BR112019027710A2

BR112019027710A2 - métodos de modulação do teor de alcaloides e do teor de uma nitrosamina específica do tabaco (tsna), uso de pelo menos um gene nic1 erf, método para produzir uma planta, planta modificada, material de propagação vegetal, uso de uma planta, folha colhida de uma planta, folha processada, material de tabaco curado, mistura de tabaco, produto da indústria do tabaco, produto de tabaco, uso de uma célula de tabaco, artigo de fumo combustível, uso de uma sequência de nucleotídeos, mutante de uma planta, progênie ou semente

Info

Publication number: BR112019027710A2
Application number: BR112019027710-2A
Authority: BR
Inventors: Matthew Edward HUMPHRY; Shengming Yang; Qiulin Qin
Original assignee: University Of Kentucky Research Foundation
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2020-08-18
Also published as: CN111315891A; JP2024045195A; JP2020524508A; MX2023005683A; CA3067842A1; MX2019015413A; IL271516A; EP3642346A1; JP7470139B2; WO2018237107A1; IL271516B1; US20200291413A1; AR112113A1; PH12019550294A1; JP7366758B2; JP2022078014A

Abstract

A presente invenção proporciona um método de modulação do teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco), o método compreendendo a modificação da referida planta pela modulação da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nic1 ERF. A presente invenção também proporciona o uso de pelo menos um gene Nic1 ERF para modulação do teor de alcaloide de uma planta, bem como células de tabaco, plantas, materiais de propagação de plantas, folhas colhidas, tabacos processados ou produtos de tabaco obteníveis de acordo com a invenção.

Description

MÉTODOS DE MODULAÇÃO DO TEOR DE ALCALOIDES E DO TEOR DE UMA NITROSAMINA ESPECÍFICA DO TABACO (TSNA), USO DE PELO MENOS UM GENE NICl ERF, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA, PLANTA MODIFICADA, MATERIAL DE PROPAGAÇÃO VEGETAL, USO DE UMA PLANTA, FOLHA COLHIDA DE UMA PLANTA, FOLHA PROCESSADA, MATERIAL DE TABACO CURADO, MISTURA DE TABACO, PRODUTO DA INDÚSTRIA DO TABACO, PRODUTO DE TABACO, USO DE UMA CÉLULA DE TABACO, ARTIGO DE FUMO COMBUSTÍVEL, USO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, MUTANTE DE UMA PLANTA, PROGÊNIE OU SEMENTE

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a métodos de modulação do teor de alcaloide, por exemplo, teor de nicotina de uma planta ou parte da mesma. A invenção também se estende a métodos para modular a expressão e/ou atividade de polipeptídeos codificados por genes que modulam o teor de alcaloides nas plantas. Alternativamente, a invenção proporciona métodos para modular a expressão e/ou atividade de genes que codificam polipeptídeos que modulam o teor de alcaloides nas plantas. A invenção também se estende a construções que podem ser usadas para modular os polipeptídeos, células vegetais transformadas com tais construções e para as próprias plantas transgênicas. A invenção também se refere ao uso de folhas colhidas de tais plantas transgênicas que foram transformadas com uma construção genética para modular o teor de alcaloides e artigos de fumo (por exemplo, artigos de fumo combustíveis) compreendendo essas folhas.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] Os alcaloides são um grupo de compostos naturais que contêm principalmente átomos básicos de nitrogênio e são produzidos por uma grande variedade de organismos, incluindo bactérias, fungos, plantas e animais. Os alcaloides podem ser classificados de acordo com a semelhança do esqueleto de carbono, por exemplo, indol-, isoquinolina- e piridina-semelhante. Os derivados de piridina são uma classe de alcaloides monoméricos; esta classe inclui derivados simples de piridina, derivados de piridina policíclica condensada e não condensada e derivados de sesquiterpeno e piridina. Exemplos são a nicotina, a nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina. A maioria das funções biológicas conhecidas dos alcaloides está relacionada à proteção. Os alcaloides do tabaco aprimoram os atributos sensoriais da fumaça.

[0003] A nicotina ocorre naturalmente em várias variedades de plantas, mas é encontrada em nível mais alto na planta de tabaco. É produzida em espécies selvagens e cultivadas de Nicotiana e desempenha um papel importante na defesa de plantas contra herbívoros e insetos (Voelckel et al. 2001, incorporado aqui por referência), representando - 90% do teor total de alcaloides. Os 10% restantes da variedade de alcaloides são principalmente constituídos por nornicotina, anatabina, miosmina e anabasina.

[0004] A regulação do teor de alcaloides no tabaco é complexa. Vários fatores, incluindo genótipo, ambiente, fertilização e práticas agronômicas (por exemplo, cobertura), afetam os níveis de alcaloides nas plantas de tabaco.

[0005] Na década de 1930, certos tipos de tabaco de charuto cubano (Nicotiana tabacum) foram identificados como tendo teor alcaloide muito baixo, e essa característica foi introduzida nas linhagens de criação de tabaco dos EUA (Valleau 1949, incorporado aqui por referência). O atributo de baixo alcaloide foi subsequentemente incorporado na estrutura genética da cultivar Burley 21 (B21) através de várias gerações de retrocruzamentos (Legg et al. 1970 incorporado aqui por referência).

[0006] Estudos genéticos usando Burley 21 de baixo alcaloide (LA-B21) sugeriram que dois loci não-ligados, inicialmente referidos como lócus A e B (Legg et al. 1969 incorporado por referência), mas mais tarde conhecidos como MNicl e Nic2, contribuem para os níveis de nicotina na folha do tabaco como lócus regulador da biossíntese de nicotina (Legg e Collins 1971 incorporado por referência; Hibi et al.1994, incorporado por referência). LA B21 foi reportado como mais suscetível a danos causados por insetos, de acordo com o papel dos alcaloides na defesa das plantas. Também tem sido relatado que as linhagens isogênicas de tabaco curado em fumeiro com alcaloides totais baixos (cerca de 0,2%) tem um rendimento inferior. Por meio de duplicação haploide da progênie F, do cruzamento entre o tipo selvagem ou B21 com alcaloide alto (HA-B21, AABB) x LA-B21 (aabb), Collins et al. (1974 incorporado por referência) desenvolveram outras duas linhagens isogênicas (NILs) de B21 com alcaloide intermediário alto (HI-B21, AAbb) e intermediário baixo (LI-B21, aaBB), que mais tarde foram registradas como variedades em 1988 (Nielsen et al., 1988 incorporado por referência). As linhagens quase isogênicas (NILs) são referidas aqui como Burley 21 (B21, NiclNic2), Intermediário Alto (HI,

NiclNic2), Intermediário Baixo (LI, NiclNic2) e Alcaloide Baixo B21 (LA, NiclNic2).

[0007] Estudos subsequentes mostraram que esses dois loci também controlam a expressão de numerosos genes não relacionados à biossíntese de nicotina, como os genes de resposta ao estresse (Kidd et al. 2006 incorporado por referência). O lócus Nic2 foi caracterizado com base na identificação de uma grande exclusão (Shoji et al. 2010 incorporado aqui por referência), mas a elucidação da localização do lócus Nicl no tabaco se mostrou difícil, devido à natureza complexa de características quantitativas, como as abordagens de clonagem com base em mapas.

[0008] A modificação do teor de alcaloides nas plantas (por exemplo, tabaco) pode ter várias vantagens comerciais. Por exemplo, a diminuição do teor total de alcaloides nas plantas pode aumentar o valor da referida planta como um recurso de biomassa. Por exemplo, a modificação do teor de alcaloides pode compreender a redução do teor de alcaloides, por exemplo, o teor de nicotina das plantas de tabaco. As plantas e produtos de tabaco com nicotina reduzida podem ser desejáveis, tendo em vista a potencial regulação dos “limites máximos de nicotina”, isto é, os limites superiores médios da nicotina nos produtos de tabaco. Alternativamente, o aumento do teor de alcaloides nas plantas por exemplo, tabaco plantas, pode ajudar a proteger as plantas contra insetos e herbívoros. Ainda existe uma necessidade de plantas com modificação do teor de alcaloides, por exemplo, com teor de nicotina modulado, com propriedades melhoradas comercialmente desejáveis e métodos para produzir as mesmas.

[0009] Os alcaloides de piridina do tabaco são precursores das nitrosaminas específicas do tabaco (TSNAs) que se formam durante a cura das folhas após a colheita. As quatro TSNAs principais encontradas nas folhas de tabaco curadas são N'- nitrosonornicotina (NNN), N'-nitrosoanatabina (NAT), N'- nitrosoanabasina (NAB) e 4- (metil nitrosamino)-l- (3-piridil) - l1-butanona (NNK).

[0010] TSNAs se formam quando as espécies de óxido nitroso (por exemplo, NO, NO>z, N203; e N704) reagir com alcaloides do tabaco. NAT e NAB são formados através da nitrosação dos alcaloides secundários anatabina e anabasina, respectivamente. Embora estudos iniciais tenham afirmado que o NNN é originário da nicotina e da nornicotina, relatórios mais recentes demonstraram que a ocorrência de NNN nas folhas de tabaco curadas está correlacionada com o teor de nornicotina, e não com a nicotina (Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27 23-46 (2001); Lewis et al., Plant Biotech J. 6: 346-354 (2008)). A nornicotina é o derivado desmetilado da nicotina, o principal alcaloide do tabaco responsável por 90% do teor total de alcaloides (Saitoh et al., 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480). A relação precursor/produto da formação de NNK é menos clara. Alguns estudos afirmam que o NNK é um produto de nitrosação da nicotina, mas devido à lenta taxa de reação da nitrosação da nicotina, é provável que um derivado oxidado da nicotina, em vez da própria nicotina, sirva como precursor direto do NNK (Caldwell et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993)). A identificação dos genes responsáveis pela produção e regulação dos precursores do TSNA é de grande importância.

[0011] Embora a nornicotina represente tipicamente apenas 2 a 4% do teor total de alcaloides da piridina nas plantas de tabaco, a instabilidade genética que leva ao aparecimento espontâneo de plantas conversoras com alto teor de nornicotina é um problema crônico na produção de tabaco. Manter baixos níveis de nornicotina pode impedir o sabor e o aroma desagradáveis associados a esse alcaloide, além de reduzir a formação de N- nitrosonornicotina (NNN) em produtos da indústria do tabaco, dos quais a nornicotina é o precursor direto.

[0012] O gene responsável pela maioria da conversão de nicotina em nornicotina é um gene nicotina desmetilase CYP82E4, que codifica um citocromo P450 monooxigenase (Siminszky et al., Proc. Natl. Acad. Scad. USA, 102 (2005), pp. 14919-14924; Xu et al., Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319). A família do gene da nicotina desmetilase no tabaco é amplamente caracterizada, mas pouco se sabe sobre outros processos celulares que podem influenciar os níveis de nornicotina. Ainda existe uma grande necessidade de desenvolver metodologias que possam reduzir ainda mais os níveis de TSNAs em plantas de tabaco e produtos produzidos a partir de plantas de tabaco.

[0013] Como descrito nos Exemplos, os inventores procuraram investigar os genes responsáveis pela síntese de alcaloides, com o objetivo de modular o teor de alcaloides nas plantas, por exemplo, diminuir o teor de nicotina nas plantas de tabaco. Suas pesquisas os levaram a criar cruzamentos de Burley 21 (B21), B21 com alcaloide normal/alto (HA) x B21 com alcaloide intermediário baixo (LI), B21 com alcaloide normal/alto (HA) x B21 com alcaloide baixo (LA) e B21 com intermediário alto (HI) x plantas de tabaco com baixo alcaloide B21 (LA). O teor de alcaloide das plantas resultantes F> foi analisado. A genotipagem de SNP foi realizada em F;s com o maior ou menor teor de alcaloides das populações F, de HA x LA e HA x LI para identificar marcadores polimórficos para análise posterior. Uma população HI x LA também foi gerada para mapeamento preciso. Os inventores desenvolveram marcadores que segregam com o lócus Nicl. Os nove genes da subfamília do fator de resposta ao etileno (ERF) foram identificados como potenciais reguladores do fator de transcrição da síntese de alcaloides.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0014] Verificou-se surpreendentemente que, modulando a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF, como ensinado aqui, o teor de alcaloide das plantas pode ser modulado. Assim os produtos do tabaco com teor de alcaloides modulados e propriedades comercialmente desejáveis procuradas pelos consumidores de produtos do tabaco podem ser produzidos. Em alguns casos, os consumidores podem desejar um produto com baixos níveis de teor alcaloide, por exemplo, baixos níveis de teor de nicotina.

[0015] A presente invenção pode ser particularmente útil no campo da agricultura molecular de plantas, onde plantas (como tabaco e outras Nicotiana spp.) são usadas para a produção de proteínas, peptídeos e metabolitos, por exemplo, para a produção de produtos terapêuticos e farmacêuticos, como antibióticos, partículas semelhantes a vírus ou neutracêuticos ou moléculas pequenas. O tabaco foi usado para o desenvolvimento de um anticorpo neutralizador do HIV em um projeto financiado pela UE chamado PharmPlant e Medicago Inc., Canadá, trabalhou em uma plataforma baseada em tabaco para a produção de partículas semelhantes a vírus para a fabricação de vacinas contra a gripe.

[0016] Assim, uma planta de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para agricultura molecular para reduzir ou eliminar a presença de nicotina e/ou outros alcaloides nicotínicos. O uso de uma planta com baixo teor de nicotina ou raiz é benéfico na agricultura molecular e reduziria os custos de processamento a jusante associados à purificação.

[0017] Em outros casos, pode ser desejável produzir plantas com altos níveis de alcaloides, por exemplo, altos níveis de teor de nicotina, de modo que a nicotina possa ser purificada da planta do tabaco para produzir um produto de nicotina pura, por exemplo, para uso em dispositivos que utilizam líquido contendo nicotina (por exemplo, e cigarros) ou dentro de dispositivos de aquecimento de tabaco. Por exemplo, a produção de plantas com folhas contendo altos níveis de nicotina poderia reduzir os custos de extração de nicotina para a produção de líquidos eletrônicos para cigarros eletrônicos.

[0018] Os presentes inventores investigaram a regulação da biossíntese de nicotina nas plantas de tabaco. Eles investigaram os loci reguladores Nicl e Nic2 que, acredita-se, controlam a expressão de genes estruturais relacionados à nicotina e outros genes não relacionados. Um objetivo dos inventores foi proporcionar um teor de alcaloides alterado. Nove genes ERF foram identificados na região Nicl, que modulou inesperadamente o teor de alcaloides em plantas de tabaco modificadas, em comparação com suas contrapartes de plantas de tipo selvagem cultivadas nas mesmas condições.

[0019] os presentes inventores surpreendentemente determinaram um método para modular o teor de alcaloides, por exemplo, teor de nicotina de uma planta de tabaco por modulação da atividade ou expressão de um gene ERF. O teor de nicotina em uma planta de tabaco pode ser diminuído através da inibição da atividade ou expressão de um gene ERF. Antes da presente invenção, não se sabia que a modulação da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF como descrito aqui poderia ser usada para modular o teor de alcaloides.

[0020] Os presentes inventores determinaram que a modulação de um gene Nicl ERF pode reduzir o teor alcaloide da planta modificada para um nível surpreendentemente baixo.

[0021] A linhagem LI (intermediário baixo, aaBB) normalmente produz cerca de metade do teor de alcaloides em comparação com a linhagem HA (alcaloide alto, AABB). No entanto, no Exemplo 13, as linhagens EMS foram produzidas e são equivalentes à linhagem LI. Linhagens EMS com mutações em Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199) foram produzidas. Essas linhagens EMS mutantes produziram cerca de um terço do teor alcaloide em comparação com a linhagem HA - muito menor do que seria esperado para uma linhagem LI.

[0022] Em outro exemplo, quando o Nicl ERF Nitab4.5 0003090g90030.1 (ERFI99) foi eliminado pela edição de genes da linhagem HI (AAbb), o teor alcaloide da linhagem nocaute foi muito menor que o teor alcaloide da linhagem equivalente LA (aabb) (veja o Exemplo 14). Esses dados sugerem surpreendentemente que a modulação da atividade ou expressão (por exemplo, derrubar ou eliminar a atividade ou expressão) de um gene Nicl ERF (por exemplo, Nitab4.5 0003090g0030.1 ou ERF199) por si só é suficiente para modular (por exemplo, reduzir) o teor de alcaloide de uma planta ou de parte da mesma.

[0023] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para modular o teor alcaloide de uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células, o método compreendendo a modificação da referida planta ou cultivo de células modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF: em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0024] Em outro aspecto, é provido um método para modulação do teor de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA em uma planta de tabaco ou parte da mesma planta, o método compreendendo a modificação da referida planta ou um cultivo de células modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF: em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID

No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou enquanto o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0025] Em outro aspecto, é provido o uso de um gene Nicl ERF para modular o teor alcaloide de uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco) ou planta ou parte da mesma ou um cultivo celular em que: pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende um sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma, ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0026] A presente invenção proporciona em um aspecto adicional um método para produzir uma planta ou parte da mesma, um cultivo de células, um material de propagação de plantas, uma folha de tabaco, uma folha de tabaco cortada, uma folha de tabaco processada ou uma folha de tabaco cortada e processada que tenha teor de alcaloide modulado, o método compreendendo a modificação da referida planta ou cultivo de células para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF em que: pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma, ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0027] Adequadamente, pelo menos um gene Nicl ERF para uso de acordo com a presente invenção pode codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0028] Adequadamente, pelo menos um gene de Nicl ERF para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0029] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, em que o teor de alcaloides é modulado em comparação com um cultivo de plantas ou células que não foi modificado para modular a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF.

[0030] Em outro aspecto, é provida uma planta ou parte da mesma ou um cultivo de células que foi modificado para alcançar uma modulação no teor de alcaloides em comparação com uma planta não modificada ou cultivo de células não modificada, em que a modificação é a modulação da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

[0031] Em outro aspecto, é provido material de propagação de plantas que pode ser obtido a partir de um cultivo de plantas ou células de acordo com a invenção ou de uma planta produzida pelo método da invenção.

[0032] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, ou uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor alcaloide da planta diminui em comparação com uma planta que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

[0033] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF é diminuída.

[0034] Em outro aspecto, é provido um método ou uso da invenção, ou uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor de alcaloides da planta é aumentado em comparação com uma planta que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

[0035] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação da planta, em que a planta é modificada para aumentar a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e a planta exibe um teor de alcaloides aumentado em comparação com uma planta que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

[0036] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor de alcaloides totais da planta é modulado.

[0037] Em um aspecto, é provido um método ou utilização da invenção, uma planta ou parte da mesma, da invenção, ou de um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina são modulados. Em um aspecto, o teor de nicotina é modulado.

[0038] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que a planta é da família Solanaceae.

[0039] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que a planta é do gênero Solanum.

[0040] Em outro aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que a planta é do gênero Nicotiana.

[0041] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta de tabaco ou parte da invenção, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor de nicotina é modulado.

[0042] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta de tabaco ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção, em que o teor de nicotina é diminuído.

[0043] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, da invenção, ou de um material de propagação de plantas da invenção, em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou pelo menos um gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0044] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação vegetal da invenção, em que um gene ERF adicional é modulado em que: o gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF e codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou o gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF e compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65; ou SEQ ID No. 69 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0045] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação vegetal da invenção, em que um gene ERF adicional é modulado em que o gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF e compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID No. 69 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma ou codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No.72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0046] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação de plantas da invenção em que pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou pelo menos um gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma e em que um gene ERF adicional é modulado em que: o gene ERF adicional é pelo menos um gene Nic2 ERF, por exemplo um gene Nic2 ERF que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tal como estabelecido em: SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF, por exemplo, um gene Nic2 ERF que compreende uma sequência de nucleotídeos, conforme estabelecido em: SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ

ID No. 61; ou SEQ ID No. 65; ou SEQ ID No. 69 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0047] Em um aspecto, é provido um método ou uso da invenção, uma planta ou parte da mesma, ou um material de propagação vegetal da invenção, em que pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou pelo menos um gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma e em que um gene ERF adicional é modulado, em que o gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF que compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID No. 69 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma ou codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0048] Em outro aspecto, é provido o uso de uma planta ou parte da mesma da invenção, ou de uma planta produzida pelo método da invenção para produzir uma planta.

[0049] Em outro aspecto, é provido o uso de uma planta ou parte da mesma da invenção, ou de uma planta produzida pelo método da invenção para a produção de um produto (por exemplo, um produto da indústria do tabaco).

[0050] Em outro aspecto, é provido o uso de uma planta ou parte da mesma da invenção, ou de uma planta produzida pelo método da invenção para cultivar uma colheita.

[0051] Em um aspecto, a invenção proporciona material de tabaco curado fabricado a partir de uma planta ou uma parte da mesma de acordo com a invenção ou um extrato do mesmo ou um cultivo de células de tabaco de acordo com à invenção.

[0052] Em outro aspecto, é provida uma mistura de tabaco compreendendo o referido material de tabaco curado de acordo com a invenção.

[0053] Em outro aspecto, é provido o uso de uma planta ou parte da invenção, ou de uma planta produzida pelo método da invenção para produzir uma folha.

[0054] Em um aspecto, é provida uma folha colhida de uma planta da invenção, ou obtida a partir de uma planta propagada a partir de um material de propagação da invenção, ou obtida a partir de uma planta obtida por uma utilização da invenção, ou obtida a partir de uma planta produzida pelo método da invenção.

[0055] Em um aspecto, é provida uma folha colhida de uma planta da invenção, em que a folha colhida de uma planta é uma folha colhida cortada.

[0056] A invenção proporciona em outro aspecto folha processada, de preferência uma folha processada não viável: obtenível a partir de uma planta obtenível a partir de uma utilização da invenção; obtenível processando uma planta da invenção; obtenível a partir de uma planta propagada a partir de um material de propagação vegetal da invenção; ou obtenível processando uma folha colhida de uma planta da invenção; ou obtenível a partir de uma planta produzida pelo método da invenção.

[0057] Em um aspecto, é provida uma folha processada da invenção, em que a folha é processada por cura, fermentação, pasteurização ou uma combinação das mesmas.

[0058] Em um aspecto, é provida uma folha processada da invenção, em que a folha processada é uma folha processada cortada.

[0059] A invenção proporciona em outro aspecto um produto de tabaco preparado a partir de: uma planta de tabaco da invenção ou uma parte da mesma; uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de plantas de tabaco da invenção; uma folha colhida de uma planta de tabaco da invenção; uma folha de tabaco processada da invenção; ou uma planta de tabaco produzida pelo método da invenção.

[0060] A invenção proporciona em outro aspecto um produto da indústria do tabaco preparado a partir de: i) uma planta de tabaco da invenção ou uma parte da mesma ou um cultivo de células de tabaco da invenção; ii) uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco da invenção; iii) uma folha colhida de uma planta de tabaco da invenção; iv) uma folha de tabaco processada da invenção.

[0061] Em um aspecto, é provido um produto de tabaco da invenção, em que o produto de tabaco é um artigo de fumo combustível.

[0062] Em outro aspecto, é provido um produto da indústria do tabaco da invenção, em que o produto do tabaco é um produto do tabaco sem fumaça.

[0063] Em um aspecto, é provido um produto da indústria do tabaco da invenção, em que o produto da indústria do tabaco é um sistema de provisão de aerossol não combustível, como um dispositivo de aquecimento de tabaco ou um dispositivo gerador de aerossol.

[0064] Em um aspecto, é provido o uso de uma célula (por exemplo, célula de tabaco) da invenção para modular o teor de alcaloides em cultivo de células.

[0065] Em um aspecto, é provido um artigo de fumo, produto de tabaco sem fumaça ou dispositivo de aquecimento de tabaco compreendendo uma planta ou uma parte da mesma de acordo com a invenção ou um extrato (por exemplo, um extrato de tabaco) ou um cultivo de células de tabaco de acordo com a invenção; Ou um material de tabaco curado de acordo com a invenção; ou uma mistura de tabaco de acordo com a invenção.

[0066] Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene Nicl ERF selecionado dentre: SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma, para selecionar uma planta com teor alcaloide modulado (por exemplo, reduzido) e/ou teor modulado (por exemplo, reduzido) de nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA.

[0067] Adequadamente, o uso pode compreender a determinação da presença de uma modificação em pelo menos um gene Nicl ERF selecionado a partir de: SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma, na referida planta, em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a atividade ou expressão de pelo menos um gene MNicl ERF. Adequadamente, a modificação pode reduzir ou eliminar a expressão ou função do gene Nicl ERF de modo que a expressão ou função proteica do gene Nicl ERF na referida planta não seja detectável.

[0068] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um mutante de uma planta portadora de uma mutação hereditária em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o gene Nicl ERF é selecionado dentre: SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; em que a referida mutação herdável modula (por exemplo, diminui) a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e em que a planta mutante modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou o teor modulado de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida mutação hereditária.

[0069] A mutação hereditária é realizada por meios técnicos, isto é, a mutação hereditária é projetada e não é uma mutação que ocorre naturalmente. Qualquer meio técnico pode ser usado para induzir a mutação hereditária. Adequadamente, a mutação hereditária pode ser realizada por mutagênese química, como tratamento com metanossulfonato de etila (EMS), irradiação física e agentes de inserção, incluindo T-DNAs; mutagênese por UV ou técnicas de edição de genes (tal como CRISPR/Cas). Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma progênie ou semente de uma planta mutante que carrega a mutação hereditária de acordo com a presente invenção.

[0070] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma folha colhida, uma folha processada ou um material de tabaco curado produzido a partir de uma planta que compreende uma modificação em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o pelo menos um gene Nicl ERF é selecionado a partir de: SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e em que a referida planta modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou o teor modulado de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida modificação no pelo menos um gene Nicl ERF.

[0071] A invenção proporciona também um método, uma folha, uma planta, um material de propagação de plantas, uma folha colhida, um tabaco processado, um produto de tabaco, um uso ou uma combinação dos mesmos, como descrito aqui com referência à descrição e desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0072] Concretizações da invenção serão descritas agora, por meio apenas de exemplo, com referência aos os desenhos que acompanham, nos quais:

[0073] Figura 1 Painel A mostra o nível de alcaloides totais para linhagens parentais e Fx; derivam a partir dos cruzamentos de HA x LI. O painel B mostra níveis de nicotina para linhagens parentais e Fx; derivados dos cruzamentos de HA x LA. Trinta plantas individuais para cada linhagem parental e 200 F;xs foram selecionados para cada população para análise química dos níveis alcaloides.

[0074] Figura 2 mostra uma comparação de mapas genéticos de indivíduos F7 selecionados a partir dos cruzamentos de HA x LI e HA x LA com o mapa consenso de N. tabacum 30k Infinium HD 2015. As linhas tracejadas indicam marcadores identificados entre os mapas F7, e o mapa de consenso, linhas pontilhadas indicam marcadores identificados entre os dois mapas F>2. Fonte em negrito indica marcadores comuns a mais de um mapa. Somente marcadores que foram identificados nos mapas HA x LA ou HA x LI são mostrados no mapa de consenso, outras posições de marcadores são mostradas como linhas pretas horizontais.

[0075] Figura 3 Painel A e B mostram genotipagem dos selecionados F> individuais dos cruzamentos de HA (AABB) X LI (aaBB) com marcador SNP4 CAPS. O painel A mostra os 20 F2s com os níveis de alcaloides mais baixos. O painel B mostra os 24 F>s com os níveis de alcaloides mais altos. Painéis C e D mostram a genotipagem dos indivíduos F> selecionados a partir dos cruzamentos de HA (AABB) X LA (aabb) com o marcador SNP4 CAPS. O painel C mostra os 24 F>xs com os níveis de alcaloide mais baixos. O painel D mostra os 20 F2s com os níveis de alcaloides mais altos. HA, HI e LI e LA foram utilizados como controle. Os recombinantes potenciais são indicados com setas.

[0076] Figura 4 Painel A mostra uma comparação entre os valores de fenótipo de teor de alcaloides totais para LA, LI, HI e HA. Os valores médios para 30 plantas são LA = 0,4 %, LI = 1,69 %, HI = 2,89 %, HA = 3,06 %. O Painel B mostra uma comparação de valores de fenótipo de teor de nicotina para L A, LI, HI e HA. Os valores médios para 30 plantas são LA = 0,39%, LI = 1,61%, HI = 2,76%, HA = 2,92%.

[0077] Figura 5 Painel A mostra os níveis de alcaloides totais para as linhagens parentais HI e LA, e plantas F7 genotipadas como AA (F; - AA) e aa (F;-aa). O painel B mostra os níveis de nicotina para as linhagens parentais HI e LA, e plantas F, genotipadas como AA (F;- AA) e aa (F;-aa). A planta genotipada como AA, mas com os níveis de alcaloide ou nicotina mais baixos, indicada pela seta nos painéis, foi ensacada para coletar sementes de F3.

[0078] Figura 6 Painel A mostra o teor de alcaloides totais para as linhagens parentais HI e LA e F3s derivados da planta F? ensacada. Painel B mostra os níveis de nicotina para as linhagens parentais HI e LA e F3s derivados da planta F> ensacada. Não foi observada segregação fenotípica em 40 plantas F3.

[0079] Figura 7 mostra o mapa genético para Nicl. O número de recombinantes observados com o respectivo marcador é dado. A distância genética (cm) para cada marcador é indicada no lado esquerdo do cromossoma. O lócus Nicl, co-segregando com SNP4, é flanqueado por SNP2/SNP3 e SNP5. Uma região de deleção maior que 500 Kb (INDEL1) foi relatada em torno do lócus Nicl por Adams et al. (US20160374387Al incorporado aqui por referência). Juntamente com os SNPs a sua montante e jusante (13 e 14), a deleção genômica fica fora da região delimitada do lócus Nicl.

[0080] Figura 8 mostra o mapa genético para o lócus Nic2. O número de recombinantes observados com o respectivo marcador é dado. A distância genética (cM) para cada marcador foi indicada no lado esquerdo do cromossomo. O lócus Nic2 co-segrega com SNP17 e SNP 18.

[0081] Figura 9 mostra a análise alcaloide de raízes peludas (fundo de LA) transformadas por Nicl ERFs. Raízes peludas de HI e LA transformadas com vetor vazio foram usadas como controles.

[0082] Figura 10 até Figura 81 mostra a SEQ ID NO. 1 a SEQ ID No. 72 como descrito abaixo.

[0083] Figura 82 mostra um mapa físico parcialmente completo da região genômica Nicl, mostrando as localizações dos andaimes e dos marcadores (não desenhados à escala). Linhas finas e pretas indicam andaimes híbridos BioNano com andaimes cinza escuro alinhados abaixo deles, de acordo com os pseudocromossomos de Edwards et al. (2017 incorporado aqui por referência). Seções pontilhadas na linha preta indicam regiões de sequência não contínuas; pequenas lacunas indicam pontos de interrupção entre os superandaimes da BioNano (consulte Edwards et al.2017 para obter detalhes). Cinza claro indica as localizações dos andaimes estimados com base na análise recíproca do BLAST para o genoma de Sierro et al. (2014 Nature Communications 5, 3833 incorporado aqui por referência). Os andaimes pálidos indicam a localização estimada com base na posição do marcador associado em um dos mapas genéticos. Locais aproximados do marcador SNP/INDEL mostrados abaixo dos andaimes. Caixas cinza pontilhadas indicam a região da sequência identificada por Adams et al. (2016).

[0084] Figura 83 mostra um mapa físico completo da região genômica Nic2, mostrando as localizações dos andaimes e dos marcadores (não desenhados em escala). Linhas finas e pretas indicam andaimes híbridos BioNano com andaimes cinza escuro alinhados abaixo deles, de acordo com os pseudocromossomos de Edwards et al. (2017). Pequenas lacunas na linha preta indicam pontos de interrupção entre os superandanimes da BioNano (consulte Edwards et al.2017 para obter detalhes). Cinza claro indica as localizações dos andaimes estimados com base na análise recíproca do BLAST para o genoma de Sierro et al. (2014). Os andaimes pálidos indicam a localização estimada com base na posição do marcador associado em um dos mapas genéticos. Os locais aproximados dos marcadores SNP são mostrados abaixo dos andaimes. Caixas cinza pontilhadas indicam a região da sequência identificada por Adams et al. (2016).

[0085] Figura 84 mostra os níveis de alcaloides totais (nicotina, nornicotina, anabasina e anatabina) em uma população segregada de plantas mutantes EMS, agrupadas pelo estado da mutação em Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199). A mudança de aminoácidos para plantas mutantes é mostrada entre parênteses após o identificador do gene. Diferenças significativas das respectivas plantas de tipo selvagem com p <0,01 ou p <0,05 (teste t de Student) são indicadas por um asterisco duplo ou único, respectivamente.

[0086] Figura 85 mostra análise de sequências de gene nocaute editor-mediador de Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199) na linha mutante heterozigótica Ll. Ll continha um alelo mutante com uma inserção “A”, o que levou a um códon de parada prematuro. Os produtos de PCR amplificados com o par de iniciadores (SEQ ID No. 111 e SEQ ID No. 112) foram clonados em pGEM-T Easy Vector, e, pelo menos, 10 colônias foram selecionadas para sequenciamento.

[0087] Figura 86 mostra a análise alcaloide de anatabina, anabasina, nornicotina e nicotina com plantas Tl do mutante L1 editado por genes. O nocaute de Nitab4.5 0003090g0030.1 diminuiu significativamente o teor de alcaloides na planta HI (A), e os níveis de alcaloides nos mutantes homozigotos foram quase 1/10 do que nas plantas LA (B). WI-Tl, Het-Tl e Mut-Tl foram utilizados para indicar os três genótipos de plantas Tl; tipo selvagem, mutantes heterozigoto e homozigoto, respectivamente. Pelo menos 15 plantas individuais foram medidas para cada genótipo. Plantas HI e LA foram usadas como controle.

[0088] Figura 87 mostra a análise RT-PCR do nível de expressão relativo para alelos Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199) entre HI e LA. A expressão Nitab4.5 0003090g0030.1 é específica da raiz e é regulada negativamente em plantas LA. A actina foi usada como controle interno. O par de iniciadores usado para amplificar Nitab4.5 /0003090g0030.1 foi 5'AGTCCTAGCTCAAGTTTTAGCAGCTTCGA3'

(SEQ ID No. 73) e 5'CGGACTCGGAGTACTTTTCATGGGAT3' (SEQ ID No. 172) e, para a actina, foi 5'ACGCAAGTACAGTGA3' (SEQ ID No. 173) e 5'GCAGATGAGCTCCTCCCTTT3' (SEQ ID No. 74).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0089] Um resumo dos identificadores de sequência usados em toda a especificação do assunto e a listagem de sequência correspondente são fornecidos em que:

[0090] SEQ ID No. 1 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0003090g0020.1 ou também conhecido como ERF17L34AN.

[0091] SEQ ID No. 2 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0003090g0020.1 (ERFI7L34AN).

[0092] SEQ ID No. 3 corresponde aos cds de Nitab4.5 0003090g0020.1 (ERFI7L3AN).

[0093] SEQ ID No. 4 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0003090g0020.1 (ERF17L34AN).

[0094] SEQ ID No. 5 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0003090g0030.1 ou também conhecido como ERFI199.

[0095] SEQ ID No. 6 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199).

[0096] SEQ ID No. 7 corresponde aos cds do Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199).

[0097] SEQ ID No. 8 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199).

[0098] SEQ ID No. 9 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0003665g0040.1 ou também conhecido como (JRES5SL2).

[0099] SEQ ID No. 10 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 00036659g90040.1 (JRESL2).

[0100] SEQ ID No. 11 corresponde aos códigos de Nitab4.5 000366590040.1 (JRESL2).

[0101] SEQ ID No. 12 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0003665g90040.1 (JRESL2).

[0102] SEQ ID No. 13 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0004620g0010.1 ou também conhecido como ERF210.

[0103] SEQ ID No. 14 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0004620g0010.1 (ERF210).

[0104] SEQ ID No. 15 corresponde aos cds do Nitab4.5 0004620g0010.1 (ERF210).

[0105] SEQ ID No. 16 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0004620g0010.1 (ERF210).

[0106] SEQ ID No. 17 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0004620g0030.1 ou também conhecido como ERF91.

[0107] SEQ ID No. 18 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0004620g0030.1 (ERF91).

[0108] SEQ ID No. 19 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0004620g0030.1 (ERF91).

[0109] SEQ ID No. 20 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0004620g0030.1 (ERF91).

[0110] SEQ ID No. 21 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0004620g0080.1 ou também conhecido como ERF29.

[0111] SEQ ID No. 22 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0004620g90080.1 (ERF29).

[0112] SEQ ID No. 23 corresponde aos cds de Nitab4.5 0004620g0080.1 (ERF29).

[0113] SEQ ID No. 24 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0004620g90080.1 (ERF29).

[0114] SEQ ID No. 25 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0004620g0090.3, também conhecido como ERF130.

[0115] SEQ ID No. 26 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0004620g90090.3 (ERF130).

[0116] SEQ ID No. 27 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0004620g90090.3 (ERF130).

[0117] SEQ ID No. 28 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0004620g0090.3 (ERF130).

[0118] SEQ ID No. 29 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0004620g0095.1, também conhecido como ERF16.

[0119] SEQ ID No. 30 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0004620g0095.1 (ERFI16).

[0120] SEQ ID No. 31 corresponde aos cds do Nitab4.5 0004620g90095.1 (ERFI16).

[0121] SEQ ID No. 32 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0004620g90095.1 (ERFI16).

[0122] SEQ ID No. 33 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0006382g0040.1, também conhecido como ERF110.

[0123] SEQ ID No. 34 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0006382g90040.1 (ERF110).

[0124] SEQ ID No. 35 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0006382g90040.1 (ERF110).

[0125] SEQ ID No. 36 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0006382g90040.1 (ERF110).

[0126] SEQ ID No. 37 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0002924g0010.1, também conhecido como ERF17LI.

[0127] SEQ ID No. 38 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0002924g90010.1 (ERFI17LI).

[0128] SEQ ID No. 39 corresponde aos cds de Nitab4.5 0002924g90010.1 (ERF17LI).

[0129] SEQ ID No. 40 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 000292490010.1 (ERF17LI).

[0130] SEQ ID No. 41 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0002924g0020.2, também conhecido como ERF179.

[0131] SEQ ID No. 42 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 000292490020.2 (ERF179).

[0132] SEQ ID No. 43 corresponde aos códigos de Nitab4.5 000292490020.2 (ERF179).

[0133] SEQ ID No. 44 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 000292490020.2 (ERF179).

[0134] SEQ ID No. 45 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0002924g0040.2, também conhecido como ERF17.

[0135] SEQ ID No. 46 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 000292490040.2 (ERF17).

[0136] SEQ ID No. 47 corresponde aos cds de Nitab4.5 0002924g90040.2 (ERF17).

[0137] SEQ ID No. 48 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0002924g90040.2 (ERF17).

[0138] SEQ ID No. 49 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0002924g0045.1, também conhecido como ERFI168.

[0139] SEQ ID No. 50 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 00029249g90045.1 (ERF168).

[0140] SEQ ID No. 51 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0002924g90045.1 (ERF168).

[0141] SEQ ID No. 52 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0002924g90045.1 (ERF168).

[0142] SEQ ID No. 53 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 00029249g0050.2, também conhecido como ERF115.

[0143] SEQ ID No. 54 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 000292490050.2 (ERF115).

[0144] SEQ ID No. 55 corresponde aos cds de Nitab4.5 000292490050.2 (ERF115).

[0145] SEQ ID No. 56 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0002924g90050.2 (ERF115).

[0146] SEQ ID No. 57 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0006499g0010.1, também conhecido como ERF104.

[0147] SEQ ID No. 58 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0006499g90010.1 (ERF1O04).

[0148] SEQ ID No. 59 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0006499g90010.1 (ERF104).

[0149] SEQ ID No. 60 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0006499g90010.1 (ERF104).

[0150] SEQ ID No. 61 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0006499g0020.2 também conhecido como ERF221.

[0151] SEQ ID No. 62 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0006499g0020.2 (ERF221).

[0152] SEQ ID No. 63 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0006499g90020.2 (ERF221).

[0153] SEQ ID No. 64 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0006499g0020.2 (ERF221).

[0154] SEQ ID No. 65 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 0012667g90020.2 (ERF91L1).

[0155] SEQ ID No. 66 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 001266790020.2 (ERF91LI1).

[0156] SEQ ID No. 67 corresponde aos códigos de Nitab4.5 001266790020.2 (ERF91LI1).

[0157] SEQ ID No. 68 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 001266790020.2 (ERF91LI1).

[0158] SEQ ID No. 69 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica o gene conhecido como Nitab4.5 00150559g0010.2, também conhecido como ERF189.

[0159] SEQ ID No. 70 corresponde à sequência de cDNA de Nitab4.5 0015055g90010.2 (ERF189).

[0160] SEQ ID No. 71 corresponde aos códigos de Nitab4.5 0015055g90010.2 (ERF189).

[0161] SEQ ID No. 72 corresponde à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Nitab4.5 0015055g90010.2 (ERF189).

[0162] Algumas sequências divulgadas aqui contêm “N” em sequências de nucleotídeos. “N” pode ser qualquer nucleotídeo ou uma exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos. Por exemplo, em alguns casos, uma sequência de “N” s é mostrada. O número de “N”s não necessariamente se correlaciona com o número real de nucleotídeos nessa posição. Pode haver mais ou menos nucleotídeos do que o mostrado como “N” na sequência.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0163] Pela primeira vez, os presentes inventores mostraram que, modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco), o teor de alcaloide e/ou de TSNA da planta podem ser modulados.

[0164] Pelo menos um gene Nicl ERF é selecionado a partir do grupo que compreende: um gene que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou S EQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0165] Adequadamente, pelo menos um gene Nicl ERF pode ser um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis ou sete genes selecionados do grupo que compreende: um gene que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como definida em: SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou

SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0166] Em um aspecto, pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos nuca como definida na SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0167] Em um aspecto, a atividade ou expressão de pelo menos um Nicl ERF adicional é modulada. Adequadamente, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou pelo menos oito Nicl ERFs adicionais selecionados da Tabela 1 também podem ser modulados.

[0168] Em um aspecto, pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou pelo menos um gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma é modulado; e a atividade ou expressão de pelo menos um Nicl ERF adicional é modulada. Adequadamente, pelo menos um Nicl ERF adicional pode ser selecionado a partir de: um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 1; SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma. Adequadamente, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou pelo menos oito Nicl ERFs adicionais podem ser modulados.

[0169] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um método para modular o teor alcaloide de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, compreendendo o método de modificar a referida planta modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene ERF.

[0170] O termo “modulação” é usado aqui para significar aumento ou diminuição.

[0171] O termo “aumento do teor de alcaloides “ é usado aqui para significar que a concentração e/ou o teor total de alcaloides no produto da presente invenção (por exemplo, planta, parte da mesma (por exemplo, folha), folha processada ou um produto fabricado a partir da planta (por exemplo, um produto de tabaco)) é maior em comparação com um produto semelhante que não tenha sido modificado de acordo com a presente invenção.

[0172] O termo “diminuição do teor de alcaloides” é usado aqui para significar que a concentração e/ou o teor total de alcaloides no produto da presente invenção (por exemplo, planta, parte da mesma (por exemplo, folha), folha processada ou um produto fabricado a partir da planta (por exemplo, produto de tabaco)) é menor em comparação com um produto comparável que não foi modificado de acordo com a presente invenção.

[0173] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um método de modular (ou seja, aumentar ou reduzir) o teor de nitrosamina específica de tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, o método compreendendo modificar a referida planta modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

[0174] Em uma concretização, o TSNA é N'nitrosonornicotina (NNN) e/ou o precursor é nornicotina.

[0175] Em uma concretização, o TSNA pode ser um ou mais dos grupos selecionados dentre: N'-nitrosonornicotina (NNN), N'nitrosoanatabina (NAT), N'-nitrosoanabasina (NAB) e 4 (metilnitrosamino)-1- (3- piridil) -l-butanona (NNK).

[0176] Em uma concretização preferida, o TSNA é N'- nitrosonornicotina (NNN).

[0177] O TSNA pode ser medido em um tabaco processado, por exemplo, tabaco curado ou tabaco reconstituído. Em uma concretização, o teor de TSNA é medido e/ou modificado (por exemplo, reduzido) em uma planta de tabaco curada ou em parte da mesma (por exemplo, em folha de tabaco curada).

[0178] O termo “nitrosamina específica do tabaco” ou “TSNA”, conforme usado aqui, tem seu significado usual no estado da técnica, ou seja, uma nitrosamina que é encontrada apenas em produtos de tabaco ou outros produtos que contêm nicotina. Adequadamente, pelo menos uma nitrosamina específica para tabaco pode ser 4- (metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-l-butanona (NNK), N'-nitrosonornicotina(NNN), N'-nitrosoanatabina (NAT) ou N- nitrosoanabasina (NAB).

[0179] Mais adequadamente, pelo menos uma nitrosamina específica para tabaco pode ser NNK ou NNN.

[0180] Em uma concretização, a nitrosamina específica para tabaco é NNN.

[0181] O termo “precursor do mesmo”, quando usado em relação a pelo menos uma nitrosamina específica do tabaco, refere-se a um ou mais produtos químicos ou compostos de uma planta de tabaco que dão origem à formação de uma nitrosamina específica do tabaco ou estão envolvidos na reação de nitrosação que leva à produção de nitrosamina específica do tabaco. Adequadamente, o termo “precursor do mesmo” pode se referir a nitrato, nitrito ou óxido nítrico.

[0182] Em uma concretização, o precursor do TSNA é um ou mais do grupo selecionado de nornicotina, anabasina, anatabina e um derivado oxidado da nicotina, como a pseudooxinicotina (PON).

[0183] Em uma concretização preferida, o precursor do TSNA é a nornicotina.

[0184] Em uma concretização, o precursor do TSNA pode ser PON. O precursor do TSNA (por exemplo, NNN, NNK, NAB e/ou NAT) pode ser medido em folhas de tabaco verde, por exemplo, antes do processamento, por exemplo, antes da cura. Em uma concretização, o precursor do TSNA (por exemplo, NNN, NNK, NAB e/ou NAT) é medido e/ou modificado (por exemplo, reduzido) em uma folha de tabaco verde, por exemplo, antes do processamento, por exemplo, antes da cura.

[0185] Em uma concretização de realização de um método e/ou uso da invenção, resulta em uma redução de pelo menos um TSNA ou um precursor do mesmo na planta de tabaco modificada (ou parte da mesma) quando comparada com uma planta de tabaco (ou parte da mesma) que não tenha sido modificada de acordo com a presente invenção.

[0186] Os termos “reduzindo pelo menos um TSNA ou precursor do mesmo” ou “redução de pelo menos um TSNA ou precursor a ele” são usados aqui para significar que a concentração e/ou teor total de pelo menos um TSNA ou precursor do mesmo no produto, método ou uso da invenção é menor em relação a um produto, método ou uso comparável. Por exemplo, um produto da indústria do tabaco comparável seria derivado de uma planta de tabaco que não tivesse sido modificada de acordo com a presente invenção, mas na qual todas as outras características relevantes fossem as mesmas (por exemplo, espécies vegetais, condições de cultivo, método de processamento de tabaco, etc).

[0187] Qualquer método conhecido no estado da técnica para determinar a concentração e/ou níveis de pelo menos um TSNA ou precursor do mesmo pode ser usado. Em particular, um método que pode compreender a adição de padrão interno marcado com deutério, pode ser usada uma extração e filtração aquosas, seguidas de análises utilizando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Outros exemplos para determinar a concentração e/ou o nível de um precursor de uma nitrosamina específica para tabaco incluem um método como o detalhado no método recomendado pela CORESTA CRM-72: Determinação de nitrosaminas específicas para tabaco em produtos de tabaco e tabaco por LC-MS/MS; CRM sendo desenvolvido na ISO/DIS 21766 ou Wagner et al. Analytical Chemistry (2005), 77 (4), 1001-1006, os quais são incorporados aqui por referência.

[0188] Adequadamente, a concentração e/ou o teor total de pelo menos uma nitrosamina ou precursor da mesma específico para tabaco pode ser reduzido através da realização de um método e/ou uso da presente invenção. Adequadamente, a concentração e/ou o nível de pelo menos uma nitrosamina ou precursor da mesma específico para tabaco pode ser reduzida em uma planta de tabaco da invenção (por exemplo, obtenível ou obtida por um método e/ou uso da invenção) quando comparada à concentração e/ou nível de pelo menos uma(s) nitrosamina(s) específica(s) de tabaco ou precursor da mesma em uma planta de tabaco que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0189] A concentração e/ou o teor total de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzido em uma folha de tabaco, folha colhida, folha de tabaco processada, produto da indústria do tabaco ou combinações dos mesmos obtiveis ou obtidas em uma planta de tabaco (ou parte de uma planta de tabaco ou de um cultivo de células de tabaco) da invenção, quando comparada com uma folha de tabaco, folha colhida, folha de tabaco processada, produto da indústria do tabaco ou combinações doe mesmos obtiveis ou obtidas a partir de uma planta de tabaco (ou parte de uma planta de tabaco ou um cultivo de células de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0190] Adequadamente, a concentração e/ou teor total de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzido em uma folha de tabaco processada.

[0191] Adequadamente, a concentração e/ou o nível de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzida em um produto da indústria do tabaco.

[0192] Em uma concretização, pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzida em pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%. Em algumas concretizações, pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzida entre cerca de 5% e cerca de 95%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre 20% e cerca de 80%, entre 30% e cerca de 70%, ou entre cerca de 40% e 60%.

[0193] Em relação às folhas de tabaco processadas (por exemplo, curadas) (por exemplo, curadas ou reconstituídas), pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzida entre cerca de 5000 ng/g e cerca de 50 n9/9, entre cerca de 4000 n9g/g e cerca de 100 ng/g, entre cerca de 3000 ng/g e 500 ng/g ou entre 2000 ng/g e 1000 ng/g. Em algumas concretizações, pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco ou precursor da mesma pode ser reduzida em pelo menos cerca de 5000 ng/g, pelo menos cerca de 4000 ng/g, pelo menos cerca de 3000 ng/g, pelo menos cerca de 2000 ng/g, pelo menos cerca de

1000 ng/g, pelo menos cerca de 500 ng/g, pelo menos cerca de 100 ng/g ou pelo menos cerca de 50 ng/9g.

[0194] O termo “ um produto comparável “, conforme definido aqui, seria um derivado de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não tivesse sido modificada de acordo com a presente invenção, mas na qual todas as outras características relevantes fossem as mesmas (por exemplo, espécies de planta, condições de crescimento, método de processamento da planta, por exemplo, tabaco etc.). O produto comparável de acordo com a presente invenção pode significar uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou uma parte da mesma, como uma folha (por exemplo, uma folha de tabaco), uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida), uma folha cortada (por exemplo, uma folha de tabaco colhida cortada), uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada) ou material de propagação de plantas (por exemplo, material de propagação de plantas de tabaco) ou um produto compreendendo a referida planta ou parte, por exemplo, um produto de tabaco ou suas combinações obtiveis ou obtidas de uma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção, por exemplo, para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou um ou mais genes Nicl ERF em combinação com um ou mais genes Nic2 ERF). Produtos comparáveis também podem ser conhecidos como controles ou do tipo selvagem. Em uma concretização, um produto comparável é aquele que não compreende um gene Nicl ERF cuja atividade ou expressão foi modulada. Em uma concretização, um produto comparável é aquele que não compreende um gene Nicl ERF cuja atividade ou expressão foi modulada nem um gene Nic2 ERF cuja atividade ou expressão foi modulada.

[0195] O termo “planta não modificada”, como definido aqui, seria uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não tivesse sido modificada de acordo com a presente invenção, para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e na qual todas as outras características relevantes eram as mesmas (por exemplo, espécies de planta, condições de cultivo, método de processamento de tabaco, etc.). Em uma concretização, uma planta não modificada é aquela que não compreende um gene Nicl ERF cuja atividade ou expressão foi modulada. Em uma concretização, um produto comparável é aquele que não compreende um gene Nicl ERF cuja atividade ou expressão foi modulada nem um gene Nic2 ERF cuja atividade ou expressão foi modulada.

[0196] As plantas adequadas de acordo com a invenção incluem plantas da família Solanaceae, que incluem, por exemplo, tabaco, tomate, estramônio, berinjela, mandrágora, beladona, pimentão (páprica, pimenta) e batata. Em uma concretização, um gênero adequado de Solanaceae é Solanum, por exemplo, Solanum lycopersicum ou Solanum tuberosum. Em uma concretização, um gênero possível de Solanaceae é Nicotiana. Adequadamente, a Nicotiana pode ser uma espécie de Nicotiana tabacum. Uma espécie apropriada de Nicotiana pode ser designada para aqui como planta do tabaco, ou simplesmente tabaco.

[0197] A “atividade ou expressão” de um gene Nicl ERF (ou um gene Nic2 ERF) pode se referir ao nível de transcrição, tradução, ou seja, expressão de proteínas, ou a atividade da proteína codificada pelo gene Nicl ERF (ou o gene Nic2 ERF, respectivamente). A atividade de um gene Nicl ERF (ou um gene Nic2 ERF) está relacionada à sua capacidade de funcionar como um fator de transcrição na biossíntese de alcaloides. A atividade de um gene Nicl ERF (ou um gene Nic2 ERF) pode ser determinada medindo os produtos da síntese de alcaloides, isto é, medindo o teor de alcaloides.

[0198] De acordo com um aspecto da invenção, a expressão gênica pode ser diminuída (ou inibida) inibindo a transcrição e/ou tradução. Em uma concretização, à atividade ou expressão de um gene pode se referir ao nível de transcrição, ou seja, a quantidade de RNAm produzido, ou tradução, ou seja, o nível ou quantidade de proteína produzida.

[0199] Em algumas concretizações, a modulação do teor alcaloide refere-se a um aumento no teor alcaloide, em que a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF é aumentada.

[0200] Em algumas concretizações, a modulação do teor alcaloide refere-se a uma diminuição no teor alcaloide, em que a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF é diminuída (ou inibida).

[0201] Em algumas concretizações, a modulação do teor de alcaloides refere-se a um aumento no teor de alcaloides, em que a atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF e a atividade ou expressão de pelo menos um de Nic2 ERF é aumentada em combinação.

[0202] Em algumas concretizações, a modulação do teor alcaloide refere-se a uma diminuição no teor alcaloide em que a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e a atividade ou expressão de pelo menos um Nic2 ERF é diminuída (ou inibida) em combinação.

[0203] Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir das folhas. Em um aspecto, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas verdes. Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas curadas, por exemplo, folhas curadas ao ar, curadas por combustão, curadas pelo fogo ou curadas ao sol. Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas curadas por combustão. Em um aspecto adicional, o teor de alcaloides é medido a partir de folhas curadas ao ar.

[0204] O termo “ teor alcaloide “ é usado aqui para significar a concentração e/ou quantidade total de todo o grupo de compostos classificados como alcaloides. Alcaloides normalmente presentes no tabaco incluem nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina é modulada. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina é reduzido. Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados a partir de nicotina, anatabina, anabasina e nornicotina é aumentado. O teor adequado de nicotina é modulado. Em uma concretização, o teor de nicotina é reduzido.

[0205] Qualquer método conhecido no estado da técnica para determinar a concentração e/ou o teor total de alcaloides pode ser usado. Um método preferido para analisar o teor de alcaloides envolve a análise pelo método de detecção por ionização por chama por cromatografia em fase gasosa (GC-FID).

[0206] Em uma concretização, é provido um método para produzir uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma, um material de propagação de plantas (por exemplo, um material de propagação de plantas de tabaco), uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), uma folha (por exemplo, um tabaco folha), uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida), uma folha cortada (por exemplo, uma folha de tabaco cortada), uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada), uma folha cortada e processada (por exemplo, um tabaco cortado e processado folha), um produto compreendendo a referida planta ou parte da mesma (por exemplo, um produto de tabaco) ou suas combinações obtiveis ou obtidas por uma planta da invenção que possui teor alcaloide modulado, o método compreendendo a modificação do referido tabaco para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF. O teor de alcaloides modulado pode ser determinado pela comparação do teor de alcaloides na planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma, material de propagação de plantas (por exemplo, material de propagação de plantas de tabaco), uma célula (por exemplo uma célula de tabaco), folha (por exemplo, folha de tabaco) folhas colhidas (por exemplo, folhas de tabaco colhidas), folhas colhidas (por exemplo, folhas de tabaco colhidas), folhas processadas (por exemplo, folhas de tabaco processadas), folhas cortadas e processadas (por exemplo, folhas de tabaco cortadas e processadas), um produto que compreende uma planta ou parte da mesma, da presente invenção, por exemplo, um produto de tabaco, ou suas combinações com um produto comparável.

[0207] Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma planta, por exemplo, uma planta de tabaco, por exemplo, planta de tabaco modificada.

Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha (por exemplo, uma folha de tabaco, por exemplo, uma folha de tabaco de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha colhida (por exemplo, uma folha de tabaco colhida de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha cortada colhida (por exemplo, uma folha de tabaco cortada colhida de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha processada (por exemplo, uma folha de tabaco processada, por exemplo, uma folha de tabaco processada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha cortada e processada (por exemplo, uma folha de tabaco cortada e processada, por exemplo, uma folha de tabaco cortada e processada de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em uma folha curada (por exemplo, uma folha de tabaco curada a partir de uma planta de tabaco modificada)

Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em um extrato de folha verde (por exemplo, uma folha de tabaco verde de uma planta de tabaco modificada). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em um produto compreendendo a planta da presente invenção ou parte da mesma (por exemplo, um produto de tabaco, por exemplo, um produto de tabaco produzido a partir de uma planta de tabaco modificada ou parte da mesma). Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado em qualquer um dos produtos acima ou combinações dos mesmos.

Adequadamente,

a modulação do teor alcaloides descrita acima pode ser um aumento no teor alcaloides. Adequadamente, a modulação do teor alcaloides descrita acima pode ser uma diminuição no teor alcaloides.

[0208] Em uma concretização, o teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina é diminuído.

[0209] Adequadamente, a modulação do teor alcaloides descrita acima pode ser uma diminuição no teor de nicotina.

[0210] Em uma concretização, o teor de nicotina de uma planta modificada (por exemplo, planta de tabaco), material de propagação de plantas (por exemplo, material de propagação de plantas de tabaco), folha (por exemplo, folha de tabaco), folha colhida (por exemplo, folha de tabaco colhida), folha cortada (por exemplo, folhas de tabaco colhida cortada), folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada), e folha processada e cortada (por exemplo, folha de tabaco processada e cortada) ou produto de tabaco a partir de uma planta de tabaco modificada é diminuída.

[0211] Em uma concretização, o teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, planta do tabaco) ou parte da mesma pode ser modulado por, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, vezes quando comparado com o teor de alcaloides de um planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma, respectivamente, que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF em combinação com pelo menos um gene Nic2 ERF) que foi cultivada em condições de crescimento semelhantes. Adequadamente, o teor de alcaloides pode ser modulado por cerca de duas vezes até cerca de 10 vezes, preferencialmente cerca de 3 vezes até cerca de 10 vezes, adequadamente de cerca de 3 vezes até cerca de 5 vezes. Adequadamente, a modificação pode ser um aumento ou uma diminuição no teor de alcaloides. Adequadamente, a modulação pode ser de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina. Adequadamente, a modificação é do teor de nicotina.

[0212] Em uma concretização da invenção, o teor de alcaloides de uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco) ou parte da mesma pode ser modulado por 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em comparação com uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma que não foi modificada de acordo com a presente invenção. A modulação pode ser um aumento ou uma diminuição no teor de alcaloides quando comparado a uma planta não modificada (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma. Adequadamente, a modulação pode ser de um teor total de alcaloides. Adequadamente, a modulação pode ser de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, anatabina, anabasina, miosmina e nornicotina. Adequadamente, a modificação é do teor de nicotina.

[0213] Em uma concretização, o método ou uso resulta em teor alcaloide modulado em comparação com uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou um gene Nicl ERF e um Nic2 ERF) e, mais particularmente, em comparação com, ou em relação à expressão de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) na ausência das modulações introduzidas.

[0214] Em uma concretização, uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma foi modificada para alcançar uma modulação no teor de alcaloides em comparação com uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma, respectivamente, que não foi modificada para modular a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF).

[0215] O termo “ modificando “ ou “modificado” tal como utilizado aqui, significa uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco) que tenha sido alterada ou modificada. A presente invenção compreende a modificação de plantas utilizando técnicas de modificação genética de plantas ou modificação não genética de plantas. Tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica e exemplos de técnicas de modificação genética incluem métodos de transformação, métodos transgênicos, cisgênicos e de edição de genes. Exemplos de técnicas de modificação não genética incluem a mutagênese com nêutrons rápidos, mutagênese química, por exemplo, a mutagênese de metanossulfanato de etila (EMS) e as modernas abordagens de análise populacional.

[0216] Em uma concretização, uma variante natural que possui um gene Nicl ERF modificado é selecionada e essa característica ou gene é produzida em uma segunda planta que possui características comercialmente desejáveis.

[0217] Em uma concretização, a planta (por exemplo, uma planta de tabaco) de acordo com a invenção pode ser uma planta transgênica.

[0218] Em outra concretização, a planta (por exemplo, uma planta de tabaco) de acordo com a invenção pode ser uma planta não transgênica.

[0219] Adequadamente, a modulação de pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e de pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação) não está presente em LA Burley 21.

[0220] Adequadamente, a modulação do pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e de pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação) não está presente em Burley 21.

[0221] Em algumas concretizações, uma modificação que diminui a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nic2 ERF) e, portanto, diminui o teor alcaloide que é selecionado do grupo que consiste em: diminuir, impedir ou atenuar a transcrição, tradução ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF (ou ambos, pelo menos, um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF); inibição da síntese do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene Nicl ERF (ou de ambos, pelo menos, um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação), ou a sua liberação a partir de armazenamentos intracelulares; ou aumento da taxa de degradação do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação).

[0222] Em uma concretização, a modificação que diminui a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou uma ou mais modificações que diminuem a atividade de pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação) compreende uma mutação de um ou mais genes ERF.

[0223] Em uma concretização, a mutação exclui um ou mais genes ERF inteiros.

[0224] Em uma concretização, um ou mais genes EFERF pode compreender uma ou mais mutações nos genes. Adequadamente, uma ou mais mutações resultam em atividade gênica reduzida Ou eliminada no gene mutante. Em uma concretização, uma ou mais mutações resultam em um gene inativo. Em uma concretização, a mutação pode ser uma deleção. Em uma concretização, a mutação pode ser uma inserção. Em uma concretização, a mutação pode introduzir um códon de parada precoce. Em uma concretização, O sítio alvo é único para o gene ERF alvo e não existe em outros genes ERF. Em uma concretização, a mutação tem como alvo a extremidade 5'da região de codificação da proteína.

[0225] Em uma concretização, a mutação é uma mutação sem sentido.

[0226] Em uma concretização, os mutantes têm níveis reduzidos de alcaloide total e/ou de nicotina reduzidos.

[0227] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 4 ou uma sequência com pelo menos 90%, de preferência pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0228] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) sequência de aminoácidos SEQ ID No. 8 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0229] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 12 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0230] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 16 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0231] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 20 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0232] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 24 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0233] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 28 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0234] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 32 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0235] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo compreendendo (ou consistindo em) a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 36 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0236] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em: SEQ ID No. 1 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0237] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de codificação estabelecida em: SEQ ID No. 3 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0238] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 5 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0239] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ

ID No. 9 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0240] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 13 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0241] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 17 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0242] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 21 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0243] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 25 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0244] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 29 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0245] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais mutações em um gene Nicl ERF compreendendo (ou consistindo em) a sequência de nucleotídeos estabelecida em: SEQ ID No. 33 ou uma sequência com pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96% de identidade com a mesma.

[0246] A título de exemplo, o presente método pode compreender: º provisão de uma mutação em uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma; º provisão de uma mutação em um promotor de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma;

.º provisão de uma mutação em uma sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma com a mesma;

. provisão de uma mutação em um promotor de uma sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com à mesma com à mesma;

. provisão de um RNA antissenso, SiRNA ou miRNA que reduz o nível de sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%,

preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma; . provisão de um RNA antissenso, SsSiRNA ou miRNA que reduz o nível da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID No. 1; SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma.

[0247] Em uma concretização, bem como a modulação (por exemplo, mutação) de um ou mais genes Nicl ERF, um ou mais genes Nic2 ERF são também modulados (por exemplo, mutados).

[0248] Adequadamente, qualquer uma das modificações do gene Nicl ERF (por exemplo, mutações) ensinadas aqui pode ser usada em combinação com uma ou mais modificações de um gene Nic2 ERF em que o gene Nic2 ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em: SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou o gene Nic2 ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65;

ou SEQ ID No. 69 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0249] A título de exemplo, o presente método pode compreender: .º provisão de uma mutação numa sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80% preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma; º provisão de uma mutação em um promotor de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma com a mesma; º provisão de uma mutação numa sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65;

ou SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com à mesma com à mesma;

. provisão de uma mutação em um promotor de uma sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65; ou SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma com a mesma;

. provisão de um RNA antissenso, siRNA ou miRNA que reduz o nível de sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com mesma;

.º provisão de um RNA antissenso, SsiRNA ou miRNA que reduz o nível da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou

SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65; ou SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90% preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma.

[0250] Em uma concretização, é utilizada em combinação uma mutação em pelo menos um gene Nicl ERF, selecionado a partir do grupo que consiste em uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma com a mesma, ou uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma; e uma mutação em pelo menos um gene Nic2 ERF, particularmente uma ou mutações na sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 52 ou SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 68 ou SEQ

ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos que compreende SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 49 ou SEQ ID No. 53, ou SEQ ID No. 57 ou SEQ ID No. 61 ou SEQ ID No. 65 ou SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (de preferência pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, mais particularmente, a mutação Nic2 ERF é uma ou mutações na sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou na sequência de nucleotídeos SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma.

[0251] Em uma concretização, é usada em combinação uma mutação em pelo menos um gene Nicl ERF que consiste em uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 8; ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%,

preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou uma ou mais mutações em uma sequência ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 5; ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com à mesma; e uma mutação em pelo menos um gene Nic2 ERF, particularmente uma ou mais mutações na sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 52, SEQ ID No.56, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 68 ou SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90 %, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou uma ou mais mutações, uma sequência de nucleotídeos que compreende a SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 65 ou SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (de preferência pelo menos 80%, preferencialmente em pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma.

[0252] Em uma concretização, é usada em combinação uma mutação em pelo menos um gene Nicl ERF que consiste em uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 8; ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 296%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos de um gene ERF que compreende a SEQ ID No. 5; ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma; e uma mutação em pelo menos um gene Nic2 ERF que consiste em uma ou mais mutações em uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID No. 72 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (de preferência pelo menos 80 %, preferencialmente pelo menos 290%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma, ou uma ou mais mutações em uma sequência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID No. 69 ou uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% (preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 98%) de identidade de sequência com a mesma.

[0253] Um ou mais genes Nic2 ERF pode ser um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, oito ou nove, genes Nic2 ERF selecionados na Tabela 2.

[0254] Em algumas concretizações, uma modificação que diminui a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação) e, assim, diminui o teor de alcaloides é um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em uma mutação pontual, uma exclusão, uma inserção, uma duplicação e uma inversão em um ou mais genes ERF. Adequadamente, a modificação é introduzida por um método selecionado de mutagênese aleatória e mutagênese direcionada. Adequadamente, a modificação pode ser introduzida por um método de mutagênese direcionado selecionado a partir de meganuclease, nuclease de dedo de zinco, TALEN, edição de genes e CRISPR, por exemplo.

[0255] Conforme usado aqui, o termo “mutação” abrange uma variante genética natural ou uma variante manipulada.

[0256] Em particular, o termo “mutação” refere-se a uma variação na sequência de aminoácidos em comparação com a sequência mostrada como SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade de sequência, o que reduz a expressão ou função da proteína.

[0257] O termo “mutação” pode se referir a uma variação na sequência de nucleotídeos em comparação com a sequência mostrada como na SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou em uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade de sequência com a mesma.

[0258] Em uma concretização preferida, cada cópia de uma sequência de ácidos nucleicos como mostrada em SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3; SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou em uma sequência com pelo menos 70%

de identidade com a mesma ou codificando uma proteína compreendendo uma sequência mostrada como SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou a SEQ ID No. 36 ou uma sequência que possui pelo menos 70% de identidade de sequência com à mesma que está presente na planta é mutada como definido aqui (por exemplo, cada cópia genômica de um gene que codifica a referida proteína em uma planta é mutada). Por exemplo, cada cópia do gene no genoma alotetraploide de N. tabacum pode estar mutada.

[0259] Em uma concretização preferida, a planta ou célula vegetal de acordo com a presente invenção é homozigota para a mutação.

[0260] Em uma concretização, preferencialmente a planta ou célula vegetal de acordo com a presente invenção expressa apenas o ácido nucleico mutado. Em outras palavras, em algumas concretizações, nenhuma proteína endógena (ou endógena e funcional) está presente nas plantas de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, se estiver presente qualquer proteína endógena, é preferencialmente em uma forma inativa e/ou truncada.

[0261] A mutação pode interromper a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína como detalhado aqui.

[0262] A interrupção pode fazer com que a sequência de ácidos nucleicos não seja transcrita e/ou traduzida.

[0263] A sequência de ácidos nucleicos pode ser interrompida, por exemplo, excluindo ou modificando o códon de início ATG da sequência de ácidos nucleicos, de modo que a tradução da proteína seja reduzida ou impedida.

[0264] A sequência de ácidos nucleicos pode compreender uma ou mais alterações de nucleotídeo que reduzem ou impedem a expressão da proteína ou afetam o transporte de proteínas. Por exemplo, a expressão da proteína pode ser reduzida ou impedida pela introdução de um ou mais códons de parada prematuros, uma alteração de fase, uma mutação de emenda ou uma substituição de aminoácidos não tolerada na fase de leitura aberta.

[0265] Um códon de parada prematuro refere-se a uma mutação que introduz um códon de parada na fase de leitura aberta e impede a tradução de toda a sequência de aminoácidos. O códon de parada prematuro pode ser um códon TAG (“âmbar”), TAA (“ocre”) ou TGA (“opala” ou “umber”). Adequadamente, o códon de parada prematuro pode ser introduzido em Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199); como mostrado em qualquer um dos SEQ ID No. 5-7. Adequadamente, o códon de parada prematuro em Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199); como mostrado em qualquer um dos SEQ ID No. 5-7 pode ser um códon de parada prematuro TGA (“opala” ou “umber”).

[0266] Uma mutação de alteração de fase (também chamada de erro de enquadramento ou alteração da fase de leitura) é uma mutação causada por indels (inserções ou deleções) de um número de nucleotídeos em uma sequência de ácidos nucleicos que não é divisível por três. Devido à natureza tripla da expressão gênica pelos códons, a inserção ou exclusão pode alterar o quadro de leitura, resultando em uma tradução completamente diferente da original. Uma mutação de alteração de fase geralmente fará com que a leitura dos códons após a mutação codifique diferentes aminoácidos. A mutação de alteração de fase geralmente resultará na introdução de um códon de parada prematuro.

[0267] Um mutante de emenda insere, exclui ou altera um número de nucleotídeos no sítio específico no qual a emenda ocorre durante o processamento do RNA mensageiro precursor no RNA mensageiro maduro. A deleção do sítio de emenda resulta em um ou mais íntrons remanescentes no RNAm maduro e pode levar à produção de proteínas anormais.

[0268] Uma substituição de aminoácidos não tolerada refere- se a uma mutação que causa uma substituição de aminoácidos não sinônima na proteína que resulta em função reduzida ou diminuída da proteína.

[0269] Qualquer método conhecido no estado da técnica para fornecer uma mutação em uma sequência de ácidos nucleicos pode ser utilizado no presente método. Por exemplo, pode ser utilizada recombinação homóloga, na qual é criado um vetor no qual as sequências relevantes de ácido nucleico são mutadas e usadas para transformar plantas ou células vegetais. Plantas recombinantes ou células vegetais que expressam a sequência mutada podem então ser selecionadas.

[0270] A sequência de ácidos nucleicos pode ser total ou parcialmente deletada. A deleção pode ser contínua ou pode compreender uma pluralidade de seções de sequência. A deleção remove preferencialmente uma quantidade suficiente de sequência de nucleotídeos de modo que a sequência de ácidos nucleicos não codifique mais uma proteína funcional. A deleção pode, por exemplo, remover pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 90% da porção de codificação da sequência de ácidos nucleicos.

[0271] A deleção pode ser total, no caso em que 100% da porção codificante da sequência de ácidos nucleicos está ausente, quando comparado com o genoma correspondente uma planta não modificada comparável.

[0272] Os métodos para deleção de sequências de ácidos nucleicos em plantas são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, pode ser utilizada recombinação homóloga, na qual é criado um vetor em que as sequências de ácidos nucleicos relevantes estão ausentes e usadas para transformar plantas ou células vegetais. Plantas recombinantes ou células vegetais que expressam a nova porção da sequência podem então ser selecionadas.

[0273] As células vegetais transformadas com um vetor como descrito acima podem ser cultivadas e mantidas de acordo com métodos de cultivo de tecidos bem conhecidos, como cultivo das células em um meio de cultura adequado, fornecido com os fatores de crescimento necessários, como aminoácidos, hormônios vegetais, vitaminas, etc.

[0274] A modificação da sequência de ácidos nucleicos pode ser realizada usando métodos de mutagênese direcionada (também denominada troca de nucleotídeo direcionada (TND) ou mutagênese oligo-direcionada (MOD)). Os métodos de mutagênese direcionada incluem, sem limitação, aqueles que empregam nucleases de dedo de zinco, TALENsS (consulte os documentos MWO2011/072246 e WO2010/079430), sistemas Cas9-like, Cas9/crRNA/tracrRNA ou Cas9/gRNA CRISPR (consulte WO 2014/071006 e WO2014/093622),

meganucleases (ver WO2007/047859 e WO2009/059195), ou métodos de mutagênese direcionada que empregam oligonucleotídeos mutagênicos, possivelmente contendo nucleotídeos quimicamente modificados para melhorar a mutagênese com complementaridade de sequência ao gene, em protoplastos vegetais (por exemplo, KeyBase6 ou TALENsS).

[0275] Alternativamente, sistemas de mutagênese como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455 e McCallum et al.2000, Plant Physiol. 123, 439-442, ambos incorporados aqui por referência) podem ser usados para gerar linhagens de plantas que compreendem um gene que codifica uma proteína com uma mutação. O método TILLING utiliza a mutagênese química tradicional (por exemplo, mutagênese do metanossulfonato de etila (EMS)) seguida de triagem de alto rendimento para mutações. Assim, podem ser obtidas plantas, sementes e tecidos compreendendo um gene com a mutação desejada.

[0276] O método pode compreender as etapas de mutagênese de sementes de plantas (por exemplo, mutagênese EMS), agrupamento de plantas ou DNA individuais, amplificação por PCR de uma região de interesse, formação de heteroduplex e detecção de alto rendimento, identificação da planta mutante, sequenciamento de produto de PCR mutante. É entendido que outros métodos de mutagênese e seleção podem ser igualmente usados para gerar tais plantas modificadas. As sementes podem, por exemplo, ser irradiadas ou tratadas quimicamente e as plantas podem ser rastreadas quanto a um fenótipo modificado.

[0277] As plantas modificadas podem ser diferenciadas das plantas não modificadas, ou seja, plantas do tipo selvagem, por métodos moleculares, como as mutações presentes no DNA, e pelas características fenotípicas modificadas. As plantas modificadas podem ser homozigotas ou heterozigotas para a mutação.

[0278] Adequadamente, o método pode compreender a transformação de uma célula de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) com uma construção genética capaz de inibir a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou uma construção capaz de inibir a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação).

[0279] Em algumas concretizações, uma modificação que aumenta a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação) e, assim, aumenta o teor de alcaloides é selecionada do grupo que consiste em: aumentar, promover ou aumentar a transcrição, tradução ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e de pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação); aumento da síntese do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação), ou suas liberações a partir de reservas intracelulares; ou diminuição da taxa de degradação do polipeptídeo codificado por pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação).

[0280] Adequadamente, o método pode compreender a transformação de uma célula de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) com uma construção genética que codifique pelo menos um gene exógeno Nicl ERF (ou que codifique pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação), ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que é capaz de promover ou aumentar pelo menos um gene endógeno Nicl ERF (ou pelo menos um gene endógeno Nicl ERF e pelo menos um gene endógeno Nic2 ERF em combinação). Será apreciado que cada uma destas opções resultaria em uma atividade aumentada e a expressão do polipeptídeo codificado pela, pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene Nicl ERF e o pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação). O método pode compreender a regeneração da planta a partir da célula transformada.

[0281] Assim, é provido o uso de construção genética que é capaz de aumentar a atividade e/ou expressão de um polipeptídeo codificado por pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF em combinação), para aumentar o teor de alcaloides em uma planta transformada com a construção.

[0282] A construção genética pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 16 SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 32 ou SEQ ID No. 36, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma. A construção pode compreender a sequência de nucleotídeos, conforme estabelecido em: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID

No. 33, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma.

[0283] Em algumas concretizações, um método ou uso de acordo com a presente invenção compreende aumentar o teor alcaloide de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) aumentando a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e aumentando a atividade ou expressão de um gene Nic2 ERF.

[0284] Adequadamente, o método ou uso para aumentar o teor de alcaloides compreende aumentar a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente conforme estabelecido em: SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos substancialmente como estabelecido em: SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma e um gene Nic2 ERF em que o gene Nic2 ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente como estabelecido em: SEQ ID No. 40; ou SEQ ID No. 44; ou SEQ ID No. 48; ou SEQ ID No. 52; ou SEQ ID No. 56; ou SEQ ID No. 60; ou SEQ ID No. 64; ou SEQ ID No. 68; ou SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene Nic2 ERF compreende uma sequência de nucleotídeos substancialmente como estabelecido em: SEQ ID No. 37; ou SEQ ID No. 41; ou SEQ ID No. 45; ou SEQ ID No. 49; ou SEQ ID No. 53; ou SEQ ID No. 57; ou SEQ ID No. 61; ou SEQ ID No. 65; ou SEQ ID No.

69.

[0285] Adequadamente, o método ou uso para aumentar o teor de alcaloides compreende aumentar a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou SEQ ID No. 36 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 1; ou SEQ ID No. 3; ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma e um gene Nic2 ERF, em que o gene Nic2 ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 72 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene Nic2 ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 69.

[0286] O termo “inibição” (por exemplo, inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF), conforme usado aqui, significa que a atividade ou expressão do gene Nicl ERF é menor ou diminuída em comparação com a atividade ou expressão do gene em um produto comparável ou a quantidade ou atividade de uma proteína produzida pelo gene Nicl ERF é menor.

[0287] Em uma concretização, o termo “inibição” (por exemplo, inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF), conforme usado aqui, significa que a atividade ou expressão do gene Nicl ERF é menor em comparação com à atividade gênica ou expressão do gene em um produto comparável.

[0288] A atividade de genes Nicl ERF específicos pode ser medida medindo a transcrição do gene. Os métodos para medir a transcrição são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, entre outros, Northern Blot, RNA-Segq, hibridização in situ, microssequenciamento de DNA e RT-PCR. Alternativamente, a atividade de um gene pode ser medida indiretamente medindo o nível do produto do gene, por exemplo, a proteína codificada pelo referido gene.

[0289] Em algumas concretizações, a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF pode ser modulada, isto é, aumentada ou diminuída em pelo menos 10% 20% 30% ou 40%, adequadamente pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, mais adequadamente pelo menos cerca de 80%, 90%, 95% ou 100% quando comparada com a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0290] Adequadamente, a expressão ou função do gene Nicl ERF pode ser reduzida, parcialmente inativada, inibida, eliminada, eliminada ou perdida, de modo que a expressão ou função proteica Nicl ERF não seja detectável.

[0291] Em um aspecto, pelo menos um gene MNicl ERF é nocauteado. Em outras palavras, o gene Nicl ERF foi completamente inoperante.

[0292] Em um aspecto, um gene Nicl ERF que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID No. 8 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido na SEQ ID No. 5 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma é nocauteado.

[0293] Em uma concretização preferida, o gene Nicl ERF pode ter substancialmente nenhuma atividade ou expressão, o que significa que a planta pode compreender menos de cerca de 1% (adequadamente menor que cerca de 0,1%) de atividade ou expressão, preferencialmente quando comparada a uma planta que não foi modificada para inibir a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF.

[0294] Em algumas concretizações, a atividade ou expressão de um gene Nic2 ERF pode ser modulada, isto é, aumentada ou diminuída em pelo menos 10% 20% 30% ou 40%, adequadamente pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, mais adequadamente pelo menos cerca de 80%, 90%, 95% ou 100% quando comparada com a atividade ou expressão de um gene Nic2 ERF em uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) que não foi modificada de acordo com a presente invenção.

[0295] Em uma concretização preferencial, o gene Nic2 ERF pode ter substancialmente nenhuma atividade ou expressão, o que significa que a planta pode compreender menos de cerca de 1%

(adequadamente menor que cerca de 0,1%) de atividade Ou expressão, preferencialmente quando comparada a uma planta que não foi modificada para inibir a atividade ou expressão de um gene Nic2 ERF.

[0296] Um “gene ERF”, conforme usado aqui, refere-se a um gene do fator de transcrição que pertence à subfamília do fator de resposta ao etileno (ERF).

[0297] Um “gene Nicl ERF”, conforme usado aqui, refere-se a um gene ERF que os presentes inventores identificaram nos Exemplos aqui como mapeamento para a região Nicl. Genes Nicl ERF, tais como utilizados aqui estão listados na Tabela 1 abaixo, juntamente com a seu nucleotídeo correspondente, cDNA, cds e amino identificadores de sequência de aminoácidos. Tabela 1. Sequências Nicl ERF.

[0298] Adequadamente, pelo menos um gene Nicl ERF para uso na presente invenção é qualquer um daqueles listados na Tabela 1.

[0299] As sequências genômicas de cada um dos genes Nicl ERFs e Nic? ERFs listados nas tabelas acima são idênticas às suas sequências de codificação correspondentes, com exceção do Nicl ERF ERF17L3. A sequência genômica de ERF17L3 (SEQ ID No. 1) não é idêntica à sequência de codificação de ERF17L3 (SEQ ID No. 3).

[0300] Um “ gene Nic2 ERF”", conforme usado aqui, refere-se a um gene ERF que os presentes inventores identificaram nos Exemplos aqui como mapeamento para a região Nic2. Os genes Nic2 ERF, tais como utilizados aqui estão listados na Tabela 2 abaixo juntamente com o seu nucleotídeo correspondente, cDNA, cds e identificadores de sequência de aminoácidos. Tabela 2. Sequências Nic2 ERF.

Identificador Nome do SEQ ID No.s (nucleotídeo, cCDNA, gene cds, aminoácidos respectivamente)

AAA Nitab4.5 000292490020.2 SEQ ID No.s 41-44 Naná a Dona Aga? Nitab4.5 0002924g0045.1 SEQ ID No.s 49-52 Nitab4.5 0002924g0050.2 SEQ ID No.s 53-56 Nitab4.5 0006499g0010.1 SEQ ID No.s 57-60 Nitab4.5 0006499g0020.2 SEQ ID No.s 61-64 Nitab4.5 0012667g90020.2 SEQ ID No.s 65-68 Nitab4.5 0015055g0010.2 SEQ ID No.s 69-72

[0301] Adequadamente, o gene Nic2 ERF para uso na presente invenção é qualquer um daqueles listados na Tabela 2.

[0302] Em uma concretização, pelo menos um gene Nicl ERF referido aqui pode ser codificado por uma sequência de polinucleotídeos compreendendo: i) uma sequência de polinucleotídeos mostrada aqui como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3; SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 33; ou ii) um fragmento funcional da sequência de polinucleotídeos mostrada em i) cujo fragmento funcional codifica um gene de síntese Nicl ERF, ou iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada aqui como SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 32 ou SEQ ID No. 36, ou iv) uma sequência de polinucleotídeos que pode hibridar com o polinucleotídeo ensinado em i), ii) ou iii) acima em condições de alta restrição, ou v) uma sequência de polinucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente 80%, preferencialmente 85% preferencialmente 290%, preferencialmente 295%, mais preferencialmente 96%, mais preferencialmente 97%, mais preferencialmente 98%) de identidade com o polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) acima, ou vi) uma sequência de polinucleotídeos que difere do polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) devido à degeneração do código genético.

[0303] Em uma concretização, pelo menos um gene Nic2 ERF referido aqui pode ser codificado por uma sequência de polinucleotídeos compreendendo:

i) uma sequência de polinucleotídeos mostrada aqui como SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 65 ou SEQ ID No. 69; ou ii) um fragmento funcional da sequência de polinucleotídeos mostrada em i) cujo fragmento funcional codifica um gene Nicl ERF, ou iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada aqui como SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 68 ou SEQ ID No. 72, ou iv) uma sequência de polinucleotídeos que pode hibridar com o polinucleotídeo ensinado em i), ii) ou iii) acima em condições de alta restrição, ou v) uma sequência de polinucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente 80%, preferencialmente 85% preferencialmente 90%, preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, mais preferencialmente 97%, mais preferencialmente 98%)de identidade com o polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) acima, ou vi) uma sequência de polinucleotídeos que difere do polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) devido à degeneração do código genético.

[0304] Em uma concretização, pelo menos um gene Nicl ERF para uso de acordo com a presente invenção pode ser endógeno para a planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0305] Em uma concretização, pelo menos um gene Nic2 ERF para uso de acordo com a presente invenção pode ser endógeno para a planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0306] A referência mencionada aqui a um gene “endógeno” não apenas se refere ao gene em questão como encontrado em uma planta em sua forma natural (isto é, sem que haja intervenção humana), mas também se refere ao mesmo gene (ou a um ácido nucleico substancialmente homólogo/gene) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzida numa planta (um transgene) ou em uma célula vegetal. Por exemplo, uma planta transgênica contendo esse transgene pode encontrar uma redução substancial da expressão do transgene e/ou redução substancial da expressão do gene endógeno. O gene isolado pode ser isolado de um organismo ou pode ser fabricado pelo homem, por exemplo, por síntese química.

[0307] Em outra concretização, pelo menos um gene Nicl ERF para uso de acordo com a presente invenção pode ser exógeno para a planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0308] Em outra concretização, pelo menos um gene Nic2 ERF para uso de acordo com a presente invenção pode ser exógeno para a planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0309] O termo “gene exógeno” pode significar que o gene que é transformado na planta não modificada é de uma fonte externa, ou seja, de uma espécie diferente daquela que está sendo transformada. O gene ERF exógeno pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente igual ou diferente de um gene ERF endógeno na planta não modificada. O gene exógeno pode ser derivado de uma sequência genômica ou de cDNA correspondente ao gene ERF de qualquer espécie. O gene exógeno pode formar um gene quimérico. O gene exógeno pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela l1, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma. O gene exógeno pode compreender a sequência de nucleotídeos como apresentada na Tabela 2, ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortólogo da mesma.

[0310] A presente invenção também proporciona o uso de um gene Nicl ERF para modular o teor alcaloide de uma planta.

[0311] Em uma concretização, a invenção proporciona também o uso de um gene ERF adicional, em que o gene ERF adicional é um gene Nic2 ERF, conforme descrito aqui na Tabela 2.

[0312] Os métodos para diminuir a expressão de genes ou produtos gênicos estão bem documentados no estado da técnica. Qualquer método aqui descrito para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF pode ser usado para modificar a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF.

[0313] Em uma concretização, a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de ambos os genes Nicl ERF pode ser inibida por qualquer método conhecido no estado da técnica. Em outra concretização, a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e a atividade ou expressão de um gene Nic2 ERF podem ser inibidas por qualquer método conhecido no estado da técnica.

[0314] Os métodos para inibir a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF podem incluir a edição de genes, mutagênese direcionada, interferência de RNA, cossupressão antissenso ou senso (consulte Wang e Wagner 2003, Planta Volume 216, Edição 4, p. 686-691, que é incorporado aqui por referência). Em uma concretização, a inibição da atividade ou expressão de um gene pode ser alcançada pelo uso da edição de genes. A edição de genes pode ser realizada usando qualquer método conhecido no estado da técnica. Alguns exemplos não limitativos são apresentados aqui.

[0315] Em uma concretização, a inibição atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou a expressão de tanto um gene Nicl ERF e um Nic2 ERF do gene pode ser conseguida utilizando métodos de genes de edição, incluindo CRISPR, incluindo a utilização de sistema CRISPR/Cas9. As ferramentas de edição genômica CRISPR/Cas9 estão disponíveis comercialmente, como o “Guide-it” da Clontech (Avenida du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, França).

[0316] Adequadamente, para gerar um vetor de edição de genes PRGEB-M24, o promotor snoRNA U3 de arroz no vetor pRGEB31 pode ser substituído pelo promotor M24 amplificado a partir de pSiM24 (Sahoo et al., 2014 incorporado aqui por referência) através de clonagem por infusão assistida com HindIII e Bsal. Para manter a integridade da sequência SsgRNA e o sítio de reconhecimento BsaIl no vetor pRGEB-M24, o promotor M24 pode ser primeiro amplificado com iniciadores ligados ao sítio de reconhecimento B sal (HindIII EcoRI M24F: GATTACGCCAAGCTTTCCCGTATACCCCGGGGAATTCGT (SEQ ID No. 139);

BsaI M24pro R: cgagaccteggtetecAGATGAGAGATATTCGATTCCG (SEQ ID No. 140)). O produto de PCR diluído será amplificado com iniciadores ligados à sequência de SgRNA ausente (HindIII EcoRI M24F; gRNA Bsal R: ttctagctetaaaacCGAGACCTCGGTCTCCAGATGA (SEQ ID No. 141)). Um par de oligos pode ser projetado para atingir especificamente cada um dos genes candidatos na tabela abaixo. Tabela 3.

Nome Oligo 1 para alvo da Oligo 2 para alvo da Gene Sinonimo edição de gene edição de gene do gene 7 q Nitab4.5 00036 | 7570 CoRAT ENO TD Na o | ARACATTGCARAAGACTTCGTC

6590040.1 Da 758) | ' AGAA (SEQ ID No. 159 Nitab4. 5 00030 ERF199 TGTGA TETO TE Nero AAACTCACATGAATCCCATGAA

9090030.1 - 160) | o. AAGT (SEQ ID No. 161) Nitab4.5 00046 | 550510 Graca (SEO TD No, | AAACTCTACAGARAACARCTTT 20g90010.1 - 162) ' TACT (SEQ ID No. 163) Nitab4.5 00046 ERF911L2 CCRTE SEO TD Ne AAACCATGGTTCTTCTTTGTTT 209g90030.1 - 7164) ' CCTC (SEQ ID No. 165 Nitab4.5 00046 | 5500 CARGA (SmO ED Ne AARACTCTTCTCAACTATGATTC 209g0080.1 . 166) ' CGAT (SEQ ID No. 167) Nitab4.5 00046 ERF130 CITAR SEO ED es AAACTTAAGCCTTGCGTTGGCT 20g0090.3 - 768) ' CCTC (SEQ ID No. 169) Nitab4.5 00046 ERF16 CETIG (SEO TD Nes AAACCAAAGTTTTGGTCCGAAA 209g90095.1 - 170) | ? ' GGGA (SEQ ID No. 171

[0317] As bases sublinhadas na Tabela 3 acima representam o sentido ou sequências antissenso de sítios alvo.

[0318] Os pares oligo são primeiro anelados para produzir um fragmento de fita dupla com saliências de 4 nucleotídeos 5'em ambas as extremidades e depois ligados ao vetor PpRGEB-M24 digerido com Bsal.

[0319] Outro método de edição de genes inclui o uso da tecnologia TALEN (efetor tipo ativador de transcrição de nuclease) com kits disponíveis comercialmente (por exemplo, de Addgene, lKendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, EUA). Em uma concretização, a inibição da atividade ou expressão de, pelo menos, um gene Nicl ERF ou a atividade ou a expressão de tanto um gene Nicl ERF e um pelo menos um gene Nic2 ERF pode ser alcançada utilizando TALEN.

[0320] Em outra concretização, o método pode compreender o uso de nucleases de dedo de zinco, como a tecnologia de nuclease de dedo de zinco CompozrO, disponível na Sigma-Aldrich. Outra concretização pode compreender o uso de meganucleases (ou outro método) descrito em Silva et al. Curr Gene Ther. Fev 2011; 11 (1): 11-27 (cujo ensino é incorporado aqui por referência).

[0321] Em uma concretização, o método para inibir a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou um gene Nic2 ERF pode ser alvo de mutagênese. Qualquer método de mutagênese direcionada pode ser usado. Em uma concretização, o método pode ser mutagênese dirigida por oligonucleotídeo (MDO), como KeyBaseO disponível na Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, Holanda). Em outra concretização, a inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF pode ser alcançada pelo uso de uma construção ou vetor (por exemplo, um plasmídeo).

[0322] As construções genéticas da invenção podem estar na forma de um cassete de expressão, que pode ser adequado para inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF em uma célula hospedeira ou para aumentar a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF em uma célula hospedeira. A construção genética pode ser introduzida em uma célula hospedeira sem ser incorporada em um vetor. Por exemplo, a construção genética, que pode ser uma molécula de ácido nucleico, pode ser incorporada dentro de um lipossoma ou de uma partícula de vírus. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico purificada (por exemplo, DNA livre de histona ou DNA nu) pode ser inserida diretamente em uma célula hospedeira por meios adequados, por exemplo, captação por endocitose direta. A construção genética pode ser introduzida diretamente nas células de um indivíduo hospedeiro (por exemplo, uma planta) por transfecção, infecção, microinjeção, fusão celular, fusão de protoplastos ou bombardeio balístico. Alternativamente, as construções genéticas da invenção podem ser introduzidas diretamente em uma célula hospedeira usando uma pistola de partículas.

[0323] Alternativamente, a construção genética pode compreender ou ser abrigada dentro de um vetor recombinante, para expressão em uma célula hospedeira adequada. O vetor recombinante pode ser um plasmídeo, cosmídeo ou fago. Tais vetores recombinantes são altamente úteis para transformar células hospedeiras com a construção genética da invenção e para replicar a cassete de expressão na mesma. O técnico especializado apreciará que as construções genéticas da invenção podem ser combinadas com muitos tipos de estrutura de vetor para fins de expressão. A estrutura de um vetor pode ser um vetor binário, por exemplo, um que pode se replicar em E. coli e Agrobacterium tumefaciens. Por exemplo, um vetor adequado pode ser um plasmídeo PBIN, como pBIN19 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12: 8711-21).

[0324] Os vetores recombinantes podem incluir uma variedade de outros elementos funcionais, além da sequência que inibe a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ou à atividade ou expressão de ambos, pelo menos um gene Nicl ERF e de pelo menos um gene Nic2 ERF. Por exemplo, o vetor pode compreender um promotor. Além disso, o vetor recombinante pode ser projetado de modo que se replique autonomamente no citosol da célula hospedeira. Nesse caso, elementos que induzem ou regulam a replicação do DNA podem ser necessários no vetor recombinante. Alternativamente, o vetor recombinante pode ser projetado de tal maneira que se integre ao genoma de uma célula hospedeira. Neste caso, estão previstas sequências de DNA que favorecem a integração direcionada (por exemplo, por recombinação homóloga).

[0325] O vetor recombinante também pode compreender DNA codificador de um gene que pode ser usado como um marcador selecionável no processo de clonagem, isto é, para permitir a seleção de células que foram transfectadas ou transformadas e para permitir a seleção de células que hospedam vetores incorporando DNA heterólogo. O vetor também pode compreender DNA envolvido na regulação da expressão da sequência de codificação ou para direcionar o polipeptídeo expresso para uma determinada parte da célula hospedeira, por exemplo, tricomas ou tricomas glandulares. Portanto, o vetor pode compreender pelo menos um elemento adicional selecionado de um grupo que consiste em: um gene marcador selecionável (por exemplo, um gene de resistência a antibióticos); um sinal de terminação de polipeptídeo; e uma sequência de direcionamento de proteínas (por exemplo, um peptídeo de trânsito).

[0326] Em uma concretização, o método ou uso pode compreender a inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF utilizando um oligonucleotídeo interferente. Em uma concretização, o oligonucleotídeo é baseado em RNA. Em uma concretização, o oligonucleotídeo é o RNA de interferência (RNAi), por exemplo, dsRNAi. Em uma concretização, o método pode compreender a transformação de uma célula de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) com uma molécula de RNAi, por exemplo, dsRNAi, que inibe a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF.

[0327] Em uma concretização, a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF diminui em pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95% ou mais, ou 100% em comparação com a atividade ou expressão do polipeptídeo na planta do tipo selvagem.

[0328] Em uma concretização, a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nic2 ERF é diminuída em pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, ou 100% em comparação com a atividade ou expressão do polipeptídeo na planta de tipo selvagem.

[0329] Em uma concretização, a atividade ou expressão de ambos pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF é reduzida em pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, ou 100% em comparação com a atividade ou expressão do polipeptídeo na planta de tipo selvagem.

[0330] A atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de ambos, pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF, pode ser inibida por qualquer método conhecido no estado da técnica. Em qualquer uma das concretizações anteriores, a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de ambos, pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF, pode ser inibida por qualquer método, incluindo métodos de edição de genes incluindo CRISPR, incluindo o uso do sistema CRISPR-Cas9, interferência de RNA (RNAi), cossupressão antissenso ou senso, edição de genes ou mutagênese direcionada. Em qualquer uma das concretizações anteriores, a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF pode ser inibida usando um método RNAi, por exemplo, usando miRNA, siRNA, dsRNA ou sSshRNA.

[0331] Em uma concretização, a construção que modula a atividade ou expressão do gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF e de pelo menos um gene de Nic2 ERF pode estar compreendida em um vetor. Adequadamente, o vetor pode ser um plasmídeo.

[0332] Em uma concretização, o vetor para uso na presente invenção é o plasmídeo à base de Agrobacterium.

[0333] Consequentemente, em um plantas da concretização (por exemplo, uma planta de tabaco) e materiais de propagação de plantas (por exemplo, um material de propagação de planta de tabaco), as folhas (por exemplo, folhas de tabaco), folhas colhidas cortadas, folhas processadas (por exemplo, folhas de tabaco processadas) ou folhas processadas e cortadas (por exemplo, folhas de tabaco cortadas e processadas) são fornecidas em que a expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF é modulada.

[0334] Em outra concretização, a célula (por exemplo, célula de tabaco), planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma e/ou material de propagação de plantas pode apreender uma construção que modula a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF. Em uma concretização, a construção diminui a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou a expressão tanto de um gene Nicl ERF quanto de um gene Nic2 ERF. Em outra concretização, a construção aumenta a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF. Em uma concretização adicional, a célula (por exemplo, célula de tabaco), planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma e/ou material de propagação de plantas de acordo com a invenção pode compreender: i) uma sequência de polinucleotídeos mostrada aqui como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3; SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 9, SEQ ID No.

13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 25, SEQ ID No.

29 ou SEQ ID No. 33; ou ii) um fragmento funcional da sequência de polinucleotídeos mostrada em i) cujo fragmento funcional codifica um gene Nicl ERF, ou iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos aqui mostrada como SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 32 ou SEQ ID No. 36, ou iv) uma sequência de polinucleotídeos que pode hibridar com o polinucleotídeo ensinado em i), ii) ou iii) acima em condições de alta restrição, ou Vv) uma sequência de polinucleotídeos que possui pelo menos 70% (preferencialmente 80%, preferencialmente 85% preferencialmente 90%, preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, mais preferencialmente 97%, mais preferencialmente 98%) de identidade com o polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) acima, ou vi) uma sequência de polinucleotídeos que difere do polinucleotídeo mostrado em i), ii) ou iii) devido à degeneração do código genético.

[0335] Em uma concretização, a célula (por exemplo, célula de tabaco) é cultivada em um cultivo celular.

[0336] Em uma concretização, pelo menos um gene Nicl ERF (ou pelo menos um gene Nicl ERF e pelo menos um gene Nic2 ERF) é usado para modular o teor de alcaloides (por exemplo, teor de nicotina) em uma célula ou cultivo de células (por exemplo, um cultivo de células de tabaco).

[0337] Em uma concretização vantajosa, a inibição da atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF ou da atividade ou expressão de ambos, pelo menos um gene Nicl ERF e um mínimo de um gene Nic2 ERF, pode resultar em uma diminuição no teor de alcaloides. A inibição adequada da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ou da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e de pelo menos um gene Nic2 ERF pode resultar em uma diminuição no teor de nicotina.

[0338] Em outra concretização, aumentar a atividade Ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF pode resultar em um aumento no teor de alcaloides. Aumentar adequadamente a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF pode resultar em um aumento no teor de nicotina.

[0339] Em uma concretização, a planta ou parte da mesma é uma planta de tabaco. Em uma concretização, a planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção é uma planta Burley ou curada em fumeiro modificada de acordo com a presente invenção. Em uma concretização, a presente invenção refere-se a uma planta Burley ou curada em fumeiro modificada de acordo com a presente invenção. Em uma concretização, a planta de tabaco (por exemplo, planta de tabaco modificada) de acordo com a presente invenção é uma planta de tabaco oriental ou turco.

[0340] Em uma concretização, a planta de tabaco ou parte da mesma é curada. Em uma concretização, a planta de tabaco ou parte da mesma é curada, por exemplo, curada ao ar, curada em fumeiro, curada ao fogo ou curada ao sol. Em um aspecto adicional, a planta de tabaco ou parte da mesma é curada em fumeiro. Em um aspecto adicional, a planta de tabaco ou parte da mesma é curada ao ar.

[0341] A cura em fumeiro é bem conhecida no estado da técnica e refere-se ao processo de cura de tabaco com fumeiro que são alimentados por caixas de incêndio ou sistemas alimentados a gás. Esse processo cura o tabaco por calor sem expô-lo à fumaça, aumentando lentamente a temperatura ao longo da cura. Este método produz tabaco com alto teor de açúcar e com níveis médios a altos de nicotina. O celeiro de tabaco Smith é um exemplo de um celeiro tradicional de tabaco curado com fumeiro.

[0342] Os tabacos curados ao ar incluem Burley, Maryland e tabacos escuros. O fator comum é que a cura é principalmente sem fontes artificiais de calor e umidade. Os tabacos Burley são de cor marrom claro a escuro, ricos em óleo e com pouco açúcar. Os tabacos Burley são curados ao ar nos celeiros. Os principais países em crescimento da Burley são Argentina, Brasil, Itália, Malawi e as plantas de tabaco dos EUA Burley incluem, por exemplo, Clay 402, Clay 403, Clay 502, Ky 14, Ky 14, Ky 907, Ky 910, Ky 8959, NC 2, NC 3, NC 4, NC 5, NC 2000, TN 86, TN 90, TN 97, R 610, R 630, R711, R 712, NCBH 129, Bu 21xKy 10, HBO4P, Ky 14xL 8, Kt 200, Newton 98, Pedigo 561, Pf561 e Va 509.

[0343] Os tabacos de Maryland têm boas propriedades de queima, baixa nicotina e aroma neutro. Os principais países em crescimento de Maryland incluem os EUA e a Itália. Os tabacos escuros curados ao ar são diferenciados de outros tipos principalmente pelo processo de fermentação, que confere ao tabaco curado ao ar sua cor marrom médio a marrom-escuro e aroma distinto. Suas folhas têm baixo teor de açúcar, mas alto teor de nicotina. Tabacos curados ao ar escuros são usados principalmente na produção de tabaco de mascar e rapé. As principais regiões de cultivo de tabacos escuros com cura pelo fogo são Tennessee, Kentucky e Virginia, EUA.

[0344] O termo “fragmento funcional”, conforme utilizado aqui, refere-se a uma porção de um polinucleotídeo que é capaz de funcionar da mesma maneira que o polinucleotídeo. Por exemplo, se o polinucleotídeo é um gene ERF, então, o fragmento funcional deve ser capaz de funcionar como um gene ERF, por exemplo, o fragmento funcional retém a atividade do gene ERF. O fragmento funcional pode ter um nível de atividade que seja igual ou maior ao nível de atividade de um polinucleotídeo de comprimento total.

[0345] Em uma concretização, um fragmento funcional pode ser uma porção de um gene Nicl ERF, como discutido aqui compreendendo pelo menos 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos contínuos. Em algumas concretizações, o fragmento funcional pode compreender pelo menos 150 nucleotídeos de um Nicl ERF discutido aqui.

[0346] Em uma concretização, um fragmento funcional de um gene Nic2 ERF pode ser uma porção de um gene Nic2 ERF, conforme discutido aqui, compreendendo pelo menos 50, 75, 100, 150, 200, 300, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos contínuos. Em algumas concretizações, o fragmento funcional pode compreender pelo menos 150 nucleotídeos de um Nic2 ERF discutido aqui.

[0347] O termo “variante funcional”, conforme utilizado aqui, refere-se à variabilidade que pode surgir em sequências genômicas sem perda significativa de atividade na função do gene e/ou na função da proteína. Por exemplo, alguns aminoácidos presentes em um polipeptídeo (ou alguns nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo) podem ser substituídos sem perda significativa de atividade. O variante funcional pode ter um nível de atividade que é igual a, ou maior que, o nível de atividade do polinucleotídeo não variante e/ou polipeptídeo. Sequências que diferem dos genes ERF divulgados aqui devido à degeneração do código genético são variantes funcionais. Um variante pode diferir da sequência de interesse por tão poucos como 10, tão poucos como 9, tão poucos como 8, tão poucos como 7 tão poucos como 6, tão poucos como 5, tão poucos como 4, tão poucos como 3, tão poucos como 2 ou tão poucos como 1 aminoácido.

[0348] O termo “degeneração do código genético”, conforme utilizado aqui, refere-se à redundância em códons que codificam sequências polipeptídicas exibidas como a multiplicidade de combinações de três códons que especificam um aminoácido. Por exemplo, em uma molécula de RNAm que codifica um polipeptídeo que possui um aminoácido isoleucina, a isoleucina pode ser codificada por AUU, AUC ou AVA. Isso significa que uma molécula de DNA que codifica o RNA pode ter várias sequências, mas oO polipeptídeo resultante terá a mesma sequência. Em outras palavras, as sequências de nucleotídeos polimórficas podem codificar o mesmo produto polipeptídico. Isto significa que uma sequência de ácidos nucleicos pode compreender uma sequência com identidade de sequência muito baixa com uma segunda sequência enquanto codifica a mesma sequência polipeptídica.

[0349] As sequências que possuem um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com as sequências de aminoácidos de um polipeptídeo que possui as propriedades específicas descritas aqui ou de qualquer sequência de nucleotídeos descrita aqui podem ser variantes funcionais.

[0350] O termo “ortólogo”, conforme utilizado aqui, refere- se aos genes que são derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado de especiação. Os ortólogos podem compartilhar pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99% ou identidade de sequência maior na sequência de nucleotídeos e ou no nível da sequência de aminoácidos. Os genes ortólogos geralmente compartilham as mesmas funções ou funções semelhantes, ou seja, têm função conservada.

[0351] Em algumas concretizações da presente invenção, um promotor pode ser fornecido. O promotor para uso na presente invenção pode ser um ou mais selecionados do grupo que consiste em: um promotor constitutivo, um promotor específico de senescência, um promotor específico de tecido, um promotor regulado pelo desenvolvimento e um promotor induzível. Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor constitutivo.

[0352] Um promotor constitutivo direciona a expressão de um gene através das várias partes de uma planta continuamente durante o desenvolvimento da planta, embora o gene não possa ser expresso no mesmo nível em todos os tipos de células. Exemplos de promotores constitutivos conhecidos incluem aqueles associados ao transcrito do vírus de mosaico de couve-flor 35S (odell JT, Nagy F, Chua NH (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 358 promoter, Nature 313 810-2), o gene da actina 1 do arroz (Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991) Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants (Plant Cell 3 1155-65)) e o gene da ubiquitina 1 do milho (Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993) Activity of à maize ubiquitin promoter in transgenic rice, Plant Molec. Biol. 23 567-81), que são incorporados aqui por referência. os promotores constitutivos incluem o promotor vírus da mancha em anel de cravo (CERV). A sequência do DNA do vírus da mancha em anel cravo: comparação com o vírus de mosaico de couve-flor e retrovírus ((Hull R, Sadler J, Longstaff M 1986 EMBO Journal, 5 (2): 3083- 3090), que é incorporado aqui por referência).

[0353] O promotor constitutivo pode ser selecionado a partir de: um promotor do vírus da mancha em anel de cravo (CERV), um vírus de mosaico de couve-flor (promotor CaMV 35S), um promotor do gene da actina 1 de arroz ou do gene da ubiquitina 1 de milho. Adequadamente, o promotor pode ser um promotor de CERV.

[0354] Alternativamente, em algumas concretizações, o promotor pode não ser um vírus de mosaico de couve-flor (promotor CaMV 35S). Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor específico de senescência. Um “promotor específico de senescência” (SAG) pode ser um mecanismo que está associado ao controle da expressão de um gene associado à senescência. Desta forma, o promotor pode restringir a expressão de uma sequência codificante (isto é, um gene) à qual está operacionalmente ligada substancialmente exclusivamente ao tecido senescente. Portanto, um promotor específico de senescência pode ser um promotor capaz de promover preferencialmente a expressão gênica em um tecido vegetal de uma maneira regulada pelo desenvolvimento, de modo que a expressão de uma região codificadora de proteína 3'ocorra substancialmente apenas quando o tecido vegetal estiver passando por senescência. Ele será apreciado que a senescência tende a ocorrer nas partes mais velhas da planta, tais como as folhas mais velhas, e não nas partes mais jovens de plantas, tais como as sementes.

[0355] Um exemplo de uma planta que é conhecida por expressar numerosos genes associados à senescência é Arabidopsis Portanto, o promotor pode ser isolado de um gene associado à senescência em Arabidopsis. Gepstein et al. (The Plant Journal, 2003, 36, 629-642), incorporado aqui por referência, conduziram um estudo detalhado dos SAGs e seus promotores usando Arabidopsis como modelo. A construção genética pode compreender um promotor de qualquer um dos SAGs divulgados neste artigo. Por exemplo, um promotor adequado pode ser selecionado de um grupo que consiste em SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 e SAG18, ou uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo.

[0356] Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor SAG12 ou SAG13. Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor SAG12, que será conhecido pelo técnico especializado, ou um variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo (Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319, incorporado aqui por referência). Promotores adequados e suas sequências podem ser encontrados no documento WO2010/097623 (incorporado aqui por referência).

[0357] Em outra concretização, o promotor pode ser um promotor específico de tecido. Um promotor específico de tecido é aquele que direciona a expressão de um gene em uma (ou algumas) partes de uma planta, geralmente durante toda a vida útil dessas partes da planta. A categoria de promotor específico de tecido também inclui geralmente promotores cuja especificidade não é absoluta, isto é, eles também podem direcionar a expressão em um nível mais baixo em tecidos que não seja o tecido preferido. Vários promotores específicos de tecidos são conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles associados ao gene da patatina expresso no tubérculo de batata e ao gene da glutenina de alto peso molecular expresso no endosperma do trigo, cevada ou milho. Qualquer um destes promotores pode ser utilizado na presente invenção.

[0358] Adequadamente, o promotor específico de tecido pode ser um promotor específico de folha. Os promotores específicos de folhas adequadamente podem incluir FOLHAS ASSIMÉTRICAS 1 (AS1).

[0359] Em uma concretização particularmente preferida, o promotor específico de tecido é um promotor específico de raiz.

[0360] Em outra concretização, o promotor pode ser um promotor regulado pelo desenvolvimento. Um promotor regulado pelo desenvolvimento direciona uma alteração na expressão de um gene em uma ou mais partes de uma planta em um momento específico durante o desenvolvimento da planta. O gene pode ser expresso nessa parte da planta em outros momentos em um nível diferente (geralmente mais baixo) e também pode ser expresso em outras partes da planta.

[0361] Em uma concretização, o promotor pode ser um promotor induzível. Um promotor induzível é capaz de direcionar a expressão de um gene em resposta a um indutor. Na ausência do indutor, o gene não será expresso. O indutor pode atuar diretamente sobre a sequência do promotor ou pode neutralizar o efeito de uma molécula repressora. O indutor pode ser um agente químico, como um metabólito, uma proteína, um regulador de crescimento ou um elemento tóxico, um estresse fisiológico, como calor, ferimentos ou pressão osmótica, ou uma consequência indireta da ação de um patógeno ou praga. Um promotor regulado pelo desenvolvimento pode ser descrito como um tipo específico de promotor induzível que responde a um indutor endógeno produzido pela planta ou a um estímulo ambiental em um ponto específico do ciclo de vida da planta. Exemplos de promotores induzíveis conhecidos incluem aqueles associados à resposta da ferida, como descrito por Warner SA, Scott R, Draper J. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AOPRI) wound- responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.) incorporado aqui por referência, resposta à temperatura conforme divulgada por Benfey & Chua (1989) (Benfey, PN e Chua, NH. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181) incorporada aqui por referência e resposta induzida quimicamente, como descrito por Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424), incorporado aqui por referência.

[0362] Assim, em uma concretização, o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em: o promotor CERV, o promotor do vírus de mosaico de couve-flor 358 (completo ou truncado), o promotor de rubisco, o promotor de plastocianina de ervilha, o promotor da nopalina sintase, o promotor da ligação de clorofila r/b, promotor de glutenina de alto peso molecular, promotor de a, B-gliadina, promotor de hordeína e promotor de patatina.

[0363] Em uma concretização, o promotor pode ser o promotor CaMV 358 ou um promotor 35S modificado com uma região potencializadora duplicada ou região potencializadora dupla (R. Kay et al. Science. 1987 jun. 5; 236 (4806): 1299-302, que é incorporada aqui por referência).

[0364] Em uma concretização, o promotor pode ser o promotor nativo.

[0365] Como usado aqui, “ promotor nativo “ refere-se ao promotor que é endógeno ao gene, isto é, que está operacionalmente ligado ao gene na natureza.

[0366] O vetor recombinante também pode compreender DNA codificador de um gene que pode ser usado como um marcador selecionável no processo de clonagem, isto é, para permitir a seleção de células que foram transfectadas ou transformadas e para permitir a seleção de células que hospedam vetores incorporando DNA heterólogo. O vetor também pode compreender DNA envolvido na regulação da expressão da sequência de codificação ou direcionando o polipeptídeo expresso para uma determinada parte da célula hospedeira, por exemplo, o cloroplasto. Portanto, o vetor pode compreender pelo menos um elemento adicional selecionado de um grupo que consiste em: um gene marcador selecionável (por exemplo, um gene de resistência a antibióticos); um sinal de terminação de polipeptídeo; e uma sequência de direcionamento de proteínas (por exemplo, um peptídeo de trânsito de cloroplasto).

[0367] Exemplos de genes marcadores adequados incluem genes de resistência a antibióticos, tais como aqueles que conferem resistência à canamicina, Geneticin (G418) e higromicina (npt- II, hyg-B); genes de resistência a herbicidas, tais como aqueles que conferem resistência a herbicidas à base de fosfinotricina e sulfonamida (bar e sul, respectivamente; EP-A-242246, EP-A- 0249637), incorporados aqui por referência; e marcadores rastreados, tais como beta-glicuronidase (GB2197653), incorporados aqui por referência, luciferase e proteína fluorescente verde (GFP). O gene marcador pode ser controlado por um segundo promotor, que permite a expressão em células, que podem ou não estar na semente, permitindo assim a seleção de células ou tecidos que contêm o marcador em qualquer estágio do desenvolvimento da planta. Os segundos promotores adequados são o promotor do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium e o promotor derivado do gene que codifica o transcrito do vírus de mosaico de couve-flor 35S (CaMV). No entanto, qualquer outro segundo promotor adequado pode ser utilizado.

CARACTERÍSTICAS COMERCIALMENTE DESEJÁVEIS

[0368] Em uma concretização, as plantas da presente invenção têm um teor de alcaloides totais reduzido e/ou o teor de um ou mais alcaloides selecionados de entre nicotina, nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina reduzido e/ou nicotina reduzida, enquanto que as características de sabor e/ou outras características comercialmente desejáveis são pelo menos mantidas. Em uma concretização, as plantas da presente invenção produzem folhas de qualidade e/ou qualidade semelhantes às plantas que não foram modificadas de acordo com a invenção.

[0369] Em uma concretização, as plantas da presente invenção têm um teor de nicotina reduzido sem uma mudança significativa nas características de sabor da planta (por exemplo, comparadas com a mesma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção).

[0370] Em uma concretização, as plantas da presente invenção têm um teor reduzido de nicotina sem uma alteração significativa (por exemplo, diminuição) em outras características comercialmente desejáveis da planta (por exemplo, comparadas com a mesma planta que não foi modificada de acordo com a presente invenção). Em particular, o rendimento da planta modificada é de preferência não reduzido em comparação com a mesma planta que não tenha sido modificada de acordo com a presente invenção.

[0371] Portanto, em uma concretização, os métodos e usos da presente invenção referem-se à redução do teor total de alcaloides e/ou redução de um ou mais alcaloides selecionados de nicotina, nornicotina, anabasina e anatabina e/ou redução de nicotina, mantendo as características de sabor e/ou outras características comercialmente desejáveis (por exemplo, rendimento).

[0372] O termo “características comercialmente desejáveis” incluirá características como rendimento, altura das plantas maduras, número de folhas colhíveis, comprimento médio dos nós, comprimento da folha de corte, largura da folha de corte, qualidade, tolerância ao estresse abiótico (por exemplo, seca),

tolerância a herbicidas e/ou tolerância ao estresse biótico (por exemplo, insetos, bactérias ou fungos).

[0373] O termo “características comercialmente desejáveis” como ensinado aqui vai incluir características tais como a resistência à seca, resistência a pragas, altura das plantas maduras, o número de folhas colhíveis, comprimento médio de nó, o comprimento da folha de corte, a largura da folha de corte, e rendimento, que são comparáveis às referidas características no progenitor curado em fumeiro de uma planta comparável quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0374] A menos que especificado de outra forma, utilizado aqui, o rendimento de tabaco refere-se ao rendimento de folhas curadas que é calculado com base no peso das folhas de tabaco curadas por acre em condições padrão de campo, seguindo práticas agronômicas e cura padrão.

[0375] Em um aspecto, uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da presente invenção tem um rendimento entre 50% e 150%, entre 55% e 145%, entre 60% e 140%, entre 65% e 135%, entre 70% e 130%, entre 75% e 125%, entre 80% e 120%, entre 85% e 115% entre 90% e 110%, entre 90% e 110%, entre 95% e 105%, entre 50% e 100%, entre 55% e 100%, entre 60% e 100%, entre 65% e 100% entre 70% e 100%, entre 75% e 100%, entre 75% e 100%, entre 80% e 100%, entre 85% e 100%, entre 90% e 100 %, entre 95% e 100%, entre 100% e 150%, entre 105% e 150%, entre 110% e 150%, entre 110% e 150%, entre 115% e 150%, entre 120% e 150%, entre 125% e 150%, entre 130% e 150%, entre 135% e 150%, entre 140% e 150% ou entre 145% e 150% do rendimento de uma planta comparável quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0376] Em outro aspecto, o rendimento da planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da presente invenção é de aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2/7, 2,8, 2,9 ou 3,0 vezes o rendimento de uma planta comparável quando cultivada em condições de campo semelhantes

[0377] Em outro aspecto, o rendimento de uma planta de tabaco da presente invenção é comparável ao rendimento da planta comparável curada por combustão quando cultivada em condições de campo semelhantes.

[0378] Em um aspecto, uma planta de tabaco da presente invenção proporciona um rendimento selecionado do grupo que consiste de entre cerca de 1200 e 3500, entre 1300 e 3400, entre 1400 e 3300, entre 1500 e 3200, entre 1500 e 3200, entre 1600 e 3100, entre 1700 e 3000, entre 1800 e 2900, entre 1900 e 2800, entre 2000 e 2700, entre 2100 e 2600, entre 2200 e 2500 e entre 2300 e 2400 libras/acre.

[0379] Em outro aspecto, uma planta de tabaco da presente invenção proporciona um rendimento selecionado do grupo que consiste de entre cerca de 1200 e 3500, entre 1300 e 3500, entre 1400 e 3500, entre 1500 e 3500, entre 1500 e 3500, entre 1600 e 3500, entre 1700 e 3500, entre 1800 e 3500, entre 1900 e 3500, entre 2000 e 3500, entre 2100 e 3500, entre 2200 e 3500, entre 2300 e 3500, entre 2400 e 3500, entre 2400 e 3500, entre 2500 e 3500, entre 2600 e 3500, entre 2700 e 3500, entre 2800 e 3500, entre 2900 e 3500, entre 3000 e 3500 e entre 3100 e 3500 libras/acre.

[0380] Em um aspecto adicional, uma planta de tabaco da presente invenção proporciona um rendimento selecionado a partir do grupo que consiste de entre cerca de 1200 e 3500, entre 1200 e 3400, entre 1200 e 3300, entre 1200 e 3200, entre 1200 e 3100, entre 1200 e 3000, entre 1200 e 2900, entre 1200 e 2800, entre 1200 e 2700, entre 1200 e 2600, entre 1200 e 2500, entre 1200 e 2400, entre 1200 e 2300, entre 1200 e 2300, entre 1200 e 2200, entre 1200 e 2100, entre 1200 e 2000, entre 1200 e 1900, entre 1200 e 1800, entre 1200 e 1700, entre 1200 e 1600, entre 1200 e 1500 e entre 1200 e 1400 libras/acre.

PLANTAS

[0381] As plantas adequadas de acordo com a invenção incluem a família de plantas Solanaceae, que inclui, por exemplo, erva daninha de jimson, berinjela, mandrágora, beladona, pimentão (páprica, pimenta), batata e tabaco.

[0382] Em uma concretização, um gênero adequado de Solanaceae é Solanum, por exemplo, Solanum lycopersicum.

[0383] Em uma concretização, um gênero adequado de Solanaceae é Nicotiana, por exemplo, Nicotiana tabacum ou MNicotiana rustica.

[0384] Uma espécie adequada de Nicotiana pode ser Nicotiana tabacum. Espécies de Nicotiana pode ser designado aqui como uma planta do tabaco, ou simplesmente tabaco.

PLANTAS DE TABACO

[0385] A presente invenção proporciona métodos, usos dirigidos para as plantas (por exemplo, plantas do tabaco), bem como uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), uma planta

(por exemplo, uma planta do tabaco) e um material de propagação da planta.

[0386] O termo “tabaco”, conforme usado aqui, refere-se a uma planta do gênero Nicotiana que é usada na produção de produtos de tabaco. Exemplos não limitativos de plantas de “tabaco” adequadas incluem N. tabacum e N. rustica (por exemplo, N. tabacum L., LA B21, LN KYl171, Tl 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 e Petico).

[0387] Em uma concretização de uma planta de tabaco adequada pode ser qualquer germoplasma, linhagem ou variedade de N. tabacum.

[0388] Em outra concretização, uma planta de tabaco adequada pode ser espécie diferente de tabacum.

[0389] O material de tabaco pode ser derivado ou obtido a partir de variedades de tipos de Nicotiana tabacum, vulgarmente conhecido como variedades Burley, variedades de fumeiro ou brilhantes e variedades escuras. Em algumas concretizações, oO material de tabaco é derivado de uma planta Burley, ou Virginia uma planta de tabaco escura. A planta de tabaco pode ser selecionada a partir de tabaco Burley, tabaco raro, tabaco especial, tabaco expandido ou semelhante.

[0390] O uso de cultivares de tabaco e cultivares de tabaco de elite também é contemplado aqui. A planta de tabaco para uso aqui pode, portanto, ser uma variedade de tabaco ou cultivar de tabaco de elite. As variedades particularmente úteis de Nicotiana tabacum incluem o tipo Virgínia curado em fumeiro, o tipo Burley e o tipo oriental.

[0391] Em algumas concretizações, a planta de tabaco pode ser, por exemplo, selecionada de uma ou mais das seguintes variedades: L. cultivar T.I. 1068, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), KT DiH3 Híbrido 107, Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, F4 do cruzamento BU21 x Hoja Parado, linhagem 97, KTRDCt+2 Híbrido 49, KTRDC * 4 Híbrido 110, Burley 21, PMO016, KTRDCH+5 KY 160 SI, KTRDCH7 FCA, KTRDCH+6 TN 86 SI, PMO21, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 8959, KY 9, KY 907, MD 609, McNair 373, NC 2000, PG 01, PG 04, POl, PO2, PO3, RG 11, RG 17, RG 8, Speight G-28, TN 86, TN 90, TN 50, VA 509, AS44, PG 04, POl, PO2, PO3, RG 11, RG 17, RG 8, Speight G-28, TN 86, TN 90, VA 509, AS44, Banket Al, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 319, Coker 347, Criollo Misionero, PMO092, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HBO4P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, PM102, Kutsage El, KY 14 x L8, KY 171, LA BU 21, McNair 944, NC 2326, NF 71, NC 297, NF 3, PVH 03, PVH 09, PVH 19, PVH 21 10, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, PM132, Wislica, Yayaldag, NC 4, TR Madole, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TT -1068, KDH-960, TI-1070, TW136, PM204, PM205, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, TN 90, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153 e Petit Havana.

[0392] Exemplos não limitativos de variedades ou cultivares são: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF91 1, DT 538 LC, tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido 404LC, Híbrido 501 LC, K 149,

K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, A KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, Nº 7371 LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, Tabaco 'Perique' PD 7312 LC, PVHO3, PVHO9, PVH19, PVH50, PVHS51l, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G- 28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, Tl 1406, Tl 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, POl1, PO2, PO3, RG 1 1, RG 8, VA 509, AS44, Banket Al, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81 , DVH 405, Galpao Comum, HBO4P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage El , LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 21 10, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep Pl2-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, Tl1-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana.

Subvariedades de baixo conversor acima, mesmo que não sejam especificamente identificadas aqui, também são contempladas.

[0393] A planta do tabaco pode ser uma Burley, Virgínia curada em fumeiro ou Oriental.

[0394] Em uma concretização, o material de propagação de plantas pode ser obtido a partir de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da invenção. Um “material de propagação de planta”, conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer matéria vegetal retirada de uma planta a partir da qual outras plantas possam ser produzidas. Adequadamente, o material de propagação da planta pode ser uma semente. Adequadamente, o material de propagação da planta pode ser pólen.

[0395] Em uma concretização, a célula (por exemplo, uma célula de tabaco), a planta (por exemplo, uma planta de tabaco) e/ou o material de propagação de plantas da invenção pode compreender atividade ou expressão modulada de um gene Nicl ERF ou de um gene Nicl ERF e de um Nic2 ERF gene. Em outra concretização, a célula (por exemplo, célula de tabaco), planta (por exemplo, planta de tabaco) e/ou material de propagação de plantas pode compreender uma construção ou vetor de acordo com a invenção. Em outra concretização, a célula (por exemplo, célula de tabaco), planta (por exemplo, planta de tabaco) e/ou material de propagação de planta pode ser obtida (por exemplo, obtida) por um método de acordo com a invenção.

[0396] Adequadamente, uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) ou parte da mesma de acordo com a presente invenção pode compreender atividade ou expressão modulada de um gene Nicl ERF (ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF), quando comparada a uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco) ou parte da mesma que tem não foi modificada para modular a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou de ambos gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF).

[0397] Em uma concretização, a planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma de acordo com a presente invenção compreende uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco) da invenção. Em outra concretização, O material de propagação de plantas pode ser obtenível (por exemplo, obtido) de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da invenção.

[0398] Em uma concretização, é provida a utilização de uma célula (por exemplo, uma célula de tabaco), conforme previsto nas concretizações anteriores para a produção de um produto (por exemplo, um produto de tabaco). Além disso, é provido o uso de uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco), tal como aqui descrito para produzir uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco).

[0399] A presente invenção também proporciona em outra concretização o uso de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) das concretizações anteriores para a produção de um produto (por exemplo, um produto de tabaco). Em outra concretização, é provido o uso de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) da invenção para cultivar uma colheita. Em uma concretização, a utilização de um gene Nicl ERF ou de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF de acordo com o presente invento resulta na modulação do teor de alcaloide de uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco).

[0400] Em uma concretização, o método ou uso de um gene Nicl ERF ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF de acordo com a presente invenção pode resultar na modulação do teor alcaloide.

Em outra concretização, a utilização de um gene Nicl ERF ou de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF (por exemplo, a atividade ou expressão do mesmo) pode resultar em uma diminuição no teor de um ou mais alcaloides. Adequadamente, o teor de um ou mais de anatabina, anabasina, miosmina, nornicotina ou nicotina pode ser reduzido. Adequadamente, o teor de nicotina é reduzido. Adequadamente, isto pode ser observado quando a atividade ou expressão do gene Nicl ERF ou de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF, é diminuída em comparação com plantas de tipo selvagem.

[0401] Em uma outra concretização, o método ou o uso de um gene Nicl ERF ou de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF, (por exemplo, atividade ou expressão aumentada do mesmo) pode resultar em um aumento do teor de um ou mais alcaloides. Adequadamente, o teor de um ou mais de anatabina, anabasina, nornicotina ou nicotina pode ser aumentado. Adequadamente, o teor de nicotina é reduzido. Adequadamente, isso pode ser observado quando a atividade ou expressão do gene Nicl ERF é aumentada em comparação com plantas do tipo selvagem.

[0402] Em uma concretização adequadamente, a planta (por exemplo, planta de tabaco) ou parte da mesma, por exemplo, a folha ou folha colhida ou folha processada colhida, ou produtos (por exemplo, produtos de tabaco) compreendendo a planta compreendem um gene Nicl ERF modificado (por exemplo, mutado ou excluído) da presente invenção (ou um modificado (por exemplo, mutado ou eliminado) gene Nicl ERF em combinação com um modificado (por exemplo, mutado ou eliminado) gene Nic2 ERF de acordo com a presente invenção).

[0403] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um cultivo de células de tabaco (por exemplo, cultivo in vitro) A cultivo de células de tabaco pode ser uma cultura de suspensão de células de tabaco. Estas células de tabaco cultivadas in vitro podem ser incorporadas a um produto de tabaco, por exemplo, como um substituto para partículas de tabaco convencionais, fragmentos, lâmina de tabaco de corte fino ou de corte longo como ingrediente aditivo ou como substituto e aditivo.

[0404] Em uma concretização, é provida a utilização de um cultivo celular de tabaco, por exemplo, uma cultivo celular de tabaco colhido e/ou processado, ou um extrato do mesmo de acordo com a presente invenção para a produção de um produto de tabaco.

[0405] As células de tabaco colhidas a partir de um cultivo in vitro podem ser secas, por exemplo, liofilizadas, por exemplo, para produzir um pó.

[0406] O especialista da área terá conhecimento de métodos conhecidos para estabelecer cultivos in vitro de células do tabaco. A título de exemplo, apenas o seguinte método pode ser usado: coleta de sementes para formar uma planta de tabaco de interesse e esterilizar seu exterior para eliminar organismos indesejados, plantio das referidas sementes para cultivo de uma planta de tabaco de interesse, remoção do tecido da planta de tabaco (por exemplo, do caule do tabaco) para uso como explante, estabelecimento de uma cultivo de calos a partir do explante de tabaco, estabelecimento de um cultivo de suspensão de células do cultivo de calos e colheita do material da cultivo (por exemplo, incluindo células de tabaco) para produzir um cultivo de células de tabaco.

[0407] As células do tabaco podem ser colhidas por vários métodos, incluindo filtração, por exemplo, filtração a vácuo. A amostra pode ser lavada no filtro adicionando água e o líquido restante removido com a filtração, por exemplo, filtração a vácuo.

[0408] O cultivo de células de tabaco colhidas pode ser posteriormente processado, por exemplo, secagem, como secagem ao ar e/ou liofilizado. O cultivo de células de tabaco colhidas ou o cultivo de células de tabaco colhidas a seco ou um extrato do mesmo pode ser incorporado nos produtos de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0409] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma planta de tabaco ou parte da mesma para uso na agricultura molecular. Adequadamente, uma planta ou parte da mesma modificada de acordo com a presente invenção pode ser utilizada na fabricação de proteínas como terapêuticos, por exemplo, antibióticos, partículas semelhantes a vírus, neutracêuticos ou pequenas moléculas.

[0410] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um método para a produção de proteínas (por exemplo, proteínas terapêuticas); o método que compreende modificar uma planta ou parte da mesma capaz de produzir a referida proteína (por exemplo, proteína terapêutica) modulando a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF: em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID No. 4; ou SEQ ID No. 8; ou SEQ ID No. 12; ou SEQ ID No. 16; ou SEQ ID No. 20; ou SEQ ID No. 24; ou SEQ ID No. 28; ou SEQ ID No. 32; ou

SEQ ID No. 36 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID No. 1; SEQ ID No. 3, ou SEQ ID No. 5; ou SEQ ID No. 9; ou SEQ ID No. 13; ou SEQ ID No. 17; ou SEQ ID No. 21; ou SEQ ID No. 25; ou SEQ ID No. 29; ou SEQ ID No. 33 ou uma variante funcional ou fragmento funcional ou ortóloga da mesma; e cultivar a planta em condições suficientes para permitir a produção da referida proteína (por exemplo, proteína terapêutica).

PRODUTOS

[0411] A presente invenção também proporciona produtos obteníveis ou obtidos a partir de tabaco de acordo com a presente invenção. Os produtos são fornecidos de modo que podem ser obteníveis ou obtidos a partir de uma planta de tabaco em que a atividade ou expressão do gene Nicl ERF ou de ambos genes Nicl ERF e Nic2 ERF foram modulados e que compreende teor de alcaloides modulados.

[0412] Conforme usado aqui, o termo “produto da indústria do tabaco” se destina a incluir artigos de fumo combustíveis, como cigarros, cigarrilhas, charutos, tabaco para cachimbos ou para cigarros de rolo (com base em tabaco, derivados de tabaco, tabaco expandido, tabaco reconstituído, substitutos do tabaco ou outro material para fumar), sistemas de fornecimento de aerossóis não combustíveis, como produtos de aquecimento que liberam compostos de materiais de substrato sem queimar, como cigarros eletrônicos, produtos de aquecimento de tabaco e sistemas híbridos para gerar aerossol a partir de uma combinação de materiais de substrato, por exemplo, sistemas híbridos contendo um substrato líquido ou gel ou sólido, bem como materiais de substrato que formam aerossol usados dentro desses sistemas de fornecimento de aerossóis; e artigos de entrega sem aerossol, como pastilhas, gomas, adesivos, artigos compreendendo pós respiráveis e produtos de tabaco sem fumaça, como snus e rapé, cujos artigos de entrega sem aerossol podem ou não entregar nicotina.

[0413] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma planta de tabaco ou uma parte da mesma de acordo com a presente invenção.

[0414] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de um cultivo de células do tabaco de acordo com a presente invenção.

[0415] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0416] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma folha colhida de uma planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0417] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma folha de tabaco processada de acordo com a presente invenção.

[0418] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) um material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0419] Adequadamente, o produto da indústria do tabaco pode ser preparado a partir de (por exemplo, pode compreender) uma mistura de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0420] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um artigo para fumar combustível, selecionado do grupo que consiste em um cigarro, uma cigarrilha e um charuto.

[0421] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco compreende um ou mais componentes de um artigo de fumo combustível, como um filtro, uma haste de filtro, segmentos de haste de filtro, tabaco, uma haste de tabaco, um segmento de haste de tabaco, um derramamento, um componente de liberação aditiva como uma cápsula, um fio, miçangas, um papel tal como um invólucro, um papel de filtro ou um papel de cigarro.

[0422] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um sistema de provisão de aerossol não combustível.

[0423] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco compreende um ou mais componentes de um sistema de provisão de aerossol não combustível, como um aquecedor e um substrato que forma aerossol.

[0424] Em uma concretização, o sistema de provisão de aerossol é um cigarro eletrônico também conhecido como dispositivo vaporizador.

[0425] Em uma concretização, O cigarro eletrônico compreende um aquecedor, uma fonte de alimentação capaz de fornecer energia ao aquecedor, um substrato que forma aerossol, como um líquido ou gel, um alojamento e opcionalmente um bocal.

[0426] Em uma concretização, o substrato que forma aerossol está contido em um recipiente de substrato. Em uma concretização, o recipiente de substrato é combinado com ou compreende o aquecedor.

[0427] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um produto de aquecimento que libera um ou mais compostos aquecendo, mas não queimando, um material de substrato. O material do substrato é um material que forma aerossol e que pode ser, por exemplo, tabaco ou outros produtos diferentes de tabaco, que podem ou não conter nicotina. Em uma concretização, o produto de aquecimento é um produto de aquecimento de tabaco.

[0428] Em uma concretização, o produto de aquecimento é um dispositivo eletrônico.

[0429] Em uma concretização, o produto de aquecimento de tabaco compreende um aquecedor, uma fonte de energia capaz de fornecer energia ao aquecedor, um substrato que forma aerossol, como um material sólido ou gel.

[0430] Em uma concretização, o produto de aquecimento é um artigo não eletrônico.

[0431] Em uma concretização, o produto de aquecimento compreende um substrato que forma aerossol, como um material sólido ou gel, e uma fonte de calor que é capaz de fornecer energia térmica ao substrato que forma aerossol sem qualquer meio eletrônico, tal como por queima de um material de combustão, como carvão.

[0432] Em uma concretização, o produto de aquecimento também compreende um filtro capaz de filtrar o aerossol gerado pelo aquecimento do substrato que forma aerossol.

[0433] Em algumas concretizações, o material de substrato que forma aerossol pode compreender um agente gerador de vapor ou aerossol ou um umectante, como glicerol, propilenoglicol, triacetina ou dietilenoglicol.

[0434] Em uma concretização, o produto da indústria do tabaco é um sistema híbrido para gerar aerossol por aquecimento, mas não queima, uma combinação de materiais de substrato. Os materiais de substrato podem compreender, por exemplo, sólido, líquido ou gel que pode ou não conter nicotina. Em uma concretização, o sistema híbrido compreende um substrato líquido ou gel e um substrato sólido. O substrato sólido pode ser, por exemplo, tabaco ou outros produtos que não sejam de tabaco, que podem ou não conter nicotina. Em uma concretização, o sistema híbrido compreende um substrato líquido ou gel e tabaco.

[0435] Em outra concretização, o produto pode compreender uma construção da invenção que modula a atividade ou expressão do gene Nicl ERF e o teor de alcaloides diminuído.

[0436] Em outra concretização, o produto pode compreender uma ou mais construções da invenção que modulam ambas a atividade ou expressão do gene Nicl ERF e a atividade ou expressão do gene Nic2 ERF em que o referido produto tem o teor de alcaloides modulado.

[0437] Em uma concretização, é provido o uso de uma planta da invenção (por exemplo, uma planta de tabaco) para produzir folhas (por exemplo, folha de tabaco). Adequadamente, a folha (por exemplo, folha de tabaco) pode ser submetida a aplicações a jusante, como processamento. Desta forma, em uma concretização a utilização da concretização anterior podem proporcionar uma folha processada (por exemplo uma folha de tabaco processada). Adequadamente, a folha de tabaco pode ser submetida a cura, fermentação, pasteurização ou combinações das mesmas.

[0438] Em outra concretização, a folha (por exemplo, folha de tabaco) pode ser cortada. Em algumas concretizações, a folha (por exemplo, folhas de tabaco) pode ser cortada antes ou depois de ser submetida a cura, fermentação, pasteurização Ou combinações das mesmas.

[0439] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma folha colhida de uma planta da invenção (por exemplo, uma planta de tabaco). Em uma concretização, a folha colhida pode ser obtida a partir de uma planta (por exemplo, uma planta do tabaco) que modulou a atividade ou expressão do gene Nicl ERF ou que modularam ambas as atividades ou expressões dos genes Nicl ERF e Nic2 ERF. Adequadamente, a folha colhida possui um teor alcaloide modulado. Em outra concretização, a folha colhida pode ser obtenível (por exemplo, obtida) de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) propagada a partir de um material de propagação da presente invenção. Em outra concretização, é provida uma folha colhida obtenível a partir de um método ou uso da presente invenção. Adequadamente, a folha colhida pode ser uma folha colhida cortada. Em algumas concretizações, a folha colhida pode compreender células viáveis (por exemplo, células viáveis de tabaco). Em algumas concretizações, a folha colhida não compreende células viáveis (por exemplo, células viáveis de tabaco). Em outras concretizações, a folha colhida pode ser sujeita a processamento adicional.

[0440] Algumas plantas de tabaco podem ser colhidas cortando os caules e colhendo todas as folhas simultaneamente (por exemplo, como no tabaco Burley). Outras plantas de tabaco (por exemplo, tabaco curado em fumeiro) podem ser colhidas em estágios em um processo como o condicionamento, em que folhas individuais são removidas do caule à medida que amadurecem.

[0441] Como usado aqui, “condicionamento” refere-se à remoção de folhas de plantas de tabaco. Isso pode se referir à remoção de folhas maduras ou aptas de plantas curadas em fumeiro.

[0442] Também é provida uma folha processada (por exemplo uma folha de tabaco processada). A folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada) pode ser obtida a partir de uma planta da invenção (por exemplo, planta de tabaco). Adequadamente, a folha processada pode ser obtida de uma planta obtida de acordo com qualquer um dos métodos e/ou usos da presente invenção. Em uma concretização, a folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada) pode ser obtida a partir de uma planta (por exemplo, planta do tabaco) que tem a atividade ou expressão do gene Nicl ERF modulada ou de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF e o teor de alcaloides modulados, de preferência quando comparado a uma folha de controle, isto é, comparada a uma folha de uma planta (por exemplo, planta de tabaco) que não foi modificada de acordo com a invenção. A folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada) pode compreender uma modulação na atividade ou expressão do gene Nicl ERF ou de um gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF e teor de alcaloides modificado.

[0443] Em outra concretização, a folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada) pode ser obtenível de uma planta (por exemplo, planta do tabaco) propagada de uma planta (por exemplo, planta do tabaco) de propagação de material de acordo com a presente invenção. A folha processada (por exemplo, folha de tabaco processada) da presente invenção é obtida através do processamento de uma folha colhida da invenção.

[0444] O termo “folha processada”, conforme utilizado aqui, refere-se a uma folha que passou por uma ou mais etapas de processamento às quais as folhas são submetidas no estado da técnica. Uma “folha processada” compreende nenhuma ou praticamente nenhuma célula viável.

[0445] O termo “folha de tabaco processada”, conforme utilizado aqui, refere-se a uma folha de tabaco que passou por uma ou mais etapas de processamento às quais o tabaco é submetido no estado da técnica. Uma “folha de tabaco processada” compreende nenhuma ou praticamente nenhuma célula viável.

[0446] O termo “células viáveis” refere-se a células que são capazes de crescer e/ou são metabolicamente ativas. Portanto, se uma célula é considerada não viável, também chamada de “inviável”, a célula não exibe as características de uma célula viável.

[0447] O termo “substancialmente células não viáveis” significa que menos de cerca de 5% do total de células são viáveis. De preferência, menos de cerca de 3%, mais preferencialmente menos que cerca de 1%, ainda mais preferencialmente menos que cerca de 0,1% do total de células são viáveis.

[0448] Em uma concretização, a folha de tabaco processada pode ser processada por um ou mais de entre: cura, fermentação e/ou pasteurização. Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por cura. A folha de tabaco pode ser curada por qualquer método conhecido no estado da técnica. Em uma concretização, a folha de tabaco pode ser curada por um ou mais dos métodos de cura selecionados do grupo que consiste em: cura ao ar, cura ao fogo, cura em fumeiro e cura ao sol. Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao ar. Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada em fumeiro.

[0449] Normalmente, a cura ao ar é alcançada pendurando folhas de tabaco em celeiros bem ventilados e permitindo a secagem. Isso geralmente é realizado durante um período de quatro a oito semanas. A cura ao ar é especialmente adequada para o tabaco Burley.

[0450] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao fogo. A cura ao fogo é normalmente obtida pendurando folhas de tabaco em grandes celeiros, onde os fogos de madeira são mantidos em fogo baixo contínuo ou intermitente e geralmente levam entre três dias e dez semanas, dependendo do processo e do tabaco.

[0451] Em outra concretização, a folha de tabaco pode ser curada em fumeiro. A cura em fumeiro pode compreender amarração de folhas de tabaco em palitos de tabaco e pendurá-las em barras em celeiros de cura. Os celeiros costumam ter um fumeiro que sai de caixas de incêndio alimentadas externamente. Normalmente, isso resulta em tabaco que foi curado pelo calor sem ser exposto à fumaça. Normalmente, a temperatura aumenta lentamente ao longo da cura, com todo o processo levando aproximadamente 1 semana.

[0452] Adequadamente, a folha de tabaco pode ser curada ao sol. Esse método geralmente envolve a exposição do tabaco descoberto no sol.

[0453] Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por fermentação. A fermentação pode ser realizada de qualquer maneira conhecida no estado da técnica. Normalmente, durante a fermentação, as folhas de tabaco são empilhadas em pilhas (a massa) de tabaco curado, cobertas, por exemplo, com estopa para reter a umidade. A combinação da água restante dentro da folha e o peso do tabaco gera um calor natural que amadurece o tabaco. A temperatura no centro do volume é monitorada diariamente. Em alguns métodos, toda semana o volume inteiro é aberto. As folhas são então removidas para serem sacudidas e umedecidas e a massa é girada para que as folhas internas saiam para fora e as folhas inferiores sejam colocadas na parte superior da massa. Isso garante uma fermentação uniforme em todo o volume. A umidade adicional nas folhas, além da rotação real das próprias folhas, gera calor, liberando a amônia natural do tabaco e reduzindo a nicotina, além de atenuar a cor e melhorar o aroma do tabaco. Normalmente, o processo de fermentação continua por até 6 meses, dependendo da variedade de tabaco, da posição da barra na folha, da espessura e do uso pretendido da folha.

[0454] Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser processada por pasteurização. A pasteurização pode ser particularmente preferida quando a folha de tabaco será usada para produzir um produto de tabaco sem fumaça, mais preferencialmente snus. A pasteurização de folhas de tabaco pode ser realizada por qualquer método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, a pasteurização pode ser realizada conforme detalhado em J. Foulds, L. Ramstrom, M. Burke, K. Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359, cujo ensino é incorporado aqui por referência.

[0455] Durante a produção de snus, a pasteurização é normalmente realizada por um processo no qual o tabaco é tratado termicamente com vapor por 24 a 36 horas (atingindo temperaturas de aproximadamente 100 ºC). Isso resulta em um produto quase estéril e, sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que uma das consequências disso seja uma limitação da formação adicional de TSNA.

[0456] Em uma concretização, a pasteurização pode ser pasteurização a vapor.

[0457] Em algumas concretizações, a folha de tabaco processada pode ser cortada. A folha de tabaco processada pode ser cortada antes ou após o processamento. Adequadamente, a folha de tabaco processada pode ser cortada após o processamento.

[0458] Em algumas concretizações, a planta de tabaco, a folha colhida de uma planta de tabaco e/ou a folha de tabaco processada podem ser usadas para extrair nicotina. A extração de nicotina pode ser alcançada usando qualquer método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, um método para extrair nicotina do tabaco é ensinado na US 2.162.738 que é incorporada aqui por referência.

[0459] Em um aspecto, a presente invenção proporciona material de tabaco curado feito de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a invenção.

[0460] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma mistura de tabaco compreendendo material de tabaco feito de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma mistura de tabaco compreendendo material de tabaco curado de acordo com a presente invenção.

[0461] Adequadamente, a mistura de tabaco de acordo com a presente invenção pode compreender aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 10% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 20% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 30% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 40% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 50% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 60% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 70% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura tabaco pode compreender aproximadamente 80% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção. Adequadamente, a mistura de tabaco pode compreender aproximadamente 90% de tabaco de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção.

[0462] Em um aspecto, um produto de mistura de tabaco da presente invenção compreende pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento em peso seco de tabaco curado a partir de uma planta de tabaco ou parte da mesma de acordo com a presente invenção.

[0463] Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado ao ar. Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado em fumeiro. Adequadamente, o material de tabaco curado pode ser curado ao sol.

[0464] Um produto de tabaco ou artigo de fumo de acordo com a presente invenção pode compreender o material de tabaco (por exemplo, material de tabaco curado) de acordo com a presente invenção.

[0465] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um produto de tabaco. Adequadamente, um produto de tabaco pode ser um produto de tabaco misturado. Em uma concretização, o produto do tabaco pode ser preparado a partir de uma planta de tabaco da invenção ou de uma parte da mesma. Em uma concretização o produto do tabaco pode ser preparado a partir de uma planta do tabaco que tem a atividade do ou expressão do gene Nicl ERF ou aàa atividade ou expressão de ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF. O produto do tabaco pode compreender uma redução na atividade ou expressão do gene Nicl ERF e no teor alcaloide reduzido. Adequadamente, a planta de tabaco ou parte da mesma pode ser propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0466] O termo “parte da mesma”, conforme usado aqui no contexto de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco) refere-se a uma porção da planta (por exemplo, planta de tabaco). De preferência, a “parte da mesma” é uma folha de uma planta (por exemplo, uma planta de tabaco).

[0467] Em outra concretização, o produto de tabaco pode ser preparado a partir de uma folha colhida da invenção. Em uma outra concretização, o produto do tabaco pode ser preparado a partir de uma folha de tabaco processada da invenção. Adequadamente, o produto do tabaco pode ser preparado a partir de uma folha de tabaco processada por um ou mais dos seguintes: cura, fermentação e/ou pasteurização. Adequadamente, o produto do tabaco pode compreender -— uma folha de tabaco cortada, opcionalmente processada de acordo com a concretização anterior.

[0468] Em uma concretização, o produto do tabaco pode ser um artigo de fumo. Tal como utilizado aqui, o termo “artigo de fumo” pode incluir e produtos fumáveis, tais como a fumo de rolo cigarros, charutos e cigarrilhas, seja com base em tabaco, produtos derivados do tabaco, tabaco expandido, de tabaco reconstituído ou substitutos de tabaco.

[0469] Em outra concretização, o produto de tabaco pode ser um produto de tabaco sem fumaça. O termo “produto do tabaco sem fumaça”, conforme usado aqui, refere-se a um produto do tabaco que não se destina a ser fumado e/ou sujeito a combustão. Em uma concretização, um produto de tabaco sem fumaça pode incluir snus, rapé, tabaco de mascar ou similares.

[0470] Em uma concretização adicional, o produto de tabaco pode ser um dispositivo de aquecimento de tabaco ou dispositivo híbrido ou cigarros eletrônicos ou similares. Tipicamente, em dispositivos de aquecimento ou dispositivos híbridos, um aerossol é gerado pela transferência de calor a partir de uma fonte de calor para um substrato de formação de aerossol fisicamente separado ou material, o qual pode ser localizado dentro, em torno de ou a jusante da fonte de calor. Durante o fumo, os compostos voláteis são liberados do substrato formador de aerossol por transferência de calor da fonte de calor e arrastados pelo ar aspirado através do artigo de fumo. À medida que os compostos liberados esfriam, eles se condensam para formar um aerossol que é inalado pelo usuário.

[0471] Artigos e dispositivos geradores de aerossol para consumo ou dispositivos de aquecimento de tabaco de fumo são conhecidos no estado da técnica. Eles podem incluir, por exemplo, dispositivos geradores de aerossóis aquecidos eletricamente nos quais um aerossol é gerado pela transferência de calor de um ou mais elementos de aquecimento elétrico do dispositivo gerador de aerossóis para o substrato de formação de aerossóis de um dispositivo de aquecimento de tabaco. Adequadamente, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo gerador de aerossol.

[0472] De preferência, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo de aquecimento e sem queima. Os dispositivos de aquecimento sem queima são conhecidos no estado da técnica e liberam compostos aquecendo, mas não queimando, tabaco. Um exemplo de um dispositivo de aquecimento sem queima, adequado pode ser um exemplo do documento WO2013/034459 ou GB2515502, que são incorporados aqui por referência.

[0473] Em uma concretização, oO substrato de formação de aerossol de um dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um produto de tabaco de acordo com a presente invenção.

[0474] Em uma concretização, o dispositivo de aquecimento de tabaco pode ser um dispositivo híbrido. POLINUCLEOTÍDEOS/POLIPEPTÍDEOS/CONSTRUÇÕES

[0475] Em certas concretizações da presente invenção, construções que modulam a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF (ou de pelo menos um gene de Nicl ERF e de pelo menos um gene de Nic2 ERF) podem ser transformadas em células vegetais adequadamente sob a direção de um promotor.

[0476] Em certas concretizações da presente invenção, construções que diminuem (ou seja, inibem) a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF) podem ser transformadas em células vegetais sob a direção de um promotor. A construção genética pode ser uma construção de edição de genes ou pode compreender uma molécula de RNAi, que pode compreender uma pequena molécula de RNA interferente (siRNA) ou uma molécula alça tipo grampo-de-cabelo curto (shRNA).

[0477] Em certas concretizações da presente invenção, construções que aumentam a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF) podem ser transformadas em células vegetais sob a direção de um promotor, por exemplo, construções que codificam um gene endógeno Nicl ERF.

[0478] As construções podem ser introduzidas nas plantas de acordo com a presente invenção por meio de vetor adequado, por exemplo, vetores de transformação de plantas. Um vetor de transformação de planta pode compreender um cassete de expressão compreendendo na direção da transcrição 5'-3', uma sequência promotora, uma sequência de construção direcionada a um gene Nicl ERF (ou direcionada a ambos os genes Nicl ERF e Nic2 ERF) e, opcionalmente, uma sequência terminadora não traduzida em 3', incluindo um sinal de parada para RNA polimerase e um sinal de poliadenilação para poliadenilase. A sequência do promotor pode estar presente em uma ou mais cópias, e essas cópias podem ser idênticas ou variantes de uma sequência do promotor como descrito acima. A sequência terminadora pode ser obtida a partir de genes vegetais, bacterianos ou virais. Sequências de terminação adequados são a sequência terminadora rbcS E9 de ervilha, a sequência terminadora derivada do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens e a sequência terminadora do vírus de mosaico da couve-flor 35S, por exemplo. Um especialista na área estará prontamente ciente de outras sequências terminadoras adequadas.

[0479] A construção da presente invenção também pode compreender um mecanismo de melhoria da expressão gênica para aumentar a força do promotor. Um exemplo de um tal elemento potencializador é um derivado de uma porção do promotor do gene da plastocianina da ervilha, e que é o objeto do Pedido de Patente Internacional No. WO 97/20056, que é incorporado aqui por referência. Elementos potencializadores adequados podem ser o elemento potencializador derivado do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens e o elemento potencializador 35S de vírus de mosaico da couve-flor, por exemplo.

[0480] Essas regiões reguladoras podem ser derivadas do mesmo gene que a sequência de DNA promotor ou derivadas de genes diferentes, de Nicotiana tabacum ou outros organismos, Por exemplo, de uma planta da família Solanaceae ou da subfamília Cestroideae. Todas as regiões reguladoras devem ser capazes de operar nas células do tecido a ser transformado.

[0481] A sequência de DNA do promotor pode ser derivada do mesmo gene que o gene de interesse, por exemplo, o gene que O promotor irá direcionar, por exemplo, um gene que codifica um Nicl ERF da invenção, uma sequência codificadora usada na presente invenção ou pode derivar de um gene diferente, de Nicotiana tabacum ou de outro organismo, por exemplo, de uma planta da família Solanaceae ou da subfamília Cestroideae.

[0482] O cassete de expressão pode ser incorporada em um vetor básico de transformação de plantas, como pBIN 19 Plus, pBI 101, PKYLX71:35S82, pCcCAMBIAZ300 ou outros vetores de transformação de plantas adequados conhecidos no estado da técnica. Além do cassete de expressão, o vetor de transformação da planta conterá as sequências necessárias para o processo de transformação. Estes podem incluir os genes de Agrobacterium vir, uma ou mais sequências de borda de T-DNA e como marcador selecionável ou outro meio de identificação de células vegetais transgênicas.

[0483] O termo “vetor de transformação de plantas” significa uma construção capaz de expressão in vivo ou in vitro. De preferência, o vetor de expressão é incorporado no genoma do organismo. O termo “incorporado” abrange, de preferência, incorporação estável no genoma.

[0484] As técnicas para transformar plantas são bem conhecidas no estado da técnica e incluem a transformação mediada por Agrobacterium, por exemplo. O princípio básico na construção de plantas geneticamente modificadas é inserir informações genéticas no genoma da planta, a fim de obter uma manutenção estável do material genético inserido. Uma revisão das técnicas gerais pode ser encontrada nos artigos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27), que são incorporados aqui por referência.

[0485] Tipicamente, na transformação mediada por Agrobacterium, um vetor binário carregando um DNA estranho de interesse, isto é, uma construção Nicl ERF, é transferido de uma cepa apropriada de Agrobacterium para uma planta alvo pelo co-r cultivo da Agrobacterium com explantes da planta alvo. O tecido vegetal transformado é então regenerado em meio de seleção, que compreende um marcador selecionável e hormônios de crescimento da planta. Uma alternativa é o método de mergulho floral (Clough & Bent, 1998 Plant J. Dez., 1998; 16(6): 735-43, que é incorporado aqui por referência), pelo qual botões florais de uma planta intacta são colocados em contato com uma suspensão de cepa de Agrobacterium contendo o gene quimérico e, em seguida há o estabelecimento das sementes, os indivíduos transformados são germinados e identificados pelo crescimento em meio seletivo. A infecção direta de tecidos vegetais por Agrobacterium é uma técnica simples que tem sido amplamente empregada e descrita em Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, ed.: D.S. Ingrams e J.P. Helgeson, 203-208. que é incorporado aqui por referência.

[0486] Outros métodos de transformação adequados incluem a transferência direta de genes para protoplastos usando técnicas de polietilenoglicol ou eletroporação, bombardeio de partículas, microinjeção e o uso de fibras de carboneto de silício, por exemplo. Plantas transformadoras usando transformação balística, incluindo a técnica de bigode de carboneto de silício, são ensinadas em Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C JJ, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A e Wang K (1994), que é incorporado aqui por referência. A produção de plantas de milho transgênicas férteis por transformação mediada por bigode de carboneto de silício é ensinada no The Plant Journal 6: 941-948, que é incorporado aqui por referência) e técnicas de transformação viral são ensinadas, por exemplo, em Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992), que é incorporado aqui por referência. O uso do vírus de mosaico da mandioca como um sistema de vetor para plantas é ensinado no Gene 110: 213-217, que é incorporado aqui por referência. Outros ensinamentos sobre transformação de plantas podem ser encontrados no documento EP- A-0449375, incorporado aqui por referência.

[0487] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a um sistema vetor que carrega uma construção e a introduz no genoma de um organismo, como uma planta, adequadamente uma planta de tabaco. O sistema de vetor pode compreender um vetor, mas pode compreender dois vetores. No caso de dois vetores, o sistema de vetor é normalmente chamado de sistema de vetor binário. Os sistemas de vetores binários são descritos em mais detalhes em Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19, que é incorporado aqui por referência.

[0488] Um sistema extensivamente empregado para transformação de células vegetais utiliza o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes descrito por An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 e Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams e J.P. Helgeson, 203-208, que são incorporados aqui por referência. Após cada método de introdução do gene exógeno desejado de acordo com a presente invenção nas plantas, a presença e/ou inserção de outras sequências de DNA pode ser necessária. A utilização de T-DNA para a transformação de células vegetais foi intensivamente estudada e está descrita na EP-A-120516; Hoekema, em: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Amsterdã, 1985, capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1- 46; e Anetal., EMBO J (1985) 4: 277-284, incorporado aqui por referência.

[0489] Células vegetais transformadas com construções que modulam a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF podem ser cultivadas e mantidas de acordo com métodos bem conhecidos de cultivo de tecidos, como cultivo das células em um meio de cultura adequado fornecido com os fatores de crescimento necessários, tais como aminoácidos, hormônios de plantas, vitaminas, etc.

[0490] O termo “planta transgênica” referente à presente invenção inclui qualquer planta que compreende uma construção que modula a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF (ou de um gene Nicl ERF e de um gene Nic2 ERF) de acordo com a invenção. Por conseguinte, uma planta transgênica é uma planta que foi transformada com uma construção de acordo com a invenção. Preferencialmente, a planta transgênica exibe atividade ou expressão de Nicl ERF modulada (ou a atividade ou expressão tanto do gene Nicl ERF quanto do gene Nic2 ERF) e teor de alcaloides modulado, de acordo com a presente invenção. O termo “planta transgênica” não abrange sequências codificantes de nucleotídeos nativas no seu ambiente natural quando estas estão sob o controle do seu promotor nativo que também está no seu ambiente natural.

[0491] Em um aspecto, um gene Nicl ERF, uma construção, um vetor de transformação de planta ou célula vegetal de acordo com a presente invenção está em uma forma isolada. O termo “isolado” significa que a sequência está pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como encontrada na natureza.

[0492] Em um aspecto, um gene Nicl ERF, uma construção, vetor de transformação de planta ou célula vegetal de acordo com a invenção está em uma forma purificada. O termo “purificada” significa em um estado relativamente puro, por exemplo, pelo menos cerca de 90% puro, ou pelo menos cerca de 95% puro ou pelo menos cerca de 98% puro.

[0493] O termo “sequência de nucleotídeos”, conforme utilizado aqui, refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou sequência de polinucleotídeos e uma variante, homóloga, fragmentos e seus derivados (como porções das mesmas). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica Ou sintética ou recombinante, que pode ser de fita dupla ou de fita simples, representando a fita de senso ou antissenso.

[0494] O termo “sequência de nucleotídeos” em relação à presente invenção inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA. Preferencialmente significa DNA, mais preferencialmente sequência de cDNA que codifica para a presente invenção.

[0495] Em uma concretização preferida, a sequência de nucleotídeos quando relacionada a e quando abrangida pelo escopo da presente invenção, ou seja, o gene Nicl ERF, inclui a sequência de nucleotídeos nativa quando em seu ambiente natural e quando está ligada a(s) sua(s) sequência(s) naturalmente associada(s) que também está/estão em seu ambiente natural. Para facilitar a referência, chamaremos esta concretização preferida de “sequência de nucleotídeos nativa”. A este respeito, o termo “sequência de nucleotídeos nativa” significa uma sequência de nucleotídeos inteira que está em seu ambiente nativo e quando operacionalmente ligada a um promotor inteiro ao qual está naturalmente associado, cujo promotor também está em seu ambiente nativo.

[0496] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que tem as propriedades específicas como um gene Nicl

ERF como aqui definido ou uma proteína que é adequada para modificação pode ser identificada e/ou isolada e/ou purificada de qualquer célula ou organismo que produz a referida proteína. Vários métodos são bem conhecidos no estado da técnica para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação de sequências de nucleotídeos. A título de exemplo, técnicas de amplificação por PCR para preparar mais de uma sequência podem ser usadas uma vez que uma sequência adequada tenha sido identificada e/ou isolada e/ou purificada.

[0497] Em uma alternativa mais adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o fator de transcrição ERF pode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método fosforamidita descrito por Beucage SL et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, que é incorporado aqui por referência, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805, que é incorporado aqui por referência. No método fosforamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificado, anelado, ligado e clonado em vetores apropriados.

[0498] Como usado aqui, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou o termo “proteína”. Em alguns casos, o termo “sequênci de nucleotídeos, isto é, o gene ERF que codifica esse polipeptídeo (daqui em diante referido como uma “sequência(s homóloga (s)”). Aqui, o termo “homóloga” significa uma entidade com uma certa homologia com as sequências de aminoácidos em questão e as sequências de nucleotídeos em questão. Aqui, o termo “homologia” pode ser equiparado a “identidade”.

[0500] A sequência de aminoácidos homóloga e/ou sequência de nucleotídeos e/ou fragmentos devem fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou melhora a atividade do gene ERF. Tipicamente, as sequências homólogas compreenderão os mesmos sítios ativos, etc., como a sequência de aminoácidos em questão, por exemplo, ou codificarão os mesmos sítios ativos. Embora a homologia possa também ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções “químicas similares), no contexto da presente invenção, é preferível expressar homologia em termos de identidade de sequência. Sequências homólogas tipicamente retêm domínios ou padrões funcionais.

[0501] Em uma concretização, uma sequência homóloga é tomada para incluir uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos que possui uma, duas ou várias adições, deleções e/ou substituições em comparação com a sequência em questão.

[0502] As comparações de homologia ou identidade podem ser realizadas pelo olho, ou mais geralmente, com a ajuda de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Esses programas de computador disponíveis no mercado podem calcular % de homologia entre duas ou mais sequências. A porcentagem % de homologia ou de identidade pode ser calculada através de sequências contínuas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é diretamente comparado com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo por vez. Isso é chamado de alinhamento “sem lacuna”. Normalmente, esses alinhamentos sem lacunas são executados apenas em um número relativamente curto de resíduos.

[0503] Embora esse seja um método muito simples e consistente, ele não leva em consideração que, por exemplo, em um par de sequências idêntico, uma inserção ou exclusão fará com que os seguintes resíduos de aminoácidos sejam desalinhados, resultando potencialmente em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é realizado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência é projetada para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar indevidamente a pontuação geral da homologia. Isso é alcançado inserindo “lacunas” no alinhamento da sequência para tentar maximizar a homologia local.

[0504] No entanto, esses métodos mais complexos atribuem “penalidades de lacuna” a cada lacuna que ocorre no alinhamento, de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o menor número de lacunas possível - refletindo em maior relação entre as duas sequências comparadas - atingirá uma pontuação mais alta do que uma com muitas lacunas. Os “custos de lacuna afim” são normalmente usados que cobram um custo relativamente alto pela existência de uma lacuna e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação mais utilizado. As penalidades com altas lacunas certamente produzirão alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de lacuna sejam modificadas. No entanto, é preferível usar os valores padrão ao usar esse software para comparações de sequência.

[0505] Portanto, o cálculo da % máxima de homologia requer, primeiramente, a produção de um alinhamento ideal, levando em consideração as penalidades de lacuna. Um programa de computador adequado para realizar esse alinhamento é o Vector NTI (Invitrogen Corp.). Exemplos de software que podem executar comparações de sequências incluem, entre outros, o pacote BLAST (consulte Ausubel et al.1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4º Ed - Capítulo 18), BLAST 2 (consulte FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 e tatiana&ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al.1990 JJ. Mol. Biol. 403-410) e AlignX por exemplo. Pelo menos BLAST, BLAST 2 e FASTA estão disponíveis para pesquisa off-line e online (consulte Ausubel et al.1999, páginas 7-58 a 7-60).

[0506] Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento em si normalmente não é baseado em uma comparação de pares tudo ou nada. Em vez disso, geralmente é usada uma matriz de pontuação de similaridade em escala que atribui pontuações a cada comparação pareada com base na similaridade química ou na distância evolutiva. Um exemplo dessa matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o conjunto de programas BLAST. Os programas Vector NTI geralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos personalizada, se fornecida

(consulte o manual do usuário para obter mais detalhes). Para alguns aplicativos, é preferível usar os valores padrão para o pacote Vector NTI.

[0507] Alternativamente, os percentuais de homologias podem ser calculados usando o recurso de alinhamento múltiplo no Vector NTI (Invitrogen Corp.), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Depois que o software produz um alinhamento ideal, é possível calcular % de homologia, de preferência%t de identidade de sequência. O software normalmente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0508] Penalidades de lacunas deveriam ser usadas para a determinação da identidade de sequência, em seguida, de preferência, os seguintes parâmetros são utilizados para alinhamento em pares: mero TO

PARA CLUSTAL DNA PROTEÍNA TAMANHO DE ; | PALAVRA 2 | 1 Triplo K

PENALIDADE DE Embetee as a EXTENSÃO DE - [Bet e ese li

[0509] Em uma concretização, CLUSTAL pode ser usado com a penalidade de lacuna e a extensão de lacuna definidas como definidas acima. Em algumas concretizações, as penalidades de lacuna usadas para o alinhamento BLAST ou CLUSTAL podem ser diferentes das detalhadas acima. O especialista avaliará que os parâmetros padrões para a execução dos alinhamentos BLAST e CLUSTAL podem mudar periodicamente e poderá selecionar parâmetros apropriados com base nos parâmetros padrões detalhados para os algoritmos de alinhamento BLAST ou CLUSTAL no momento.

[0510] Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma sequência de nucleotídeos é determinado sobre pelo menos 50 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 60 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 70 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 80 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 90 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 100 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 150 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 200 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 250 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 300 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 350 nucleotídeos contínuos, de preferência sobre pelo menos 400 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 450 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 500 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 550 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 600 nucleotídeos contínuos, preferencialmente sobre pelo menos 650 nucleotídeos contínuos, ou preferencialmente sobre pelo menos 700 nucleotídeos contínuos.

[0511] Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma sequência de nucleotídeos, cDNA, cds ou aminoácidos pode ser determinado em toda a sequência.

[0512] As sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. As substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, desde que a atividade de ligação secundária da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos com carga negativa incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos com carga positiva incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0513] Substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e de preferência na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos um pelo outro:

ALIFÁTICO APOLAR Polar - sem carga Polar - com carga o es

[0514] A presente invenção também abrange a substituição homóloga (a substituição e a reposição são usadas aqui para significar a troca de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, isto é, substituição idêntica, como básica para básica, ácida para ácida, polar para polar etc. Também pode ocorrer substituição não homóloga, isto é, de uma classe de resíduo para outra ou, alternativamente, envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais como ornitina (a seguir denominada Z), ornitina de ácido diaminobutírico (doravante referido como B), norleucina ornitina (a seguir denominada O), pirialalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[0515] As substituições também podem ser feitas por aminoácidos não naturais incluem; aminoácidos alfa* e alfa- dissubstituídos*, aminoácidos N-alquila*, ácido lático*, derivados halogenados de aminoácidos naturais como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, pI- fenilalanina*, L-alil-glicina*, B-alanina *, ácido L-a-amino butírico*, ácido L- a -amino butírico*, ácido L- a-amino isobutírico*, ácido L-a -amino capróicot, ácido 7-amino heptanóico*, L-metionina sulfona”, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolinat, L-tioprolina*, derivados de metil fenilalanina (Phe), tais como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)*t, L-Tyr (metil)*, L-Phe (4- isopropil)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3- carboxílico)*, ácido L-diaminopropiônico! e L-Phe (4-benzil)*. A notação * foi utilizada para os fins da discussão acima (relacionada à substituição homóloga ou não homóloga), para indicar a natureza hidrofóbica do derivado, enquanto td foi utilizado para indicar a natureza hidrofílica do derivado, tf* indica características anfipáticas.

[0516] Variantes de sequências de aminoácidos podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência incluindo grupos alquila tais como grupos metil, etil ou propil em adição para espaçadores de aminoácidos tais como resíduos de glicina ou B-alanina. Uma outra forma de variação envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptoide, que serão bem compreendidos pelos técnicos no assunto. Para evitar dúvidas, “a forma peptoide” é usada para se referir a resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte a-carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo em vez do a-carbono. Os processos para a preparação de peptídeos na forma peptóide são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

[0517] As sequências de nucleotídeos para uso na presente invenção podem incluir nucleotídeos sintéticos ou modificados nos mesmos. Um número de diferentes tipos de modificação de oligonucleotídeos é conhecido no estado da técnica. Estes incluem os esqueletos de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3 'e/ou 5' da molécula. Para os fins da presente invenção, deve ser entendido que as sequências de nucleotídeos descritas aqui podem ser modificadas por qualquer método disponível no estado da técnica. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a atividade in vivo ou a vida útil das sequências de nucleotídeos da presente invenção.

[0518] A presente invenção também abrange sequências que são complementares às sequências de ácidos nucleicos da presente invenção ou sequências que são capazes de hibridar com as sequências da presente invenção ou com sequências que são complementares a elas. O termo “hibridização”, conforme usado aqui, deve incluir “o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se une a uma fita complementar através do emparelhamento de bases”, bem como o processo de amplificação realizado nas tecnologias de reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0519] A presente invenção também se refere a sequências de nucleotídeos que podem hibridar com as sequências de nucleotídeos da presente invenção (incluindo sequências complementares das apresentadas aqui). Preferencialmente, a hibridização é determinada de acordo com rigor as condições (por exemplo 50 “*C e 0,2xSSC (1xSSC = NaCl a 0,15 M, 0,015 M de Na; citrato de pH 7,0)). Mais preferencialmente, a hibridização é determinada de acordo com alto rigor de condições (por exemplo 65 ºC e 0,1xSSC (1xSSC = NaCl a 0,15 M, 0,015 M de Nasxcitrato de PH 7,0)).

[0520] Em um aspecto, a sequência para utilização na presente invenção é uma sequência sintética - isto é, uma sequência que foi preparada por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não está limitado a, sequências feitas com o uso ideal de códons para organismos hospedeiros.

[0521] O termo “vetor de expressão” significa uma construção capaz de expressão in vivo ou in vitro. Em uma concretização, O vetor da presente invenção expressa um gene de Nicl ERF como descrito aqui. Em uma concretização, o vetor da presente invenção expressa também um gene Nic2 ERF como descrito aqui. De preferência, o vetor de expressão é incorporado no genoma de um organismo hospedeiro adequado. O termo “incorporado” abrange, de preferência, incorporação estável no genoma.

[0522] A sequência de nucleotídeos para utilização na presente invenção pode estar presente em um vetor no qual a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a sequências reguladoras capazes de proporcionar a expressão da sequência de nucleotídeos por um organismo hospedeiro adequado. As construções para uso na presente invenção podem ser transformadas em uma célula hospedeira adequada como descrito aqui para proporcionar a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. A escolha do vetor, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou vetor fago dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual ele será introduzido. Os vetores podem ser utilizados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou usados para transfectar, transformar, transduzir ou infectar uma célula hospedeira.

[0523] Em algumas aplicações, a sequência de nucleotídeos para uso na presente invenção está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora que é capaz de fornecer a expressão da sequência de nucleotídeos, tal como pela célula hospedeira escolhida. A título de exemplo, a presente invenção abrange um vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos de um gene Nicl ERF como descrito aqui operativamente ligado a uma sequência reguladora tal, isto é, o vetor é um vetor de expressão.

Adequadamente, o vetor pode adicionalmente compreender a sequência de nucleotídeos de um gene Nic2 ERF, como descrito aqui, está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora.

[0524] O termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência reguladora “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação é ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0525] O termo “sequências reguladoras” inclui promotores e potencializadores e outros sinais de regulação de expressão. O termo “promotor” é utilizado no sentido normal do estado da técnica, por exemplo, um sítio de ligação à RNA polimerase. A sequência de nucleotídeos dentro de uma construção que codifica um gene Nicl ERF ou um gene Nicl ERF e um gene Nic2 ERF pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um promotor.

[0526] O termo “construção” - que é sinônimo de termos como “cassete” ou “vetor” - inclui uma sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a presente invenção, direta ou indiretamente ligada a um promotor.

[0527] Um exemplo de ligação indireta é a provisão de um grupo espaçador adequado, como uma sequência de íntrons, como o íntron Shl1l ou o íntron ADH, intermediária ao promotor e a sequência de nucleotídeos da presente invenção. O mesmo vale para o termo “fundido” em relação à presente invenção, que inclui ligação direta ou indireta. Em alguns casos, os termos não cobrem a combinação natural da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína normalmente associada ao promotor de genes do tipo selvagem e quando ambos estão em seu ambiente natural. A construção pode até conter ou expressar um marcador, o que permite a seleção da construção genética.

[0528] Uma revisão das técnicas gerais usadas para transformar plantas pode ser encontrada nos artigos de Potrykus (Annu Rev Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27), que são incorporados aqui por referência. Outros ensinamentos sobre transformação de plantas podem ser encontrados no documento EP- A-0449375, incorporado aqui por referência.

[0529] Em uma concretização provida aqui são SNPs para uso na genotipagem do lócus Nicl em plantas (por exemplo, plantas de tabaco).

[0530] Em uma concretização, marcadores para uso na genotipagem do lócus Nicl em plantas (por exemplo, plantas de tabaco) são providos aqui. Em uma concretização, pares de iniciadores para uso na genotipagem do lócus Nicl em plantas (por exemplo, plantas de tabaco) são providos aqui. Em uma concretização, iniciadores para genotipagem do lócus Nicl em plantas de tabaco são providos na Tabela 4.

[0531] Em uma concretização, marcadores para uso na genotipagem do lócus Nic2 em plantas (por exemplo, plantas de tabaco) são providos aqui. Em uma concretização, pares de iniciadores para uso na genotipagem do lócus Nic2 em plantas (por exemplo, plantas de tabaco) são providos aqui. Em uma concretização, iniciadores para genotipagem do lócus Nic2 em plantas de tabaco são providos na Tabela 5 e 6.

[0532] Como usado aqui, “SNP” ou “polimorfismo de nucleotídeo único” significa uma variação de sequência que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência do genoma é alterado ou variável em relação a uma sequência de referência. Os “marcadores SNP” existem quando os SNPs são mapeados para sítios no genoma.

[0533] Como usado aqui, “marcador” ou “marcador SNP” significa uma sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos que é suficientemente única para caracterizar um lócus específico no genoma. Uma característica polimórfica pode ser usada como um marcador se for herdada diferencialmente e exibir desequilíbrio de ligação com uma característica fenotípica de interesse. Quando se afirma que uma característica está ligada a um determinado marcador, será entendido que o segmento de DNA atual cuja sequência afeta a característica usualmente se co-segrega com o marcador.

[0534] Em uma concretização, qualquer SNP identificado na Tabela 4 pode ser usado em um método de genotipagem de plantas (por exemplo, plantas de tabaco) para identificar a presença, ausência ou modificação do lócus Nicl. Em uma concretização, qualquer par de iniciadores identificados na Tabela 4 pode ser usado em um método de genotipagem de plantas (por exemplo, plantas de tabaco) para identificar a presença ou ausência do lócus Nicl.

[0535] Em uma concretização, qualquer SNP identificado na Tabela 5 ou Tabela 6 para uso em um método de genotipagem de plantas (por exemplo, plantas de tabaco) para identificar a presença ou ausência do lócus Nic2. Em uma concretização,

qualquer par de iniciadores identificados na Tabela 4 ou na Tabela 7 pode ser usado em um método de genotipagem de plantas (por exemplo, plantas de tabaco) para identificar a presença ou ausência do lócus Nicl.

[0536] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que geralmente é entendido por um técnico no assunto ao qual essa divulgação pertence. Singleton, et al., DICIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nova York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionam uma das habilidades com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.

[0537] Esta divulgação não é limitada pelos métodos e materiais exemplificativos divulgados neste documento, e quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui podem ser utilizados na prática ou no teste de concretizações da presente divulgação. Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. A menos que definido de outra forma, quaisquer sequências de ácidos nucleicos são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente.

[0538] Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos ou concretizações desta divulgação que podem ser obtidos por referência à especificação como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação como um todo.

[0539] Os aminoácidos são referidos aqui usando o nome do aminoácido, a abreviação de três letras ou a abreviação de uma letra. O termo “proteína”, como usado aqui, inclui proteínas polipeptídeos e peptídeos. Como usado aqui, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou do termo “proteína”. Em alguns casos, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “peptídeo”. Em alguns casos, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “enzima”.

[0540] Na presente divulgação e reivindicações, os códigos convencionais de uma letra e três letras para resíduos de aminoácidos podem ser utilizados. O código de três letras para aminoácidos, definido em conformidade com a Comissão Conjunta de Nomenclatura Bioquímica da IUPACIUB (JCBN). Entende-se também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético.

[0541] Outras definições de termos podem aparecer em toda a especificação. Antes das concretizações exemplares serem descritas com mais detalhes, é para entender que esta divulgação não se limita a concretizações particulares descritas, pois tais podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui tem o objetivo de descrever apenas concretizações particulares, e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0542] Quando um intervalo de valores é provido, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superior e inferior desse intervalo também é especificamente divulgado. Cada intervalo menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediário em um intervalo declarado e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado é abrangido nesta divulgação. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos ou excluídos no intervalo independentemente, e cada intervalo em que um, nenhum ou ambos os limites está incluído nos intervalos menores também é abrangido nesta divulgação, sujeito a qualquer limite excluído especificamente no intervalo declarado. Quando o intervalo declarado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídos nesta divulgação.

[0543] Deve-se notar que tal como se utiliza aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem os referidos plurais a menos que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma enzima” ou “uma nitrato redutase” inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e equivalentes dos mesmos conhecidos pelos técnicos no assunto e assim por diante.

VANTAGENS

[0544] Verificou-se surpreendentemente que, modulando a atividade ou expressão de um gene Nicl ERF, como ensinado aqui, o teor de alcaloides e/ou o teor de TSNA das plantas podem ser modulados. Assim, produtos de tabaco com teor de alcaloide modulado e/ou teor de TSNA e características comercialmente desejáveis procuradas pelos consumidores de produtos de tabaco podem ser produzidas.

[0545] os presentes inventores surpreendentemente determinaram um método para a modulação do teor de alcaloides, por exemplo, teor de nicotina, e/ou teor de TSNA de uma planta de tabaco através da modulação da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF. O teor de nicotina ou TSNA de uma planta de tabaco pode ser diminuído pela inibição da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF. Antes da presente invenção, não se sabia que a modulação da atividade ou expressão de um gene Nicl ERF, como descrito aqui, poderia ser usada para modular o teor de alcaloides e/ou TSNA.

[0546] Os presentes inventores determinaram que a modulação de um gene Nicl ERF pode reduzir o teor alcaloide da planta modificada para um nível surpreendentemente baixo.

U Conforme demonstrado neste documento, uma única mutação nocaute do ERF199 em um estado tipo selvagem resulta em uma maior redução no teor de alcaloides do que a mutação Nicl na LI (aaBB)

[0547] A linhagem LI (intermediário baixo, aaBB) normalmente produz cerca de metade do teor de alcaloides em comparação com a linhagem HA (alcaloide alto, AABB). No entanto, no Exemplo 13, foram produzidas linhagens EMS que são equivalentes à linhagem LI. Linhagens EMS com mutações em Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199) foram produzidas. Essas linhagens EMS mutantes produziram cerca de um terço do teor alcaloide em comparação com a linhagen HA - muito menor do que seria esperado para uma linhagem LI.

.º Como demonstrado aqui, em um estado HI (AAbb), uma mutação nocaute em ERFI99 proporciona um teor alcaloide surpreendentemente muito menor do que o LABurley 21 (aabb) .

[0548] Nicl ERF Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199) foi eliminado pela edição de genes da linhagem HI (AAbb), o teor de alcaloides da linhagem eliminável foi muito menor que o teor alcaloides da linhagem LA equivalente (aabb) (ver Exemplo 14). Estes dados indicam surpreendentemente que a modulação da atividade ou expressão (por exemplo, derrubando ou nocauteando a atividade ou expressão) de um gene Nicl ERF (por exemplo Nitab4.5 0003090g0030.1 ou ERF199) por si só é suficiente para modular (por exemplo, reduzir) o teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma. º A redução de alcaloides quando a mutação Nic2 em HI (AAbDDb) é combinada com a mutação ERF199 em uma única planta é muito maior do que seus efeitos aditivos combinados, o que sugere epistasia.

[0549] As publicações discutidas neste documento são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que tais publicações constituem estado da técnica às reivindicações anexas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Análise de alcaloides de linhagens quase isogênicas de Burley 21

[0550] Os inventores procuraram identificar os genes Nicl responsáveis pelo teor de alcaloides alterado nas plantas. As quatro NILS de Burley 21 (B21) - alcaloide normal/alto B21 (HA- B21), alcaloide intermediário alto B21 (HI-B21), alcaloide intermediário baixo B21 (LI-B21) e alcaloide baixo B21 (LA-B21) (daqui em diante referido como HA, HI, LI e LA) foram cultivadas na estufa em vasos de 6,5 polegadas de profundidade x 6,5 polegadas de diâmetro, com 5 furos de dreno em PRO-MIX do solo até que elas chegaram a dois meses de idade e as amostras de raízes foram colhidas para análise de RNA-seq. Três populações diferentes de segregação de F> foram derivadas independentemente dos cruzamentos de HA (AABB) x LI (aaBB), HA (AABB) x LA (aabb) e HI (AAbb) x LA (aabb). 200 indivíduos F7, de cada um dos cruzamentos HA x LA e HA x LI foram cultivados no campo e os níveis alcaloides foram medidos em todas as linhagens em três meses de idade. Seiscentos indivíduos F>r de HI x LA foram cultivados em campo até os três meses de idade e testados quanto ao teor de alcaloides, como acima. Resultados - Fenotipagem de F>xs derivados dos cruzamentos HA (AABB) x LI (aaBB) e HA (AABB) x LA (aabb)

[0551] Verificou-se que os níveis totais de alcaloides para as plantas F 2 derivadas dos cruzamentos de HA x LI e HA x LA são contínuos (Figura l, painel A mostra os níveis totais de alcaloides para linhagens parentais e F;xs derivados dos cruzamentos de HA x LI. O painel B mostra os níveis de nicotina para as linhagens parentais e os F;xs derivados dos cruzamentos de HA x LA (B)), de modo que o genótipo Nicl para ambas as populações não pôde ser inferido de maneira inequívoca com base no valor do fenótipo. Este é particularmente o caso na população F>? de HA x LI, onde o intervalo de valores fenotípicos para linhagens parentais se sobrepõe (Figura 1A). Para mapear para o lócus Nicl, foram selecionadas as linhagens 20 e 24 mais baixas e as linhagens F> 24 e 20 mais altas da população de HA x LI e HA x LA, respectivamente. As plantas F> (total de 88) com os níveis mais baixos ou mais altos de alcaloides poderiam ser genotipadas como homozigotas recessivas (aa) ou dominantes (2A). EXEMPLO 2 Desenvolvimento de marcador e análise de ligação

[0552] Para determinar os genes candidatos responsáveis pelo teor de alcaloides alterado, Quarenta e quatro F;s do Exemplo 1 com o níveis altos mais extremos ou níveis baixos de alcaloides das populações F, de HA x LA e HA x LI foram selecionados para genotipagem de SNP com um tabaco personalizado 30K Infinium iSelect HD BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA), com seus respectivos parentais. Os agrupamentos de SNP foram gerados usando o GenomeStudio versão 2011.1 (Illumina Inc., San Diego, CA) e todos os marcadores polimórficos identificados foram usados para análises posteriores. Mapas de ligação genética para ambas as populações foram construídos usando o software Joinmap versão 3.0 (Stam, 1993) usando a função de mapeamento de regressão, com configurações padrão. A fim de tratar o mapa dos loci Nicl e Nic2, o mapeamento intervalo foi realizado nas duas populações que utilizam MapoTL versão 6.0 (Van Ooijen, 2009 incorporado aqui por referência) com a opção de genotipagem seletiva selecionada e tamanho do passo de 1 cM.

[0553] Os SNPs identificados a partir de tanto RNA-seq quanto pelo uso de BeadChip 30K Infinium iSelect HD personalizado nas duas populações acima foram validados sequenciando os respectivos genótipos e comparando com a sequência de HA. Todos os SNPs confirmados foram convertidos em marcadores CAPS ou dCAPS (Neff et al., 2002 incorporado aqui por referência) e usados para gerar um mapa para a população F> HI x LA. Um mapa genético para essa população foi construído usando o Joinmap, usando as configurações acima. O DNA usado para genotipagem foi extraído de amostras de folhas de todas as linhagens usando o método CTAB (Doyle, J.J. e J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytoochemical Bulletin 19: 11-15 incorporado aqui por referência). Isolamento e sequenciamento de RNA

[0554] O RNA total foi isolado usando o mini kit QIAGEN Plant RNeasy (QIAGEN) e tratado com DNase I para remover a contaminação residual do DNA, de acordo com o manual do fabricante. A quantidade e a qualidade das amostras de RNA foram avaliadas com o BioAnalyzer 2100 (Agilent Genomics). As bibliotecas de RNA- seq foram construídas usando o kit Illumina TruSeq RNA Sample Prep (Illumina). Todas as bibliotecas foram sequenciadas na plataforma Illumina Hiseq Rapid Mode 150-Cycle. A chamada de base e a desmultiplexação da amostra foram realizadas usando o software Illumina HiSeg Control Software e o software CASAVA pipeline.

Análise de dados RNA-seq e chamada SNP

[0555] A separação da amostra e o corte do adaptador/código de barras foram realizados usando o software padrão Illumina e a qualidade das leituras cortadas foi verificada com o FastQC. Dois transcriptomas de referência foram utilizados para mineração de dados do sequenciamento de RNA. Um contém 239 genes ERF anotados por Rushton et al. (2008 incorporado aqui por referência). O outro foi gerado por predição gênica no rascunho do genoma TN 90 (Sierro et al., 2014 incorporado aqui por referência). As leituras de RNA-segq foram alinhadas aos transcriptomas de referência do tabaco com o arquivo de formato de recurso geral (GFF) usando TopHat v2.0.9 chamando Bowtie2 v2.1.0 (Langmead e Salzberg, 2012 incorporado aqui por referência). Genotipificador unificado - ferramenta de análise de genoma (GATK; versão 2.8-1-g932cdôa) foi usado para chamar SNPs nos quatro acessos, resultando em um arquivo de formato de chamada variante de múltiplas amostras (VCF) (McKenna et al., 2010 incorporado aqui por referência). Chamadas variantes com qualidade inferior a 20 foram removidas posteriormente com o filtro VCF. Mapeamento físico e identificação de genes candidatos

[0556] Marcadores SNP encontrados para serem estreitamente geneticamente ligados seja com lócus Nicl ou Nic2 foram alinhados contra um mapa genético de consenso de alta densidade para o tabaco (consenso de Nicotiana tabacum 30k Infinium HD 2015; https://solgenomics.net/cview/map.pl?map version id=178 incorporado aqui por referência). Marcadores no interior das regiões de interesse em torno dos loci Nicl e Nic2 que foram capazes de ser ancorados de forma única a uma montagem de genoma de tabaco melhorado (Edwards et al., 2017 incorporado aqui por referência) foram usados para identificar andaimes híbridos BioNano (isto é, regiões de pseudocromossomo) subtendendo as duas regiões. As lacunas nas sequências foram subsequentemente preenchidas pela identificação de superandaimes equivalentes da variedade de tabaco TN 90 (Sierro et al., 2014 incorporado aqui por referência) contendo correspondências idênticas às sequências de modelos de genes (regiões codificantes) nas duas regiões de interesse do genoma de Edwards et al. (supra 2017) usando a opção megablast com as configurações padrões na Ferramenta de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) versão

2.2.24+ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). As comparações recíprocas de BLAST foram realizadas nos superandaimes TN 90 para identificar mais andaimes de genoma de Edwards et al. (supra 2017) nas duas regiões que não puderam ser mapeadas para os superandaimes da BioNano. Somente no caso em que a maioria de um andaime de Edwards et al. (2017) foi capaz de ser mapeada para um superandaime TN 90, se incluído na lista. Marcadores que puderam ser mapeados exclusivamente para os andaimes do genoma, mas não estavam presentes no andaime híbrido BioNano, também foram usados para colocar os andaimes correspondentes nas duas regiões de interesse, com base em suas localizações relativas no consenso, mapas genéticos de HA x LA ou HA x LI. Os candidatos a modelos genéticos nas duas regiões atualizadas foram então comparados com dados de RNA-seq (Edwards et al., supra 2017) e alterados, se necessário.

[0557] Para comparar a região identificada neste estudo com a de Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência), a análise BLAST foi realizada como acima, usando sequências genômicas de Adams et al. (supra 2016) contra o genoma de Edwards et al. (supra 2017). Acertos de sequência mostrando uma identidade mínima de 99% em pelo menos 1 kb foram considerados como evidências de correspondências. Resultados Genotipagem iSelect HD BeadChip dos F;s selecionados derivados de HA x LA e HA x LI

[0558] Usando 30K Infinium iSelect HD BeadChip personalizado, foram identificados vários outros grupos não ligados em ambas as populações HA x LI e HA x LA (dados não mostrados), o que indica que mais do que as regiões Nicl e Nic? estão segregando entre HA e LA. Isso sugere que seria improvável encontrar a região Nicl apenas a partir do mapeamento de marcadores polimórficos entre os dois parentais. A análise QTL com o método de genotipagem seletiva MapoTL identificou um grupo de ligação contendo vários marcadores comuns às populações F, HA x LI e HA x LA que foram significativamente associadas ao teor de alcaloides totais (pontuações máximas no LOD de 31,13 e 26,95, respectivamente), explicando a variação de 51,2% e 46,2% nessa característica, respectivamente. Esses marcadores co-localizados com marcadores no grupo de ligação 7 (Pseudocromossomo 7 do genoma de Edwards et al. (supra 2017)) do mapa consenso de N. tabacum 30k Infinium HD 2015.

[0559] A Figura 2 mostra uma comparação de mapas genéticos de indivíduos F7 selecionados a partir dos cruzamentos HA x LI e HA x LA com o mapa consenso de N. tabacum 30k Infinium HD 2015. As linhas tracejadas indicam marcadores identificados entre os mapas F;7 e o mapa consenso, linhas pontilhadas indicam marcadores identificados entre os dois mapas F>2. A fonte em negrito indica marcadores comuns a mais de um mapa. Apenas os marcadores que foram identificados no mapa HA x LA ou HA x LI são mostrados no mapa consenso, outras posições de marcadores são mostradas como linhas horizontais em preto.

[0560] Além desse grupo, também foi identificado outro grupo que teve uma associação significativa com o teor de alcaloides totais na população Fr HA x LA (pontuação máxima no LOD de 14,01), mas explicou apenas cerca de metade da variação para essa característica como marcadores no grupo de ligação 7 (variação máxima de 27,6% explicada). Este grupo também continha um marcador específico de gene dominante para Nic2 (Qin et al., 2015; Nic2 marcado na Figura 2). Os marcadores deste grupo cor localizado com os marcadores no grupo de ligação 19 do mapa consenso (Pseudocromossomo 19 do genoma de Edwards et al. (2017)), o que é consistente com a região genômica proposta do lócus Nic2(Kajikawa et al., 2017). Identificação de SNP para genes ERF com base no sequenciamento de RNA

[0561] A anotação de fatores de transcrição com o genoma do tabaco revelou 239 genes ERF no genoma do tabaco (Rushton et al.2008 incorporado aqui por referência). A identificação de SNP com base na análise RNA-seq de HA, HI, LI e LA revelou um SNP no ERF110 (Nitab4.5 0006382g90040.1; Tabela 1). Auxiliado com a enzima de restrição Bstz17I, o SNP no ERF110 foi convertido em um marcador CAPS, designado SNP4 (Tabela 7). A análise de ligação com os 88 indivíduos F, selecionados derivados dos cruzamentos HA x LI e HA x LA demonstrou que SNP4 foi ligado ao lócus Nicl, com 6 recombinantes detectadas a partir das 44 F>s com os menores níveis de alcaloides (Figura 3).

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[0562] Além disso, a análise de ligação de SNP4 com os marcadores 30K Infinium iSelect HD BeadChip indicou que ele estava intimamente ligado aos marcadores no grupo de ligação 7 que estavam significativamente associados ao teor total de alcaloides nas duas populações (Figura 2). No entanto, devido ao fato de que o genótipo de uma planta F2> individual não pode ser determinado com precisão a partir de seus dados de fenótipo, como mencionado anteriormente, a recombinação observada pode ser devida a erros de fenotipagem. Assim, é necessária uma população segregada mais adequada para o mapeamento do lócus Nicl. EXEMPLO 3 Comparação do fenótipo para as NILs de B21

[0563] Trinta plantas para cada NIL de B21 foram então selecionadas para medir seu teor alcaloide (Figura 4). Os níveis totais de alcaloide ou nicotina para diferentes linhagens podem ser facilmente identificados fenotipicamente, em uma base média. No entanto, a identificação em uma única planta não é tão consistente, porque há considerável sobreposição fenotípica entre plantas individuais de diferentes linhagens, como LI e HI, LI eHAeHIeHA (Figura 4).

[0564] Mesmo dentro da mesma linhagem, os níveis totais de alcaloide ou nicotina podem variar dramaticamente entre plantas individuais, com exceção da linhagem LA. Portanto, geramos uma população F; derivada do cruzamento entre HI e LA e realizamos análises de alcaloides totais dessa população (Figura 5).

EXEMPLO 4 Genotipagem de 600 F;s de HI x LA com o marcador SNP4 caPS

[0565] Com base nos resultados da genotipagem das populações HA x LI e HA x LA, decidimos testar a capacidade diagnóstica do marcador SNP4 CAPS em uma população maior.

[0566] A genotipagem de plantas 600 F> derivadas de HI x LA com SNP4 revelou uma taxa de segregação de 150: 289:161 para AA:Aa: aa, que se ajusta ao esperado 1: 2: 1 (2 = 1,21, df = 2, P = 0,55). Foram selecionadas 150 plantas preditas homozigotas dominantes (AA) e 161 plantas F> homozigotas recessivas preditas (aa) para análise de alcaloides. Os dois grupos F> foram discretos, sem sobreposição. Todos os indivíduos com o genótipo previsto aa apresentavam baixos níveis de alcaloides (0,17- 0,41%), dentro do intervalo do progenitor LA (0,18-0,38% (Figura 5).

[0567] Similarmente, os níveis de alcaloides eram altos para as plantas AA previstas, e nenhuma delas se enquadrava no intervalo do progenitor LA. No entanto, algumas das plantas AA previstas foram observadas fora do intervalo do progenitor HI. Para confirmar o genótipo Nicl na planta que foi genotipada como AA, mas que continha menor teor de nicotina (indicado pela seta na Figura 5), verificamos os genótipos e segregação do fenótipo alcaloide na próxima geração para este indivíduo. Todas as linhagens F3; mantiveram o genótipo AA previsto quando analisadas com o marcador SNP4.

[0568] A análise química de 40 F;s derivada dessa linhagem revelou que todas as plantas continham níveis comparáveis de alcaloide ao HI (Figura 6) e nenhuma planta caiu no intervalo dos níveis de alcaloides do LA, substanciando a hipótese de que o F7 selecionado era homozigoto e o marcador SNP que desenvolvemos é co-segregado com o lócus Nicl.

EXEMPLO 5 Mapeamento genético de Nicl em uma população F2 de HI x LA

[0569] Nós realizamos o sequenciamento de DNA das quatro NILsS B21 para confirmar os polimorfismos de sequência que foram identificados como estando intimamente ligados ao lócus Nicl usando o Infinium iSelect HD BeadChip 30K (Figura 3). Seis desses SNPs puderam ser convertidos em marcadores CAPS ou dCAPS baseados em PCR (a Tabela 4 mostra SNPs e marcadores convertidos identificados com base na análise personalizada 30K Infinium iSelect HD BeadChip para a região Nicl). Para identificar mais marcadores para o mapeamento genético do lócus Nicl, realizamos a identificação de SNP com base no sequenciamento de RNA usando a sequência de referência do genoma TN 90 publicada (Sierro et al., 2014 incorporado por referência). Mais seis SNPs foram detectados entre as NILS de B21l segregando para Nicl, todos convertidos em marcadores CAPS ou dCAPS (Tabela 7). Também geramos marcadores CAPS para dois SNPs de um estudo anterior, analisando a região potencial de deleção de Nicl, marcadas com SNP13 e SNPl4, na Figura 7 e Tabela 7 [SEQ. ID 133 e 136 em Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência), respectivamente]. Além disso, utilizamos iniciadores usados para caracterizar uma exclusão de 500kb da mesma publicação [anotada como SEQ. IDs 3 e 4 em Adams et al. (2016))]), a fim de desenvolver um marcador dominante para essa região de deleção (marcado como INDEL1 na Figura 7). O mapeamento genético do lócus Nicl foi realizado com os marcadores na Tabela 4 e na Tabela 7 usando 161 plantas F? recessivas (aa) derivadas de HI x LA (Figura 7). Como pode ser visto a partir do mapa genético, o lócus Nicl, co-segregando com SNP4, é flanqueado por SNP3 e SNP5 (Figura 7), e é geneticamente diferente da região identificada por Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência).

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EXEMPLO 6 Mapeamento genético de Nic2 em uma população F, de HA x LA

[0570] Para desenvolver marcadores baseados em PCR na região em torno de MNic2, realizamos o sequenciamento acima nos marcadores de chip SNP que estão ligados a esse lócus, com base na população F2 de HA x LA. Seis desses SNPs puderam ser convertidos em marcadores CAPS ou dCAPS baseados em PCR (Tabela 5).

[0571] De acordo com o lócus Nicl, utilizamos o RNA-seq para identificar mais SNPs vinculados ao lócus Nic2. Mais três SNPs foram identificados que puderam ser convertidos em marcadores dCAPS (Tabela 6). O mapeamento genético do lócus Nic2 foi realizado com os marcadores na Tabela 5 e na Tabela 6 usando 188 Frs de HA x LA (Figura 8). Como pode ser visto no mapa genético, o lócus Nic2 (definido pelo marcador NIC1l de Qin et al. (2015)) co-segrega com SNP17 e 18 (Figura 8).

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EXEMPLO 7 Localização física de Nicl e Nic2 com base na sequência genômica de Edwards et al. (2017)

[0572] Usando os marcadores identificados como sendo intimamente ligados a partir da comparação do mapa consenso de N. tabacum 30k Infinium HD 2015 com os mapas genéticos F, de HA x LI e HA x LA, identificamos uma região genômica de fusão que abrange o lócus Nicl subtendido pelos marcadores Nt1AB6591 e Nt1AA9777. Utilizando o conjunto híbrido BioNano de Edwards et al. (2017 incorporado aqui por referência), conseguimos identificar os andaimes mapeados para os pseudocromossomos que cobriam a maior parte dessa região (consulte a Figura 82, coluna 'Evidência' na Tabela 8). Análise recíproca do BLAST nos superandaimes TN 90 do Sierro et al. (2014 incorporado aqui por referência) do conjunto do genoma foi capaz de identificar mais andaimes de Edwards et al. (2017) na região para preencher possíveis lacunas no conjunto da sequência (consulte a Figura 82, coluna 'TN 90 Superandaime'! na Tabela 8). Finalmente, os marcadores que não puderam ser integrados com base em nenhum dos métodos acima, mas puderam ser mapeados exclusivamente para um andaime em Edwards et al. (2017), foram integrados com base em sua posição nos mapas genéticos consenso, HA x LA ou HA x LI (Figura 82). No caso de evidência contraditória para a localização de um andaime, foi utilizada a localização do andaime no conjunto híbrido BioNano.

[0573] Para mapear a região Nicl, utilizamos o mapa genético da população F>, derivada de HI x LA (Figura 7). Os marcadores SNP gerados a partir de ambos os 30K Infinium iSelect HD BeadChip e RNA-seg (Tabelas 4 e 5) foram mapeados para a região genômica de fusão subtendida pelos marcadores identificados acima. Os andaimes contendo novos marcadores SNP dentro desta região foram adicionados à região genômica de fusão, conforme os mapas genéticos consenso de HA x LA e HA x LI acima. Com base nos recombinantes identificados na população F>, de HI x LA (Figura 7), limitamos nossa região de interesse à região genômica de fusão delimitada pelos andaimes Nitab4.5 0003553 e Nitab4.5 0007027 (Figura 82). Esta região contém notavelmente um aglomerado de nove genes anotados como sendo fatores de transcrição ERF (Tabela 8). Utilizamos então informações de RNA- seq de Edwards et al. (2017 incorporado aqui por referência), a fim de melhorar os modelos de genes para genes dentro desta região identificada na Tabela 8; IDs de sequência mostradas na Tabela 1).

[0574] Em seguida, comparamos a região Nicl identificada com um andaime que é deletado nas linhagens LI, identificado por Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência) [SEQ. ID 85]. Isto foi realizado através da análise BLAST desta sequência para os andaimes genômicos de Edwards et al. (2017 incorporado aqui por referência). De acordo com os resultados do mapeamento genético (Figura 7), a região previamente identificada por Adams et al. (2016) encontra-se em uma região física a montante da nossa região Nicl identificada (ver Figura 82).

[0575] Para caracterizar melhor a região Nic2, realizamos a mesma análise acima para a região genômica subtendida pelos marcadores Ntl1AA9370 e NtlAC6499 (Figura 2). Essa região foi também delimitada pelos marcadores SNP15 e SNP18/19 usados no mapeamento fino de Nic2 (Figura 8). A avaliação dos genes na região indicou que estes continham um aglomerado de nove genes anotados como fatores de transcrição ERF (Tabela 9), incluindo muitos genes previamente identificados (Shoji et al., 2010; Kajikawa et al., 2017). Utilizamos informações de RNA-seq de Edwards et al. (2017), a fim de melhorar os modelos de genes para os genes ERF nessa região identificada (Tabela 9; IDs de sequência mostradas na Tabela 2). Essa região também foi comparada pela análise BLAST a uma sequência identificada por Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência), conforme a região Nicl [SEQ.

ID 2 em Adams et al. (2016)]. Os resultados dessa comparação indicam que a sequência de Adams et al. (2016 incorporado aqui por referência) para Nic2 coincide com nossa região genômica para Nic2 (veja a Figura 83), de acordo com resultados anteriores (Shoji et al., 2010 incorporado aqui por referência e Kajikawa et al., 2017 incorporado aqui por referência).

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EXEMPLO 8 Análise bioinformática dos genes nas regiões de interesse Nicl/Nic2

[0576] Dada a incidência de aglomerados de fatores de transcrição ERF em ambas as regiões de interesse, estávamos interessados quanto a possibilidade de que elas podem representar genes homólogos (ou seja, genes equivalentes a partir dos genomas ancestrais N. sylvestris e N. tomentosiformis). Análise BLAST (usando a opção blastn com configurações padrão) das sequências de codificação dos modelos de genes atuais para cada um dos genes ERF contra o genoma de Edwards et al. (2017 incorporado aqui por referência) indicou que, para maioria dos genes, a maior semelhança atingida foi com o ERF na localização recíproca equivalente (Tabela 10). Isto sugere que muitos ERFs nas duas regiões representam genes homólogos.

[0577] A fim de estender a análise das duas regiões de interesse delimitadas pelos andaimes na Tabela 8 e na Tabela 9, estávamos interessados quanto à possibilidade das regiões inteiras poderem representar segmentos cromossômicos homólogos. O exame dos andaimes nas regiões putativas Nicl e Nic2 indicou que elas eram, em grande parte de origem de N. sylvestris ou N. tomentosiformis respectivamente (dados não mostrados), suportando a hipótese de que elas são de cromossomos homólogos.

[0578] A análise BLAST (como acima) de cada um dos genes nas duas regiões de interesse indicou que a melhor ocorrência para um grande número de genes foi na região recíproca. Adicionalmente, a ordem dos genes para ambas as regiões foi amplamente mantida, sugerindo que muito pouco rearranjo do genoma ocorreu nessas duas regiões desde a formação de N. tabacum.

Com base na presença de genes homólogos entre as duas regiões genômicas identificadas, nós focamos nos genes anotados como sendo fatores de transcrição ERF na região Nicl para análise posterior.

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EXEMPLO 9 Construção vetorial

[0579] Para gerar vetores de superexpressão para os genes candidatos a Nicl, os fragmentos de cDNA das regiões codificadoras de proteínas foram amplificados e inseridos no vetor pSITE-4NB por meio da tecnologia de clonagem gateway (Chakrabarty et al., 2007 Bromial Artificial Artificial Chromosomes incorporado aqui por referência). Os iniciadores com sequências de recombinação gateway utilizadas para a amplificação das sequências que codificam para os candidatos Nicl são listados na Tabela 11. Attb refere-se a uma sequência de recombinação gateway.

Attbl: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT (SEQ ID No. 105) Attb2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT (SEQ ID No. 106) Tabela 11. Iniciadores com sequências de recombinação gateway utilizadas para amplificação das sequências de codificação para os candidatos Nicl.

Nome Gene sinônimo Iniciador direto Iniciador reverso do gene 1 attbl-TC- attb2-C- Dão ' 3 00366 | sRESL2 ATGCAGGGAATATCATTAGAG | GGCAAAAAAACTAGACGTTAAA 9 ' TTT (SEQ ID No. 107) |CA (SEQ ID No. 108)

1. attbl-TC- attb2-C- CAS 000309 | grRF17L3D | ATGGGGGACGTTTGCGGCAGA | TACCAACATTTGTAGATTAATC 9 ' GAT (SEQ ID No. 109) AA (SEQ ID No. 110)

1. attbl-TC- attb2-C- oaão a 000309 | grF199 ATGGCAATGGAAATGAATCCA | AGCTAATCTCTGTAAATTCAAG q ' GCT (SEQ ID No. 111) CT (SEQ ID No. 112) VA E attbl-TC- attb2-C- PRCSPES ANANDA ERF210 ATGAATTCAGCTGATCTTTCC | CACAMATAGTTTTCTTGGTGTT 3 : CTC (SEQ ID No. 113) CC (SEQ ID No. 114)

11. attbl-TC- attb2-C- SD noão ' 2200046? ERF91L2 ATGTACGAACAAMACAACCATC | ATTTTCAGCCAATTTTCTCTTC f ' TCA (SEQ ID No. 115) TT (SEQ ID No. 116) o) attbl-TC- attb2-C- e soão ' 3 00462 | gRF29 ATGAACCCAGCTAATGCAACC | TAGTAACATCTGGAGGTTCCAT ] ' TTC (SEQ ID No. 117) CC (SEQ ID No. 118)

1. attbl-TC- attb2-C- Sagan” am te? ERF130 ATGAATCCCCTTGATAATGCA | TAGTGACATCTCTAGATCGCGT ? ' ACC (SEQ ID No. 119) AT (SEQ ID No. 120)

1 attbl-TC- attb2-Cc- nãos ' 5 00462 | gRF1G ATGAATTCAGCAGATGTAACC | TAGTAACATGTGGAGGTTCCAA 3 ' TTC (SEQ ID No. 121) |cCc (SEQ ID No. 122) NA E attbl-TC- attb2-C- Diabo aço oo6ãs ERF110 ATATTTGAGCTTCCTGGAAMA | TTAGAACAACTAAATCAAAT 3 ' (SEQ ID No. 123) (SEQ ID No. 124)

[0580] Para construir vetores para os candidatos Nicl sob o controle de seus promotores nativos, as sequências genômicas incluindo regiões codificadoras, promotores e 3"'-UTRs, foram amplificadas com iniciadores (Tabela 12) anexados com um adaptador do sítio de reconhecimento HindIII. Dezesseis bases homólogas às extremidades do vetor linearizado foram indicadas em minúsculas, enquanto as maiúsculas indicaram sequências genéticas de tabaco. Após digestão com HindIII, os produtos amplificados foram clonados no vetor pCAMBIALl305.1 por meio de clonagem por infusão (Zhu et al., 2007 incorporado aqui por referência). Tabela 12. Nome Gene sinônimo | Iniciador direto Iniciador reverso do gene Nitab4.5 000 gcaggcatgcaagettGAA | ggecagtgecaagettecTTT 3665 00270 7 | IRESL2 ACAACCCTGTGGTGCAGCG | GGGAATAGTTATTGGATTTT 9929 ' GCT(SEQ ID No. 125) | (SEQ ID No. 126) gcaggcatagcaagetteTc Nitab4.5 000 TTCACGGTTTCCACTTTCC | IFOCagtgccaaget ACCTT 3090g0030.1 | ERFL99 TET (SEQ ID No GACTTCCCTCATGGTTGAGG g ' : (SEQ ID No. 128) 127) gcaggcatgcaagcttATA io = ggccagtgccaagettoGGAA dra ao ERF210 Gra temo ne Neo TTGATTTGACGTCCGGTTGT 9Eoa : ? : (SEQ ID No. 130) 129) Nitab4.5 000 gcaggcatgcaagcttGTG | gaccagtaccaagettcATTG 1620 0030 7 |ERF91L2 |GCATATTTTATCTGAGGTA | TAGGTGACGTAGCATGGCAT 22 : GA (SEQ ID No. 131) | (SEQ ID No. 132) gcaggcatgcaagcttTTG . se . Nitab4.5 000 TAAATTTGTGTATCATCTT | IISCagtaccaagetEGTGCA a620g0080.1 | ERF2º CARA (SEQ ID No TTGAACATATTGAATGTGGG 9, : 133) : (SEQ ID No. 134)

gcaggcatgcaagcttTTG " MSSIGA0O0 (acaso | EMGTEISAAEAEES | sascaaccnanciano 135) (SEQ ID No. 136) gcaggcatgcaagcttTAT 137) (SEQ ID No. 138) EXEMPLO 10 Sequenciamento de cromossomos artificiais bacterianos (BACs)

[0581] As etiquetas de sequência do perfil do genoma completo (WGP) estão alinhadas com os andaimes de genoma de Edwards et al. (2017) para identificar os cromossomos artificiais bacterianos (BACs) que correspondem "consistentemente aos andaimes dentro da região de interesse Nicl subtendida pelos marcadores SNP para auxiliar ainda mais no conjunto do andaime. O DNA é extraído dos clones BAC usando um kit QIAGEN Plasmid Midi, conforme as instruções do fabricante (QIAGEN), linearizado e sequenciado usando um dispositivo Oxford Nanopore MinION conforme as instruções do fabricante (Oxford Nanopore Technologies) para fornecer leituras longas no mapa. As leituras de sequência final emparelhadas com Illumina fornecem leituras curtas precisas dos clones BAC. Os andaimes do genoma do tabaco identificados como localizadas na região Nicl são remapeadas para as leituras combinadas da sequência Oxford Nanopore/Illumina dos clones BAC sobrepostos para criar uma sequência contínua. Modelos de genes são desenvolvidos para a região Nicl melhorada, conforme Edwards et al. (2017).

EXEMPLO 11 Superexpressão de Nicl ERFs por transformação de raiz em cabeleira Materiais e métodos

[0582] Os genes candidatos Nicl ERF foram superexpressos em plantas de tabaco por transformação de raiz em cabeleira. As plantas de tabaco usadas para a transformação de raízes em cabeleiras foram cultivadas a partir de caixas magenta e as folhas foram cortadas em pedaços de 0,5 cm x 0,5 cm. A linhagem Aqual de Agrobacterium rhizogenes contendo um vetor binário foi usada para infectar os pedaços de folhas. A desinfecção e a seleção da resistência à droga foram realizadas em meio Murashige e Skoog solidificado contendo 150 mg/L de sulfato de canamicina e 250 mg/L de ticarcilina. As raízes transgênicas foram distinguidas com repórter de fluorescência vermelho usando um microscópio confocal. As linhagens de raiz selecionadas foram mantidas por subcultura a cada 2 semanas em 10 ml de meio Gamborg B5 líquido com agitação constante a 80 rpm no escuro. Transformação do tabaco Plantas transgênicas estáveis foram geradas por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (Schardl et al., 1987 Gene, Volume 61, Edição 1, 1987, páginas 1-11, que é incorporado aqui por referência). A linhagem de Agrobacterium GV3101 foi usada para infectar discos de folhas estéreis. As câmaras de crescimento utilizadas para a transformação do tabaco foram programadas para l6h de luz a 23 ºC e 8h de escuro a 20 “ºC. Resumidamente, folhas de tabaco foram excisadas a partir de plantas cultivadas em caixas magenta e foram cortadas em discos de 0,4 centímetros. Os discos das folhas foram incubados por 30 minutos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens (ODçsoo = 0,3- 1) contendo o plasmídeo alvo. Após três dias de co-cultivo em meio MS, os discos das folhas foram transferidos para o meio TOM para regeneração ou seleção (meio MS com 20 g/L de sacarose; 1 mg/L de IAA, 2,5 mg/L de BAP). Ticarcilina (250 mg/L) foi usada para matar o excesso de Agrobacteria. Sulfato de canamicina (300 mg/1) para as construções pSITE-4NB ou higromicina B (40 mg/L) para pCAMBIAI305.1 e as construções de edição de gene foram utilizadas como seleção de transformação, respectivamente. Os brotos regenerados foram removidos dos discos das folhas e transferidos para o meio MS contendo ticarcilina (250 mg/L) para enraizamento. Após o desenvolvimento de 3 ou 4 raízes (pelo menos 2 cm), a plântula foi transferida para o solo.

Resultados

[0583] Nós usamos a transformação da raiz em cabeleira para avaliar a função do gene para os Nicl ERFs. A análise química revelou que todos as construções aumentaram os níveis de alcaloides nas raízes em cabeleira de LA (Figura 9). No entanto, não conseguimos colher raízes em cabeleira para Nitab4.5 0004620g90090.3. As raízes em cabeleira transformadas com esse gene foram escurecendo gradualmente durante a subcultura e não puderam sobreviver, embora tenham sido desenvolvidas normalmente no início. Os efeitos letais podem ser desencadeados por altos níveis de ácido nicotínico nessas raízes em cabeleira, que precisam ser mais investigadas. Com base na transformação da raiz em cabeleira, pelo menos seis ERFs no lócus Nicl são capazes de regular a biossíntese de alcaloides com efeitos diferenciais: Nitab4.5 0003090g0030.1 (ERF199);

Nitab4.5 0003665g90040.1 (JRESL2) ;Nitab4.5 00046209g90010.1(ERF210); Nitab4.5 0004620g90030.1(ERF91);Nitab4.5 0004620g90080.1 (ERF29 e Nitab4.5 00046209g90095.1 (ERF16) EXEMPLO 12 Expressão dos genes Nicl ERF em plantas transgênicas estáveis

[0584] Nós também validamos função de Nicl ERFs com ensaios de transformação estável. Pelo menos doze plantas transgênicas foram obtidas para cada superexpressão de Nicl ERFs sob o controle do promotor 35S. A análise química revelou que a superexpressão de Nitab4.5 0003090g0030.1, Nitab4.5 0004620g0080.1 e Nitab4.5 000462g0090.3 em plantas LA aumentou significativamente o teor de alcaloides. Particularmente, a superexpressão de Nitab4.5 0003090g0030.1 resultou em níveis alcaloides comparáveis às plantas HI.

[0585] Nós transferimos sequências genômicas incluindo o promotor nativo, e região codificante 3'-UTR (região não traduzida) para Nitab4.5 0003090g0030.1 para plantas LA. A análise química com plantas TO mostrou que a produção de alcaloides foi significativamente melhorada pela transformação genética de Nitab4.5 0003090g0030.1. É notável que os níveis alcaloides em transformantes contendo a construção genômica de Nitab4.5 0003090g0030.1 foram ligeiramente mais baixa do que os de HI, o que pode ser causado por hemizigosidase de plantas TO. EXEMPLO 13 Mutantes EMS Nicl induzidos

[0586] Testes de complementação via transformação estável de Nicl ERFs indicaram que é possível restaurar o fenótipo Nicl. No entanto, nós queríamos para determinar se o nocaute de qualquer um destes genes poderia gerar uma fenocópia do fenótipo Nicl por si só.

[0587] Portanto, aproximadamente 2000 linhagens mutantes EMS foram desenvolvidas da variedade TI 1068 para os fins de identificação de plantas de tabaco contendo genes mutados. As mutações nos genes ERF na região Nicl de interesse da Tabela 1 acima, bem como as mutações no ERF189 (Nitab4.5 0015055g0010.2) da região Nic2 foram identificadas por sequenciamento de DNA usando linhagens M2 agrupadas dessa população, conforme Rigola et al. (2009 incorporado aqui por referência).

[0588] Linhagens mutantes M2 de agrupamentos de sementes identificadas como contendo mutações em Nitab4.5 0003090g0030.1 foram cultivadas em estufa e em 11 semanas de idade que está analisadas para teor de alcaloides como acima.

[0589] Linhagens mutantes M2 homozigotas e heterozigotas para este gene que está identificado por sequenciamento de DNA; segregantes nulos foram usados como plantas de controle para cada linhagem mutante. Os níveis médios de alcaloides foram determinados para cada classe de genótipo; diferenças significativas entre os grupos de tipo selvagem e mutantes/heterozigotos foram determinadas pelo teste t de Student (Figura 84). Um mínimo de quatro indivíduos em cada classe de genótipo foram utilizados para esta análise. A análise química indicou que uma mutação homozigótica em Nitab4.5 0003090g0030.1 causou um códon de parada prematuro (alteração de aminoácido (Q25*) resultando em plantas com aproximadamente um terço do teor de alcaloides em comparação com o controle tipo selvagem. EXEMPLO 14 Edição genética

[0590] A edição de genes foi usada para mutar um gene Nicl ERF em um estado HI para determinar se plantas equivalentes a linhagens LA poderiam ser geradas.

[0591] Uma linhagem mutante heterozigota, denominada Ll, causada por uma inserção de bp de A, foi identificada para Nitab4.5 0003090g0030.1 em TO.

[0592] Um códon de parada precoce foi introduzido no alelo mutado de Nitab4.5 0003090g90030.1 em L1 e interrompeu a função do gene de acordo (Figura 85). Para melhor caracterizar o efeito de fenótipo contribuído por Nitab4.5 0003090g0030.1, nós colhemos sementes de L1 e realizamos análises químicas na geração Tl. Os genótipos das plantas Tl, tipo selvagem (WTI-T1), mutante heterozigota (Het-Tl) e mutante homozigota (Mut-Tl), foram determinados por sequenciamento de DNA. Os níveis de alcaloides totais de WI-Tl foram comparáveis aos das plantas HI (Figura 86A. Embora a redução dos níveis de alcaloides nas plantas Het- Tl não tenha sido significativa, em média, seus valores de fenótipo foram reduzidos pela metade dos níveis das plantas WT- Tl. Para as mutantes homozigotas, Mut-Tl, o teor de alcaloide foi apenas discernível, que foi mais baixo do que o das plantas LA (Figura 86A). Como pode ser visto a partir da Figura 86B, oO nocaute de Nitab4.5 0003090g0030.1 na linhagem HI resultou em quase 1/10 dos níveis de alcaloides de plantas LA.

[0593] Para entender por que os níveis de alcaloides do Mut- Tl foram muito inferiores aos das plantas LA, investigamos os polimorfismos a nível de sequência e expressão para alelos Nitab4.5 0003090g0030.1 entre alelos HI e LA.

[0594] Nós sequenciamos aproximadamente 2,2 kb a montante do o códon de iniciação, a sequência de codificação, e cerca de 1,2 kb a jusante do códon de terminação, mas nenhum SNP foi identificado entre estes dois alelos. Análise de PCR em tempo real (RT) revelou que Nitab4.5 0003090g0030.1 é especificamente expresso na raiz, o que explica porque a biossíntese da nicotina é específica das raízes.

[0595] Em comparação com a linhagem HI, a expressão de Nitab4.5 0003090g0030.1 é regulada negativamente na linhagem LA (Figura 87). Portanto, a diferença fenotípica entre HI e LA é introduzida pela expressão diferencial do gene Nicl.

[0596] Embora a expressão fraca de Nicl conduza a baixos níveis de alcaloides em LA, é previsto que um teor ultrabaixo de alcaloides possa ser alcançado por uma interrupção completa de Nicl, que está de acordo com nossa observação em plantas Mut-T1 (Figura 86B).

[0597] Todas as publicações mencionadas na especificação acima são incorporadas aqui por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da presente invenção serão evidentes para os técnicos no assunto sem se afastar do escopo e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com concretizações preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para os especialistas em bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados, devem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de modulação do teor de alcaloides de uma planta ou parte da mesma, ou um cultivo de células, caracterizado pelo fato de que o método compreende a modificação da referida planta ou cultivo de células pela modulação da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF: em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID NO: 8; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 28; ou SEQ ID NO: 32; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

2. Método de modulação do teor de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de uma TSNA em uma planta de tabaco ou parte de planta da mesma caracterizado pelo fato de que o método compreende a modificação da referida planta ou um cultivo de células pela modulação da atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF: em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID NO: 8; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 28; ou SEQ ID NO: 32; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO:

5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

3. Uso de pelo menos um gene Nicl ERF caracterizado pelo fato de ser para modular o teor de alcaloides de uma célula ou planta ou parte da mesma ou uma cultura de células em que: o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID NO: 8; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 28; ou SEQ ID NO: 32; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma, ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

4, Método para produzir uma planta ou parte da mesma, um cultivo de células, um material de propagação vegetal, uma folha, uma folha cortada colhida, uma folha processada ou uma folha cortada e processada que tem teor alcaloide modulado, caracterizado pelo fato de que o método compreende a modificação da referida planta ou cultivo de células para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene de Nicl ERF em que: o pelo menos um gene de Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em: SEQ ID NO: 8; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 28; ou SEQ ID NO: 32; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma, ou em que o gene ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em: ou SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

5. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o teor de alcaloides é modulado em comparação com um cultivo de células ou plantas que não foi modificado para modular a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF.

6. Planta modificada ou parte da mesma ou um cultivo de células modificadas caracterizado pelo fato de ser para modular o teor de alcaloides em comparação com uma planta não modificada ou um cultivo de células não modificada, em que a modificação é a modulação da atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID NO: 8; ou SEQ ID NO: 12; ou SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 24; ou SEQ ID NO: 28; ou SEQ ID NO: 32; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

7. Material de propagação vegetal caracterizado pelo fato de ser obtenível de uma planta de acordo com a reivindicação 6 Ou de um cultivo de células ou plantas produzido pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.

8. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, ou uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com a reivindicação 6, ou um material de propagação vegetal de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o teor de alcaloide da planta é diminuído em comparação com uma planta ou cultivo de células que não foi modificada para modular a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF.

9. Método ou uso de acordo com a reivindicação 8, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com a reivindicação 8, ou um material de propagação vegetal de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF ser diminuída.

10. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou uma planta ou parte da mesma ou um cultivo de células de acordo com a reivindicação 6, ou um material de propagação vegetal, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o teor de alcaloides da planta ou do cultivo de células é aumentado em comparação com uma planta que não foi modificada para modular a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF.

11. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou 10, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com a reivindicação 6 ou 10, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações 7 ou 10, caracterizado pelo fato de que a planta é modificada para aumentar a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e o cultivo de células ou plantas exibe um aumento no teor de alcaloides em comparação com um cultivo de plantas ou células que não foi modificada para modular a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF.

12. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 5 a 11, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou de 8 a 11, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o teor alcaloide total da planta ou cultivo de células é modulado.

13. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 12, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou de 8 a 12, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações de 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o teor de um ou mais alcaloides selecionados a partir de nicotina, nornicotina, anabasina, miosmina e anatabina é modulado, de preferência o teor de nicotina é modulado.

14. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 13, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou de 8 a 13, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações de 7 a 13, caracterizado pelo fato de que a planta ou célula vegetal é da família Solanaceae.

15. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 14, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou de 8 a 14, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações de 7 a 14, caracterizado pelo fato de que a planta ou célula vegetal é do gênero Solanum.

16. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 14, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou de 8 a 14, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações de 7 a 14, caracterizado pelo fato de que a planta ou célula vegetal é do gênero Nicotiana.

17. Método ou uso de acordo com a reivindicação 16, uma planta de tabaco ou parte da mesma ou cultivo de células de tabaco de acordo com a reivindicação 16, ou um material de propagação vegetal de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o teor de nicotina é modulado.

18. Método ou uso de acordo com a reivindicação 16, uma planta de tabaco ou parte da mesma ou cultivo de células de tabaco de acordo com a reivindicação 16, ou um material de propagação vegetal de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o teor de nicotina é diminuído.

19. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 18, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou 8 ou de 11 a 18,

ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações 7 ou de 11 a 18 caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene Nicl ERF codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8 ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; Ou pelo menos um gene Nicl ERF compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5 ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

20. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 19, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou 8 ou de 11 a 19, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações 7 ou de 11 a 19 caracterizado pelo fato de que um gene ERF adicional é modulado em que: o gene ERF adicional é pelo menos um gene Nic2 ERF e codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em: SEQ ID NO: 40; ou SEQ ID NO: 44; ou SEQ ID NO: 48; ou SEQ ID NO: 52; ou SEQ ID NO: 56; ou SEQ ID NO: 60; ou SEQ ID NO: 64; ou SEQ ID NO: 68; ou SEQ ID NO: 72 ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; ou o gene ERF adicional é pelo menos um gene Nic2 ERF e compreende uma sequência de nucleotídeos como estabelecido em: SEQ ID NO: 37; ou SEQ ID NO: 41; ou SEQ ID NO: 45; ou SEQ ID NO: 49; ou SEQ ID NO: 53; ou SEQ ID NO: 57; ou SEQ ID NO: 61; ou SEQ ID NO: 65; ou SEQ ID NO: 69.

21. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de 8 a 20, uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células de acordo com as reivindicações 6 ou 8 ou 11 a 20, ou um material de propagação vegetal de acordo com as reivindicações 7 ou de 11 a 20, caracterizado pelo fato de que um gene ERF adicional é modulado em que o gene ERF adicional é pelo menos um gene Nic2 ERF e compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 69 ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma ou codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:72 ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma.

22. Uso de uma planta ou parte da mesma ou cultivo de células caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou de 8 a 21, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, ou de 8 a 20, para produzir uma planta.

23. Uso de uma planta ou parte da mesma ou um cultivo de células caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou de 8 a 21, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 ou de 8 a 21 para a produção de um produto.

24. Uso de uma planta ou parte da mesma caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou de 8 a 21, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 ou de 8 a 21 para o cultivo de uma colheita.

25. Uso de uma planta ou parte da mesma caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou de 8 a 21, ou de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 ou de 8 a 21 para produzir uma folha.

26. Folha colhida de uma planta caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou de 8 a 21, ou obtenível a partir de uma planta propagada a partir de um material de propagação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 21, ou obtenível a partir de uma planta obtenível por um uso de acordo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou de 22 a 24, ou obtenível a partir de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 ou de 8 a 21.

27. Folha colhida de uma planta de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a folha colhida de uma planta é uma folha colhida cortada.

28. Folha processada, preferencialmente uma folha de tabaco processada, preferencialmente uma folha de tabaco processada não viável caracterizada pelo fato de ser: obtenível a partir de uma planta obtenível a partir de uma utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou de 22 a 24; obtenível por processamento de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou de 7 a 21; obtenível a partir de uma planta propagada a partir de um material de propagação vegetal, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 21; ou obtenível por processamento de uma folha colhida de uma planta de acordo com as reivindicações 26 ou 27; ou obtenível a partir de uma planta produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 ou de 8 a 21.

29. Folha processada, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a folha é processada por cura fermentação, pasteurização ou uma combinação das mesmas.

30. Folha processada de acordo com as reivindicações 28 ou 29 caracterizada pelo fato de que a folha processada é uma folha processada cortada.

31. Material de tabaco curado caracterizado pelo fato de ser fabricado a partir de uma planta ou parte da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21 ou um extrato dela.

32. Mistura de tabaco caracterizada pelo fato de que compreende o referido material de tabaco curado, de acordo com a reivindicação 31.

33. Produto da indústria do tabaco caracterizado pelo fato de ser preparado a partir de: uma planta de tabaco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21, ou uma parte da mesma ou um cultivo de células de tabaco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21;

uma planta de tabaco ou parte da mesma propagada a partir de um material de propagação de planta de tabaco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21; uma folha colhida de uma planta de acordo com a reivindicação 25 ou 26, em que a planta é tabaco; folha processada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 29, em que a planta é tabaco; ou uma planta produzida pelo método da reivindicação 16.

34. Produto da indústria do tabaco, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o produto do tabaco é um artigo de fumo combustível.

35. Produto da indústria do tabaco, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o produto do tabaco é um produto do tabaco sem fumaça.

36. Produto de tabaco, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o produto de tabaco é um sistema de fornecimento de aerossol não combustível, tal como um dispositivo de aquecimento de tabaco ou um dispositivo gerador de aerossol.

37. Uso de uma célula de tabaco, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser para modular o teor de alcaloides em cultivo de células.

38. Artigo de fumo combustível, sistema de provisão de aerossol não combustível, produto do tabaco sem fumaça ou dispositivo de aquecimento do tabaco caracterizado pelo fato de que compreende uma planta ou uma parte da mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 21 ou um extrato (por exemplo, um extrato de tabaco) do mesmo ou um cultivo de células de tabaco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21; ou um material de tabaco curado de acordo com a reivindicação 31; ou uma mistura de tabaco de acordo com a reivindicação 32.

39. Uso de uma sequência de nucleotídeos caracterizado pelo fato de ser de pelo menos um gene Nicl ERF selecionado entre: SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma, para selecionar uma planta com teor alcaloide modulado (por exemplo, reduzido) e/ou teor modulado (por exemplo, reduzido) de nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de um TSNA.

40. Mutante de uma planta portadora de uma mutação hereditária caracterizado pelo fato de estar em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o gene Nicl ERF é selecionado dentre: SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; em que a referida mutação hereditária modula (por exemplo, diminui) a atividade ou expressão do pelo menos um gene Nicl ERF e em que a planta mutante modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou o teor modulado de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida mutação hereditária.

41. Progênie ou semente de uma planta mutante caracterizado pelo fato de que carrega a mutação hereditária de acordo com a reivindicação 40.

42. Folha colhida, folha processada ou material de tabaco curado caracterizado pelo fato de ser produzido a partir de uma planta que compreende uma modificação em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos um gene Nicl ERF, em que o pelo menos um gene Nicl ERF é selecionado a partir de: SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 9; ou SEQ ID NO: 13; ou SEQ ID NO: 17; ou SEQ ID NO: 21; ou SEQ ID NO: 25; ou SEQ ID NO: 29; ou uma variante funcional ou ortóloga da mesma; em que a referida modificação modula (por exemplo, diminui) a atividade ou expressão de pelo menos um gene Nicl ERF e em que a referida planta modulou (por exemplo, diminuiu) o teor de alcaloides e/ou teor modulado de uma nitrosamina específica do tabaco (TSNA) ou um precursor de TSNA em relação a uma planta comparável que não carrega a referida modificação em pelo menos um gene Nicl ERF.