total em comparação com uma planta de controle sem essa superexpressão transgênica ou mutagênica em condições comparáveis.

[0169] Em um aspecto, um nível mais baixo de nicotina ou alcaloide total refere-se a pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% reduzido em comparação para uma planta de controle em condições comparáveis.

[0170] Em um aspecto, um nível mais alto de nicotina ou alcaloide total refere-se a pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700% ou 800% aumentaram em comparação com uma planta de controle em condições comparáveis.

[0171] Em um aspecto, construtos de DNA recombinante ou cassetes de expressão também podem compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transgênicas. Genes marcadores selecionáveis incluem, entre outros, genes que codificam resistência a antibióticos, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos como a β- galactosidase e proteínas fluorescentes como a proteína verde fluorescente (GFP).

[0172] Em um aspecto, construtos de DNA recombinante ou cassetes de expressão compreendem um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor preferido para o tecido (por exemplo, um promotor específico de folha ou raiz). Promotores constitutivos exemplificativos incluem o promotor principal do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados na Pat. U.S. 6.072.050; o principal promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J 3:2723-2730); ALS promoter (U.S.

Pat. No. 5,659,026), e semelhantes. Promotores indutíveis por produtos químicos exemplificativos incluem o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores de interesse induzíveis a produtos químicos incluem promotores responsivos a esteroides (ver, por exemplo, o promotor induzido por glicocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores indutíveis à tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e Pat. U.S. 5.814.618 e 5.789.156). Promotores exemplificativos adicionais que podem ser usados são os responsáveis pela expressão de gene regulada pelo calor, expressão de gene regulada pela luz (por exemplo, a ervilha rbcS-3A; o promotor rbcS do milho; o gene da proteína de ligação à clorofila alb encontrado na ervilha; ou o promotor Arabssu), expressão de gene regulada por hormônio (por exemplo, sequências responsivas ao ácido abscísico (ABA) do gene Em do trigo; HVA1 e HVA22 induzíveis por ABA e promotores rd29A de cevada e Arabidopsis; e expressão de gene induzida por ferida (por exemplo, de wunl), expressão de gene específica de órgão (por exemplo, do gene da proteína de armazenamento específica do tubérculo; o gene zeína de 23 kDa do milho descrito por; ou o feijão Francês (gene da ß-phaseolina) ou o agente patogênico promotores induzíveis (por exemplo, os promotores PR-1, prp-1, ou (promotores de ß-1,3, o promotor wirla induzível por fungos de trigo, e os promotores induzíveis por nemátodos, TobRB7- 5A e Hmg-1, de salsa árida do tabaco, respectivamente).

[0173] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida compreende ainda expressão aumentada ou reduzida da atividade de genes envolvidos na biossíntese ou transporte de nicotina. Os genes envolvidos na biossíntese de nicotina incluem, mas não estão limitados a, arginina descarboxilase (ADC), metilputrescina oxidase (MPO), NADH desidrogenase, ornitina descarboxilase (ODC), fosforibossilantranilato isomerase (PRAI), putrescina N-metiltransferase (PMT); quinolato fosfororibosil transferase (QPT) e S-adenosil- metionina sintetase (SAMS). A nicotina sintase, que catalisa a etapa de condensação entre um derivado do ácido nicotínico e o cátion metilpirrolínio, não foi elucidada, embora dois genes candidatos (A622 e NBB1) tenham sido propostos. Veja US 2007/0240728 A1 e US 2008/0120737A1. A622 codifica uma proteína do tipo isoflavona redutase. Além disso, vários transportadores podem estar envolvidos na translocação da nicotina. Um gene transportador, chamado MATE, foi clonado e caracterizado (Morita et al., PNAS 106:2447-52 (2009)).

[0174] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida compreende ainda um nível aumentado ou reduzido de mRNA, proteína ou ambos de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 e NBB1, em comparação com uma planta de controle de tabaco. Em outro aspecto, as plantas de tabaco fornecidas compreendem ainda um transgene que suprime diretamente a expressão de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622, e NBB1. Em outro aspecto, uma planta de tabaco fornecida compreende ainda um transgene ou mutação que suprime a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, ADC,

ODC, PRAC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 e NBB1. Em outro aspecto, uma planta de tabaco fornecida compreende ainda um transgene que superexpressa um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 e NBB1.

[0175] Também são divulgadas a transformação de plantas de tabaco com construtos recombinantes ou cassetes de expressão descritos usando quaisquer métodos de transformação adequados conhecidos na técnica. Os métodos para a introdução de sequências polinucleotídicas em plantas de tabaco são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transitória e métodos mediados por vírus. "Transformação estável" refere-se à transformação em que a o construto nucleotídico de interesse introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma. “Transformação transitória” pretende significar que uma sequência é introduzida na planta e é expressa apenas temporalmente ou está presente apenas temporariamente na planta.

[0176] Métodos adequados de introdução de polinucleotídeos nas células vegetais da presente divulgação incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Shillito et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:313-336; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium(Pat. U.S. 5.104.310, 5.149.645, 5.177.010,

5.231.019, 5.463.174, 5.464.763, 5.469.976, 4.762.785,

5.004.863, 5.159.135, 5.563.055 e 5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-

2722) e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, Pat. U.S. 4.945.050, 5.141.131, 5.886.244,

5.879.918 e 5.932.782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Veja também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação).

[0177] Em um outro aspecto, construtos recombinantes ou cassetes de expressão podem ser introduzidos nas plantas contatando as plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, esses métodos envolvem incorporar um cassete de expressão da presente divulgação em uma molécula viral de DNA ou RNA. Reconhece-se que os promotores para utilização em cassetes de expressão também abrangem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína nela codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais, são conhecidos na técnica. Por exemplo, ver Pat. U.S. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,

5.589.367, 5.316.931 e Porta et al. (1996) Molecular

Biotechnology 5:209-221.

[0178] Qualquer tecido vegetal que possa ser posteriormente propagado usando métodos clonais, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um construto recombinante ou um cassete de expressão. Por "organogênese", pretende-se o processo pelo qual brotos e raízes são desenvolvidos sequencialmente a partir de centros meristemáticos. Por "embriogênese", pretende-se o processo pelo qual brotos e raízes se desenvolvem juntos de maneira concertada (não sequencialmente), seja a partir de células somáticas ou gametas. Os tecidos exemplificativos que são adequados para vários protocolos de transformação descritos incluem, entre outros, tecido caloso, tecido meristemático existente (por exemplo, meristemas apicais, gemas axilares e meristemas radiculares) e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema cotilédone e meristema hipocótilo), hipocótilos, cotilédones, discos de folhas, pólen, embriões e semelhantes.

[0179] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida é de um tipo de tabaco selecionado do grupo que consiste em tabaco de conduto, tabaco com cura a ar, tabaco com cura a ar escuro, tabaco com cura a fogo, tabaco Galpao e tabaco Oriental. Em outro aspecto, uma planta de tabaco fornecida é de um tipo de tabaco selecionado do grupo que consiste em tabaco Burley, tabaco de Maryland e tabaco escuro.

[0180] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida está em um fundo de tabaco com cura por conduto ou exibe uma ou mais características de tabaco curado por conduto descritas aqui. Os tabacos com cura por conduto (também chamados Virgínia ou tabacos claros) representam aproximadamente 40%

da produção mundial de tabaco.

Os tabacos com cura por conduto também são chamados de "tabaco brilhante" devido à cor amarelo-dourada a laranja-escura que atingem durante a cura.

Os tabacos com cura por conduto têm um aroma e sabor leves e brilhantes.

Os tabacos de conduto são geralmente ricos em açúcar e baixos em óleos.

Os principais países produtores de tabaco com cura por conduto são Argentina, Brasil, China, Índia, Tanzânia e EUA.

Em um aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo de tabaco com conduto controlada selecionado do grupo que consiste em CC 13, CC 27, CC 33, CC 37, CC 65, CC 67, CC 700, GF 318, GL 338, GL 368, GL 939, K 346, K 399, K326, NC 102, NC 196, NC 291, NC 297, NC 299, NC 471, NC 55, NC 606, NC 71, NC 72, NC 92, PVH 1118, PVH 1452, PVH 2110, SPEIGHT 168, SPEIGHT 220, SPEIGHT 225, SPEIGHT 227, SPEIGHT 236 e qualquer variedade derivada essencialmente de qualquer uma das variedades anteriores.

Em outro aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo de tabaco com cura por conduto selecionado do grupo que consiste em Coker 48, Coker 176, Coker 371-Gold, Coker 319, Coker 347, GL 939, K 149, K326, K 340, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, NC 27NF, NC 37NF, NC 55, NC 60, NC 71, NC 72, NC 82, NC 95, NC 297, NC 606, NC 729, NC 2326, McNair 373, McNair 944, Ox 207, Ox 414 NF, Reams 126, Reams 713, Reams 744, RG 8, RG 11, RG 13, RG 17, RG 22, RG 81, RG H4, RG H51, Speight H-20, Speight G-28, Speight G-58, Speight G-70, Speight G-108, Speight G-l11, Speight G-l17, Speight 168, Speight 179, Speight NF- 3, Va 116, Va 182 e qualquer variedade essencialmente derivada de qualquer uma das variedades anteriores. Ver WO 2004/041006 A1. Em um aspecto adicional, plantas, sementes, híbridos, variedades ou linhagens de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa estão em qualquer fundo curado por conduto selecionado do grupo que consiste em K326, K346 e NC196.

[0181] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida está em um fundo de tabaco curado por ar ou exibe uma ou mais características de tabaco curado por ar descritas aqui. Os tabacos curados por ar incluem Burley, Maryland e tabacos escuros. O fator comum é que a cura é principalmente sem fontes artificiais de calor e umidade. Os tabacos Burley são de cor marrom claro a escuro, ricos em óleo e com pouco açúcar. Os tabacos Burley são curados por ar nos celeiros. Os principais países produtores de Burley são Argentina, Brasil, Itália, Malawi e EUA. Os tabacos de Maryland são extremamente macios, têm boas propriedades de queima, nicotina baixa e aroma neutro. Os principais países produtores de Maryland incluem os EUA e a Itália. Em um aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo de tabaco Burley selecionado do grupo que consiste em Argila 402, Argila 403, Argila 502, Ky 14, Ky 907, Ky 910, Ky 8959, NC 2, NC 3, NC 4, NC 5, NC 2000, Tn 86, Tn 90, Tn 97, R 610, R 630, R 711, R 712, NCBH 129, Bu 21×Ky 10, HB04P, Ky 14×L 8, Kt 200, Newton 98, Pedigo 561, Pf561 e Va 509. Em um aspecto adicional, plantas, sementes, híbridos, variedades ou linhagens de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa estão em qualquer fundo Burley selecionado do grupo que consiste em TN 90, KT 209, KT 206, KT212 e HB 4488. Em outro aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo de tabaco Maryland selecionado do grupo que consiste em Md 10, Md 40, Md 201, Md 609, Md 872 e Md 341.

[0182] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida está em um fundo de tabaco escuro curado por ar ou exibe uma ou mais características de tabaco escuro curado por ar descritas aqui. Os tabacosescuros curados por ar são diferenciados de outros tipos principalmente pelo processo de cura, que confere ao tabaco escuro curado por ar sua cor marrom médio a marrom-escuro e aroma distinto. Tabacos escuros curados por ar são usados principalmente na produção de tabaco de mascar e rapé. Em um aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo escuro de tabaco curado por ar selecionado do grupo que consiste em Sumatra, Jatim, Dominican Cubano, Besuki, One sucker, Green River, Virginia sun-cured, e Paraguan Passado.

[0183] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida está em um fundo de tabaco escuro curado por fogo ou exibe uma ou mais características de tabaco escuro curado por fogo descritas aqui. Tabacos escuros curados por fogo são geralmente curados por fogo de madeira de baixa queima nos pisos de celeiros de cura fechados. Suas folhas têm baixo teor de açúcar, mas alto teor de nicotina. Tabacos escuros curados por fogo são usados para fazer misturas de cachimbos, cigarros, tabaco de mascar, rapé e charutos de gosto forte. As principais regiões de cultivo de tabacos escuros curados por fogo são Tennessee, Kentucky e Virginia, EUA. Em um aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo escuro de tabaco curado pelo fogo selecionado do grupo que consiste em Narrow Leaf Madole, Improved Madole, Tom Rosson Madole, Newton's VH Madole, Little Crittenden, Green Wood, Little Wood, Small Stalk Black Mammoth, DT 508, DT 518, DT 592, KY 171, DF 911, DF 485, TN D94, TN D950, VA 309, e VA 359.

[0184] Em um aspecto, uma planta de tabaco fornecida está em um fundo de tabaco Oriental ou exibe uma ou mais características de tabaco Oriental aqui descritas. Os tabacos Orientais também são chamados de tabacos Gregos, de aroma e Turcos, devido ao fato de serem tipicamente cultivados em regiões do leste do Mediterrâneo, como Turquia, Grécia, Bulgária, Macedônia, Síria, Líbano, Itália e Romênia. O tamanho pequeno da planta e da folha, característico das variedades orientais atuais, bem como suas propriedades aromáticas únicas, são o resultado da adaptação da planta ao solo pobre e às condições climáticas estressantes nas quais ela se desenvolveu ao longo dos séculos passados. Em um aspecto, uma planta ou semente de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa é fornecida em um fundo de tabaco oriental selecionado do grupo que consiste em Izmir, Katerini, Samsun, Basma and Krumovgrad, Trabzon, Thesalian, Tasova, Sinop, Izmit, Hendek, Edirne, Semdinli, Adiyanman, Yayladag, Iskenderun, Duzce, Macedonian, Mavra, Prilep, Bafra, Bursa, Bucak, Bitlis, Balikesir, e qualquer variedade essencialmente derivada de qualquer uma das variedades anteriores.

[0185] Em um aspecto, plantas, sementes, híbridos, variedades ou linhagens de tabaco descritas aqui (que podem ser de alcaloide baixo, nicotina baixa, alcaloide alto ou nicotina alta ) são essencialmente derivadas ou no contexto genético da BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, `Perique` tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, or VA359, Maryland 609, HB3307PLC, HB4488PLC, KT206LC, KT209LC, KT210LC, KT212LC, R610LC, PVH2310, NC196, KTD14LC, KTD6LC, KTD8LC, PD7302LC, PD7305LC, PD7309LC, PD7318LC, PD7319LC, PD7312LC, ShireyLC ou qualquer variedade comercial de tabaco, de acordo com as técnicas convencionais de reprodução de tabaco conhecidas na técnica.

[0186] Todas as variedades específicas mencionadas acima, do tipo escuro curado por ar, Burley, Maryland, escuro curado por fogo ou Oriental são listadas apenas para fins exemplificativos. Também são contempladas no presente pedido quaisquer outras variedades Orientais escuras curadas por fogo, Burley, Maryland, escuras curadas por ar.

[0187] Também são fornecidas populações de plantas de tabaco descritas. Em um aspecto, uma população de plantas de tabaco tem uma densidade de plantio entre cerca de 5.000 e cerca de 8.000, entre cerca de 5.000 e cerca de 7.600, entre cerca de 5.000 e cerca de 7.200, entre cerca de 5.000 e cerca de 6.800, entre cerca de 5.000 e cerca de 6.400, entre cerca de 5.000 e cerca de 6.000, entre cerca de 5.000 e 5.600, entre cerca de 5.000 e cerca de 5.200, entre cerca de 5.200 e cerca de 8.000, entre cerca de 5.600 e cerca de 8.000, entre cerca de 6.000 e cerca de 8.000, entre cerca de 6.400 e cerca de 8.000, entre cerca de 6.800 e cerca de 8.000, entre 7.200 e 8.000, ou entre 7.600 e 8.000 plantas por acre. Em outro aspecto, uma população de plantas de tabaco está em um tipo de solo com baixa a média fertilidade.

[0188] Também são fornecidos recipientes de sementes de plantas de tabaco descritas. Um recipiente de sementes de tabaco da presente divulgação pode conter qualquer número, peso ou volume de sementes. Por exemplo, um recipiente pode conter pelo menos ou mais que cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 ou mais sementes. Alternativamente, o recipiente pode conter pelo menos ou mais do que cerca de 1 onça, 5 onças, 10 onças, 1 libra, 2 libras, 3 libras, 4 libras, 5 libras ou mais sementes. Recipientes de sementes de tabaco podem ser qualquer recipiente disponível na técnica. A título de exemplo não limitativo, um recipiente pode ser uma caixa, uma bolsa, um pacote, uma bolsa, um rolo de fita, um tubo ou uma garrafa.

[0189] Também é fornecido material de tabaco curado feito a partir de uma planta de tabaco com alcaloide baixo ou nicotina baixa. Além disso, é fornecido material de tabaco curado feito de uma planta de tabaco descrita com níveis mais altos de alcaloide total ou nicotina.

[0190] “Cura” é o processo de envelhecimento que reduz a umidade e provoca a destruição da clorofila, deixando as folhas de tabaco douradas e pelo qual o amido é convertido em açúcar. O tabaco curado tem, portanto, um maior teor de açúcares redutores e um teor menor de amido em comparação com as folhas verdes colhidas. Em um aspecto, o tabaco em folha verde fornecido pode ser curado usando meios convencionais, por exemplo, cura por conduto, cura por celeiro, cura por fogo, cura por ar ou cura ao sol. Veja, por exemplo, Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford) para uma descrição de diferentes tipos de métodos de cura. O tabaco curado geralmente é envelhecido em um tambor de madeira (por exemplo, uma cabeça de porco) ou em caixas de papelão em condições compactadas por vários anos (por exemplo, dois a cinco anos), com um teor de umidade que varia de 10% a cerca de 25%. Veja Patente U.S. 4.516.590 e 5.372.149. O tabaco curado e envelhecido pode ser processado posteriormente. Processamento adicional inclui o condicionamento do tabaco sob vácuo com ou sem a introdução de vapor a várias temperaturas, pasteurização e fermentação. A fermentação é tipicamente caracterizada por alto teor de umidade inicial, geração de calor e uma perda de 10 a 20% de peso seco. Ver, por exemplo, Patentes U.S. 4.528.993,

4.660.577, 4.848.373, 5.372.149; Publicação U.S. 2005/0178398; e Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford). O tabaco curado, envelhecido e fermentado pode ser processado posteriormente (por exemplo, cortado, picado, expandido ou misturado). Veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.528.993; 4.660.577; e 4.987.907. Em um aspecto, o material de tabaco curado da presente divulgação é curado ao sol. Em outro aspecto, o material de tabaco curado da presente divulgação é curado por conduto, curado por ar ou curado po fogo.

[0191] O material de tabaco obtido a partir das linhagens, variedades ou híbridos de tabaco da presente divulgação pode ser usado para fabricar produtos de tabaco. Como usado neste documento, "produto do tabaco" é definido como qualquer produto fabricado ou derivado do tabaco destinado ao uso ou consumo humano.

[0192] Os produtos de tabaco fornecidos incluem, sem limitação, produtos de cigarro (por exemplo, cigarros e cigarros de substituição), produtos de cigarro (por exemplo, tabaco para embalagem de cigarros e cigarrilhas), produtos de tabaco para cachimbo, produtos derivados de tabaco, produtos de nicotina derivada de tabaco, produtos de tabaco sem fumaça (por exemplo, rapé úmido, rapé seco e tabaco para mascar), filmes, mastigáveis, presilhas, peças moldadas, géis, unidades consumíveis, matrizes insolúveis, formas ocas, tabaco reconstituído, tabaco expandido e semelhantes. Veja, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. US 2006/0191548.

[0193] Como usado neste documento, "cigarro" refere-se a um produto de tabaco com uma "haste" e "enchimento". A “haste” do cigarro inclui o papel do cigarro, o filtro, o invólucro (usado para conter materiais de filtração), o papel de ponta que prende o papel do cigarro (incluindo o enchimento) ao filtro e todas as colas que mantêm esses componentes juntos. O "enchimento" inclui (1) todos os tabacos, incluindo, sem limitação, tabaco reconstituído e expandido, (2) substitutos que não sejam de tabaco (incluindo, entre outros, ervas, materiais vegetais que não sejam de tabaco e outras especiarias que possam acompanhar os tabacos enrolados no papel do cigarro), (3) revestimentos, (4) aromas e (5) todos os outros aditivos (que são misturados em tabacos e substitutos e enrolados no cigarro).

[0194] Como usado neste documento, " tabaco reconstituído" refere-se a uma parte do enchimento de tabaco feita a partir de pó de tabaco e outro material de sucata de tabaco, processada em forma de folha e cortada em tiras para se parecer com tabaco. Além da economia de custos, o tabaco reconstituído é muito importante por sua contribuição para o sabor do cigarro no processamento do desenvolvimento do sabor usando reações entre amônia e açúcares.

[0195] Como usado neste documento, " tabaco expandido" refere-se a uma parte do material de enchimento de tabaco que é processada através da expansão de gases adequados, de modo que o tabaco seja "inchado", resultando em densidade reduzida e maior capacidade de enchimento. Isso reduz o peso do tabaco usado nos cigarros.

[0196] Os produtos de tabaco derivados de plantas da presente divulgação também incluem cigarros e outros artigos para fumar, particularmente aqueles artigos para fumar incluindo elementos de filtro, em que a haste de material para fumar inclui tabaco curado dentro de uma mistura de tabaco. Em um aspecto, um produto de tabaco da presente divulgação é selecionado do grupo que consiste em uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco para cachimbo de água, tabaco picado e tabaco cortado. Em outro aspecto, um produto de tabaco da presente divulgação é um produto de tabaco sem fumaça. Os produtos de tabaco sem fumaça não são queimados e incluem, mas não se limitam a, mascar tabaco, tabaco úmido sem fumaça, snus e rapé seco. O tabaco para mascar é uma folha de tabaco grosseiramente dividida que normalmente é acondicionada em uma embalagem grande tipo bolsa e usada em um rolo de fumo ou torção. O tabaco úmido e sem fumaça é um tabaco úmido, mais finamente dividido, fornecido na forma solta ou em bolsa e normalmente é acondicionado em latas redondas e usado como uma pitada ou em uma bolsa colocada entre a bochecha e a gengiva de um consumidor adulto de tabaco. Snus é um tabaco sem fumaça tratado termicamente. O rapé seco é um tabaco finamente moído que é colocado na boca ou usado por via nasal. Em um aspecto adicional, um produto de tabaco da presente divulgação é selecionado do grupo que consiste em tabaco para mascar de folha solta, tabaco para mascar de fumo de rolo, rapé úmido e rapé nasal. Em ainda outro aspecto, um produto de tabaco da presente divulgação é selecionado do grupo que consiste em um cigarro aquecido eletronicamente, um cigarro eletrônico, um dispositivo de vapor eletrônico.

[0197] Em um aspecto, um produto de tabaco da presente divulgação pode ser um produto de tabaco misturado. Em outro aspecto, um produto de tabaco da presente divulgação pode ser um produto de tabaco com nicotina baixa. Em um aspecto adicional, um produto de tabaco da presente divulgação pode compreender nornicotina a um nível menor que cerca de 3 mg/g. Por exemplo, o teor de nornicotina nesse produto pode ser de 3,0 mg/g, 2,5 mg/g, 2,0 mg/g, 1,5 mg/g, 1,0 mg/g, 750 µg/g, 500 pg/g, 250 pg/g, 100 pg/g, 75 pg/g, 50 pg/g, 25 pg/g, 10 pg/g, 7,0 pg/g, 5,0 pg/g, 4,0 pg/g, 2,0 pg/g, 1,0 pg/g, 0,5 pg/g, 0,4 pg/g, 0,2 pg/g, 0,1 pg/g, 0,05 pg/g, 0,01 pg/g ou indetectável.

[0198] Em um aspecto, material de tabaco curado ou produtos de tabaco fornecidos compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,75%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% e 9% com base no peso seco. Em outro aspecto, material de tabaco curado ou produtos de tabaco fornecidos compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01% e 0,02%, entre 0,02% e 0,05%, entre 0,05% e 0,75%, entre 0,75% e 0,1%, entre 0,1% e 0,15%, entre 0,15% e 0,2%, entre 0,2% e 0,3%, entre 0,3% e 0,35%, entre 0,35% e 0,4%, entre 0,4% e 0,5%, entre 0,5% e 0,6%, entre 0,6% e 0,7%, entre 0,7% e 0,8%, entre 0,8% e 0,9%, entre 0,9% e 1%, entre 1% e 1,1%, entre 1,1% e 1,2%, entre 1,2% e 1,3%, entre 1,3% e 1,4%, entre 1,4% e 1,5%, entre 1,5% e 1,6%, entre 1,6% e 1,7%, entre 1,7% e 1,8%, entre 1,8% e 1,9%, entre 1,9% e 2%, entre 2 % e 2,1%, entre 2,1% e 2,2%, entre 2,2% e 2,3%, entre 2,3% e 2,4%, entre 2,4% e 2,5%, entre 2,5% e 2,6%, entre 2,6% e

2,7%, entre 2,7% e 2,8%, entre 2,8% e 2,9%, entre 2,9% e 3%, entre 3% e 3,1%, entre 3,1% e 3,2%, aposta entre 3,2% e 3,3%, entre 3,3% e 3,4%, entre 3,4% e 3,5% e entre 3,5% e 3,6% com base no peso seco. Em outro aspecto, o material de tabaco curado ou produtos de tabaco fornecidos compreendem um nível de nicotina ou alcaloide médio total selecionado do grupo que consiste em cerca de 0,01% e 0,1%, entre 0,02% e 0,2%, entre 0,03% e 0,3%, entre 0,04% e 0,4%, entre 0,05% e 0,5%, entre 0,75% e 1%, entre 0,1% e 1,5%, entre 0,15% e 2%, entre 0,2% e 3% e entre 0,3% e 3,5% com base no peso seco.

[0199] A presente divulgação também fornece métodos para a produção de linhagens, cultivares ou variedades de tabaco que compreendem um nível desejável de alcaloide total ou nicotina, por exemplo, baixo teor de nicotina ou sem nicotina. A produção de animais pode ser realizada através de qualquer procedimento conhecido. Impressões digitais de DNA, mapeamento de SNP, mapeamento de haplótipos ou tecnologias semelhantes podem ser usadas em um programa de produção de seleção assistida por marcadores (MAS) para transferir ou reproduzir um traço ou alelo desejável em uma planta de tabaco. Por exemplo, um produtor pode criar populações segregantes em uma geração F2 ou retrocruzada usando plantas híbridas F1 ou cruzando adicionalmente as plantas híbridas F1 com outras plantas doadoras com um genótipo agronomicamente desejável. As plantas das gerações F2 ou de retrocruzamento podem ser rastreadas quanto a um traço agronômico desejada ou um perfil químico desejável utilizando uma das técnicas conhecidas na técnica ou listadas aqui. Dependendo do padrão de herança esperado ou da tecnologia MAS usada, a autopolinização de plantas selecionadas antes de cada ciclo de retrocruzamento para ajudar na identificação das plantas individuais desejadas pode ser realizada. O retrocruzamento ou outro procedimento de produção pode ser repetido até que o fenótipo desejado do progenitor recorrente seja recuperado. Um progenitor recorrente na presente divulgação pode ser uma variedade curada por combustão, uma variedade Burley, uma variedade escura curada por ar, uma variedade curada por fogo escura ou uma variedade Oriental. Outras técnicas de produção podem ser encontradas, por exemplo, em Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y., aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0200] Os resultados de um programa de produção de plantas usando as plantas de tabaco descritas incluem linhagens, cultivares, variedades, progênies, raças e híbridos úteis da presente divulgação. Como usado neste documento, o termo "variedade" refere-se a uma população de plantas que compartilham características constantes que as separam de outras plantas da mesma espécie. Uma variedade é frequentemente, embora nem sempre, vendida comercialmente. Embora possua um ou mais traços distintivos, uma variedade é ainda caracterizada por uma variação geral muito pequena entre indivíduos dentro dessa variedade. Uma variedade de "linha pura" pode ser criada por várias gerações de autopolinização e seleção ou propagação vegetativa de um único progenitor usando técnicas de cultura de tecidos ou células. Uma variedade pode ser essencialmente derivada de outra linhagem ou variedade. Conforme definido pela

Convenção Internacional para a Proteção de Novas Variedades de Plantas (2 de dezembro 2 de 1961, revisada em Genebra em 10 de novembro de 1972; em 23 de outubro de 1978; e em 19 de março de 1991), uma variedade é "essencialmente derivada" de uma variedade inicial se: a) for predominantemente derivada da variedade inicial ou de uma variedade predominantemente derivada da variedade inicial, mantendo a expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial; b) é claramente distinguível da variedade inicial; e c) exceto pelas diferenças que resultam do ato de derivação, está de acordo com a variedade inicial na expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial. Variedades essencialmente derivadas podem ser obtidas, por exemplo, pela seleção de um mutante natural ou induzido, uma variante somaclonal, um indivíduo variante de plantas da variedade inicial, retrocruzamento ou transformação. Uma primeira variedade de tabaco e uma segunda variedade de tabaco, da qual a primeira variedade é essencialmente derivada, são consideradas como tendo fundos genéticos essencialmente idênticos. Uma “linhagem” distinta de uma variedade geralmente indica um grupo de plantas usadas não comercialmente, por exemplo, em pesquisas de plantas. Uma linhagem normalmente exibe pouca variação geral entre indivíduos para uma ou mais traços de interesse, embora possa haver alguma variação entre indivíduos para outros traços.

[0201] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método de introgressão de um traço de baixa nicotina em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: (a) cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie; (b) genotipar uma ou mais plantas de tabaco de progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, onde o marcador polimórfico está em um intervalo cromossômico flanqueado por dois marcadores de SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201; e (c) selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de baixa nicotina.

Em outro aspecto, esses métodos compreendem ainda o retrocesso da planta de tabaco de progênie selecionada com a segunda variedade de tabaco.

Em um aspecto adicional, esses métodos compreendem ainda: (d) cruzar a planta de progênie selecionada consigo ou com a segunda variedade de tabaco para produzir uma ou mais plantas de tabaco de progênie adicionais; e (e) selecionar uma planta de tabaco progênie adicional compreendendo o traço de nicotina baixa.

Em um aspecto, a etapa (e) de selecionar compreende a seleção assistida por marcador.

Em um aspecto, esses métodos produzem uma única conversão genética compreendendo um traço de nicotina baixa.

Em um aspecto, esses métodos produzem uma única conversão genética compreendendo uma introgressão Nic1b_ERF.

Em um aspecto, a segunda variedade de tabaco é uma variedade de elite.

Em outro aspecto, a etapa de genotipagem desses métodos envolve um ou mais ensaios de marcadores moleculares.

Em outro aspecto, o marcador polimórfico usado neste método compreende um polimorfismo selecionado do grupo que consiste em polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções na sequência de DNA (Indels), repetições simples de sequência de sequência de DNA (SSRs), um comprimento de fragmento de restrição polimorfismo (RFLP) e uma etiqueta SNP. Em outro aspecto, a planta de tabaco de progênie selecionada compreende uma introgressão cromossômica mais curta no locus Nic1b_ERF em comparação com LA Burley 21.

[0202] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um método de introgressão de um traço de nicotina baixa em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: (a) cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie; (b) genotipar uma ou mais plantas de tabaco de progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, onde o marcador polimórfico está a 20 cM, 10 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,5 cM ou menos que 0,5 cM de qualquer um dos marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou qualquer locus com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186; e (c) selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de nicotina baixa. Em um aspecto, este método compreende a seleção simultânea ou concomitante de um ou mais marcadores moleculares associados ou intimamente ligados ao locus Nic1b_ERF, bem como de um ou mais marcadores moleculares associados ou intimamente ligados ao locus Nic2.

[0203] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa, o método compreendendo: (a) isolar ácidos nucleicos de uma coleção de germoplasma de tabaco; (b) ensaiar os ácidos nucleicos para um ou mais marcadores intimamente ligados ao locus Nic1b_ERF ; e (c) selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa, com base no ensaio do marcador. Em um aspecto, os um ou mais marcadores testados intimamente ligados ao locus Nic1b_ERF estão dentro de cerca de 20 cM, 10 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,5 cM ou menos que 0,5 cM de qualquer um de marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou qualquer locus com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54, 153, 154, 158, 159 e 202 a 205. Em outro aspecto, este método compreende ainda a análise de um ou mais marcadores intimamente ligados ao locus Nic2. Em um aspecto, os um ou mais marcadores testados intimamente ligados ao locus Nic2 estão dentro de cerca de 20 cM, 10 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,5 cM ou menos que 0,5 cM de qualquer um de loci polimórficos localizados em um dos ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168. Em um aspecto, este método compreende ainda determinar o nível de nicotina da planta selecionada para confirmar o traço de nicotina baixa.

[0204] Também é divulgado aqui um método de introgressão de um traço de baixa nicotina em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: (a) cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie; (b) genotipar uma ou mais plantas de tabaco de progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, em que o marcador polimórfico está em um intervalo cromossômico flanqueado por dois marcadores de SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. Nos. 125 a 145 e 193 a 201; e (c) selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo traço de nicotina baixa. Em um aspecto, esses métodos produzem uma única conversão genética compreendendo um traço de nicotina baixa. Em um aspecto, esses métodos produzem uma única conversão genética compreendendo uma introgressão Nic2. Em um aspecto, a segunda variedade de tabaco é uma variedade de elite. Em outro aspecto, a etapa de genotipagem desses métodos envolve um ou mais ensaios de marcadores moleculares. Em outro aspecto, o marcador polimórfico usado neste método compreende um polimorfismo selecionado do grupo que consiste em polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções na sequência de DNA (Indels), repetições simples de sequência de sequência de DNA (SSRs), um comprimento de fragmento de restrição polimorfismo (RFLP) e uma etiqueta SNP. Em outro aspecto, a planta de tabaco de progênie selecionada compreende uma menor deleção cromossômica no locus Nic2 em comparação com LA Burley 21.

[0205] Como usado neste documento, “locus” é uma região de cromossoma onde um ácido nucleico polimórfico, determinante de traço, gene ou marcador está situado. Os loci desta divulgação compreendem um ou mais polimorfismos em uma população; por exemplo, alelos alternativos estão presentes em alguns indivíduos. Como usado neste documento, "alelo" refere-se a uma sequência alternativa de ácido nucleico em um locus particular. O comprimento de um alelo pode ser tão pequeno quanto 1 base de nucleotídeo, mas geralmente é maior. Por exemplo, um primeiro alelo pode ocorrer em um cromossomo, enquanto um segundo alelo ocorre em um segundo cromossomo homólogo, por exemplo, como ocorre para diferentes cromossomos de um indivíduo heterozigoto ou entre diferentes indivíduos homozigotos ou heterozigotos em uma população. Conforme usado neste documento, o termo "intervalo cromossômico" designa uma extensão linear contígua de DNA genômico que reside em um único cromossomo.

[0206] Como usado neste documento, um centimorgan ("cM") é uma unidade de medida da frequência de recombinação. Um cM é igual a uma chance de 1% que um marcador num locus genético será separado de um marcador num segundo locus devido ao cruzamento numa única geração. As distâncias genéticas aqui referidas podem ser calculadas a partir dos valores de recombinação usando a função Kosambi (Kosambi, The estimation of map distances from recombination values. Annals of Eugenics, 12:172–75(1944)).

[0207] Como aqui utilizado, “intimamente ligado a” ou "associado com" significa que o marcador ou locus está a cerca de 20 cM, 10 cM, 5 cM, 1 cM, 0,5 cM, ou menos que 0,5 cM de outro marcador ou locus. Por exemplo, 20 cM significa que a recombinação entre o marcador e o locus com uma frequência igual ou menor que cerca de 20%.

[0208] Como usado neste documento, "introgressão" ou "introgredir" refere-se à transmissão de um alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro.

[0209] Como usado neste documento, "cruzado" ou "cruzar" significa produzir progênie via fertilização (por exemplo, células, sementes ou plantas) e inclui cruzamentos entre plantas (sexual) e autofertilização (auto).

[0210] Como usado neste documento, "retrocruzar" e "retrocruzamento" se referem ao processo pelo qual uma planta progênie é repetidamente cruzada de volta para um de seus progenitores. Em um esquema de retrocruzamento, o progenitor "doador" refere-se à planta progenitora com o gene ou locus desejado a ser introgressado. O progenitor "receptor" (usado uma ou mais vezes) ou progenitor "recorrente" (usado duas ou mais vezes) refere-se à planta dos pais na qual o gene ou locus está sendo introgressado. O cruzamento inicial dá origem à geração F1. O termo "BC1" refere-se ao segundo uso do progenitor recorrente, "BC2" refere-se ao terceiro uso do progenitor recorrente e assim por diante. Em um aspecto, um retrocruzamento é realizado repetidamente, com um indivíduo de progênie de cada geração sucessiva de retrocruzamento sendo retrocruzado para o mesmo genótipo progenitor.

[0211] Como usado neste documento, "gene único convertido" ou "conversão de gene único" refere-se a plantas que são desenvolvidas usando uma técnica de produção de plantas conhecida como retrocruzamento ou via engenharia genética, onde essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas de uma variedade são recuperadas além do único gene transferido para a variedade pela técnica de retrocruzamento ou por engenharia genética.

[0212] Conforme usado no presente documento, “variedade de elite” significa qualquer variedade que resultou da produção genética e da seleção de desempenho agronômico superior.

[0213] Conforme usado neste documento, "selecionar" ou "seleção" no contexto de seleção ou produção assistida por marcadores refere-se ao ato de escolher ou escolher indivíduos desejados, normalmente de uma população, com base em certos critérios predeterminados.

[0214] Como usado neste documento, o termo "traço"

refere-se a um ou mais traços detectáveis de uma célula ou organismo que podem ser influenciadas pelo genótipo. O fenótipo pode ser observável a olho nu ou por qualquer outro meio de avaliação conhecido na técnica, por exemplo, microscopia, análise bioquímica, análise genômica, um teste para uma tolerância específica à doença, etc. Em alguns casos, um fenótipo é controlado diretamente por um único gene ou locus genético, por exemplo, um "traço genético único". Em outros casos, um fenótipo é o resultado de vários genes.

[0215] Como usado neste documento, "ensaio de marcador" significa um método para detectar um polimorfismo em um local específico usando um método específico, por exemplo, medição de pelo menos um fenótipo (como cor da semente, cor da flor ou outro traço visualmente detectável), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), extensão de base única, eletroforese, alinhamento de sequências, hibridação oligonucleotídica específica alélica (ASO), DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD), tecnologias baseadas em microarranjos e tecnologias de sequenciamento de ácidos nucleicos, etc.

[0216] Como usado neste documento, "seleção assistida por marcador" (MAS) é um processo pelo qual os fenótipos são selecionados com base nos genótipos de marcadores. "Produção de seleção assistida por marcador" refere-se ao processo de seleção de um traço ou traços desejados em uma planta ou plantas, detectando um ou mais ácidos nucleicos da planta, em que o ácido nucleico está ligado ao traço desejado e, em seguida, selecionando a planta ou germoplasma que possui um ou mais ácidos nucleicos.

[0217] Como usado neste documento, "polimorfismo" significa a presença de uma ou mais variações em uma população.

Um polimorfismo pode se manifestar como uma variação na sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico ou como uma variação na sequência de aminoácidos de uma proteína.

Os polimorfismos incluem a presença de uma ou mais variações de uma sequência de ácido nucleico ou característica de ácido nucleico em um ou mais loci em uma população de um ou mais indivíduos.

A variação pode compreender, mas não está limitada a, uma ou mais alterações na base de nucleotídeos, a inserção de um ou mais nucleotídeos ou a deleção de um ou mais nucleotídeos.

Um polimorfismo pode surgir de processos aleatórios na replicação de ácidos nucleicos, através da mutagênese, como resultado de elementos genômicos móveis, da variação do número de cópias e durante o processo de meiose, como cruzamento desigual, duplicação de genoma e quebras e fusões cromossômicas.

A variação pode ser comumente encontrada ou pode existir em baixa frequência dentro de uma população, a primeira tendo maior utilidade na produção genética geral de plantas e a segunda pode estar associada a variações fenotípicas raras, mas importantes.

Polimorfismos úteis podem incluir polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções na sequência de DNA (Indels), repetições de sequência simples de sequência de DNA (SSRs), um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) e uma etiqueta SNP.

Um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região não traduzida em 5' de um gene, uma região não traduzida em 3' de um gene, microRNA, siRNA,

um locus de tolerância, um satélite marcador, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional e um padrão de metilação também podem compreender polimorfismos. Além disso, a presença, ausência ou variação no número de cópias dos anteriores pode compreender polimorfismos.

[0218] Como usado neste documento, "SNP" ou "polimorfismo de nucleotídeo único" significa uma variação de sequência que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência do genoma é alterado ou variável. Os "marcadores SNP" existem quando os SNPs são mapeados para sítios no genoma.

[0219] Como usado neste documento, "marcador" ou "marcador molecular" ou "local do marcador" é um termo usado para denotar uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido que é suficientemente única para caracterizar um locus específico no genoma. Qualquer característica polimórfica detectável pode ser usada como marcador, desde que seja herdada diferencialmente e exiba desequilíbrio de ligação com um traço fenotípico de interesse. Cada marcador é, portanto, um indicador de um segmento específico de DNA, possuindo uma sequência nucleotídica única. As posições do mapa fornecem uma medida das posições relativas de marcadores específicos em relação um ao outro. Quando se afirma que um traço está ligado a um determinado marcador, será entendido que o segmento de DNA real cuja sequência afeta o traço geralmente se cossegrega com o marcador. A localização mais precisa e definitiva de um traço pode ser obtida se marcadores forem identificados nos dois lados do traço. Ao medir a aparência do(s) marcador(s) na progênie de cruzamentos, a existência do traço pode ser detectada por testes moleculares relativamente simples sem avaliar, de fato, a aparência do traço em si, o que pode ser difícil e demorado, porque a avaliação real do traço requer o cultivo de plantas até um estágio e/ou sob condições ambientais onde o traço possa ser expresso. Em um aspecto, os marcadores utilizados exibem pontuações LOD de 2 ou superior, 3 ou superior, 4 ou superior, 5 ou superior, 6 ou superior, 7 ou superior, 8 ou superior ou 9 ou superior nos loci Nic1b_ERF ou Nic2_ERF, medindo usando um método conhecido na técnica, como Qgene Versão 2.23 (1996) e parâmetros padrão.

[0220] Entende-se que qualquer planta de tabaco da presente divulgação pode ainda compreender traços agronomicamente desejáveis adicionais, por exemplo, por transformação com um construto genético ou transgene usando uma técnica conhecida na técnica. Sem limitação, um exemplo de um traço desejado é a resistência a herbicidas, resistência a pragas, resistência a doenças; alto rendimento; valor de índice de alto grau; curabilidade; qualidade de cura; capacidade de colheita mecânica; capacidade de retenção; qualidade das folhas; altura, maturação da planta (por exemplo, maturação precoce, maturação precoce a média, maturação média, maturação média a tardia ou maturação tardia); tamanho do caule (por exemplo, um caule pequeno, médio ou grande); ou número de folhas por planta (porexemplo, um pequeno (porexemplo, 5 a 10 folhas), médio (por exemplo, 11 a 15 folhas) ou grande (por exemplo, 16 a 21) número de folhas) ou qualquer combinação. Em um aspecto, plantas ou sementes com baixo teor de nicotina ou sem nicotina divulgadas compreendem um ou mais transgenes que expressam uma ou mais proteínas inseticidas, como, por exemplo, uma proteína cristalina de Bacillus thuringiensis ou uma proteína inseticida vegetativa de Bacillus cereus, tal como VIP3 (ver, por exemplo, Estruch et al. (1997) Nat. Biotechnol.15:137). Em outro aspecto, as plantas de tabaco compreendem ainda um traço introgressad que confere resistência à podridão marrom do caule (Pat. U.S. 5.689.035) ou resistência a nemátodos de cisto (Pat. U.S. 5.491.081).

[0221] A presente divulgação também fornece plantas de tabaco compreendendo um nível alterado de nicotina ou alcaloide total, mas com um rendimento comparável ao rendimento das plantas de tabaco iniciais correspondentes sem essa alternância no nível de nicotina. Em um aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina fornece um rendimento selecionado do grupo que consiste em cerca de 1200 e 3500, entre 1300 e 3400, entre 1400 e 3300, entre 1500 e 3200, entre 1600 e 3100, entre 1700 e 3000, entre 1800 e 2900, entre 1900 e 2800, entre 2000 e 2700, entre 2100 e 2600, entre 2200 e 2500 e entre 2300 e 2400 lb/acre. Em outro aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina fornece um rendimento selecionado do grupo que consiste em cerca de 1200 e 3500, entre 1300 e 3500, entre 1400 e 3500, entre 1500 e 3500, entre 1600 e 3500, entre 1700 e 3500, entre 1800 e 3500, entre 1900 e 3500, entre 2000 e 3500, entre 2100 e 3500, entre 2200 e 3500, entre 2300 e 3500, entre 2400 e 3500, entre 2500 e 3500, entre 2600 e 3500, entre 2700 e 3500, entre 2800 e 3500, entre 2900 e 3500, entre 3000 e 3500 e entre 3100 e 3500 libras/acre.Em um aspecto adicional, as plantas de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina fornecem um rendimento entre 65% e 130%,

entre 70% e 130%, entre 75% e 130%, entre 80% e 130%, entre 85% e 130%, entre 90% e 130%, entre 95% e 130%, entre 100% e 130%, entre 105% e 130%, entre 110% e 130%, entre 115% e 130%, ou entre 120% e 130% do rendimento de uma planta de controle com fundo genético essencialmente idêntico, exceto uma mutação nic1b_erf, uma mutação nic2, um transgene Nic1b_ERF, um transgene Nic2, ou combinações dos mesmos. Em um aspecto adicional, plantas de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina fornecem um rendimento entre 70% e 125%, entre 75% e 120%, entre 80% e 115%, entre 85% e 110% ou entre 90% e 100% do rendimento de uma planta de controle com fundo genético essencialmente idêntico, exceto uma mutação nic1b_erf, uma mutação nic2, um transgene Nic1b_ERF, um transgene Nic2, ou combinações dos mesmos.

[0222] Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) não exibe um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todos os traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura. Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) não exibe dois ou mais dos traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura.

Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) não exibe três ou mais dos traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura.

Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) exibe em um nível mais baixo em comparação com LA BU21, LAFC53 ou LN KY171, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou todos os traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura.

Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) exibe em um nível mais baixo em comparação com LA BU21, LAFC53 ou LN KY171, dois ou mais dos traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura. Em um aspecto, uma planta de tabaco divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) exibe em um nível mais baixo em comparação com LA BU21, LAFC53 ou LN KY171, três ou mais, ou todos os traços LA BU21 selecionados do grupo que consiste em menor rendimento, amadurecimento e senescência retardados, maior suscetibilidade à herbivoria de insetos, maior teor de poliamina após cobertura, maior clorofila, mais células de mesofila por unidade de área foliar e baixa qualidade do produto final após a cura.

[0223] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada (por exemplo, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou com alcaloide baixo) sem impactar substancialmente um traço selecionado do grupo que consiste em rendimento, maturação e senescência, suscetibilidade à herbivoria de insetos, teor de poliamina após cobertura, nível de clorofila, número de células de mesofila por unidade de área foliar e qualidade do produto final após a cura.

[0224] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um traço substancialmente comparável a uma planta de controle não modificada, onde o traço é selecionado do grupo que consiste em produção, maturação e senescência, suscetibilidade à herbivoria de insetos, teor de poliamina após cobertura,

nível de clorofila, número de células de mesofila por unidade de área foliar e qualidade do produto final após a cura.

[0225] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou baixo alcaloide) e compreende ainda um rendimento superior a 80%, superior a 85%, superior a 90%, superior a 95%, superior a 100%, superior a 105%, superior a 110%, superior a 115%, superior a 120%, superior a 125%, superior a 130%, superior a 135% ou superior a 140% em relação ao rendimento de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um rendimento que está entre 70% e 140%, entre 75% e 135%, entre 80% e 130%, entre 85% e 125%, entre 90% e 120%, entre 95% e 115% ou entre 100% e 110% em relação ao rendimento de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um rendimento que está entre 70% e 80%, entre 75% e 85%, entre 80% e 90%, entre 85% e 95%, entre 90% e 100%, entre 95% e 105%, entre 105% e 115%, entre 110% e 120%, entre 115% e 125%, entre 120% e 130%, entre 125 e 135% ou entre 130% e 140% em relação ao rendimento de uma planta de controle não modificada.

[0226] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou baixo alcaloide) e compreende ainda um teor de poliamina após cobertura superior a 80%, superior a 85%, superior a 90%, superior a 95%, superior a 100%, superior a 105%, superior a 110%, superior a 115%, superior a 120%, superior a 125%, superior a 130%, superior a 135% ou superior a 140% em relação ao teor de poliamina após cobertura de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um teor de poliamina após cobertura que está entre 70% e 140%, entre 75% e 135%, entre 80% e 130%, entre 85% e 125%, entre 90% e 120%, entre 95% e 115% ou entre 100% e 110% em relação ao teor de poliamina após cobertura de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um teor de poliamina após cobertura que está entre 70% e 80%, entre 75% e 85%, entre 80% e 90%, entre 85% e 95%, entre 90% e 100%, entre 95% e 105%, entre 105% e 115%, entre 110% e 120%, entre 115% e 125%, entre 120% e 130%, entre 125 e 135% ou entre 130% e 140% em relação ao teor de poliamina após cobertura de uma planta de controle não modificada.

[0227] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou baixo alcaloide) e compreende ainda um nível de clorofila superior a 80%, superior a 85%, superior a 90%,

superior a 95%, superior a 100%, superior a 105%, superior a 110%, superior a 115%, superior a 120%, superior a 125%, superior a 130%, superior a 135% ou superior a 140% em relação ao nível de clorofila de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um nível de clorofila que está entre 70% e 140%, entre 75% e 135%, entre 80% e 130%, entre 85% e 125%, entre 90% e 120%, entre 95% e 115% ou entre 100% e 110% em relação ao nível de clorofila de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um nível de clorofila que está entre 70% e 80%, entre 75% e 85%, entre 80% e 90%, entre 85% e 95%, entre 90% e 100%, entre 95% e 105%, entre 105% e 115%, entre 110% e 120%, entre 115% e 125%, entre 120% e 130%, entre 125 e 135% ou entre 130% e 140% em relação ao nível de clorofila de uma planta de controle não modificada.

[0228] Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou baixo alcaloide) e compreende ainda um número de células mesófilas por unidade de área foliar superior a 80%, superior a 85%, superior a 90%, superior a 95%, superior a 100%, superior a 105%, superior a 110%, superior a 115%, superior a 120%, superior a 125%, superior a 130%, superior a 135% ou superior a 140% em relação ao número de células mesófilas por unidade de área foliar de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um número de células mesófilas por unidade de área foliar que está entre 70% e 140%, entre 75% e 135%, entre 80% e 130%, entre 85% e 125%, entre 90% e 120%, entre 95% e 115% ou entre 100% e 110% em relação ao número de células mesófilas por unidade de área foliar de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de tabaco modificada divulgada compreende uma modificação que confere um traço desejado (por exemplo, com baixo teor de nicotina, sem nicotina ou alcaloide baixo) e compreende ainda um número de células mesófilas por unidade de área foliar que está entre 70% e 80%, entre 75% e 85%, entre 80% e 90%, entre 85% e 95%, entre 90% e 100%, entre 95% e 105%, entre 105% e 115%, entre 110% e 120%, entre 115% e 125%, entre 120% e 130%, entre 125 e 135% ou entre 130% e 140% em relação ao número de células mesófilas por unidade de área foliar de uma planta de controle não modificada.

[0229] Em um aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina divulgada é adaptada para colheita em máquina. Em outro aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina divulgada é colhida mecanicamente.

[0230] Em um aspecto, as plantas de tabaco fornecidas são plantas híbridas. Os híbridos podem ser produzidos impedindo a autopolinização de plantas progenitoras fêmeas (por exemplo, progenitoras de sementes) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen de plantas progenitoras macho de uma segunda variedade fertilize as plantas progenitoras fêmeas e permitindo a formação de sementes híbridas F1 nas plantas fêmeas. A autopolinização das plantas fêmeas pode ser evitada pela emasculação das flores em um estágio inicial do desenvolvimento das flores. Alternativamente, a formação de pólen pode ser evitada nas plantas progenitoras fêmeas usando uma forma de esterilidade masculina. Por exemplo, a esterilidade masculina pode ser produzida por esterilidade masculina (MS) ou esterilidade masculina transgênica, onde um transgene inibe a microporogênese e/ou a formação de pólen, ou a autoincompatibilidade. As plantas progenitoras fêmeas contendo MS são particularmente úteis. Nos aspectos em que as plantas progenitoras fêmeas são MS, o pólen pode ser colhido de plantas férteis macho e aplicado manualmente aos estigmas das plantas progenitoras fêmeas MS, e a semente F1 resultante é colhida.

[0231] As plantas podem ser usadas para formar híbridos F1 de tabaco de cruzamento único. O pólen de uma planta progenitora macho é transferido manualmente para uma planta progenitora fêmea emasculada ou uma planta fêmea que é estéril para formar a semente F1. Alternativamente, cruzamentos de três vias podem ser realizados onde um híbrido F1 de cruzamento único é usado como progenitor feminino e é cruzado com um progenitor macho diferente. Como outra alternativa, híbridos de cruzamento duplo podem ser criados onde a progênie F1 de dois cruzamentos simples diferentes é cruzada. A auto-incompatibilidade pode ser usada com vantagem particular para impedir a autopolinização das progenitoras fêmeas ao formar um híbrido de cruzamento duplo.

[0232] Em um aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina é estéril para machos. Em um outro aspecto, uma variedade de tabaco com baixo teor de nicotina ou sem nicotina é estéril para macho citoplasmático. Plantas macho de tabaco estéreis podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica. Os métodos de produção de tabaco estéril macho são descritos em Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y. 761 pp.

[0233] Em um aspecto adicional, as partes de tabaco fornecidas incluem, entre outras, uma folha, um caule, uma raiz, uma semente, uma flor, pólen, uma antera, um óvulo, um pedicelo, uma fruta, um meristema, um cotilédone, um hipocótilo, uma vagem, um embrião, endosperma, um explante, um calo, uma cultura de tecidos, um broto, uma célula e protoplastos. Em um aspecto, a parte do tabaco fornecida não inclui sementes. Em um aspecto, esta divulgação fornece células de planta de tabaco, tecidos e órgãos que não são materiais reprodutivos e não mediam a reprodução natural da planta. Em um outro aspecto, esta divulgação também fornece células de planta de tabaco, tecidos e órgãos que são material reprodutivo e mediam a reprodução natural da planta. Em outro aspecto, esta divulgação fornece células de planta de tabaco, tecidos e órgãos que não podem se manter através de fotossíntese. Em outro aspecto, esta divulgação fornece células de planta de tabaco somáticas. Células somáticas, ao contrário de células germinativas, não mediam reprodução de planta.

[0234] As células, tecidos e órgãos fornecidos podem ser de semente, fruto, folha, cotilédone, hipocótilo, meristema, embriões, endosperma, raiz, broto, caule, vagem, flor, inflorescência, talo, pedicelo, estilete, estigma, receptáculo, pétala, sépala, pólen, antera, filamento, ovário, óvulo, pericarpo, floema, tecido vascular. Em outro aspecto, esta divulgação fornece um cloroplasto de planta de tabaco. Em um aspecto adicional, esta divulgação fornece células epidérmicas, células estomáticas, pelos de folhas ou raízes, uma raiz de armazenamento ou um tubérculo. Em outro aspecto, esta divulgação fornece um protoplasto de tabaco.

[0235] Artesãos versados entendem que as plantas de tabaco se reproduzem naturalmente via sementes, não via reprodução assexuada ou propagação vegetativa. Em um aspecto, esta divulgação fornece endosperma de tabaco. Em outro aspecto, esta divulgação fornece células de endosperma do tabaco. Em um aspecto adicional, esta divulgação fornece uma planta de tabaco estéril macho ou fêmea, que não pode se reproduzir sem intervenção humana.

[0236] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 72, 147, 150, 157 a 161, 187 a 189, e 202 a 205 e fragmentos das mesmas. Em um aspecto, a presente divulgação fornece um polipeptídeo ou proteína compreendendo pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:73 a 107, 148, 151, 180 a 183, 206, 207 e 190 a 192. Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um polipeptídeo ou proteína compreendendo pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73 a 107, 148, 151, 180 a 183, 206, 207 e 190 a 192. Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma variante biologicamente ativa de uma proteína com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73 a 107, 148, 151, 180 a 183, 206, 207 e 190 a 192. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da presente divulgação pode diferir dessa proteína em tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tão pouco quanto 10, tão pouco quanto 9, tão pouco quanto 8, tão pouco quanto 7, tão pouco quanto 6, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, tão pouco quanto 3, tão pouco quanto 2 ou tão pouco quanto 1 resíduos de aminoácido. Também são fornecidos genes ou proteínas ortólogos de genes ou proteínas do locus Nic1b_ERF. "Ortólogos" são genes derivados de um gene ancestral comum e encontrados em diferentes espécies como resultado de especiação. Os ortólogos podem compartilhar pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou superior de identidade ou semelhança da sequência na sequência nucleotídica e/ou no nível da sequência proteica. As funções dos ortólogos costumam ser altamente conservadas entre as espécies.

[0237] Como usado neste documento, o termo "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de dois polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para a correspondência máxima em uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de sequência é usado em referência a proteínas reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservativas de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado de forma ascendente para corrigir a natureza conservativa da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservadoras são consideradas como tendo "similaridade das sequência" ou "similaridade".

[0238] As moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos ou proteínas fornecidas podem ser isoladas ou substancialmente purificadas. Uma molécula de ácido nucleico, polipeptídeo, proteína ou porção biologicamente ativa dos mesmos "isolada" ou "purificada" é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Por exemplo, um polinucleotídeo ou proteína isolado ou purificado é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente.

[0239] A presente divulgação fornece ainda um método de fabricação de um produto de tabaco que compreende material de tabaco a partir de plantas de tabaco divulgadas. Em um aspecto, os métodos compreendem condicionar material de tabaco envelhecido feito de plantas de tabaco para aumentar seu teor de umidade entre cerca de 12,5% e cerca de 13,5% a cerca de 21%, misturando o material de tabaco condicionado para produzir uma mistura desejável. Em um aspecto, o método de fabricação de um produto de tabaco compreende ainda revestir ou aromatizar a mistura. Geralmente, durante o processo de revestimento, materiais de revestimento ou molho são adicionados às misturas para melhorar sua qualidade, equilibrando a composição química e desenvolvendo certas características de sabor desejadas. Mais detalhes sobre o processo de revestimento podem ser encontrados em Tobacco Production, Chemistry and Technology, Edited by L. Davis and M. Nielsen, Blackwell Science, 1999.

[0240] O material de tabaco fornecido também pode ser processado usando métodos que incluem, entre outros, tratamento térmico (por exemplo, cozimento, tostagem), aromatizante, tratamento enzimático, expansão e/ou cura. Tabacos fermentados e não fermentados podem ser processados usando essas técnicas. Exemplos de tabacos processados adequados incluem curado ao ar escuro, curado ao fogo escuro, burley, curado por conduto e enchimento ou invólucro de charuto, bem como os produtos de toda a operação de corte de folhas. Em um aspecto, as fibras de tabaco incluem até 70% de tabaco escuro em uma base de peso fresco. Por exemplo, o tabaco pode ser condicionado por etapas de aquecimento, sudorese e/ou pasteurização, conforme descrito nas publicações U.S. 2004/0118422 ou 2005/0178398.

[0241] O material de tabaco fornecido pode ser submetido à fermentação. A fermentação é tipicamente caracterizada por alto teor de umidade inicial, geração de calor e uma perda de 10 a 20% de peso seco. Ver, por exemplo, Patentes U.S.

4.528.993; 4.660.577; 4.848.373; e 5.372.149. Além de modificar o aroma da folha, a fermentação pode alterar uma ou a cor e a textura de uma folha. Também durante o processo de fermentação, os gases da evolução podem ser produzidos, o oxigênio pode ser absorvido, o pH pode mudar e a quantidade de água retida pode mudar. Ver, por exemplo, a Publicação U.S. 2005/0178398 e Tso (1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford). O tabaco curado, ou curado e fermentado pode ser posteriormente processado (por exemplo, cortado, expandido, misturado, moído ou triturado) antes da incorporação no produto oral. O tabaco, em alguns casos, é tabaco úmido curado fermentado por corte longo, com um teor volátil no forno entre 48 e 50 por cento em peso antes da mistura com o copolímero e, opcionalmente, aromatizantes e outros aditivos.

[0242] Em um aspecto, o material de tabaco fornecido pode ser processado no tamanho desejado. Em um aspecto, as fibras do tabaco podem ser processadas para ter um tamanho médio de fibra inferior a 200 micrômetros. Em um aspecto, as fibras de tabaco estão entre 75 e 125 micrômetros. Em outro aspecto, as fibras de tabaco são processadas para ter um tamanho de 75 micrômetros ou menos. Em um aspecto, as fibras de tabaco incluem tabaco de corte longo, que pode ser cortado ou triturado em larguras de cerca de 10 cortes/polegada a cerca de 110 cortes/polegada e comprimentos de cerca de 0,1 polegada a cerca de 1 polegada. As fibras de tabaco de corte duplo podem ter uma variedade de tamanhos de partículas, de modo que cerca de 70% das fibras de tabaco de corte duplo se encaixam entre os tamanhos de malha de -20 malhas e 80 malhas.

[0243] O material de tabaco fornecido pode ser processado para ter um teor total de voláteis no forno de cerca de 10% em peso ou mais; cerca de 20% em peso ou mais; cerca de 40% em peso ou mais; cerca de 15% em peso a cerca de 25% em peso; cerca de 20% em peso a cerca de 30% em peso; cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso; cerca de 45% em peso a cerca de 65% em peso; ou cerca de 50% em peso a cerca de 60% em peso. Os versados na técnica apreciarão que o tabaco "úmido" se refere tipicamente ao tabaco que tem um teor volátil no forno entre cerca de 40% em peso e cerca de 60% em peso (por exemplo, cerca de 45% em peso a cerca de 55% em peso ou cerca de 50% em peso). Como utilizado neste documento, os "voláteis do forno" são determinados calculando a porcentagem de perda de peso para uma amostra após a secagem da amostra em um forno forçado de pré-aquecimento a 110°C por 3,25 horas. O produto oral pode ter um teor geral volátil no forno diferente do conteúdo volátil no forno das fibras de tabaco usadas para fabricar o produto oral. As etapas de processamento descritas podem reduzir ou aumentar o teor volátil do forno.

[0244] A lista a seguir fornece um primeiro conjunto de modalidades exemplificativas.

[0245] 1. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais.

[0246] 2. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco compreende ainda uma mutação em um gene ERF de um locus Nic2.

[0247] 3. A planta de tabaco genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os sete genes selecionados do grupo consistindo em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168.

[0248] 4. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade, 1, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em ERF189, ERF115 ou ambas.

[0249] 5. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA selecionado do grupo que consiste em 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

[0250] 6. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA comparável àquele de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação.

[0251] 7. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% do valor do índice de grau USDA de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação.

[0252] 8. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação.

[0253] 9. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco compreende um nível de nicotina selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que 2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25 %, menos que 2,0%, menos que 1,75%, menos que 1,5%, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5 %, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2%, menos que 0,1% e menos que 0,05%.

[0254] 10. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 1, em que a planta de tabaco compreende ainda um transgene ou mutação que suprime diretamente a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, A622, aspartato oxidase, agmatina desiminase (AIC), arginase, diamina oxidase, ornitina descarboxilase, arginina descarboxilase, permease de captação de nicotina (NUP), e transportador MATE.

[0255] 11. Uma planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA comparável àquele de uma planta de controle quando cultivada e curada em condições semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação.

[0256] 12. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco compreende ainda uma mutação em um gene ERF de um locus Nic2.

[0257] 13. A planta de tabaco genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais,

ou todos os sete genes selecionados do grupo consistindo em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168.

[0258] 14. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em ERF189, ERF115 ou ambas.

[0259] 15. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA selecionado do grupo que consiste em 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

[0260] 16. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% do índice de grau da planta de controle.

[0261] 17. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina da planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0262] 18. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 11, em que a planta de tabaco compreende ainda um transgene ou mutação que suprime diretamente a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, A622, aspartato oxidase, agmatina desiminase (AIC), arginase, diamina oxidase, ornitina descarboxilase, arginina descarboxilase, permease de captação de nicotina (NUP), e transportador MATE.

[0263] 19. Um genótipo de planta ou tabaco de uma variedade de tabaco compreendendo uma mutação nic1b, em que a variedade tem um índice de grau foliar comparável ao índice de grau foliar de uma variedade de tabaco de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, em que a variedade de tabaco de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico à variedade de tabaco, exceto a mutação.

[0264] 20. O genótipo de planta ou tabaco da Modalidade 19, em que a variedade de tabaco compreende ainda uma mutação em um gene ERF de um locus Nic2.

[0265] 21. O genótipo de planta ou tabaco da Modalidade 19, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os sete genes selecionados do grupo consistindo em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168.

[0266] 22. O genótipo de planta ou tabaco da Modalidade 19, em que a planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em ERF189, ERF115, ou ambas.

[0267] 23. Uma planta de tabaco não transgênica, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos,

compreendendo um nível de nicotina selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que 2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25%, menos que 2,0 %, menos que 1,75%, menos que 1,5%, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5%, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2%, menos que 0,1% e menos que 0,05%, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais e 95 ou mais.

[0268] 24. Uma planta de tabaco não transgênica, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 23, em que a planta de tabaco não transgênica compreende um nível de nicotina de menos que 2,0% e é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor do índice de grau USDA de 70 ou mais.

[0269] 25. Uma planta de tabaco não transgênica, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 23, em que a planta de tabaco não transgênica compreende um nível de nicotina de menos que 1,0% e é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor do índice de grau USDA de 70 ou mais.

[0270] 26. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma mutação não transgênica em um locus Nic1b, em que a mutação não transgênica reduz o nível de nicotina da planta do tabaco abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%,

abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA comparável ao valor de índice de grau USDA da planta de controle e em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação não transgênica.

[0271] 27. Uma população das plantas de tabaco de qualquer uma das Modalidades 1 a 26.

[0272] 28. Material de tabaco curadoda planta de tabaco de qualquer uma das Modalidades 1 a 26.

[0273] 29. O material de tabaco curado, de acordo com a Modalidade 28, em que o material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura de conduto, cura de ar, cura de fogo e cura de sol.

[0274] 30. Uma mistura de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 28.

[0275] 31. A mistura de tabaco da Modalidade 30, em que o material de tabaco curado constitui cerca de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% do tabaco curado na mistura de tabaco em peso.

[0276] 32. A mistura de tabaco da Modalidade 30, em que o material de tabaco curado constitui cerca de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% do tabaco curado na mistura de tabaco em volume.

[0277] 33. Produto de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 28.

[0278] 34. O produto de tabaco da Modalidade 33, em que o referido produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco picado e tabaco cortado.

[0279] 35. O produto de tabaco da Modalidade 33, em que o produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça.

[0280] 36. O produto de tabaco da Modalidade 35, em que o referido produto de tabaco sem fumaça é selecionado do grupo que consiste em tabaco de mascar de folha solta, tabaco de mascar de fumo de rolo, rapé úmido e rapé nasal.

[0281] 37. Um tabaco reconstituído compreendendo o material de tabaco curado da Modalidade 28.

[0282] 38. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma mutação em um locus Nic1b, em que a mutação está ausente de uma variedade LA Burley 21.

[0283] 39. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende uma introgressão cromossômica mais curta em um locus Nic1b em comparação com a variedade

LA Burley 21.

[0284] 40. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmo, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende um nível mais baixo de nicotina em comparação com uma planta de controle de tabaco sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0285] 41. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina da planta de tabaco de controle sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0286] 42. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende um nível mais baixo de alcaloide total em comparação com uma planta de controle de tabaco sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0287] 43. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende um nível mais baixo de um ou mais alcaloides selecionados do grupo que consiste em nicotina, nornicotina, anabasina e anatabina, em comparação com um controle planta de tabaco sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0288] 44. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende um nível semelhante de um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em ácido 3-metilvalérico, ácido valérico, ácido isovalérico, um labdenoide, um cembrenoide, um éster de açúcar e um açúcar redutor, em comparação com uma planta de controle de tabaco sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0289] 45. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação é homozigótica.

[0290] 46. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação é heterozigótica.

[0291] 47. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em uma mutação pontual, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão.

[0292] 48. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação é introduzida por uma abordagem selecionada do grupo que consiste em mutagênese aleatória e mutagênese direcionada.

[0293] 49. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 48, em que a mutagênese direcionada é mediada por meganuclease, nuclease de dedo de zinco, TALEN ou CRISPR.

[0294] 50. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco compreende ainda uma mutação em gene ERF de um locus Nic2.

[0295] 51. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de um gene compreendendo uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos.

[0296] 52. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação reduz a expressão ou atividade do gene.

[0297] 53. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco, da Modalidade 38, que a mutação está localizada dentro de um gene compreendendo uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205 e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0298] 54. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de um gene compreendendo uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 19, 49, 52, 53, 202 a 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0299] 55. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco, da Modalidade 38, que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%,

pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 202 to 205, 54, e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0300] 56. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 19, 49, 52, 53, 202 a 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0301] 57. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de um gene compreendendo uma sequência de codificação que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49, 52, 53, 204, 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0302] 58. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49, 52, 53, 204, 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0303] 59. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de um gene que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 84, 87, 88, e 89, e fragmentos dos mesmos.

[0304] 60. A planta de tabaco, ou genótipo de planta ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta compreende ainda um nível reduzido de mRNA, proteína ou ambos de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, MATE e A622, em comparação com uma planta de tabaco sem a mutação quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0305] 61. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta compreende ainda um transgene ou mutação que suprime a expressão ou atividade de um ou mais genes que codificam um produto selecionado do grupo que consiste em PMT, MPO, QPT, BBL, A622, aspartato oxidase, agmatina desiminase (AIC), arginase, diamina oxidase, ornitina descarboxilase, arginina descarboxilase, permease de captação de nicotina (NUP), e transportador MATE.

[0306] 62. A planta de tabaco, ou genótipo de planta ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco é um híbrido.

[0307] 63. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos da Modalidade 38, em que a parte é selecionada do grupo que consiste em uma folha, um caule, uma raiz, uma semente, uma flor, pólen, uma antera, um óvulo, um pedicelo, uma fruta, um meristema, um cotilédone, um hipocótilo, uma vagem, um embrião, endosperma, um explante, um calo, uma cultura de tecidos, um broto, uma célula e protoplastos.

[0308] 64. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a planta de tabaco é de uma variedade selecionada do grupo que consiste em tabaco curado de conduto, tabaco curado de ar, tabaco curado de queima no escuro e tabaco Galpao e tabaco Oriental.

[0309] 65. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38,em que a planta de tabaco é de uma variedade selecionada do grupo que consiste em tabaco Burley, tabaco Maryland e tabaco de cura de ar escuro.

[0310] 66. Uma população das plantas de tabaco da Modalidade 38.

[0311] 67. Material de tabaco curadoda planta de tabaco da Modalidade 38.

[0312] 68. O material de tabaco curado da Modalidade 67, em que o material de tabaco curado compreende um nível mais baixo de nicotina em comparação com o material de tabaco curado de uma planta de controle de tabaco sem a mutação.

[0313] 69. O material de tabaco curado da Modalidade 67, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível entre 0,2% e 0,6%.

[0314] 70. O material de tabaco curado da Modalidade 67, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível entre 1,0% e 3,0%.

[0315] 71. O material de tabaco curado, de acordo com a Modalidade 67, em que o material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura de conduto, cura de ar, cura de fogo e cura de sol.

[0316] 72. Uma mistura de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 67.

[0317] 73. Um produto de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 67.

[0318] 74. O produto de tabaco da Modalidade 73, em que o referido produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco picado e tabaco cortado.

[0319] 75. O produto de tabaco da Modalidade 73, em que o produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça.

[0320] 76. O produto de tabaco da Modalidade 75, em que o referido produto de tabaco sem fumaça é selecionado do grupo que consiste em tabaco de mascar de folha solta, tabaco de mascar de fumo de rolo, rapé úmido e rapé nasal.

[0321] 77. Um tabaco reconstituído compreendendo o material de tabaco curado da Modalidade 67.

[0322] 78. Uma construto de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73 a 107, 148 151, 180 a 183, 206, 207 e 190 a 192 e fragmentos das mesmas.

[0323] 79. Uma planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco, compreendendo o construto de DNA recombinante da Modalidade 78.

[0324] 80. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 79, em que a planta de tabaco compreende um nível mais alto de nicotina em comparação com uma planta de controle de tabaco sem o construto de DNA recombinante.

[0325] 81. Material de tabaco curadoda planta de tabaco da Modalidade 79.

[0326] 82. Um produto de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 81.

[0327] 83. Um método para aumentar o nível de nicotina de uma planta de tabaco, o método compreendendo transformar uma planta de tabaco com o construto de DNA recombinante da Modalidade 78.

[0328] 84. Um construto de DNA recombinante compreendendo um promotor que é funcional em uma célula de tabaco e operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de se ligar a um RNA que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73 a 107, 148, 151, 180 a 183, 206, 207 e 190 a 192, e fragmentos dos mesmos, e em que a molécula de RNA suprime a expressão do polipeptídeo.

[0329] 85. Uma planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco, compreendendo o construto de DNA recombinante da Modalidade 84.

[0330] 86. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 85, em que a molécula de RNA é selecionada do grupo que consiste em um microRNA, um siRNA e um siRNA trans-ativador.

[0331] 87. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 85, em que o polinucleotídeo codifica um RNA de fita dupla.

[0332] 88. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 85, em que a planta de tabaco compreende um nível mais baixo de nicotina em comparação com uma planta de controle de tabaco sem o construto de DNA recombinante.

[0333] 89. Material de tabaco curadoda planta de tabaco da Modalidade 85.

[0334] 90. Um produto de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 89.

[0335] 91. Um método para reduzir o nível de nicotina de uma planta de tabaco, o método compreendendo transformar uma planta de tabaco com o construto de DNA recombinante da Modalidade 84.

[0336] 92. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1bde um gene compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos, em que a sequência inibidora é operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal e em que a sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência com um fragmento de pelo menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos de sequência selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203, e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos.

[0337] 93. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 92, em que a sequência inibodira de Nic1b é capaz de ser transcrita como um polinucleotídeo inibitório selecionado do grupo que consiste em um polinucleotídeo de RNA de fita simples, um polinucleotídeo de RNA de fita dupla e uma combinação dos mesmos.

[0338] 94. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 92, em que o promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor preferido para o tecido.

[0339] 95. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 92, em que o promotor é um promotor específico da raiz.

[0340] 96. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1bde um gene compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205, e 72, e fragmentos dos mesmos, em que a sequência inibidora é operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal e em que a sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência com um fragmento de pelo menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos de sequência selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205, e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0341] 97. Um método para introgressar um traço de nicotina baixa em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: a. cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênies; b. genotipar as uma ou mais plantas de tabaco progênies para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, em que o marcador polimórfico está em um intervalo cromossômico flanqueado por quaisquer dois marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ IDs 125 a 145 e 193 a 201; e c. selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de nicotina baixa.

[0342] 98. O método da Modalidade 97, em que o método compreende ainda retrocruzar a planta de tabaco progênie selecionada com a segunda variedade de tabaco.

[0343] 99. O método da Modalidade 97, em que o método compreende ainda: d. cruzar a planta progênie selecionada consigo mesma ou com a segunda variedade de tabaco para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênie adicionais; e e . selecionar uma planta de tabaco progênie adicional compreendendo o traço de nicotina baixa.

[0344] 100. O método da Modalidade 99, em que a etapa (e) da seleção compreende a seleção assistida por marcador.

[0345] 101. O método da Modalidade 97, em que o método produz uma única conversão genética compreendendo o traço de nicotina baixa.

[0346] 102. O método da Modalidade 97, em que a segunda variedade de tabaco é uma variedade de elite.

[0347] 103. O método da Modalidade 97, em que a genotipagem envolve um ou mais ensaios de marcadores moleculares.

[0348] 104. O método da Modalidade 97, em que o marcador polimórfico compreende um polimorfismo selecionado do grupo que consiste em polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções na sequência de DNA (Indels), repetições simples de sequência de sequência de DNA (SSRs), um comprimento de fragmento de restrição polimorfismo (RFLP) e uma etiqueta SNP.

[0349] 105. O método da Modalidade 97, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos.

[0350] 106. O método da Modalidade 97, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205 e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0351] 107. O método da Modalidade 97, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 19, 49, 52, 53, 202 a 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0352] 108. O método da Modalidade 97, em que a primeira variedade de tabaco é selecionada do grupo que consiste em LA Burley 21, LAFC53, e LN KY171.

[0353] 109. O método da Modalidade 97, em que a planta de tabaco progênie selecionada compreende uma introgressão cromossômica mais curta em um locus Nic1b em comparação com LA Burley 21, LAFC53, e LN KY171.

[0354] 110. Um método para introgressar um traço de nicotina baixa em uma variedade de tabaco, o método compreendendo: a. cruzar uma primeira variedade de tabaco compreendendo um traço de nicotina baixa com uma segunda variedade de tabaco sem o traço de nicotina baixa para produzir uma ou mais plantas de tabaco progênies; b. genotipar as uma ou mais plantas de tabaco progênie para um marcador polimórfico ligado ao traço de nicotina baixa, em que o marcador polimórfico está dentro de 20 cM de qualquer um dos marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou qualquer locus com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203, e 184 a 186; e c. selecionar uma planta de tabaco progênie compreendendo o traço de nicotina baixa.

[0355] 111. O método da Modalidade 110, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos.

[0356] 112. O método da Modalidade 110, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205 e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0357] 113. O método da Modalidade 110, em que a genotipagem compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 19, 49, 52, 53, 202 a 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0358] 114. Método para selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa, o método compreendendo: a. isolar ácidos nucleicos de uma coleção de germoplasma de tabaco; b. ensaiar os ácidos nucleicos para um ou mais marcadores intimamente ligados a um locus Nic1b; e c. selecionar uma planta de tabaco com traço de nicotina baixa com base no ensaio do marcador.

[0359] 115. O método da Modalidade 114, em que os um ou mais marcadores estão dentro de cerca de 20 cM, 10 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,5 cM ou menos que 0,5 cM de qualquer um dos marcadores SNP selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou qualquer locus com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186.

[0360] 116. O método da Modalidade 114, em que o ensaio compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, e fragmentos dos mesmos.

[0361] 117. O método da Modalidade 114, em que o ensaio compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 14, 15, 17, 18, 19, 37, 39, 49, 50, 52, 53, 54, 202 a 205 e 72, e fragmentos dos mesmos.

[0362] 118. O método da Modalidade 114, em que o ensaio compreende analisar uma sequência de ácido nucleico localizada dentro de uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 19, 49, 52, 53, 202 a 205, e 54, e fragmentos dos mesmos.

[0363] 119. O método da Modalidade 114, em que o método compreende ainda determinar o nível de nicotina da planta selecionada para confirmar o traço de nicotina baixa.

[0364] 120. O método da Modalidade 114, em que a coleção de germoplasma de tabaco é uma população reprodutora haploide.

[0365] 121. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma introgressão cromossômica obtida em qualquer um de LA Burley 21, LAFC53 e LN KY171, e flanqueada por e não compreendendo dois marcadores SNP selecionados do grupo que consiste em SEQ ID Nos. 125 a 145 e 193 a 201, ou flanqueados por quaisquer dois loci com sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos. 1, 3 a 37, 146, 149, 152 a 156, 202, 203 e 184 a 186, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais, 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais, ou 95 ou mais.

[0366] 122. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 121, em que a planta de tabaco compreende um nível de nicotina selecionado do grupo que consiste em menos que 3%, menos que 2,75%, menos que 2,5%, menos que 2,25 %, menos que 2,0%, menos que 1,75%, menos que 1,5%, menos que 1,25%, menos que 1%, menos que 0,9%, menos que 0,8%, menos que 0,7%, menos que 0,6%, menos que 0,5 %, menos que 0,4%, menos que 0,3%, menos que 0,2%, menos que 0,1% e menos que 0,05%.

[0367] 123. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos da Modalidade 121, em que a introgressão cromossômica é flanqueada e não compreende quaisquer dois de marcadores SNP selecionados do grupo que consiste em SEQ ID Nos. 126 a 135.

[0368] 124. A planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 121, em que a introgressão cromossômica é flanqueada por e não compreende marcadores SNP SEQ ID Nos 129 a 132.

[0369] 125. Uma planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, compreendendo uma primeira introgressão cromossômica que pode ser obtida de qualquer um dos LA Burley 21, LAFC53 e LN KY171, e flanqueado por e não compreendendo nenhum dos dois marcadores Nic1b Nos. 1 to 207, em que a planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, com um valor de índice de classificação do USDA comparável ao de uma planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes, em que a planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a planta de tabaco, exceto a mutação.

[0370] 126. Planta de tabaco, ou genótipo de tabaco ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 125, em que a planta de tabaco compreende nicotina em um nível abaixo de 1%, abaixo de 2%, abaixo de 5%, abaixo de 8%, abaixo de 10%, abaixo de 12%, abaixo de 15%, abaixo de 20%, abaixo de 25%, abaixo de 30%, abaixo de 40%, abaixo de 50%, abaixo de 60%, abaixo de 70% ou abaixo de 80% do nível de nicotina da planta de controle quando cultivada em condições de crescimento semelhantes.

[0371] 127. Uma população das plantas de tabaco de qualquer uma das Modalidades 121 a 126 e 136 a 141.

[0372] 128. Material de tabaco curadoda planta de tabaco de qualquer uma das Modalidades 121 a 126.

[0373] 129. O material de tabaco curado, de acordo com a Modalidade 128, em que o material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura de conduto, cura de ar, cura de fogo e cura de sol.

[0374] 130. Uma mistura de tabaco compreendendo o material de tabaco curado da Modalidade 128.

[0375] 131. A mistura de tabaco mistura de tabaco da Modalidade 130, em que o material de tabaco curado constitui cerca de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% do tabaco curado na mistura de tabaco em peso.

[0376] 132. A mistura de tabaco da Modalidade 130, em que o material de tabaco curado constitui cerca de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% do tabaco curado na mistura de tabaco em volume.

[0377] 133. Produto de tabaco que compreende o material de tabaco curado da Modalidade 128.

[0378] 134. O produto de tabaco da Modalidade 133, em que o referido produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco picado e tabaco cortado.

[0379] 135. O produto de tabaco da Modalidade 133, em que o produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em tabaco de mascar de folha solta, tabaco de mascar de fumo de rolo, rapé úmido e rapé nasal.

[0380] 136. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 146, 153, 154, 17, 18, 19, 202, e 203, e fragmentos dos mesmos.

[0381] 137. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos

97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 153, 154, 17, 18, 19, 202, e 203, e fragmentos dos mesmos.

[0382] 138. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 153, 154, 17, 18, 19, e 203, e fragmentos dos mesmos.

[0383] 139. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 13, 17, 18, e 19, e fragmentos dos mesmos.

[0384] 140. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de uma sequência que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 18, e 19, e fragmentos dos mesmos.

[0385] 141. A planta de tabaco, ou genótipo ou parte de tabaco dos mesmos, da Modalidade 38, em que a mutação está localizada dentro de um gene que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87, 88, 89, 180, 181, 206, e 207, e fragmentos dos mesmos.

[0386] Tendo agora descrito geralmente a divulgação, o mesmo será mais facilmente compreendido por referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos a título de ilustração, e não pretendem limitar a presente divulgação, a menos que especificado.

EXEMPLOS Exemplo 1: Desenvolvimento de linhagens TN90 com traço de alcaloide baixo e plantas com traço de alcaloide intermediário alto que abrigam alelos marcadores de deleção nic1 e nic2

[0387] Uma população de produção é desenvolvida a partir de um cruzamento entre LA BU21 (Low Alkaloid Burley 21, portadora de mutações nic1 e nic2 ), progenitor doador e a cultivar de elite TN90 (progenitor receptor). O objetivo é obter uma planta com alcaloide baixo que também melhore a qualidade das folhas quando comparada à linhagem progenitora LA BU21, que possui características foliares inferiores. Uma planta F2 com características desejadas (baixos níveis de alcaloides, melhor qualidade das folhas) é ainda mais preparada para obter a geração F3 e, posteriormente, a geração F5. A Figura 1 mostra o processo de produção seguido para o desenvolvimento de auto-linhagens TN90 portadoras do trato de alcaloide baixo.

[0388] Conforme mostrado na Figura 1, as plantas 22 F3 são rastreadas no arranjo Axiome® desenvolvido com base em aproximadamente 170.000 SNPs polimórficos observados em várias linhagens ressequenciadas pertencentes a diferentes tipos de tabaco (Flue, Dark, Oriental e Burley) com relação a um banco de dados de sequência do genoma do tabaco TN90. A planta 22-6 mostra cerca de 40,6% de recuperação do genoma progenitor receptor e é escolhida para avançar adicionalmente.

A geração F3 também exibe baixos níveis de alcaloides, consistentes com os observados no LABU21. A geração F4 é rastreada usando ensaios Nic1 e Nic2 KASP (ver SEQ ID Nos: 135 e 137 da US 2016/0374387, correspondendo aos marcadores Nic1KASP e Nic2KASP, respectivamente). Todas as 192 plantas F4 rastreadas abrigam as 2 deleções e 3 plantas (ds1059-138, ds1059-143 e ds1059-192) são selecionadas para avançar adicionalmente.

As sementes cultivadas dessas 3 plantas são ainda mais aumentadas e a geração F5 é avaliada.

Todas as plantas 220 F5 são homozigotas para os alelos de deleção nic1KASP e nic2KASP.

Os níveis de alcaloides nas plantas F5 são determinados pela medição de uma amostra de folhas coletada das 3a, 4a, e 5a folhas do topo da planta e 2 semanas após a cobertura.

Nem todas as plantas exibem o traço de alcaoide baixo, e também são observadas diferenças marcantes no fenótipo foliar, com várias linhagens exibindo boa qualidade da folha consistente com as observadas no tabaco Burley comercial (Tabela 1). Tabela 1: Os níveis de alcaloides e o fenótipo foliar selecionaram plantas F5 e plantas de controle.

Todas as plantas F5 são homozigotas para os alelos de deleção nic1KASP e nic2KASP.

Fenótipo de Folha ID da Total planta Boa Precária Nicotina Nornicotina Anabasina Anatabina de Alcs G61-31 X 0,417301 0,0016 0,0006 0,013401 0,432902 G61-36 X 3,901918 0,108273 0,020413 0,150738 4,181342 G61-37 X 0,379678 0,0016 0,0006 0,012404 0,394282 G61-39 X 4,157288 0,139291 0,018432 0,143015 4,458026 TN90 X 3,844 0,072 0,016 0,108 4,040 TN90 X 3,929 0,062 0,015 0,096 4,102 TN90 X 5,063 0,098 0,019 0,156 5,336 TN90 X 3,959 0,072 0,015 0,106 4,153 TN90 X 3,976 0,080 0,014 0,091 4,161 LA BU21 X 0,171 0,002 0,001 0,006 0,179 LA BU21 X 0,222 0,002 0,001 0,007 0,231 LA BU21 X 0,188 0,002 0,001 0,008 0,198 LA BU21 X 0,249 0,002 0,001 0,007 0,258 Exemplo 2: Identificação de regiões genômicas adicionais associadas ao traço de alcaloide baixo

[0389] As plantas F5 do Exemplo 1 com altos níveis de alcaloides, apesar de possuírem alelos de deleção de nic1KASP and nic2KASP homozigotos, sugerem que os marcadores de deleção nic1KASP e nic2KASP não exibem 100% de ligação com o traço de alcaloide baixo. Para investigar esta observação, é realizado um novo sequenciamento para LAFC53 (versão curada por conduto portando introgressões nic1 e nic2 ), LN KY171 (versão escura portadora de introgressões nic1 e nic2 ), KY171 (variedade escura sem introgressões nic1 e nic2 ), bem como duas (2) linhagens F5 homozigotas para alelos de deleção nic1KASP e nic2KASP, mas exibindo altos níveis de alcaloides

(G61-36 e G61-39) e duas (2) linhagens F5 homozigotas para alelos de deleção nic1KASP e nic2KASP e exibindo baixos níveis de alcaloides (G61-31 e G61-37). Essas 7 linhagens, além das linhagens re-sequenciadas anteriormente; BU21, HI BU21, LI BU21 e LA BU21, foram mapeadas usando um banco de dados do genoma TN90.

[0390] A análise de cobertura das leituras mapeadas leva à identificação de uma região de 2000-3000 bp (SEQ ID No. 1, daqui em diante "região associada a LA"), aproximadamente 2 milhões de bps a jusante do segmento de deleção de nic1 NT1.0-Scaffold0002504 descrito anteriormente em US 2016/0374387. A região associada a LA é excluída em LA BU21, LI BU21, LN KY171, LAFC53, bem como nas linhagens F5 de nic1KASPnic2KASP homozigotas de alcaloides baixos, G61-31 e G61-37. Por outro lado, a região associada a LA não é excluída (isto é, presente) em tipos selvagens (por exemplo, TN90, BU21, K326, NLM, Katerini), bem como nas linhagens F5 de nic1KASPnic2KASP G61-36 e G61-39 homozigotas de alcaloide alto. A região associada a LA não possui genes conhecidos. Um gene da fosfatase da proteína de serina treonina é encontrado 4877 bps a montante desta região e um ERF (homólogo de ERF189) é encontrado 59,945 bps a jusante desta região.

[0391] Além disso, a genotipagem SNP da planta F3 (22-6) revela que uma região genômica, começando de 1.256.063 bps e terminando em 2.766.118 bps (~ 1.510.055 bps de comprimento, SEQ ID No. 2, aqui denominada "Região Nic1b") a jusante do segmento de deleção nic1 NT1.0- Scaffold0002504, é heterozigota na planta F3 (incluindo a região associada a LA). Isso sugere que um alelo de alcaloide baixo da região Nic1b provavelmente se origina de charuto (LA BU21 foi desenvolvido a partir de um cruzamento entre BU21 e uma variedade de charutos cubanos com alcaloide baixo) e segregou nas gerações F4 e posteriores.

[0392] Além disso, 47 plantas F4 e 48 plantas F5 são genotipadas usando a matriz de axioma contendo ~ 170.000 SNP para validar ainda mais a correlação entre os níveis de alcaloides e a região associada a LA bem como a região Nic1b. A análise das 3 plantas progenitoras de geração F4 (ds1059- 138, ds1059-143 e ds1059-192) mostra que a região associada a LA e a região Nic1b são heterozigotas ou portadoras do alelo LA BU21 como (B). Da mesma forma, as 48 plantas de geração F5 mostram segregação na região associada a LA e na região Nic1b, com indivíduos com alelo B (tipo LA BU21) exibindo baixos níveis de alcaloides (0,137% a 0,417%, peso seco) e indivíduos com estado heterozigótico (H ) ou o alelo do tipo selvagem (A) exibindo níveis de alcaloides moderados a altos (1,793% a 5,419%, peso seco). Exemplo 3: Identificação de genes e marcadores na região Nic1b

[0393] A análise de sequência da região Nic1b revela pelo menos 35 genes anotados da região (Tabela 2). Esses genes são chamados de Nic1b Cigar Genes (“NCG”) 1 a 35. Entre esses genes NCG, seis genes do tipo fator de transcrição responsivos ao etileno (tipo ERF) são identificados. Os dados de RNA-seq mostram que 10 NCGs exibem expressão reduzida em plantas LA BU21 relacionadas a BU21, a partir de amostras de raízes coletadas 72 horas após a cobertura. Sete NCGs, incluindo quatro dos seis genes do tipo ERF, são suprarregulados, enquanto outros três NCGssão superregulados no LA BU21 em comparação ao BU21.

[0394] Cada um dos 35 NCGs nas plantas LA BU21, TN90 e F5 selecionadas é sequenciado novamente para identificar mutações naturais específicas que estão presentes em LA BU21 e podem causar perda da função do gene. Análises adicionais de sequenciamento também são realizadas para identificar mutações em sequências não codificantes (por exemplo, promotores) que podem causar desregulação da expressão de gene.

[0395] Além disso, polimorfismos dentro e flanqueando a região Nic1b também são identificados para desenvolver marcadores SNP. Vinte e um marcadores SNP são desenvolvidos para genotipar a região Nic1b (Tabela 3). Outros marcadores SNP são fornecidos na Tabela 4. Esses marcadores estão na região Nic1b e imediatamente ao lado de vários genes ERF. Eles têm alelos que podem ser usados para distinguir linhagens alcaloides normais de linhagens alcaloides baixas.

Tabela 2: Genes anotados na região Nic1b. a g31431 e g31432 parecem representar junção alternativa (consulte a Figura 2). b g31446 pode representar outra junção alternativa. RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. fator de transcri- ção responsivo ao etileno tipo 13 [Nicotiana NCG1 g31420 80937073 80937738 tabacum] 0,053 0,06 3 38 73 108/114 120 Subunidade A do heterodis- sulfeto Para NCG2 g31421 80969813 80970221 redutase A 0,66 0 baixo 4 39 74 proteína contendo domínio TCE de dedo de zinco RICE-

SLEEPER tipo 3 [Nicotiana tomento- NCG3 g31422 81191288 81191800 siformis] 0 0 5 40 75 Fator de junção do tipo SC35 NCG4 g31423 81373969 81374515 33 0 0 6 41 76

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No.

Proteína de ligação a RNA de planta do NCG5 g31424 81384086 81384310 tipo Tudor 0 0 7 42 77 Proteína da família de domínio móvel de plantas do tipo amino- transfe- NCG6 g31425 81384503 81385746 rase 0 0 8 43 78 Proteína da família Xantina/ Uracil NCG7 g31426 81391218 81391750 Permease 0 0 9 44 79 Proteína de bios- síntese de cobalamina NCG8 g31427 81391973 81392478 CbiX 0 0 10 45 80 Proteína da família de domínio móvel de plantas do tipo amino- transfe- NCG9 g31428 81392698 81392986 rase 0 0 11 46 81

Serina/ treonina- proteína fosfatase 7 NCG10 g31429 81393124 81393975 semelhante 0 0 12 47 82 fator de trans- crição responsivo ao etileno tipo 13 [Nicotiana NCG11 g31430 81460946 81461665 tabacum] 0,76 0,63 13 48 83 109/115 121 fator de transcri- ção responsivo ao etileno tipo 13 [Nicotiana tomento- Para NCG12 g31431 81636198 81637364 siformis] 1,69 0,75 baixo 14 49 84 110/116 g31432a 146 147 148 Regulador transcri- cional da família Para NCG13 g31433 81731664 81731954 MerR 2,11 0 baixo 15 50 85 Cadeia pesada de NCG14 g31434 81745530 81746785 Clatrina 1 0 0 16 51 86

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. fator de transcri- ção responsivo ao etileno tipo 1 [Nicotiana sylvestris Para NCG15 g31435 81752543 81753226 ] 5,72 0,46 baixo 17 52 87 111/117 122 fator de transcri- ção responsivo ao etileno tipo 13 [Nicotiana sylvestris Para NCG16 g31436 81848443 81849006 ] 4,38 0,33 baixo 18 53 88 112/118 123 fator de transcri- ção responsivo ao etileno tipo 13 [Nicotiana Para NCG17 g31437 81862134 81862760 tabacum] 45,75 6,23 baixo 19 54 89 113/119 124 Subunidade 7 do complexo do sinalossom o COP9, isoforma X1 NCG18 g31438 81868638 81876132 [Nicotiana 6,55 6,41 20 55 90

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. sylvestris ]

Proteína da família HpcH/HpaI NCG19 g31439 81908399 81908794 aldolase 0 0 21 56 91 isoforma X4 da leucina carboxil metil- transfe- rase 1 [Nicotiana sylvestris NCG20 g31440 81959838 81971528 ] 7,9 6,97 22 57 92 proteína não caractere- zada LOC1042427 06 [Nicotiana sylvestris Para NCG21 g31441 81979991 81984723 ] 4,06 18,37 cima 23 58 93 serina/ treonina- proteína quinase D6PKL1 [Nicotiana sylvestris Para NCG22 g31442 82025072 82027902 ] 3,27 6,23 cima 24 59 94

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. Proteína 1A que contém o domínio

GRAM [Nicotiana sylvestris NCG23 g31443 82058104 82091727 ] 11,73 12,31 25 60 95 E3 isoforma X1 da ubiquitina -proteína ligase RNF25 [Nicotiana sylvestris Para NCG24 g31444 82129721 82134890 ] 19,31 23,07 cima 26 61 96 Fosfoli- pase A (1) DAD1, tipo cloroplás- tico [Nicotiana sylvestris NCG25 g31445 82166384 82167631 ] 0 0 27 62 97 proteína não caractere- zada LOC1092241 19 [Nicotiana g31446b attenuata] 149 150 151

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. glicina - RNAt ligase 2, isoforma cloroplás- tica/ mitocon- drial X2 [Nicotiana sylvestris Para NCG26 g31447 82192312 82223682 ] 0 3,06 cima 28 63 98 Proteína da cauda NCG27 g31448 82255656 82255832 do fago 0 0 29 64 99 Transcrip- tase reversa de endonucle- NCG28 g31449 82301836 82302177 ase 0 0 30 65 100 inibidor do ativador do plasmino- gênio 1 do tipo proteína de ligação a RNA [Nicotiana sylvestris Para NCG29 g31450 82303411 82307034 ] 35,03 40,26 cima 31 66 101 do tipo proteína Para NCG30 g31451 82308544 82312164 RABD2a 29,92 24,36 baixo 32 67 102

RNA-seq Exemplo de (RPKM) 72 h miRNA após a artificial Local cobertura SEQ ID No. maduro Expres- exemplifi- Guia são cativo SEQ exempli relati- ID No. ficati- Nome va em (sentido/ vo de do Gene Descrição LA LA BU21 Antis- RNA SEQ gene No. início fim funcional BU21 BU21 (p<0,1) gDNA cDNA Proteína sentido) ID No. relaciona- da à ras [Nicotiana sylvestris ] Subunidade de NCG31 g31452 82530120 82530440 termossoma 0 0 33 68 103 Trocador de bicarbona- to de sódio eletrone- NCG32 g31453 82618287 82618637 utro 1 0 0 34 69 104 putativa inativa flavonol sintase 2 [Nicotiana sylvestris NCG33 g31454 82642024 82643581 ] 4,26 3,48 35 70 105 Poliproteí NCG34 g31455 82659401 82659712 na Gag-Pol 0 0 36 71 106 proteína DMR6-

OXIGENASE tipo 2 [Nicotiana Para NCG35 g31456 82726641 82728203 tabacum] 5,44 0,9 baixo 37 72 107

Tabela 3: Marcadores dentro e ao redor da região Nic1b. (*) a localização genômica é baseada em um genoma TN90, que também é usado para indicar a localização do gene NCG.

SEQ Alelo de Alelo de Nome do Localização ID Sequência de marcadores SNP baixo alto marcador * No. alcaloide alcaloide

CCAGATGCCCCTAAAAAGTGGTTTGAC

TGTTTCTTNAAGGAAAAACACTCCACA Nb1_SNP9 80.053.989 125 GTTGCAAAGGTACATTA G C

ACCGCACTTGCAGTTTGGTTTCCGTAG

GTGCGGCGNAGCAGAAGCGTCTAACAG Nb1_SNP1 81.179.741 126 GCCACAAAAAAGAAATT C T

TCGAGAGGCATAGACATGTTTACTTCA

TTTCCCCTNGAGGACTGGTTCTGCATA Nb1_SNP2 81.333.419 127 ATAATCGGGTTAAGTGT G A

AATTTAAGAAGGAAATAATTGGTAGTA

ACAGAGGGNATCCAGGTCTCAAAGAGA Nb1_SNP10 81.386.529 128 AATATCACATATTAAAA G A

ACACTCGAAATAACATACGGTTTGTGC

GGGATTTTNGGGGAGGAGTTGCAGGGG Nb1_SNP11 81.540.487 129 TTCAAACTGGTTTTCTT T C

CATCCTCCCAGGCCCTTTCAGTCAGCT

CTTCAGGTNTCTCACGATGCTTCATGT Nb1_SNP12 81.701.916 130 AGCTGTGGTCCGTAGAT T C

TCTAACTCCAAAAGGATAACTTTTCTC

CCAAGTCANATTTTATCCAAGTGTGTT Nb1_SNP13 81.955.719 131 AAGGTTTTTACTAGGTA T C

TACATTCCTTTGACATCCAACTTGGTG

TTTAGTAGNGAAATTTTGACTTATCAA Nb1_SNP3 81.961.686 132 AGAAACATCGTGTAGTC T A

AAGTATTTGTAAGATATTATGAGGTGT

CAGATAGGNATATGATGTAATTGGGTG Nb1_SNP14 82.004.963 133 TCGCCCTTGAAGACCGC G C

ATTGAAACGTACCGTGCCCTATCGGAT

TCAAATGGNGACTCTTGGGTTTCGTGC Nb1_SNP15 82.030.356 134 TCGGGGAATTTATGTCT C T

ATTCATCTTCAAGCATCATATAAAAAT Nb1_SNP4 82.086.894 135 TGGCAATTNTCAATTCTGTAAAAATGG C G

TTGTTCAGTTAGACATA GATAGTAAAAGTGATATGCCTCTAAAG

CACATGTTNGTACAAGCCGACCAGAAG Nb1_SNP16 82.088.111 136 AAGTAATCGTCAATTAC T A

CATGTTGAAATTTCATTAGCACATCTA

AAATATAANAGTAGTTTGATTATTTTG Nb1_SNP17 82.194.591 137 TAAATGCACTAATGAGT A T

ACCAGGCTTAACAGAAAGCTTCACTCG

ATCTATTCNGTTTTGGTTAGAATTCGT Nb1_SNP18 82.243.421 138 TAGGTTTCGTGAAGGAA C T

AACATGCTAATTCTATTAACAGTAACC

CCATACCCNCATGGATTACTGACGTGC Nb1_SNP19 82.300.329 139 TAATTCTATTAACAATA A G

TATACCACACTGCTAGACAAGGTAACT

CCGAAAGANGGGGAGCTTACTGATAAA Nb1_SNP20 82.418.346 140 GCTAAACTCGGGCAACA T C

CTGAACTGGCACGAATTATCGAGGATT

GAACTAACNTGAATATCTGCTCACTGA Nb1_SNP5 82.460.663 141 ACTCACATCAATACCTG A G

GCAATCGAGTTGCAAGCTTTAAATGGT

GAAAGGAANTTTTTGGTGAGTGGTCAT Nb1_SNP21 82.492.227 142 CGAGTCAAGCACTATTA T G

CCCTAGCTAGGGTACTTCTGAACCCTC

CCGAAAATNGGGGCCTCTTATCCTACT Nb1_SNP6 82.554.565 143 GAATCTACTCTCTACCC T C

CTCAAAAGCTCGACCAAATCTACCCGA

CTTCGCATNTGTGGCATGCAAGGTTAA Nb1_SNP7 82.689.866 144 GCCCCAAGCCTTCAAGT C T

CATGAACAACTTCATGACTCAAACCTA

GATCAACANCGTGCTTCAGCCTCTTGC Nb1_SNP8 82.762.168 145 ACCATCTATGAATGTCA G A

Tabela 4: Marcadores SNP muito próximos de vários genes ERF da região Nic1b. (*) a localização genômica é baseada no genoma TN90 de referência.

SEQ Alelo de Alelo de Nome do Localização* ID Sequência de marcadores SNP baixo alto marcador No. alcaloide alcaloide

TGAAAAGGGAGATACTGCTCCTACTTC ATTACAACCGTGCCATAACCAAGGAAG

TAAGTCGCGTGGTGTANACGATCCACC Nb1_SNP22 80718970 193 T C

AAACTGGAGGAGATACAGAGGCGTGAG GCGGCGCCCGTGGGGAAAGTTCGCGGC AGAGAT TTTATTAACTTGAGTTCAGCTTAAATT AACTCATAAGCTAATATGTTTGTAGTC

CAACCTATTAATCTCTNGATAGATTGG Nb1_SNP23 81459075 194 A G

GCAAGTTGAATGGATTTAAGCTCAAAT TACCACCCCGGTATATAGCATAAAAAA ATGAGT

GACTTACATCCTCCCCCGCTTAGGATC Nb1_SNP24 81468245 195 ATTCGTCATCGAATGAGGGTAAAATCT A G

ACCATTATCATCCACTNTGGCCCAACT

ATTACTTCATACACCAGTGGTACCAAA TTTTAACTAACTCCCTAAATTTTCAAA ATTTTT AATAATATGTCTGACCAGCACGATAAG CAGCCCTACCAAAATCTAATGAACCCA

TAGATTATACATTGGANACCAGGCAAT Nb1_SNP25 81639043 196 C T

ATTCTCATGAAAGAAAAAGAAGAAGAA AAAAAAAGCTGCTGGACGACGACTTGT AAATGT TGTTATTTCCCATTTGTAATAAACTAT GTAATGACTCTTAGTATGTGTTTTTAA

TAAATGTCTTTATTACNAAAAAAAAAA Nb1_SNP26 81732473 197 CAAA C, A, CA

AAAGGATGCAGCTAAAGAAACCTGAGA GTAATTGAGGGGTAAATTTCACAAATG GTCATA

CTCTGAATCACATGCTACCTTCTCTAA Nb1_SNP27 81744887 198 T TA

GAGGGGGATTTTGTTTATCATTTTTGT

GCCGATAAAATTGGCCNAAAAAAGGAA GGGAAATAAGAATCCCAAAGATAAAAA AAATTTACAAAGTAAAGAAGGGAGAGA AGGAAA ATTTCAGATGGGATACTTACTGGTTAC ATATTGTTTATGTACTCATACTACACT

TCTGTACTTAATTATANAGTGAGGCAG Nb1_SNP28 81764126 199 T C

GTACATCTTGCTACCAGTCTGGTGCGC GCCCCTAACTTATAGTTCGAGACTTCC ACGGTG TTTTCAGGCTTTCTTTGATGTTGTGTA CTGCAAGTTGTATAATAACACGCCAAA

CAAAGTAGGGTTTGGANAAAAAAAAAT Nb1_SNP29 81867616 200 C CA

AAGAATTCTAAAAAAAAGTAGCTTTTG AAGTTAAGTTGAAAAATTATATTTGGA ATTTGA

TGAAGAGGGTTATGGGGTTTGTTGGTT TTTGGGTTATGTTGCTGAAGCAGAAAA

ATGAAAAAAAACGGGGNGGGGGGGGGG Nb1_SNP30 82281793 201 A AG

AGGTTCGAAGAAGACGACCTCGGGGGG GTTTCAAAAGCTGTGCAGCCTTTTCTG TCAGCT

Exemplo 4: Abordagens transgênicas para desenvolver variedades de tabaco com níveis desejáveis de nicotina.

[0396] As abordagens de superexpressão e supressão são adotadas para investigar a função dos NCGs e desenvolver variedades de tabaco com níveis desejáveis de nicotina. Dois conjuntos de plantas transgênicas são gerados, um sendo uma abordagem de superexpressão usando a sequência de codificação completa e o outro sendo uma abordagem de supressão usando uma sequência artificial de microRNA ou RNAi. Todos os 35 NCGs (NCG1 a NCG35) são testados, com foco em todos os NCGs que exibem expressão diferencial entre TN90 e LA BU21, especialmente os NCGs que codificam proteínas do tipo ERF. Alguns dos estudos de superexpressão são conduzidos em um fundo mutante nic1 nic2 duplo (por exemplo, LA BU21) para testar a capacidade dos genes identificados (individualmente ou em combinação) de complementar ou resgatar o fenótipo mutante de alcaloide baixo de um alelo nic1 mutante.

[0397] Para a expressão de uma sequência de codificação completa ou de uma sequência artificial de microRNA, um vetor de expressão é construído para ter um promotor CsVMV e um terminador NOS, bem como um cassete com um marcador de seleção de canamicina (NPT II) sob a direção de um promotor de actina2 e ter um terminador NOS. Sequências de microRNA artificiais exemplificativas podem ser encontradas na Tabela

2. Um versado na técnica entende que outras sequências alvo podem ser usadas na construção de construtos de supressão ou outra abordagem transgênica para silenciamento de genes (por exemplo, RNAi, siRNA trans-ativador, etc.).

[0398] Os construtos de ácido nucleico transportando transgenes de interesse são introduzidas no disco das folhas de tabaco usando bombardeio de DNA ou uma abordagem biolística. Ver, por exemplo, Sanford et al., 1993, Methods Enzymol., 217:483-510; and Okuzaki and Tabei, 2012, Plant Biotechnology, 29:307-310. Resumidamente, o DNA do plasmídeo que contém o cassete de transformação é revestido com partículas de ouro de 1 µm (DNA/ouro) da seguinte maneira. As partículas de ouro de 1 μm são cozidas a 180°C por 12 horas, e uma solução estoque (40 mg/ml) é preparada. Para fazer uma mistura para 10 doses, 100 μl da solução estoque são misturados com 40 μl de DNA do vetor de expressão (1 μg/μl), 100 μl de 2,5 M CaCl2, e 40 μl de 0.1 M espermidina em um tubo de 1,5 ml. A mistura é centrifugada por 30 s a

13.000 ×g, e o pelete é lavado com 500 μl de etanol a 100%. A mistura DNA/ouro é suspensa em 100 μl de água e 10 μl são aplicados em um macrotransportador, secos e depois bombardeados. Dois tiros são bombardeados por placa usando um disco de ruptura de 1.100 psi sob vácuo parcial (711 mmHg) em um sistema PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Os discos de folhas de tabaco de folhas estreitas Madole (NLM) e Tennessee 90 (TN90) são usados para transformação com os construtos de RNAi e com os construtos de genes de comprimento total. Folhas inteiras de tabaco (com cerca de 45 x 30 mm de comprimento) são colocadas no meio MS durante a noite e o disco da folha é bombardeado com o construto no segundo dia. As folhas são cortadas em pedaços pequenos (cerca de 5 × 5 mm) e substituídas no meio TOM (meio MS com 20 g de sacarose/L; 1 mg/L IAA e 2,5 mg/L BAP) para crescer a 27°C por 3 -5 dias, depois transferido para o meio TOM para crescer, que contém 300 mg/l de canamicina (TOM-

Kan). Os tecidos são transferidos para novas placas TOM-Kan a cada 2-3 semanas, durante 4-6 semanas (27°C, 16 h de luz). Os brotos primários resistentes à canamicina são regenerados de 4 a 6 semanas após o bombardeio. Os brotos são transferidos para placas de MS-canamicina para crescer raiz. As folhas e/ou raízes das plantas T1 (e gerações subsequentes) são então avaliadas para determinar a quantidade de um ou mais alcaloides. Exemplo 5: Mutagênese aleatória para desenvolver novas mutações dentro ou ao redor da Região Nic1b, conferindo um traço de alcaloide baixo

[0399] A mutagênese aleatória dasplantas de tabaco é realizada usando a mutagênese do metanossulfonato de etil (EMS) ou bombardeio rápido de nêutrons. A mutagêneseEMS consiste em induzir quimicamente mutações de pontos aleatórios ao longo do comprimento do genoma. A mutagênese rápida de nêutrons consiste em expor as sementes ao bombardeio de nêutrons, que causa grandes deleções devido à quebra do DNA de fita dupla.

[0400] Para a mutagênese EMS, um grama (aproximadamente

10.000 sementes) de sementes de tabaco Tennessee 90 (TN90) é lavado em 0,1% Tween por quinze minutos e depois embebido em 30 ml de ddH2O por duas horas. Cento e cinquenta (150) µl de EMS a 0,5% (Sigma, No. de Catálogo M-0880) são então misturados à solução de semente/ddH2O e incubados por 8 a 12 horas (girando a 30 rpm) sob um exaustor à temperatura ambiente (RT; aproximadamente 20°C). O líquido é então removido das sementes e misturado com NaOH 1 M durante a noite para descontaminação e descarte. As sementes são então lavadas duas vezes com 100 ml de ddH2O por 2-4 horas. As sementes lavadas foram então suspensas em solução de agar a 0,1%.

[0401] As sementes tratadas com EMS na solução de agar são distribuídas uniformemente sobre a Carolina's Choice Tobacco Mix (Carolina Soil Company, Kinston, Carolina do Norte) em planos a ~ 2000 sementes/plano. Os planos são então cobertos com filme plástico e colocados em uma câmara de crescimento. Quando as mudas emergem do solo, o filme plástico é perfurado para permitir que a umidade diminua gradualmente. O filme plástico é completamente removido após duas semanas. Os planos são transferidos para uma estufa e fertilizados com fertilizante NPK. As mudas são novamente conectadas a uma bandeja de flutuação e cultivadas até o tamanho do transplante. As plantas são posteriormente transplantadas para um campo. Durante o crescimento, as plantas se polinizam para formar sementes M1. No estágio maduro, cinco cápsulas são colhidas de cada planta e designações individuais são dadas ao conjunto de sementes de cada planta. Isso forma a população M1. Um composto de sementes M1 de cada planta M0 é cultivado e as folhas das plantas M1 são coletadas para extração de DNA. Os genes-alvo dentro, ao redor ou flanqueando a região Nic1b são amplificados e sequenciados para identificação da mutação. As mutações são identificadas em todos os 35 NCGs (NCG1 a NCG35), com foco em todos os NCGs que exibem expressão diferencial entre TN90 e LA BU21, especialmente os NCGs que codificam proteínas do tipo ERF. Exemplo 6: Mutagênese direcionada para desenvolver novas mutações dentro ou ao redor da Região Nic1b, conferindo um traço de alcaloide baixo

[0402] As linhagens de tabaco com baixa nicotina, mantendo a alta qualidade das folhas, são produzidas pela introdução de mutações no locus Nic1b (por exemplo, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130,e NCGs) por meio de tecnologias precisas de engenharia de genoma, por exemplo, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição ( TALENs), meganuclease, nuclease de dedo de zinco e CRISPR (sistema Cas9, sistema Cpf1 ou sistema Csm1). Modificações do genoma são feitas em variedades comerciais de tabaco, como TN90, K326 e Narrow Leaf Madole. Todos os 35 NCGs(NCG1 a NCG35) são editados, com foco em todos os NCGs que exibem expressão diferencial entre TN90 e LA BU21, especialmente os NCGs que codificam proteínas do tipo ERF.

[0403] Por exemplo, os RNAs de guia CRISPR são projetados e sintetizados para reconhecer sequências alvo específicas dos genes NCG. Sequências de RNA guia exemplificativos são fornecidas na Tabela 2. RNA(s) guia(s) e um ácido nucleico acompanhante que codifica uma proteína Cas9, Cpf1 ou Csm1 (como uma forma de plasmídeo de DNA ou como uma forma de mRNA) são então usados para transformar protoplastos de tabaco. Os complexos de ribonucleoproteínas CRISPR- Cas9/Cpf1/Csm1 reconhecem sequências alvo específicas de NCG e introduzem uma quebra de fita dupla (DSB). O sistema de reparo de DNA de junção final não homóloga (NHEJ) endógeno fixa o DSB, que pode introduzir a deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos e resultar em possíveis mutações de perda de função. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico doadora com uma sequência desejada é incluída na transformação de protoplastos para servir como uma molécula modelo para introduzir a sequência desejada no ou ao redor do local alvo CRISPR.

[0404] Os protoplastos de tabaco são isolados das folhas de tabaco TN90 que crescem em caixas Magenta em uma câmara de crescimento. Folhas bem expandidas (5 cm) de plantas com 3-4 semanas de idade são cortadas em tiras de 0,5 a 1 mm na parte central de uma folha. As tiras de folhas são transferidas para a solução enzimática preparada (1% de celulase R10, 0,25% de macerozima R10, manitol 0,4 M, KCl 20 mM, MES 20 mM (pH 5,7), CaCl2 10 mM, BSA 0,1%) mergulhando os dois lados das tiras. As tiras de folhas são infiltradas a vácuo por 30 min no escuro usando um exsicador com digestão contínua no escuro por 4 horas a pernoite à temperatura ambiente sem agitação. Os protoplastos são filtrados em filtro de nylon de 100 µm e purificados com 3 ml de Linfoprep. Os protoplastos são centrifugados e lavados com solução W5n (NaCl 154 mM, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES, 991 mg/l glicose pH 5,7) e suspensos em solução W5n na concentração de 5 x 105/ml. Os protoplastos são mantidos em gelo por 30 minutos para se depositarem no fundo do tubo por gravidade. A solução W5n foi movida e os protoplastos foram ressuspensos em solução P2 à temperatura ambiente. 50 µl de DNA (10–20 µg de plasmídeo), 500 µl de protoplastos (2x105 protoplastos) e 550 µl de solução de PEG (40%, v/v 10 ml de 4 g de PEG4000, 0,2 M de manitol, 0,1 M CaCl2) são misturados suavemente um tubo de microcentrífuga de 15 ml e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 5 min.

[0405] Os protoplastos são sedimentados e ressuspensos com 1 ml de 2X 8EN1 (8EN1: MS sal sem NH4NO3, vitamina MS, 0,2% mio-Inositol, 4 mM MES, 1 mg/l NAA, 1 mg/l IAA, 0,5 M manitol, 0,5 mg/l de BAP, 1,5% de sacarose). Os protoplastos transformados são gelificados com igual quantidade de agarose de baixa dosagem (LMA) e 0,2 ml de protoplasto-LAM são descartados para formar uma esfera. 10 ml de 8EN1 são adicionados à esfera e, em 7 dias, são retirados 5 ml de 8EN1 e são adicionados 5 ml de 8EN2 (8EN1 com manitol 0,25 M); após mais 7 dias (14 dias), são retirados 10 ml de 8EN2 e adicionados 10 ml de 8EN2; em outros 7 dias (21 dias), 5 ml de 8EN2 são retirados e 5 ml de 8EN3 (8EN1 com 3% de sacarose e sem manitol) são adicionados; após mais 7 dias (28 dias), são retirados 10 ml de 8EN3 e adicionados 10 ml de 8EN3. Os protoplastos são mantidos por duas semanas até o crescimento do micro-calo. O calo é transferido para o meio sólido NCM até atingir cerca de 5 mm (geralmente cerca de duas semanas). O calo foi transferido para meio sólido TOM-Kan para cultivar brotos e as plantas de tabaco transformadas foram regeneradas usando os métodos aqui descritos. Calos ou plantas regeneradas são testadas e selecionadas para eventos de edição de genes com mutações desejadas nos genes NCG. São gerados alelos de NCG com perda de função (por exemplo, códon de parada precoce ou deslocamento de quadro) ou outros tipos de mutações (por exemplo, ganho de função ou neomórficos).

[0406] Da mesma forma, os genes ERF do locus Nic2 também são editados (ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, and ERF168) usando uma técnica de edição de genoma (por exemplo, sistema de edição CRISPR mediado por Cas9, Cpf1 ou Csm1). São geradas mutações de ERF com perda de função (por exemplo, códon de parada precoce) ou outros tipos de mutações (por exemplo, ganho de função ou neomórfico). Exemplo 7: Uso de repressores dominantes para suprimir o gene do tipo ERF na região Nic1b e gerar tabaco com alcaloide baixo

[0407] Os repressores dominantes são desenvolvidos para um ou mais genes do tipo ERF da região Nic1b (por exemplo, NCG1, NCG11, NCG12, NCG15, NCG16, ERF101, ERF110, ERF16, ERF130,e NCG17) anexando aos seus terminais C um ERF associado motivo de repressão anfifílica (EAR). Quando ligado a um fator de transcrição, o motivo EAR demonstrou reprimir ativamente a expressão dos genes alvo do fator de transcrição (Hiratsu et al., Plant J.34:733–739 (2003)).

[0408] Em resumo, os construtos ERF-EAR são colocados sob o controle de um promotor constitutivo (por exemplo, o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S) e usados para transformar tabaco de tipo selvagem por transformação de protoplastos ou Agrobacterium, gerando linhagens transgênicas para cada construto, bem como uma linhagem de controle que foi transformada com um vetor vazio (VC). A expressão do transgene é validada. Tanto os níveis de nicotina quanto a expressão de enzimas relacionadas à biossíntese de nicotina (putrescina N-metiltransferase (PMT), N-metilputrescina oxidase (MPO), aspartato oxidase (AO), ácido quinolínico sintase (QS), ácido quinolínico fosforibosil transferase (QPT), e oxidoreductase da família PIP A622) e transportadores da família MATE localizados em Tonoplast MATE1 e MATE2 (MATE1/2) são testados, juntamente com o nível de expressão de genes de ornitina decarboxilase (ODC), arginina decarboxilase (ADC), espermidina sintase (SPDS), S-adenosilmetionina decarboxilase (SAMDC), e S- adenosilmetionina sintase (SAMS). Exemplo 8: Reprodução de variedades de tabaco contendo nicotina baixa

[0409] Assistidos pela Região Nic1b identificada, os genes dentro e os marcadores moleculares associados a ela são híbridos, variedades e linhagens de tabaco com alcaloide baixo, que incluem uma mutação nic1b_erf (por exemplo, uma deleção completa ou parcial da Região Nic1b) com qualidade foliar comercialmente aceitável e produzida. Os genes e marcadores de NCG também são usados para rastrear alelos nic1b_erf adicionais de vários germoplasmas de Nicotiana, por exemplo, diferentes espécies de Nicotiana ou linhagens de Nicotiana tabacum. Uma coleção de quarenta e três espécies de Nicotiana, quarenta e nove linhagens de Nicotiana rustica,e aproximadamente seiscentas linhagens de Nicotiana tabacum que podem ser rastreadas é fornecida na Tabela 8 da Patente U.S. 7.700.834.

[0410] O germoplasma identificado como tendo novos alelos nic1b_erf é usado como material de origem para reprodução com tabacos cultivados. Métodos de hibridação interespecíficos ou intraespecíficos combinados com métodos de reprodução padrão, como retrocruzamento ou método de pedigree, podem ser usados para transferir um alelo mutante nic1b_erf ou nic2 desejável da fonte doadora para os tabacos cultivados. Por exemplo, uma variedade de nicotina baixa compreendendo umnic1, nic2, ou ambos alelos mutantes (por exemplo, um progenitor doador como LA Burley 21) é cruzada com uma variedade de elite de nicotina alta com um fundo genético desejável e traços agronômicos de elite. Plantas progênies F1 deste cruzamento são opcionalmente analisadas para um ou mais marcadores moleculares exemplificados na Tabela 3. Uma planta progênie F1 é então cruzada com a variedade de nicotina alta dos progenitores de elite (progenitor recorrente). As plantas da geração BC1 são genotipadas usando marcadores moleculares descritos e divulgados aqui para selecionar plantas de tabaco com segmentos de deleção nic1b_erf ou nic2 menores. Após várias rodadas de retrocruzamento (por exemplo, 5-7 gerações), é obtida uma nova variedade de tabaco de elite compreendendo tanto uma característica de alcaloide baixo quanto outras características desejáveis da linhagem de elite progenitora recorrente. Essa nova variedade de tabaco de elite também é livre para qualquer atrito genético associado à ao traço de alcaloide baixo devido a eventos de recombinação genética em torno dos loci Nic1b e Nic2. Esses eventos de recombinação desvinculam as mutações nic1b_erf e nic2 de quaisquer mutações prejudiciais associadas e, assim, reduzem ou evitam o arrasto genético. Usando a estratégia de seleção assistida por marcadores e reprodução acima, também é possível obter a pirâmide ou empilhamento de um traço de nicotina baixa com outros transgenes ou alelos naturais que reduzem os níveis de alcaloide ou TSNA.

[0411] Os híbridos, variedades ou linhagens de tabaco com alcaloide baixo podem ser feitos como um tipo de tabaco Burley, um tipo escuro, um tipo de conduto, um tipo de Maryland ou um tipo de tabaco Oriental, ou podem ser essencialmente derivados de BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY

171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, `Perique` tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, or VA359, Maryland 609, HB3307PLC, HB4488PLC, KT206LC, KT209LC, KT210LC, KT212LC, R610LC, PVH2310, NC196, KTD14LC, KTD6LC, KTD8LC, PD7302LC, PD7305LC, PD7309LC, PD7318LC, PD7319LC, PD7312LC, ShireyLC ou qualquer variedade comercial de tabaco, de acordo com as técnicas convencionais de reprodução de tabaco conhecidas na técnica. Exemplo 9: Genes adicionais da Região Nic1b

[0412] Vários genes, incluindo um RNA não codificante, são identificados na Região Nic1b. Eles estão listados na Tabela 5. Com exceção do ERF16, todos esses genes exibem níveis de expressão mais altos nas plantas de irmãos TN90 e F5 com alcaloide alto, em comparação com as plantas com irmãos LA BU21 e F5 com alcaloide baixo. O ERF16 parece expressar em níveis relativamente semelhantes em plantas com alcaloide alto e alcaloide baixo. Esses genes adicionais são ainda estudados conforme descrito nos Exemplos 4 a 7. Por exemplo, abordagens de superexpressão e supressão são adotadas para investigar a função desses genes e desenvolver variedades de tabaco com níveis desejáveis de nicotina. Dois conjuntos de plantas transgênicas são gerados, um sendo uma abordagem de superexpressão usando a sequência de codificação completa e o outro sendo uma abordagem de supressão usando uma sequência artificial de microRNA ou RNAi. Além disso, abordagens mutacionais (mutagênese aleatória ou edição direcionada) também são adotadas para produzir alelos mutantes desses genes.

[0413] Os resultados da superexpressão de genes ou segmentos de sequência selecionados de ou ao redor da região Nic1b são fornecidos na Tabela 13 e Figura 3. Um promotor 35S é usado para gerar superexpressão. Os transformantes T0 individuais em LA BU21 são colocados no mesmo dia, incluindo um construto de controle e construtos de superexpressão para ERF130, a região associada a LA deletada no LA BU21 (ou seja, SEQ ID No. 1, referenciada como “Nic1bΔ” que não contém gene anotado, consulte Exemplo 2), g32081 (um gene do tipo beta- glucosidase 18) e ERF16. As plantas são cobertas 12 semanas após o envasamento. Os níveis de alcaloides são determinados pela medição de uma amostra de lâmina foliar reunida nas 3a, 4a, 5a, e 6th folhas do topo da planta e 2 semanas após a cobertura. Quatro ou cinco plantas T0 independentes são testadas para cada construto, com seus níveis médios de alcaloide total ou alcaloides individuais determinados. Conforme mostrado na Figura 3, esse conjunto de dados alcaloides indica que a superexpressão do ERF16 promove a produção de nicotina (um aumento de 76% em relação ao controle). Outros alcaloides menores (incluindo nornicotina, anabasina e anatabina) também aparecem aumentados nas plantas de superexpressão de ERF16, que contribuem para o aumento total de alcaloides em 76% em relação ao controle. Não é observada mudança óbvia nos níveis de nicotina ou alcaloide devido à superexpressão de ERF130, sequência Nic1bΔ ou g32081. Exemplo 10: Vários fatores de transcrição do cromossomo 7 expressam diferencialmente entre as linhagens de tabaco alcaloide normal e alcaloide reduzido

[0414] Listados na Tabela 6, vários fatores de transcrição adicionais são identificados a partir do cromossomo 7 para exibir níveis de expressão diferencial entre BU21 e LA BU21. Esses genes adicionais são ainda estudados conforme descrito nos Exemplos 4 a 7. Por exemplo, abordagens de superexpressão e supressão são adotadas para investigar a função desses genes e desenvolver variedades de tabaco com níveis desejáveis de nicotina. Dois conjuntos de plantas transgênicas são gerados, um sendo uma abordagem de superexpressão usando a sequência de codificação completa e o outro sendo uma abordagem de supressão usando uma sequência artificial de microRNA ou RNAi. Além disso, abordagens mutacionais (mutagênese aleatória ou edição direcionada) também são adotadas para produzir alelos mutantes desses genes. Exemplo 11: Vários genes ERF da região Nic1b estão envolvidos na biossíntese de nicotina

[0415] Os construtos de microRNA artificial ("amiRNA") são projetadas usando uma espinha dorsal MIR6147 para suprimir vários genes ERF de ou perto da região Nic1b (coletivamente referidos como "Nic1b_ERFs"), conforme descrito no Exemplo 4. Alguns microRNAs artificiais são projetados para suprimir Nic1b_ERFs individuais especificamente. Outros microRNAs são projetados para direcionar vários Nic1b_ERFs simultaneamente. Algumas sequências de microRNA artificiais maduras exemplificativas são fornecidas na Tabela 2.

[0416] As plantas T0 transformadas com um construto de amiRNA específico de Nic1b_ERF são colocadas em vasos no mesmo dia que suas plantas de controle correspondentes com um construto de amiRNA-GUS. O tecido da raiz para estudos de expressão de gene é coletado das plantas enquanto é envasado novamente em vasos maiores. Os níveis de alcaloides são determinados pela medição de uma amostra de lâmina foliar reunida nas 3a, 4a, 5a, e 6a folhas do topo da planta e 2 semanas após a cobertura. Em resumo, aproximadamente 0,5 g de tabaco é extraído usando extração líquido/líquido em um solvente orgânico contendo um padrão interno e analisado por cromatografia em fase gasosa (GC) com detecção por ionização por chama (FID). Os resultados podem ser relatados como porcentagem em peso (% em peso), tanto na forma como é ou no peso seco. A comunicação de dados com base no peso seco requer uma determinação de voláteis no forno (OV). Salvo indicação em contrário, os níveis totais ou individuais de alcaloides ou os níveis de nicotina mostrados aqui são com base no peso seco (por exemplo, percentual de alcaloide total ou percentual de nicotina). A triagem preliminar da expressão de gene é realizada usando o método qPCR multiplex com actina como controle no QuantStudio 5 ou QS12K (ThermoFisher Scientific). Um subconjunto selecionado de plantas também é rastreado em um OpenArray personalizado com 18 genes em triplicado, incluindo o gene de controle de actina no instrumento QuantStudio QS 12K.

[0417] A Tabela 7 resume os dados de alcaloides de um conjunto de transformantes T0 independentes que suprimem Nic1b_ERFs selecionados por meio de microRNA artificial. Com algumas exceções (por exemplo, 18GH2083), suprimir Nic1b_ERFs individuais por meio de microRNA artificial reduz a nicotina no fundo HI BU21 (ou seja, mutante único de nic2 ), mas não no fundo de tipo selvagem (por exemplo, t-NL Madole (PhPh) SRC) ((Tabelas 7 a 9). Isso pode sugerir redundância entre Nic1b_ERFs e também indica que o mutante único de nic2 fornece um fundo mais sensibilizado para avaliar o papel de cada Nic1b_ERF individual na regulação da nicotina. Nas plantas HI BU21, suprimir Nic1b_ERFs individuais reduz os níveis de nicotina para aproximadamente 50% a 90% das plantas de controle (Tabela 7 e Figura 4). A redução de nicotina observada nas plantas de amiRNA é consistente com a expressão de gene reduzida para múltiplos genes biossintéticos da nicotina (Tabela 10).

[0418] Asplantas T 1 são produzidas e analisadas posteriormente quanto a razões de segregação da resistência à canamicina, níveis de alcaloides e expressão de gene biossintética da nicotina. Cruzamentos são feitos para trazer vários amiRNAs em uma única planta para suprimir vários Nic1b_ERFs simultaneamente. Exemplo 12: Modulação dos níveis de nicotina através da manipulação de genes ERF associados aos loci Nic1b e/ou Nic2.

[0419] Para atingir níveis desejáveis de nicotina no tabaco, dois grupos de genes ERF são manipulados por superexpressão ou suprarregulação e por abordagens transgênicas ou mutagênicas. Cada grupo de ERFs está agrupado em torno da região Nic1b ou Nic2. O primeiro grupo de ERFs inclui ERF101, ERF110, ERFnew, ERF199, ERF19, ERF130, ERF16, ERF29, ERF210, e ERF91L2, encontrados aqui para agrupar em torno da região Nic1b (individualmente Nic1b_ERF e coletivamente Nic1b_ERFs). Consulte a Tabela 11 e Kajikawa et al.,, Plant physiol. 2017, 174:999-1011. Os membros principais desse primeiro grupo de ERF ERFnew, ERF199, ERF19, ERF29, ERF210, e ERF91L2. Este primeiro grupo também pode incluir o JRE5L2. O segundo grupo de ERFs inclui ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168 (individualmente Nic2_ERF e coletivamente Nic2_ERFs) que parecem ser deletados em HI BU21 (ou seja, um mutante único de nic2). Consulte Shoji et al., Plant Cell, (10):3390-409 (2010). Os membros principais do segundo grupo incluem ERF189 e ERF115. Este segundo grupo também pode ser expandido para um grupo maior, incluindo ERF163, ERF91L1, ERF104∆C, ERF221, ERF115, ERF168, ERF17, ERF179, ERF17L1, ERF189, ERF17L2∆C, JRE5L1, ERF104L1∆C, e ERF168L1∆C. Consulte a Tabela 12 e Kajikawa et al.,, Plant physiol. 2017, 174:999-1011.

[0420] As abordagens transgênicas incluem a supressão de genes baseada em interferência de RNA (por exemplo, antissentido, cossupressão, RNAi baseado em repetição invertida ou em hairpin, microRNA artificial, RNA de pequena interferência (ta-si) artificial de trans-ativador) e supressores negativos dominantes (por exemplo, motivo de repressão anfifílica (ERA) associada a ERF). A supressão baseada em transgene ou baseada em cisgene pode ser direcionada a um único gene ERF especificamente, ou a um subconjunto de genes ERF simultaneamente. Os supressores negativos dominantes podem ser produzidos cisgenicamente, por exemplo, batendo em uma sequência de codificação de motivo EAR no quadro com uma sequência de codificação endógena de ERF.

[0421] As abordagens mutagênicas incluem mutagênese aleatória tanto quimicamente (por exemplo, TILLING baseada em EMS) ou fisicamente (por exemplo, irradiação) e edição de genoma. Quaisquer técnicas de edição de genoma descritas aqui podem ser usadas e incluem, por exemplo, TALENs, meganuclease, nuclease de dedo de zinco e CRISPR (sistema Cas9, sistema Cpf1 ou sistema Csm1.

[0422] Abordagens transgênicas ou mutagênicas são usadas para gerar alelos mutantes do primeiro e segundo grupos de ERFs, concentrando-se nos membros principais. Alelos de perda de função (nulos) e alelos mutantes fracos são produzidos. Várias combinações de alelos mutantes Nic2_ERF são produzidas para suprimir o nível ou atividade de Nic2_ERFs e potencialmente para o nível ou atividade semelhante ao alelo mutante nic2encontrado em HI BU21 ou LA FC53. Várias combinações de alelos mutantes Nic1b_ERF são produzidas para suprimir o nível ou atividade de Nic1b_ERFs e potencialmente para o nível ou atividade semelhante ao alelo mutante nic1 encontrado em LI BU21 ou LA FC53. Uma combinação adicional de alelos mutantes em vários genes Nic2_ERF e Nic1b_ERF é gerada ou introgressada em uma única planta de tabaco para produzir uma linhagem de tabaco de alcaloide baixo com níveis de nicotina e alcaloide total semelhantes aos encontrados em LA BU21, LA FC53 ou LN KY171.

Tabela 5: Genes adicionais da Região Nic1b ou de suas vizinhanças no cromossomo 7. As posições genômicas inicial e final são fornecidas com base no genoma TN90 de referência.

Os números de identificação de sequência (SEQ ID Nos.) são fornecidos para as sequências de DNA de codificação genômicas (incluindo íntron (s) se aplicável), sequências de cDNA e proteínas ou outras sequências de RNA codificadas para cada um dos genes.

Nome do gene Chr Início Parada Descrição do gene gDNA cDNA Produto de proteína ou RNA

Nt_Nic1_ncRNA1 Chr7 82278764 82281886 Nicotiana tabacum não caracterizada 152 157 162 a 179

LOC107772192, ncRNA

ERF101 Chr7 79268220 79268714 Fator de transcrição responsivo ao etileno de 202 204 206

(g31383) Nicotiana tabacum

ERF110 Chr7 80719601 80718555 Fator de transcrição responsivo ao etileno de 203 205 207

(PB19937) Nicotiana tabacum

ERF16 Chr7 81736466 81737137 Fator de transcrição responsivo ao etileno tipo 153 158 180

2 de Nicotiana tabacum

ERF130 Chr7 81730582 81731212 Fator de transcrição responsivo ao etileno tipo 154 159 181

2 de Nicotiana tabacum (LOC107802085)

g32081 Chr7 11557571 11561989 Nicotiana tabacum beta-glucosidase tipo 18 155 160 182

(LOC107766388), variante de transcrição X1,

mRNA g32082 Chr7 11562016 11564044 Nicotiana tabacum beta-glucosidase tipo 18 156 161 183

(LOC107766388), variante de transcrição X2,

mRNA

Tabela 6: Fatores de transcrição do cromossomo 7 exibindo expressão diferencial entre as linhagens de tabaco alcaloide normal e alcaloide reduzido.

As posições genômicas inicial e final são fornecidas com base no genoma TN90 de referência.

Nome do Chr Início Parada Descrição do gene gDNA cDNA Produto de gene proteína/codificado g33110 Chr7 158878946 158879671 A0A1J6KC41_NICAT, fator de transcrição 184 187 190 responsivo ao etileno 1b g33196 Chr7 162789270 162791192 G7LHR2_MEDTR, fator de transcrição da 185 188 191 família Basic Helix Loop Helix (BHLH)

g31395 Chr7 79994750 79997309 Fator de transcrição da família Myb 186 189 192

Tabela 7: Um conjunto de transformantes T0 demonstra que a supressão de Nic1b_ERFs individuais via microRNA artificial reduz a nicotina no fundo HI BU21 (isto é, t-HI Burley 21, um mutante único de nic2 ). Uma espinha dorsal MIR6147 é usada para microRNA artificial ("aMIR6147"). A coluna "% Conv" representa a porcentagem de conversão de nicotina em nornicotina.

O nível médio de nicotina de múltiplos transformantes de controle T0 GUS é usado para determinar os níveis relativos de nicotina em cada um dos transformantes individuais Nic1b_ERF amiRNA T0. As plantas são cobertas 16 semanas após o envasamento inicial com amostras de folhas coletadas 2 semanas depois para análise de alcaloides. % Média % de de nicotina ID da Total % Média nicotina Gene/ Norni- Anaba- Anata- % em Planta Variedade Nicotina de de em Construto cotina sina bina Conv relação T0 Alks nicotina relação ao ao controle controle ag- t-HI 18GH1968 aMIR6147 1,567 0,032 0,006 0,036 1,641 2,0% 50% Burley 21 _g31420 ag- t-HI 18GH1972 aMIR6147 1,583 0,029 0,007 0,041 1,661 1,8% 50% 1,64 52% Burley 21 _g31420 ag- t-HI 18GH1973 aMIR6147 1,780 0,036 0,008 0,036 1,860 2,0% 56% Burley 21 _g31420 ag- t-HI 18GH1993 aMIR6147 2,281 0,053 0,010 0,044 2,386 2,3% 72% Burley 21 _g31436 ag- t-HI 18GH1997 aMIR6147 2,279 0,049 0,010 0,045 2,383 2,1% 72% 2,27 72% Burley 21 _g31436 ag- t-HI 18GH1998 aMIR6147 2,265 0,051 0,009 0,045 2,370 2,2% 72% Burley 21 _g31436

% Média % de de nicotina ID da Total % Média nicotina Gene/ Norni- Anaba- Anata- % em Planta Variedade Nicotina de de em Construto cotina sina bina Conv relação T0 Alks nicotina relação ao ao controle controle ag- t-HI 2,60 18GH1981 aMIR6147 3,237 0,085 0,014 0,063 3,400 102% Burley 21 % _g31430 ag- t-HI 2,20 18GH1984 aMIR6147 2,561 0,057 0,009 0,030 2,656 81% Burley 21 % _g31430 ag- t-HI 2,40 18GH1985 aMIR6147 2,800 0,069 0,013 0,055 2,937 89% 2,83 89% Burley 21 % _g31430 ag- t-HI 2,40 18GH1986 aMIR6147 2,813 0,070 0,013 0,055 2,951 89% Burley 21 % _g31430 ag- t-HI 2,30 18GH1987 aMIR6147 2,722 0,064 0,012 0,050 2,848 86% Burley 21 % _g31430 ag- t-HI 2,40 18GH1989 aMIR6147 2,643 0,065 0,013 0,057 2,777 84% Burley 21 % _g31435 ag- t-HI 2,50 18GH1990 aMIR6147 3,494 0,090 0,016 0,058 3,658 110% 2,92 92% Burley 21 % _g31435 ag- t-HI 2,00 18GH1992 aMIR6147 2,628 0,055 0,012 0,049 2,744 83% Burley 21 % _g31435 ag- t-HI 2,60 18GH2001 aMIR6147 3,280 0,089 0,015 0,074 3,458 104% Burley 21 % _g31437 ag- t-HI 2,40 18GH2002 aMIR6147 2,958 0,071 0,011 0,052 3,092 93% Burley 21 % _g31437 2,94 93% ag- t-HI 8,00 18GH2003 aMIR6147 2,836 0,247 0,014 0,077 3,173 90% Burley 21 % _g31437 ag- t-HI 2,00 18GH2006 aMIR6147 2,770 0,058 0,013 0,064 2,904 88% Burley 21 % _g31437

% Média % de de nicotina ID da Total % Média nicotina Gene/ Norni- Anaba- Anata- % em Planta Variedade Nicotina de de em Construto cotina sina bina Conv relação T0 Alks nicotina relação ao ao controle controle ag- t-HI 2,50 18GH2007 aMIR6147 3,046 0,079 0,015 0,064 3,204 96% Burley 21 % _g31437 ag- t-HI 2,10 18GH2008 aMIR6147 2,752 0,058 0,012 0,062 2,884 87% Burley 21 % _g31437 t-HI ag-GUS- 18GH2014 3,524 0,101 0,013 0,043 3,682 2,8% Burley 21 amiR6147 t-HI ag-GUS- 18GH2015 2,998 0,075 0,013 0,053 3,138 2,4% Burley 21 amiR6147 100% 3,16 100% t-HI ag-GUS- 18GH2016 2,924 0,091 0,013 0,056 3,084 3,0% Burley 21 amiR6147 t-HI ag-GUS- 18GH2017 3,208 0,084 0,013 0,054 3,358 2,5% Burley 21 amiR6147

Tabela 8: Um segundo conjunto de plantas t0transformadas com microRNAs artificiais direcionando Nic1b_ERFs individuais no fundo HI BU21 (isto é, t-HI Burley 21, um mutante único de nic2 ). Este conjunto de plantas T0 são cobertas 15 semanas após o envasamento inicial com amostras de folhas coletadas 2 semanas depois para análise de alcaloides.

Em comparação com as plantas da Tabela 7, essas plantas são cobertas uma semana antes, o que pode resultar em falta de consistência nas plantas de controle (o nível de nicotina varia de 1,52% a 2,78%) e, portanto, as plantas de amiRNA não apresentam uma redução consistente da nicotina.

O mesmo conjunto de construtos de amiRNA da Tabela 7 é usado.

A coluna "% Conv" representa a porcentagem de conversão de nicotina em nornicotina.

O nível médio de nicotina de múltiplos transformantes de controle T0 GUS é usado para determinar os níveis relativos de nicotina em cada um dos transformantes individuais Nic1b_ERF amiRNA T0. % de % Média nicotina ID da de Gene/ Nico- Norni- Anaba- Anata- Total em Planta Variedade % Conv nicotina Construto tina cotina sina bina de Alks relação T0 no ao controle controle ag- t-HI 18GH2052 aMIR6147_ 2,143 0,047 0,010 0,051 2,251 2,15% 108% Burley 21 g31420 ag- t-HI 18GH2058 aMIR6147_ 3,870 0,098 0,015 0,056 4,038 2,46% 196% Burley 21 g31420 ag- t-HI 18GH2059 aMIR6147_ 1,428 0,028 0,006 0,037 1,499 1,94% 72% Burley 21 g31420 ag- t-HI 18GH2062 aMIR6147_ 2,300 0,051 0,010 0,049 2,410 2,18 116% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2063 aMIR6147_ 2,398 0,051 0,011 0,054 2,514 2,08% 121% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2064 aMIR6147_ 2,019 0,045 0,009 0,045 2,118 2,19% 102% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2065 aMIR6147_ 1,978 0,044 0,009 0,045 2,077 2,19% 100% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2066 aMIR6147_ 1,570 0,033 0,007 0,042 1,652 2,06% 79% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2067 aMIR6147_ 2,211 0,065 0,010 0,052 2,337 2,85% 112% Burley 21 g31430 ag- t-HI 18GH2069 aMIR6147_ 2,875 0,065 0,012 0,056 3,009 2,22% 146% Burley 21 g31435 ag- t-HI 18GH2070 aMIR6147_ 2,764 0,060 0,012 0,057 2,892 2,12% 140% Burley 21 g31435

% de % Média nicotina ID da de Gene/ Nico- Norni- Anaba- Anata- Total em Planta Variedade % Conv nicotina Construto tina cotina sina bina de Alks relação T0 no ao controle controle ag- t-HI 18GH2071 aMIR6147_ 2,698 0,061 0,012 0,062 2,832 2,23% 137% Burley 21 g31435 ag- t-HI 18GH2072 aMIR6147_ 1,968 0,043 0,009 0,044 2,064 2,15% 100% Burley 21 g31435 ag- t-HI 18GH2074 aMIR6147_ 2,890 0,058 0,011 0,058 3,017 1,97% 146% Burley 21 g31435 ag- t-HI 18GH2075 aMIR6147_ 3,381 0,070 0,010 0,039 3,499 2,02% 171% Burley 21 g31435 ag- t-HI 18GH2078 aMIR6147_ 2,450 0,050 0,011 0,053 2,564 2,01% 124% Burley 21 g31436 ag- t-HI 18GH2082 aMIR6147_ 1,986 0,046 0,009 0,045 2,086 2,25% 101% Burley 21 g31437 t-HI ag-GUS- 18GH2084 1,539 0,036 0,008 0,034 1,616 2,28% Burley 21 amiR6147 t-HI ag-GUS- 18GH2085 2,060 0,050 0,009 0,046 2,165 2,38% Burley 21 amiR6147 1,975 100% t-HI ag-GUS- 18GH2086 1,520 0,035 0,007 0,033 1,594 2,23% Burley 21 amiR6147 t-HI ag-GUS- 18GH2087 2,782 0,064 0,011 0,040 2,896 2,23% Burley 21 amiR6147 SRC t-NL ag- 18GH2083 Madole aMIR6147_ 1,386 0,005 0,006 0,023 1,420 0,37% 69% (PhPh) g31437 SRC t-NL ag-GUS- 18GH2088 Madole 2,003 0,006 0,007 0,033 2,049 0,30% 100% amiR6147 (PhPh)

Tabela 9: Um conjunto de plantas T0transformadas com microRNAs artificiais direcionando Nic1b_ERFs individuais no fundo SRC t-NL Madole (PhPh) (ou seja Narrow Leaf Madole com resistência à haste preta e mutações em três genes da nicotina desmetilase para redução da nornicotina). Este conjunto de plantas T0 são cobertas 18 semanas após o envasamento inicial com amostras de folhas coletadas 2 semanas depois para análise de alcaloides.

Comparadas às plantas da Tabela 7, essas plantas são cobertas duas semanas depois.

Nenhuma redução consistente de nicotina é observada neste conjunto de plantas, o que indica que o mutante único nic2 fornece um fundo mais sensibilizado para avaliar o papel individual de Nic1b_ERF na regulação da nicotina em comparação com o fundo de tipo selvagem (por exemplo, t-NL Madole (PhPh) SRC). O mesmo conjunto de construtos de amiRNA da Tabela 7 é usado.

O nível médio de nicotina de múltiplos transformantes de controle T0 GUS é usado para determinar os níveis relativos de nicotina em cada um dos transformantes individuais Nic1b_ERF amiRNA T0. ID da Variedade Gene/ Nico- Norni- Anaba- Anata- Total % Conv % Média % de Planta Construto tina cotina sina bina de de nicotina T0 Alks nicotina em no relação controle ao controle 18GH1819 SRC t-NL ag- 2,975 0,016 0,010 0,043 3,044 0,52% 129% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31420 18GH1821 SRC t-NL ag- 2,480 0,009 0,009 0,048 2,546 0,36% 108% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31420

18GH1822 SRC t-NL ag- 2,294 0,012 0,009 0,049 2,365 0,51% 100% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31420 18GH1825 SRC t-NL ag- 2,258 0,009 0,008 0,044 2,318 0,38% 98% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31420 18GH1830 SRC t-NL ag- 2,487 0,013 0,010 0,054 2,564 0,52% 108% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31430 18GH1834 SRC t-NL ag- 2,482 0,009 0,010 0,052 2,554 0,37% 108% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31430 18GH1835 SRC t-NL ag- 1,944 0,007 0,007 0,038 1,996 0,34% 84% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31430 18GH1836 SRC t-NL ag- 2,111 0,009 0,008 0,040 2,168 0,42% 92% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31430 18GH1837 SRC t-NL ag- 2,093 0,010 0,008 0,034 2,145 0,48% 91% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31430 18GH1838 SRC t-NL ag- 2,701 0,012 0,010 0,050 2,772 0,43% 117% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1839 SRC t-NL ag- 2,035 0,010 0,007 0,033 2,086 0,50% 88% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1840 SRC t-NL ag- 2,166 0,008 0,007 0,032 2,213 0,35% 94% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1841 SRC t-NL ag- 3,534 0,013 0,010 0,049 3,606 0,37% 153% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1842 SRC t-NL ag- 2,271 0,010 0,008 0,038 2,326 0,43% 99% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1843 SRC t-NL ag- 2,891 0,013 0,011 0,051 2,966 0,43% 126% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1844 SRC t-NL ag- 2,249 0,010 0,008 0,036 2,302 0,44% 98% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31435 18GH1847 SRC t-NL ag- 2,349 0,011 0,009 0,042 2,411 0,45% 102% Madole aMIR6147_

(PhPh) g31437

18GH1848 SRC t-NL ag- 2,437 0,013 0,009 0,049 2,508 0,51% 106% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31437 18GH1849 SRC t-NL ag- 2,714 0,013 0,011 0,056 2,793 0,46% 118% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31437 18GH1850 SRC t-NL ag- 2,155 0,007 0,008 0,037 2,207 0,31 94% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31437 18GH1853 SRC t-NL ag- 2,340 0,011 0,008 0,043 2,402 0,46% 102% Madole aMIR6147_ (PhPh) g31437 18GH1902 SRC t-NL ag-GUS- 2,493 0,009 0,008 0,046 2,556 0,35% 2,304 100% Madole amiR6147 (PhPh) 18GH1903 SRC t-NL ag-GUS- 2,132 0,013 0,008 0,041 2,194 0,60% Madole amiR6147 (PhPh) 18GH1905 SRC t-NL ag-GUS- 2,286 0,012 0,009 0,042 2,348 0,50% Madole amiR6147 (PhPh)

Tabela 10: Expressão de gene em transformantes de T0 de microRNA artificiais Nic1b_ERF selecionados. "% Exp" refere-se ao nível de expressão percentual em relação ao nível médio de expressão com base em múltiplos transformantes T0 de controle.

A redução da nicotina está correlacionada com a supressão do alvo Nic1b_ERF pretendido e a expressão reduzida de múltiplos genes biossintéticos da nicotina (PMT1a, BBLa, A622, ODC, MATE2, QPT2_2). Todos os transformantes estão no fundo t-HI Burley 21. ND significa não determinado. % de Razões ID da Gene/ nico- % Exp % Exp % Exp % de % Exp % Exp. % Exp de % Exp % Exp Planta Constru- tina de de de Exp de de de de tria- de BBLa de ODC T0 to em g31420 g31436 PMT1a A622 MATE2 QPT2_2 g31430 gem de rela- Canami ção -cina ao - com- Aprox. trole ag- 18GH1968 aMIR6147 50% 1,23% ND 39,66% 52,60% 51,70% 59,50% 40,80% 85,40% 79,90% 3:1 -g31420 ag- 18GH1972 aMIR6147 50% 0,88% ND 31,68% 72,40% 60,10% 88,00% 51,00% 87,90% 114,50% 15:1 -g31420 ag- 18GH1973 aMIR6147 56% ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND -g31420 ag- 18GH1993 aMIR6147 72% ND 36,20% 18,53% 29,60% 29,40% 41,00% 43,50% 40,70% 43,80% 7:1 -g31436 ag- 18GH1997 aMIR6147 72% ND 47,98% 14,58% 44,30% 32,60% 68,10% 51,70% 42,90% 58,40% 8:1 -g31436 ag- 18GH1998 aMIR6147 72% ND 57,59% 41,16% 52,40% 52,00% 95,80% 80,20% 88,80% 106,00% 3:1 -g31436 ag-GUS- 18GH2014 100% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% ND amiR6147

Tabela 11: Genes deERF selecionados na região Nic1b ou nas proximidades.

As coordenadas genômicas de cada gene ERF são mostradas como Início e Parada no Cromossomo 7. A nomenclatura do ERF é baseada em Rushton et al., TOBFAC: the database of tobacco transcription factors, BMC Bioinformatics 2008, 9:53. A sequência de DNA de cada um dos Nic1b_ERF é obtida de um conjunto de dados TobFac e usada para sondar um banco de dados do genoma do tabaco para identificar modelos de genes anotados, transcritos e coordenadas cromossômicas.

Os números de identificação de sequência (SEQ ID Nos.) são fornecidos para as sequências de DNA de codificação genômicas (incluindo íntron (s) se aplicável),

sequências de cDNA e sequências polipeptídicas para cada um dos genes.

Nomes NCG SEQ ID SEQ ID Genes Modelos Início no Parada no SEQ ID (cDNA) (polipep- Nic1b_ERF Genéticos Cromossomo 7 Cromossomo 7 (gDNA) tídeo) ERF101 g31383 79268220 79268714 202 204 206 ERF110 PB19937 80719601 80718555 203 205 207 ERFnew NCG1 g31420 80937073 80937738 3 38 73 ERF199 NCG11 g31430 81460624 81461723 13 48 83 ERF19 NCG12 g31431 81636848 81635930 14 49 84 ERF130 ERFX 81730359 81731329 154 159 181 ERF16 ERFY 81737110 81736524 153 158 180 ERF29 NCG15 g31435 81752464 81753174 17 52 87 ERF210 NCG16 g31436 81848001 81849291 18 53 88 ERF91L2 NCG17 g31437 81862817 81861981 19 54 89 Tabela 12: Genes deERF selecionados na região Nic2 ou nas proximidades. As coordenadas genômicas de cada gene ERF são mostradas como Início e Parada no Cromossomo 19. A nomenclatura do ERF é baseada em Rushton et al., TOBFAC: the database of tobacco transcription factors, BMC Bioinformatics 2008, 9:53; Shoji et al., Plant Cell, (10):3390-409 (2010); and Kajikawa et al.,, Plant physiol. 2017, 174:999-1011. A sequência de DNA de cada um dos Nic2_ERF é obtida de um conjunto de dados TobFac ou do banco de dados NCBI e usada para sondar um banco de dados do genoma do tabaco para identificar modelos de genes anotados, transcritos e coordenadas cromossômicas. Os números de identificação de sequência (SEQ ID Nos.) são fornecidos para as sequências de DNA de codificação genômicas (incluindo íntron (s) se aplicável), sequências de cDNA e sequências polipeptídicas para cada um dos genes.

Início no Parada no SEQ ID SEQ ID SEQ ID Genes Nic2_ERF Cromossomo 19 Cromossomo 19 (gDNA) (cDNA) (polipeptídeo) ERF189 148554599 148553901 208 215 222 ERF179 148680850 148679678 209 216 223 ERF17 148753080 148753607 210 217 224 ERF168 148760173 148758997 211 218 225 ERF115 148902094 148903201 212 219 226 ERF104 148990254 148989572 213 220 227 ERF221 149009545 149008422 214 221 228 Tabela 13:A superexpressão do ERF 16, mas não do ERF130, a região associada a LA excluída no LA BU21 (ou seja, SEQ ID No. 1, referenciada como “Nic1bΔ” que não contém gene anotado, consulte o Exemplo 2) ou g32081 (um gene tipo beta-glucosidase 18 ) resulta em aumento da nicotina e alcaloide total no LA BU21. O construto de controle é listado como ag-45EV.

Alcalóides (%) ID GH Variedade Gene Nicotina Nornicotina Anabasina Anatabina Total Conversão Nicotina Nível de de Alks Média (%) nicotina em relação ao controle

18GH2379 t-LA ag-45EV 0,1306 0,0026 0,0013 0,0059 0,1404 2,0% 0,143 100% Burley 21 18GH2380 t-LA ag-45EV 0,1372 0,0019 0,0013 0,0094 0,1498 1,4% Burley 21 18GH2381 t-LA ag-45EV 0,1198 0,0034 0,0009 0,0064 0,1305 2,8% Burley 21 18GH2433 t-LA ag-45EV 0,187 0,0022 0,0009 0,0078 0,1979 1,2% Burley 21 18GH2434 t-LA ag-45EV 0,1397 0,0018 0,0008 0,0058 0,1481 1,3% Burley 21 18GH2382 t-LA ag- 0,1351 0,0017 0,001 0,0065 0,1443 1,2% 0,148 104% Burley 21 ERF130 18GH2383 t-LA ag- 0,1242 0,0027 0 0,0053 0,1322 2,1% Burley 21 ERF130 18GH2384 t-LA ag- 0,1923 0,0028 0,0016 0,0103 0,207 1,4% Burley 21 ERF130 18GH2385 t-LA ag- 0,1794 0,0043 0,0014 0,0091 0,1942 2,3% Burley 21 ERF130 18GH2386 t-LA ag- 0,11 0,0014 0,0007 0,0052 0,1173 1,3% Burley 21 ERF130 18GH2400 t-LA ag- 0,1297 0,0047 0,001 0,0089 0,1443 3,5% 0,139 97% Burley 21 Nic1bΔ 18GH2401 t-LA ag- 0,1196 0,0018 0,0007 0,0059 0,128 1,5% Burley 21 Nic1bΔ 18GH2402 t-LA ag- 0,129 0,0019 0,0009 0,007 0,1388 1,5% Burley 21 Nic1bΔ 18GH2403 t-LA ag- 0,1771 0,0022 0,0012 0,0101 0,1906 1,2% Burley 21 Nic1bΔ 18GH2404 t-LA ag- 0,1393 0,0016 0,0009 0,0066 0,1484 1,1% Burley 21 Nic1bΔ 18GH2429 t-LA ag- 0,1981 0,0028 0,0016 0,0086 0,2111 1,4% 0,155 108% Burley 21 g32081 18GH2430 t-LA ag- 0,1511 0,0024 0,0013 0,0079 0,1627 1,6% Burley 21 g32081 18GH2431 t-LA ag- 0,1586 0,0023 0,0013 0,0067 0,1689 1,4% Burley 21 g32081

18GH2432 t-LA ag- 0,1106 0,0017 0,0012 0,0061 0,1196 1,5% Burley 21 g32081 18GH2444 t-LA ag- 0,4085 0,0066 0,0025 0,0256 0,4432 1,6% 0,252 176% Burley 21 ERF16 18GH2445 t-LA ag- Burley 21 ERF16 0,1733 0,0026 0,0012 0,0081 0,1852 1,5% 18GH2446 t-LA ag- Burley 21 ERF16 0,2248 0,0029 0,0016 0,0103 0,2396 1,3% 18GH2447 t-LA ag- Burley 21 ERF16 0,1604 0,002 0,0013 0,0074 0,1711 1,2% 18GH2448 t-LA ag- Burley 21 ERF16 0,319 0,0045 0,0018 0,0182 0,3435 1,4% 18GH2449 t-LA ag- Burley 21 ERF16 0,2257 0,0027 0,0015 0,0105 0,2404 1,2%

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta de tabaco, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação em um locus Nic1b_ERF, em que a referida planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA de 50 ou mais.

2. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida plana de tabaco é um planta Nicotiana tabacum.

3. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende ainda uma mutação em um gene ERF de um locus Nic2.

4. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende ainda uma ou mais mutações em dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, ou todos os sete genes selecionados do grupo consistindo em ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17, e ERF168.

5. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA de 70 ou mais.

6. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA comparável àquele de uma planta de controle quando crescida e curada em condições semelhantes, em que a referida planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a referida planta de tabaco, exceto a referida mutação.

7. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende nicotina em um nível abaixo de 40% do nível de nicotina de uma planta de controle quando crescida em condições de crescimento semelhantes, em que a referida planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a referida planta de tabaco, exceto a referida mutação.

8. Planta de tabaco, ou parte dela, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende um nível de nicotina inferior a 2,0%.

9. Planta de tabaco, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação não transgênica em um locus Nic1b_ERF, em que a referida mutação não transgênica reduz o nível de nicotina da referida planta de tabaco até menos de 60% do nível de nicotina de uma planta de controle quando crescida em condições de crescimento semelhantes, em que a referida planta de tabaco é capaz de produzir uma folha, quando curada, tendo um valor de índice de grau USDA comparável ao valor de índice de grau USDA da referida planta de controle e em que a referida planta de controle compartilha um fundo genético essencialmente idêntico com a referida planta de tabaco, exceto referida mutação não transgênica, em que a referida planta de tabaco é um planta Nicotiana tabacum..

10. População caracterizada pelo fato de ser das plantas de tabaco conforme definida com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Material de tabaco curado, caracterizado pelo fato de ser da planta de tabaco conforme definida com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

12. Material de tabaco curado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura de conduto, cura de ar, cura de fogo e cura de sol.

13. Mistura de tabaco, caracterizada pelo fato de que compreende o referido material de tabaco curado conforme definido com a reivindicação 11.

14. Produto de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende o material de tabaco curado conforme definido com a reivindicação 11.

15. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco picado e tabaco cortado.

16. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça.

17. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco sem fumaça é selecionado do grupo que consiste em tabaco de mascar de folha solta, tabaco de mascar de fumo de rolo, rapé úmido e rapé nasal.

18. Planta de tabaco, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação em um locus Nic1b_ERF, em que a referida mutação está ausente de LA Burley 21, LAFC53 e LN KY171.

19. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende ainda uma mutação em um gene ERF de um locus Nic2.

20. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida mutação está localizada dentro de uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54 e 202 a 205 e fragmentos das mesmas.

21. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida mutação está localizada dentro de um gene codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade para uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 73, 83, 84, 87, 88, 89, 180, 181, 206 e 207.

22. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco é de uma variedade selecionada do grupo que consiste em tabaco curado de conduto, tabaco curado de ar, tabaco curado de queima no escuro e tabaco Galpao e tabaco Oriental.

23. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida planta de tabaco é de uma variedade selecionada do grupo que consiste em tabaco Burley, tabaco Maryland e tabaco de cura de ar escuro.

24. Material de tabaco curado, caracterizado pelo fato de que é da planta de tabaco conforme definida na reivindicação 18.

25. Material de tabaco curado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende nicotina em um nível entre 0,2% e 0,6%.

26. Material de tabaco curado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida planta de tabaco compreende nicotina em um nível entre 1,0% e 3,0%.

27. Material de tabaco curado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido material de tabaco curado é feito por um processo de cura selecionado do grupo que consiste em cura de conduto, cura de ar, cura de fogo e cura de sol.

28. Produto de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende o material de tabaco curado conforme definido na reivindicação 24.

29. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha, um cigarro de filtro de recesso não ventilado, um cigarro de filtro de recesso ventilado, um charuto, rapé, tabaco de cachimbo, tabaco de charuto, tabaco de cigarro, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco picado e tabaco cortado.

30. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é um produto de tabaco sem fumaça.

31. Planta de tabaco, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende um cassete de expressão heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de Nic1b_ERF de um gene compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54 e 202 a 205 e fragmentos das mesmas, em que a referida sequência inibidora está operavelmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula de planta e em que a referida sequência inibidora tem pelo menos 90% de identidade de sequência para um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos de sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 13, 14, 17, 18, 19, 38, 48, 49, 52, 53, 54 e 202 a 205 e fragmentos das mesmas.

32. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a referida sequência inibidora de Nic1b é capaz de ser transcrita como um polinucleotídeo inibitório selecionado do grupo que consiste em um polinucleotídeo de RNA de fita simples, um polinucleotídeo de RNA de fita dupla e uma combinação dos mesmos.

33. Planta de tabaco, ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor preferido de tecido.

34. Planta de tabaco, ou parte dela, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico de raiz.