CN111315891A - 方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于调节植物(例如烟草植物)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物。本发明还提供了至少一种Nic1 ERF基因用于调节植物的生物碱含量的用途，以及根据本发明可获得的烟草细胞、植物、植物繁殖材料、收获的叶、加工的烟草或烟草产品。
Description
发明领域
本发明涉及调节植物或其部分的生物碱含量、例如烟碱含量的方法。本发明还延伸至调节由调节植物内的生物碱含量的基因编码的多肽的表达和/或活性的方法。或者，本发明提供了调节编码调节植物内的生物碱含量的多肽的基因的表达和/或活性的方法。本发明还延伸至可用于调节所述多肽的构建体、用此类构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及从已经用基因构建体转化的此类转基因植物收获的叶用于调节生物碱含量的用途，以及包含此类叶的吸烟制品(例如，可燃吸烟制品)。
背景
生物碱是一组天然存在的主要含有碱性氮原子的化合物，并由各种各样生物体(包括细菌、真菌、植物和动物)产生。可以根据碳骨架的相似性对生物碱进行分类，例如，吲哚-、异喹啉-和吡啶-样。吡啶衍生物是一类单体生物碱；此类包括吡啶的简单衍生物，多环稠合和非稠合吡啶衍生物和倍半萜吡啶衍生物。实例是烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和新烟草碱。生物碱的大多数已知生物功能与保护相关。烟草中的生物碱增强烟雾感官属性。
烟碱天然存在于几种植物中，但在烟草植物中以最高水平发现。其在野生和栽培的烟草属物种中产生，并且其在植物针对食草动物和昆虫的防御中发挥重要作用(Voelckel等人，2001，通过引用并入本文)，占总生物碱含量的~90%。生物碱合并物的剩余的10%大部分由降烟碱、新烟草碱、麦斯明(myosmine)和新烟碱构成。
烟草中的生物碱含量的调节是复杂的。几种因素，包括基因型、环境、施肥和农艺实践(例如打顶)，影响烟草植物中的生物碱水平。
在1930年代，某些古巴雪茄烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum))类型被鉴定为具有非常低的生物碱含量，并且将此性状引入美国烟草育种株系(Valleau 1949，通过引用并入本文)。随后通过多代回交将低生物碱性状并入栽培种白肋烟21(B21)的遗传背景中(Legg等人，1970，通过引用并入本文)。
使用低生物碱白肋烟21(LA-B21)的遗传研究表明，最初被称为基因座A和B(Legg等人1969，通过引用并入)、但后来称为Nic1和Nic2的两个未连锁的基因座对烟叶中的烟碱水平有贡献，作为用于烟碱生物合成的调节基因座(Legg和Collins 1971，通过引用并入；Hibi等人1994，通过引用并入)。据报道，LA B21对昆虫损伤更敏感，这与生物碱在植物防御中的作用一致。也已报道，具有低总生物碱(约0.2%)的烟道烤制的烟草的同基因株系具有更低的产率。通过来自野生型或高生物碱B21 (HA-B21, AABB) x LA-B21 (aabb)之间的杂交物的F1后代的单倍体加倍，Collins等人(1974，通过引用并入)开发了具有高中等生物碱(HI-B21, AAbb)和低中等(LI-B21, aaBB)的B21的另外两个同基因株系(NIL)，其后来在1988年被注册为品种(Nielsen等人，1988，通过引用并入)。近同基因株系(NIL)在本文中称为白肋烟21 (B21, Nic1Nic2)，高中等(HI, Nic1nic2)，低中等(LI, nic1Nic2)和低生物碱B21 (LA, nic1nic2)。
随后的研究已显示，这两个基因座还控制与烟碱生物合成无关的许多基因、诸如应激应答基因的表达(Kidd等，2006，通过引用并入)。Nic2基因座已基于大缺失的鉴定进行表征(Shoji等人，2010，通过引用并入本文)，但由于定量性状(诸如基于生物碱水平抑制图谱的克隆方法)的复杂性质，阐明Nic1基因座在烟草中的位置已证明是困难的。
改变植物(例如烟草)中的生物碱含量可以具有几种商业优势。例如，减少植物中的总生物碱含量可以增加所述植物作为生物质资源的价值。例如，改变生物碱含量可以包括降低生物碱含量，例如烟草植物的烟碱含量。鉴于“烟碱上限”的潜在调节，即烟草产品中的烟碱的平均上限，具有降低的烟碱的烟草植物和产品可能是期望的。或者，增加植物、例如烟草植物中的生物碱含量，可以帮助保护植物对抗昆虫和食草动物。仍然需要具有调节的生物碱含量(例如具有调节的烟碱含量)，具有改进的商业上期望的性状的植物及其制备方法。
烟草吡啶生物碱是烟草特异性亚硝胺(TSNA)的前体，其在收获后的叶调制期间形成。在调制的烟叶中发现的四种主要TSNA是N'-亚硝基降烟碱(NNN)、N'亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基新烟碱(NAB)和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。
当氧化氮物质(例如NO、NO2、N2O3和N2O4)与烟草生物碱反应时形成TSNA。NAT和NAB分别经由二级生物碱新烟草碱和新烟碱的亚硝化作用形成。尽管早期研究声称NNN源自烟碱和降烟碱两者，但更近的报道已证实，调制的烟叶中的NNN的存在与降烟碱含量相关，而不与烟碱相关(Bush等人, Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001); Lewis等人, PlantBiotech J. 6: 346-354 (2008))。降烟碱是烟碱的去甲基化衍生物，烟草中的主要生物碱，其占总生物碱含量的90% (Saitoh等人, 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480)。NNK形成的前体/产物关系尚不那么清楚。一些研究指出，NNK是烟碱的亚硝化产物，但由于烟碱亚硝化的反应速度慢，烟碱的氧化衍生物(而不是烟碱本身)可能是NNK的直接前体(Caldwell等人Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993))。鉴定负责TSNA前体的产生和调节的基因是非常重要的。
尽管降烟碱通常仅占烟草植物中的总吡啶生物碱含量的2-4%，但导致含高降烟碱的转化植物的自发出现的遗传不稳定性是烟草生产中的长期问题。维持低降烟碱水平可以防止与该生物碱相关的令人讨厌的风味和香气，以及减少烟草工业产品中的N-亚硝基降烟碱(NNN)的形成，其中降烟碱是它的直接前体。
负责大多数烟碱向降烟碱的转化的基因是烟碱脱甲基酶基因CYP82E4，其编码细胞色素P450单加氧酶(Siminszky等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), pp.14919-14924;Xu等人, Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319)。烟草中的烟碱脱甲基酶基因家族得到充分表征，但对可以影响降烟碱水平的其他细胞过程知之甚少。仍然非常需要设计可以进一步降低烟草植物和由烟草植物生产的产品中的TSNA的水平的方法。
如实施例中所述，本发明人试图研究负责生物碱合成的基因，其目的是调节植物中的生物碱含量，例如降低烟草植物中的烟碱含量。他们的研究促使他们产生白肋烟21(B21)、正常/高生物碱B21 (HA) x低中等生物碱B21 (LI)、正常/高生物碱B21 (HA) x 低生物碱B21 (LA)和高中等B21 (HI) x低生物碱B21 (LA)烟草植物的杂交物。分析了所得F2植物的生物碱含量。对来自HA x LA和HA x LI的F2群体的具有最高或最低生物碱含量的F2进行SNP基因分型，以鉴定多态性标记，用于进一步分析。还生成HI x LA群体用于精细作图。本发明人开发了与Nic1基因座分离的标记。来自乙烯应答因子(ERF)亚家族的九个基因被鉴定为生物碱合成的潜在转录因子调节剂。
发明概述
令人惊讶地发现，通过如本文所教导调节Nic1 ERF基因的活性或表达，可以调节植物的生物碱含量。由此，可以生产具有调节的生物碱含量和烟草产品的消费者追求的商业上期望的性状的烟草产品。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的生物碱含量、例如低水平的烟碱含量的产品。
本发明在植物分子农作的领域中特别有用，在该领域中，植物(诸如烟草和其他烟草属)用于产生蛋白、肽和代谢物，例如用于产生治疗剂和药物，诸如抗生素、病毒样颗粒或营养药物(neutraceuticals)或小分子。在EU-资助的称为PharmPlant的项目中，烟草已被用于开发HIV-中和抗体，并且加拿大的Medicago Inc.已在基于烟草的平台上进行工作，用于生产病毒样颗粒用于流感疫苗制造。
因此，根据本发明的植物可用于分子农作以减少或消除烟碱和/或其他烟碱生物碱的存在。低烟碱植物或根茎(rootsock)的使用在分子农作中是有益的，并且将减少与纯化相关的下游加工成本。
在其他情况下，可能期望产生具有高生物碱水平、例如高水平的烟碱含量的植物，使得可以从烟草植物纯化烟碱，以产生纯烟碱产品，例如用于利用含有烟碱的液体的装置(例如电子烟)中或烟草加热装置内使用。例如，具有含有高水平的烟碱的叶的植物的产生可以降低烟碱提取用于产生用于电子烟的电子液体的成本。
本发明人研究烟草植物中的烟碱生物合成的调节。他们研究调节基因座Nic1和Nic2，其被认为控制烟碱相关结构基因和其他不相关基因的表达。本发明人的一个目的是提供改变的生物碱含量。在Nic1区域中鉴定了9个ERF基因，与在相同条件下生长的其野生型植物对应物相比，所述基因意外地调节修饰的烟草植物中的生物碱含量。
本发明人已令人惊讶地确定通过调节ERF基因的活性或表达来调节烟草植物的生物碱含量、例如烟碱含量的方法。可以通过抑制ERF基因的活性或表达来减少烟草植物的烟碱含量。在本发明之前，还不知道如本文所述的Nic1 ERF基因的活性或表达的调节可用于调节生物碱含量。
本发明人已经确定Nic1 ERF基因的调节可以将修饰植物的生物碱含量降低至令人惊讶的低水平。
与HA(高生物碱，AABB)株系相比，LI(低中等，aaBB)株系通常产生约一半的生物碱含量。然而，在实施例13中，产生与LI株系等效的EMS株系。产生在Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)中具有突变的EMS株系。这些突变型EMS株系产生与HA株系相比约三分之一的生物碱含量 - 远低于对于LI株系所预期的。
在另一个实例中，当通过HI株系(AAbb)的基因编辑敲除Nic1 ERF Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)时，敲除株系的生物碱含量远低于等效LA株系(aabb)的生物碱含量(参见实施例14)。这些数据令人惊讶地表明，调节单独的Nic1 ERF基因(例如Nitab4.5_0003090g0030.1或ERF199)的活性或表达(例如敲低或敲除活性或表达)足以调节(例如降低)植物或其部分的生物碱含量。
根据第一个方面，本发明提供了调节植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物或细胞培养物：其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在另一个方面，提供了调节烟草植物或其植物部分中的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物或细胞培养物：其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No.28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ IDNo. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在另一个方面，提供了Nic1 ERF基因用于调节细胞(例如烟草细胞)或植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的用途，其中：至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ IDNo. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽，或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个进一步方面，本发明提供了用于生产具有调节的生物碱含量的植物或其部分、细胞培养物、植物繁殖材料、烟叶、切割收获的烟叶、加工的烟叶或切割和加工的烟叶的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞培养物以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，其中：至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ IDNo. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽，或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
合适地，根据本发明使用的至少一种Nic1 ERF基因可以编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽。
合适地，根据本发明使用的至少一种Nic1 ERF基因可以包含如SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，其中与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物或细胞培养物相比，生物碱含量被调节。
在另一个方面，提供了植物或其部分或细胞培养物，与未修饰的植物或未修饰的细胞培养物相比，其已被修饰以实现生物碱含量的调节，其中所述修饰是至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的调节。
在另一个方面，提供了可获得自根据本发明的植物或细胞培养物或通过本发明的方法产生的植物的植物繁殖材料。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，或本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比，植物的生物碱含量降低。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达降低。
在另一个方面，提供了本发明的方法或用途，或本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比，植物的生物碱含量增加。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述植物经修饰以增加至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比，所述植物表现出增加的生物碱含量。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述植物的总生物碱含量被调节。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中一种或多种选自烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和新烟草碱的生物碱的含量被调节。在一个方面，所述烟碱含量被调节。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述植物来自茄科。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述植物来自茄属。
在另一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述植物来自烟草属。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的烟草植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述烟碱含量被调节。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的烟草植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中所述烟碱含量降低。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ IDNo.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中额外的ERF基因被调节，其中：所述额外的ERF基因是Nic2 ERF基因，且编码包含如SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或所述额外的ERF基因是Nic2 ERF基因，且包含如SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ IDNo. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQID No. 69中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中额外的ERF基因被调节，其中所述额外的ERF基因是Nic2 ERF基因，且包含如SEQ ID No.69中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，或编码包含如SEQ ID No.72中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直系同源物的多肽。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ IDNo.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，且其中额外的ERF基因被调节，其中：
所述额外的ERF基因是至少一种Nic2 ERF基因，例如这样的Nic2 ERF基因，其编码包含如SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No.56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或
所述额外的ERF基因是Nic2 ERF基因，例如这样的Nic2 ERF基因，其包含如SEQ ID No.37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ IDNo. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，提供了本发明的方法或用途，本发明的植物或其部分，或本发明的植物繁殖材料，其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ IDNo.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，且其中额外的ERF基因被调节，其中所述额外的ERF基因是Nic2 ERF基因，其包含如SEQ ID No.69中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，或编码包含如SEQ ID No.72中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直系同源物的多肽。
在另一个方面，提供了本发明的植物或其部分或通过本发明的方法产生的植物用于培育植物的用途。
在另一个方面，提供了本发明的植物或其部分或通过本发明的方法产生的植物用于生产产品(例如烟草工业产品)的用途。
在另一个方面，提供了本发明的植物或其部分或通过本发明的方法产生的植物用于生长作物的用途。
在一个方面，本发明提供了由根据本发明的植物或其部分或其提取物或根据本发明的烟草细胞培养物制成的调制的烟草材料。
在另一个方面，提供了烟草共混物，其包含根据本发明的所述调制的烟草材料。
在另一个方面，提供了本发明的植物或其部分或通过本发明的方法产生的植物用于生产叶的用途。
在一个方面，提供了本发明的植物的收获的叶或可从本发明的繁殖材料繁殖的植物获得或可从通过使用本发明获得的植物获得或可从通过本发明的方法产生的植物植物获得的植物的收获的叶。
在一个方面，提供了本发明的植物的收获的叶，其中植物的收获的叶是切割收获的叶。
在另一个方面，本发明提供了加工的叶，优选无活力的加工的叶，其：
可获得自可从使用本发明获得的植物；
可通过加工本发明的植物获得；
可获得自从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物；或
可通过加工本发明的烟草植物的收获的叶获得；或
可从通过本发明的方法产生的植物获得。
在一个方面，提供了本发明的加工的叶，其中所述叶通过调制、发酵、巴氏杀菌或其组合加工。
在一个方面，提供了本发明的加工的叶，其中所述加工的叶是切割加工的叶。
在另一个方面，本发明提供了烟草产品，其由以下制备：
本发明的烟草植物或其植物；
从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
本发明的烟草植物的收获的叶；
本发明的加工的烟叶；或
通过本发明的方法产生的烟草植物。
在另一个方面，本发明提供了烟草工业产品，其由以下制备：
i) 本发明的烟草植物或其部分或本发明的烟草细胞培养物；
ii) 从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
iii) 本发明的烟草植物的收获的叶；
iv) 本发明的加工的烟叶。
在一个方面，提供了本发明的烟草产品，其中所述烟草产品是可燃吸烟制品。
在另一个方面，提供了本发明的烟草工业产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
在一个方面，提供了本发明的烟草工业产品，其中所述烟草工业产品是不可燃气雾剂供应系统，诸如烟草加热装置或气雾剂产生装置。
在一个方面，提供了本发明的细胞(例如烟草细胞)用于调节细胞培养物中的生物碱含量的用途。
在一个方面，提供了吸烟制品、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含根据本发明的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)或根据本发明的烟草细胞培养物；或根据本发明的调制的烟草材料；或根据本发明的烟草共混物。
在一个方面，本发明提供了至少一种选自SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直系同源物的Nic1 ERF基因的核苷酸序列用于选择具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的(例如降低的)烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量的植物的用途。
合适地，所述用途可以包括确定在所述植物中的至少一种选自SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直系同源物的Nic1 ERF基因中存在修饰，其中所述修饰调节(例如降低)所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达。合适地，所述修饰可以降低或敲除Nic1 ERF基因的表达或功能，使得在所述植物中的Nic1 ERF基因的蛋白表达或功能是不可检测的。
在一个方面，本发明提供了在至少一种Nic1 ERF基因的核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，其中所述Nic1 ERF基因选自：SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直向同源物；其中所述可遗传突变调节(例如降低)所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且其中相对于不携带所述可遗传突变的可比较的植物，突变型植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量。
所述可遗传突变通过技术手段来实现，即，所述可遗传突变是工程改造的，且不是自然存在的突变。可以使用任何技术手段来诱导可遗传突变。合适地，所述可遗传突变可以通过化学诱变、诸如甲磺酸乙酯(EMS)处理、物理辐射和插入剂、包括T-DNA；通过UV诱变或基因编辑技术(诸如CRISPR/Cas)来实现。
在另一个方面，本发明提供了突变型植物的后代或种子，其携带根据本发明的可遗传突变。
在一个方面，本发明提供了从植物产生的收获的叶、加工的叶或调制的烟草材料，所述植物在至少一种Nic1 ERF基因的核苷酸序列中包含修饰，其中所述至少一种Nic1 ERF基因选自：SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ IDNo. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直向同源物；其中所述修饰调节(例如降低)所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且其中相对于在至少一种Nic1 ERF基因中不携带所述修饰的可比较的植物，所述植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量。
本发明进一步提供了如本文中参考说明书和附图所述的方法、叶、植物、植物繁殖材料、收获的叶、加工的烟草、烟草产品、用途或其组合。
附图简述
本发明的实施方案现将仅借助于实例并参考附图进行描述，在所述附图中：
图1：小图A显示亲本株系和源自HA x LI的杂交物的F2的总生物碱水平。小图B显示亲本株系和源自HA x LA的杂交物的F2的烟碱水平。选择每个亲本株系的30株个体植物和每个群体的200株F2用于生物碱水平的化学分析。图2显示来自HA x LI和HA x LA的杂交物的选择的F2个体的遗传图谱与普通烟草30k Infinium HD共有图谱2015的比较。虚线表明在F2图谱和共有图谱之间鉴定的标记，点虚线表明两个F2图谱之间鉴定的标记。粗体字表明多于一个图谱共有的标记。仅在HA x LA或HA x LI图谱中鉴定的标记显示于共有图谱中，其他标记位置显示为水平黑线。图3：小图A和B显示用SNP4 CAPS标记对来自HA (AABB) X LI(aaBB)的杂交物的选择的F2个体进行基因分型。小图A显示20株具有最低生物碱水平的F2。小图B显示24株具有最高生物碱水平的F2。小图C和D显示用SNP4 CAPS标记对来自HA(AABB) X LA (aabb)的杂交物的选择的F2个体进行基因分型。小图C显示24株具有最低生物碱水平的F2。小图D显示20株具有最高生物碱水平的F2。HA、HI和LI和LA用作对照。潜在的重组体用箭头指示。图4：小图A显示LA、LI、HI和HA的总生物碱水平的表型值的比较。30株植物的平均值为LA = 0.4%，LI = 1.69%，HI = 2.89%，HA = 3.06%。小图B显示LA、LI、HI和HA的烟碱含量的表型值的比较。30株植物的平均值为LA = 0.39%，LI = 1.61%，HI = 2.76%，HA = 2.92%。
图5：小图A显示亲本系HI和LA以及基因分型为AA (F2—AA)和aa (F2—aa)的F2植物的总生物碱水平。小图B显示亲本株系HI和LA以及基因分型为AA (F2—AA)和aa (F2—aa)的F2植物的烟碱水平。将基因分型为AA、但具有最低生物碱或烟碱水平的植物(如小图中通过箭头指示)装袋以收集F3种子。
图6：小图A显示亲本株系HI和LA以及源自袋装的F2植物的F3的总生物碱含量。小图B显示亲本株系HI和LA以及源自袋装的F2植物的F3的烟碱水平。用40株F3植物未观察到表型分离。
图7显示Nic1的遗传图谱。给出具有相应标记的观察到的重组体的数量。每个标记的遗传距离(cM)在染色体的左侧指示。与SNP4共分离的Nic1基因座侧接SNP2/SNP3和SNP5。Adams等人(US20160374387A1，通过引用并入本文)报道，大于500 Kb的缺失区域(INDEL1)在Nic1基因座周围。连同其上游和下游的SNP (13和14)，基因组缺失落在Nic1基因座的划界区域之外。
图8显示Nic2基因座的遗传图谱。给出具有相应标记的观察到的重组体的数量。每个标记的遗传距离(cM)在染色体的左侧指示。Nic2基因座与SNP17和SNP18共分离。
图9显示由Nic1 ERF转化(LA背景)的毛状根的生物碱分析。用空载体转化的HI和LA的毛状根用作对照。
图10至图81显示如下所述的SEQ ID No.1至SEQ ID No.72。
图82显示Nic1基因组区域的部分完整的物理图谱，其显示支架和标记位置(未按比例绘制)。细黑线表示BioNano杂交支架，其中深灰色支架根据Edwards等人(2017，通过引用并入本文)的假染色体在其下方对齐。黑线中的虚线部分指示不连续的序列区域；小空位指示BioNano超级支架之间的断裂点(对于详情，参见Edwards等人2017)。浅灰色指示基于与Sierro等人(2014 Nature Communications 5, 3833，通过引用并入本文)基因组的相互BLAST分析估计的支架位置。苍白色支架指示基于遗传图谱之一上的相关标记的位置估计的位置。支架下方显示近似SNP/INDEL标记位置。灰色虚线框指示由Adams等人(2016)鉴定的序列区域。
图83显示Nic2基因组区域的部分完整的物理图谱，其显示支架和标记位置(未按比例绘制)。细黑线表示BioNano杂交支架，其中深灰色支架根据Edwards等人(2017)的假染色体在其下方对齐。黑线中的小空位指示BioNano超级支架之间的断裂点(对于详情，参见Edwards等人2017)。浅灰色指示基于与Sierro等人(2014)基因组的相互BLAST分析估计的支架位置。苍白色支架指示基于遗传图谱之一上的相关标记的位置估计的位置。支架下方显示近似SNP标记位置。灰色虚线框指示由Adams等人(2016)鉴定的序列区域。
图84显示通过Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)中的突变的状态分组的EMS突变植物的分离群体中的总生物碱水平(烟碱、降烟碱、新烟草碱和新烟碱)。突变植物的氨基酸变化显示在基因标识符后的方括号中。与相应的野生型植物在p<0.01或p<0.05(Student氏t检验)的显著差异分别通过双星号或单星号指示。
图85显示杂合突变株系L1中的Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)的基因编辑介导的敲除的序列分析。L1含有具有“A”-插入的突变等位基因，其导致提前终止密码子。将用引物对(SEQ ID No. 111和SEQ ID No. 112)扩增的PCR产物克隆至pGEM-T Easy中，并选择至少10个集落用于测序。
图86显示用基因编辑的突变体L1的T1植物的新烟草碱、新烟碱、降烟碱和烟碱的生物碱分析。Nitab4.5_0003090g0030.1的敲除显著降低HI植物中的生物碱含量(A)，且纯合突变体中的生物碱水平几乎是LA植物中的生物碱的1/10 (B)。WT-T1、Het-T1和Mut-T1用于指示T1植物的三种基因型；野生型、杂合子和纯合突变体。对于每种基因型测量至少15株单独植物。HI和LA植物用作对照。
图87显示HI和LA之间的Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)等位基因的相对表达水平的RT-PCR分析。Nitab4.5_0003090g0030.1表达是根特异性的，并且在LA植物中被下调。肌动蛋白用作内部对照。用于扩增Nitab4.5_0003090g0030.1的引物对为5'AGTCCTAGCTCAAGTTTTAGCAGCTTCGA3' (SEQ ID No. 73)和5'CGGACTCGGAGTACTTTTCATGGGAT3' (SEQ ID No. 172)，且对于肌动蛋白，为5'ACGCAAGTACAGTGTCTGGA3' (SEQ ID No. 173)和5'GCAGATGAGCTCCTCCCTTT3' (SEQ ID No.74)。
序列表
提供了在整个本说明书和相应的序列表中使用的序列标识符的概述，其中：
SEQ ID No.1对应于编码称为Nitab4.5_0003090g0020.1或另外称为ERF17L3ΔN的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.2对应于Nitab4.5_0003090g0020.1 (ERF17L3ΔN)的cDNA序列。
SEQ ID No.3对应于Nitab4.5_0003090g0020.1 (ERF17L3ΔN)的cds。
SEQ ID No.4对应于Nitab4.5_0003090g0020.1 (ERF17L3ΔN)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.5对应于编码称为Nitab4.5_0003090g0030.1或另外称为ERF199的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.6对应于Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)的cDNA序列。
SEQ ID No.7对应于Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)的cds。
SEQ ID No.8对应于Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.9对应于编码称为Nitab4.5_0003665g0040.1或另外称为(JRE5L2)的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.10对应于Nitab4.5_0003665g0040.1 (JRE5L2)的cDNA序列。
SEQ ID No.11对应于Nitab4.5_0003665g0040.1 (JRE5L2)的cds。
SEQ ID No.12对应于Nitab4.5_0003665g0040.1 (JRE5L2)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.13对应于编码称为Nitab4.5_0004620g0010.1或另外称为ERF210的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.14对应于Nitab4.5_0004620g0010.1 (ERF210)的cDNA序列。
SEQ ID No.15对应于Nitab4.5_0004620g0010.1 (ERF210)的cds。
SEQ ID No.16对应于Nitab4.5_0004620g0010.1 (ERF210)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.17对应于编码称为Nitab4.5_0004620g0030.1或另外称为ERF91的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.18对应于Nitab4.5_0004620g0030.1 (ERF91)的cDNA序列。
SEQ ID No.19对应于Nitab4.5_0004620g0030.1 (ERF91)的cds。
SEQ ID No.20对应于Nitab4.5_0004620g0030.1 (ERF91)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.21对应于编码称为Nitab4.5_0004620g0080.1或另外称为ERF29的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.22对应于Nitab4.5_0004620g0080.1 (ERF29)的cDNA序列。
SEQ ID No.23对应于Nitab4.5_0004620g0080.1 (ERF29)的cds。
SEQ ID No.24对应于Nitab4.5_0004620g0080.1 (ERF29)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.25对应于编码称为Nitab4.5_0004620g0090.3或另外称为ERF130的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.26对应于Nitab4.5_0004620g0090.3 (ERF130)的cDNA序列。
SEQ ID No.27对应于Nitab4.5_0004620g0090.3 (ERF130)的cds。
SEQ ID No.28对应于Nitab4.5_0004620g0090.3 (ERF130)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.29对应于编码称为Nitab4.5_0004620g0095.1或另外称为ERF16的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.30对应于Nitab4.5_0004620g0095.1 (ERF16)的cDNA序列。
SEQ ID No.31对应于Nitab4.5_0004620g0095.1 (ERF16)的cds。
SEQ ID No.32对应于Nitab4.5_0004620g0095.1 (ERF16)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.33对应于编码称为Nitab4.5_0006382g0040.1或另外称为ERF110的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.34对应于Nitab4.5_0006382g0040.1 (ERF110)的cDNA序列。
SEQ ID No.35对应于Nitab4.5_0006382g0040.1 (ERF110)的cds。
SEQ ID No.36对应于Nitab4.5_0006382g0040.1 (ERF110)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.37对应于编码称为Nitab4.5_0002924g0010.1或另外称为ERF17LI的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.38对应于Nitab4.5_0002924g0010.1 (ERF17LI)的cDNA序列。
SEQ ID No.39对应于Nitab4.5_0002924g0010.1 (ERF17LI)的cds。
SEQ ID No.40对应于Nitab4.5_0002924g0010.1 (ERF17LI)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.41对应于编码称为Nitab4.5_0002924g0020.2或另外称为ERF179I的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.42对应于Nitab4.5_0002924g0020.2 (ERF179)的cDNA序列。
SEQ ID No.43对应于Nitab4.5_0002924g0020.2 (ERF179)的cds。
SEQ ID No.44对应于Nitab4.5_0002924g0020.2 (ERF179)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.45对应于编码称为Nitab4.5_0002924g0040.2或另外称为ERF17的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.46对应于Nitab4.5_0002924g0040.2 (ERF17)的cDNA序列。
SEQ ID No.47对应于Nitab4.5_0002924g0040.2 (ERF17)的cds。
SEQ ID No.48对应于Nitab4.5_0002924g0040.2 (ERF17)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.49对应于编码称为Nitab4.5_0002924g0045.1或另外称为ERF168的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.50对应于Nitab4.5_0002924g0045.1 (ERF168)的cDNA序列。
SEQ ID No.51对应于Nitab4.5_0002924g0045.1 (ERF168)的cds。
SEQ ID No.52对应于Nitab4.5_0002924g0045.1 (ERF168)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.53对应于编码称为Nitab4.5_0002924g0050.2或另外称为ERF115的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.54对应于Nitab4.5_0002924g0050.2 (ERF115)的cDNA序列。
SEQ ID No.55对应于Nitab4.5_0002924g0050.2 (ERF115)的cds。
SEQ ID No.56对应于Nitab4.5_0002924g0050.2 (ERF115)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.57对应于编码称为Nitab4.5_0006499g0010.1或另外称为ERF104的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.58对应于Nitab4.5_0006499g0010.1 (ERF104)的cDNA序列。
SEQ ID No.59对应于Nitab4.5_0006499g0010.1 (ERF104)的cds。
SEQ ID No.60对应于Nitab4.5_0006499g0010.1 (ERF104)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.61对应于编码称为Nitab4.5_0006499g0020.2或另外称为ERF221的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.62对应于Nitab4.5_0006499g0020.2 (ERF221)的cDNA序列。
SEQ ID No.63对应于Nitab4.5_0006499g0020.2 (ERF221)的cds。
SEQ ID No.64对应于Nitab4.5_0006499g0020.2 (ERF221)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.65对应于编码称为Nitab4.5_0012667g0020.2 (ERF91L1)的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.66对应于Nitab4.5_0012667g0020.2 (ERF91L1)的cDNA序列。
SEQ ID No.67对应于Nitab4.5_0012667g0020.2 (ERF91L1)的cds。
SEQ ID No.68对应于Nitab4.5_0012667g0020.2 (ERF91L1)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID No.69对应于编码称为Nitab4.5_0015055g0010.2或另外称为ERF189的基因的核苷酸序列。
SEQ ID No.70对应于Nitab4.5_0015055g0010.2 (ERF189)的cDNA序列。
SEQ ID No.71对应于Nitab4.5_0015055g0010.2 (ERF189)的cds。
SEQ ID No.72对应于Nitab4.5_0015055g0010.2 (ERF189)多肽的氨基酸序列。
本文公开的一些序列在核苷酸序列中含有“N”。“N”可以是任一核苷酸或一个或多个核苷酸的缺失或插入。例如，在一些情况下，显示一串“N”。“N”的数目不一定与该位置处的核苷酸的实际数目相关。序列中可存在比如“N”所示更多或更少的核苷酸。
详述
本发明人已首次显示，通过调节植物(例如烟草植物)中的至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，可以调节植物的生物碱和/或TSNA含量。
所述至少一种Nic1 ERF基因选自：编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No.32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽的基因；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
合适地，所述至少一种Nic1 ERF基因可以是选自以下的一种或两种或三种或四种或五种或六种或七种基因：编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No.16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽的基因；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No.21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述Nic1 ERF基因包含如SEQ IDNo.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，至少一种额外的Nic1 ERF的活性或表达被调节。合适地，还可以调节选自表1的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种额外的Nic1 ERF。
在一个方面，至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ IDNo.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，其被调节；且至少一种额外的Nic1 ERF的活性或表达被调节。合适地，所述至少一种额外的Nic1 ERF可以选自：编码包含如SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ IDNo. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽的Nic1 ERF基因；或其中所述ERF基因包含如SEQID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。合适地，可以调节至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种额外的Nic1 ERF。
在一个实施方案中，本发明提供了调节植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种ERF基因的活性或表达来修饰所述植物。
术语“调节”在本文中用来意指增加或减少。
术语“增加生物碱含量”在本文中用于意味着本发明的产品(例如植物，其部分(例如叶)，加工叶或从所述植物(例如，烟草植物)制成的产品)中生物碱的浓度和/或总生物碱含量与未根据本发明修饰的可比较的产品相比更高。
术语“降低生物碱含量”在本文中用于意味着本发明的产品(例如植物，其部分(例如叶)，加工叶或从所述植物(例如，烟草植物)制成的产品)中生物碱的浓度和/或总生物碱含量与未根据本发明修饰的可比较的产品相比更低。
在一个实施方案中，本发明提供了调节(即增加或减少)植物(例如烟草植物)或其部分中的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物。
在一个实施方案中，所述TSNA是N'-亚硝基降烟碱(NNN)和/或前体是降烟碱。
在一个实施方案中，所述TSNA可以是选自以下的组中的一种或多种：N'-亚硝基降烟碱(NNN)、N'亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基新烟碱(NAB)和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。
在一个优选实施方案中，所述TSNA是N'-亚硝基降烟碱(NNN)。
所述TSNA可以在加工的烟草、例如调制的烟草或重构的烟草中测量。在一个实施方案中，TSNA含量在调制的烟草植物或其部分(例如在调制的烟叶中)中测量和/或修饰(例如降低)。
如本文所用的术语“烟草特异性亚硝胺”或“TSNA”具有本领域中的其通常含义，即仅在烟草产品或其他含烟碱产品中发现的亚硝胺。合适地，所述至少一种烟草特异性亚硝胺可以是4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基降烟碱(NNN)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)或N-亚硝基新烟碱(NAB)。
更合适地，所述至少一种烟草特异性亚硝胺可以是NNK或NNN。在一个实施方案中，所述烟草特异性亚硝胺是NNN。
当与至少一种烟草特异性亚硝胺相关使用时，术语“其前体”是指一种或多种烟草植物的化学品或化合物，其导致形成烟草特异性亚硝胺或参与亚硝化反应，导致烟草特异性亚硝胺产生。合适地，术语“其前体”可以指硝酸盐、亚硝酸盐或一氧化氮。
在一个实施方案中，所述TSNA的前体是选自以下的组中的一种或多种：降烟碱、新烟碱、新烟草碱和烟碱的氧化衍生物诸如伪氧化烟碱(PON)。
在一个优选实施方案中，所述TSNA的前体是降烟碱。
在一个实施方案中，所述TSNA的前体可以是PON。所述TSNA的前体(例如，NNN、NNK、NAB和/或NAT)可以在绿色烟叶中，例如在加工之前，例如在调制之前，进行测量。在一个实施方案中，所述TSNA的前体(例如，NNN、NNK、NAB和/或NAT)在绿色烟叶中，例如在加工之前，例如在调制之前，进行测量和/或修饰(例如降低)。
在一个实施方案中，当与未根据本发明修饰的烟草植物(或其部分)相比时，实施本发明的方法和/或用途导致修饰的烟草植物(或其部分)中的至少一种TSNA或其前体的减少。
术语“减少至少一种TSNA或其前体”或“至少一种TSNA或其前体的减少”在本文中意味着本发明的产品、方法或用途中的至少一种TSNA或其前体的浓度和/或总含量相对于可比较的产品、方法或用途更低。例如，可比较的烟草工业产品将衍生自未根据本发明修饰的、但其中所有其他相关特征相同的烟草植物(例如，植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。
可以使用本领域中已知的用于测定至少一种TSNA或其前体的浓度和/或水平的任何方法。具体而言，这种方法可以包括添加氘标记的内标、水性萃取和过滤，随后使用反相高效液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)进行分析。用于测定烟草特异性亚硝胺的前体的浓度和/或水平的其他实例包括方法，诸如CORESTA推荐方法CRM-72中详述的方法：通过LC-MS/MS测定烟草和烟草产品中的烟草特异性亚硝胺；CRM正在开发为ISO/DIS 21766或Wagneret al. Analytical Chemistry (2005), 77(4), 1001-1006，其全部通过引用并入本文。
合适地，通过实施本发明的方法和/或用途，可以降低至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。合适地，当与在未根据本发明修饰的烟草植物中的至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的含量浓度相比时，可以在本发明的(例如，通过本发明的方法和/或用途可获得或获得的)烟草植物中降低至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平。
当与从未根据本发明修饰的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)可获得或获得的烟叶、收获的叶、加工的烟叶、烟草工业产品或其组合相比时，在从本发明的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)可获得或获得的烟叶、收获的叶、加工的烟叶、烟草工业产品或其组合中降低至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。
合适地，可以在加工的烟叶中降低至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。
合适地，可以在烟草工业产品中降低至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平。
在一个实施方案中，所述至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。在一些实施方案中，所述至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少约5%至约95%、约10%至约90%、20%至约80%、30%至约70%或约40%至60%。
关于加工的(例如，调制的)烟叶(例如，调制的或重构的)，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以降低约5000 ng/g至约50 ng/g，约4000 ng/g至约100 ng/g，约3000 ng/g至500 ng/g或2000 ng/g至1000 ng/g。在一些实施方案中，所述至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。
如本文所定义的“可比较的产品”将是从未根据本发明修饰的、但其中所有其他相关特征相同的植物(例如，烟草植物)(例如，植物物种、生长条件、加工植物(例如，烟草)的方法等)衍生的产品。根据本发明的可比较的产品可以意指可获自或获得自未根据本发明修饰例如以调节Nic1 ERF基因(或一种或多种Nic1 ERF基因与一种或多种Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达的植物的植物(例如，烟草植物)或其部分，诸如叶(例如，烟叶)，收获的叶(例如，收获的烟叶)，切割收获的叶(例如，切割收获的烟叶)，加工的叶(例如，加工的烟叶)或植物繁殖材料(例如，烟草植物繁殖材料)或包含所述植物或其部分的产品，例如烟草产品或其组合。可比较的产品也可称为对照或野生型。在一个实施方案中，可比较的产品是不包含其活性或表达已被调节的Nic1 ERF基因的产品。在一个实施方案中，可比较的产品是既不包含其活性或表达已被调节的Nic1 ERF基因也不包含其活性或表达已被调节的Nic2 ERF基因的产品。
如本文所定义的术语“未修饰的植物”将是这样的植物(例如，烟草植物)，其未根据本发明修饰以调节Nic1 ERF基因的活性或表达，并且其中所有其他相关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含其活性或表达已被抑制的Nic1 ERF基因的植物。在一个实施方案中，可比较的产品是既不包含其活性或表达已被调节的Nic1 ERF基因也不包含其活性或表达已被调节的Nic2 ERF基因的产品。
根据本发明的合适的植物包括来自茄科的植物，其包括例如烟草、番茄、曼陀罗草、茄子、曼德拉草、致命的茄属植物(颠茄)、辣椒(红辣椒、辣椒)和马铃薯。在一个实施方案中，茄科的合适属是茄属，例如，番茄或马铃薯。在一个实施方案中，茄科的合适属是烟草。合适地，所述烟草可以是普通烟草(Nicotiana tabacum)物种。烟草的合适物种在本文中可以称为烟草植物，或简称为烟草。
Nic1 ERF基因(或Nic2 ERF基因)的“活性或表达”可以指转录、翻译(即蛋白表达)的水平，或由Nic1 ERF基因(或分别为Nic2 ERF基因)编码的蛋白的活性。Nic1 ERF基因(或Nic2 ERF基因)的活性涉及其在生物碱的生物合成中作为转录因子发挥功能的能力。Nic1 ERF基因(或Nic2 ERF基因)的活性可以通过测量生物碱合成的产物、即通过测量生物碱含量来测定。
根据本发明的一个方面，可以通过抑制转录和/或翻译来降低(或抑制)基因表达。在一个实施方案中，基因的活性或表达可以是指转录水平(即产生的mRNA的量)或翻译水平(即产生的蛋白的水平或量)。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的增加，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达增加。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的降低，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达降低(或抑制)。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的增加，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达和至少一种Nic2 ERF的活性或表达组合增加。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的降低，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达和至少一种Nic2 ERF的活性或表达组合降低(或抑制)。
在一个进一步方面，从叶测量生物碱含量。在一个方面，从绿叶测量生物碱含量。在一个进一步方面，从调制的叶，例如晾制的、烟道烤制的、明火烤制的或晒制的叶，测量生物碱含量。在一个进一步方面，从烟道烤制的叶测量生物碱含量。在一个进一步方面，从晾制的叶测量生物碱含量。
术语“生物碱含量”在本文中用于意指归类为生物碱的整组化合物的浓度和/或总量。烟草中通常存在的生物碱包括烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱。在一个实施方案中，一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱的生物碱的含量被调节。在一个实施方案中，一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱的生物碱的含量被降低。在一个实施方案中，一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱和降烟碱的生物碱的含量被增加。合适地，烟碱含量被调节。在一个实施方案中，所述烟碱含量被降低。
可以使用本领域中已知的用于测定生物碱的浓度和/或总含量的任何方法。用于分析生物碱含量的一种优选方法涉及通过气相色谱-火焰电离检测方法(GC-FID)进行分析。
在一个实施方案中，提供了用于生产通过具有调节的生物碱含量的本发明的植物可获得或获得的植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶(例如烟叶)、收获的叶(例如收获的烟叶)、切割收获的叶(例如切割收获的烟叶)、加工的叶(例如加工的烟叶)、切割和加工的叶(例如切割和加工的烟叶)、包含所述植物或其部分的产品(例如烟草产品)或其组合的方法，所述方法包括修饰所述烟草以调节Nic1 ERF基因的活性或表达。可以通过比较植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶(例如烟叶)、收获的叶(例如收获的烟叶)、切割收获的叶(例如切割收获的烟叶)、加工的叶(例如加工的烟叶)、切割和加工的叶(例如切割和加工的烟叶)、包含本发明的植物或其部分的产品(例如烟草产品)或其组合与可比较的产品来测定调节的生物碱含量。
合适地，生物碱含量可以在植物(例如烟草植物、例如修饰的烟草植物)中被调节。合适地，生物碱含量可以在叶(例如烟叶，例如来自修饰的烟草植物的烟叶)中被调节。合适地，生物碱含量可以在切割收获的叶(例如来自修饰的烟草植物的切割收获的烟叶)中被调节。合适地，生物碱含量可以在加工的叶(例如加工的烟叶，例如来自修饰的烟草植物的加工的烟叶)中被调节。合适地，生物碱含量可以在切割并加工的叶(例如来自修饰的烟草植物的切割并加工的烟叶)中被调节。合适地，生物碱含量可以在调制的叶(例如来自修饰的烟草植物的调制的烟叶)中被调节。合适地，生物碱含量可以在绿叶(例如来自修饰的烟草植物的绿色烟叶)的提取物中被调节。合适地，生物碱含量可以在包含本发明的植物或其部分的产品(例如烟草产品，例如由修饰的烟草植物或其部分产生的烟草产品)中被调节。合适地，生物碱含量可以在上述产品的任一种或其组合中被调节。合适地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的增加。合适地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的降低。
在一个实施方案中，一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱的生物碱的含量降低。
合适地，上述生物碱含量的调节可以是烟碱含量的降低。
在一个实施方案中，修饰的植物(例如烟草植物)、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、叶(例如烟叶)，收获的叶(例如收获的烟叶)、切割收获的叶(例如切割收获的烟叶)、加工的叶(例如加工的烟叶)、切割和加工的叶(例如切割和加工的烟叶)或来自修饰的烟草植物的烟草产品的烟碱含量降低。
在一个实施方案中，当与在相似生长条件下生长的未被修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达的植物(例如，烟草植物)或其部分的生物碱含量相比时，植物(例如，烟草植物)或其部分的生物碱含量可以分别被调节至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。合适地，生物碱含量可以被调节约2倍至约10倍，优选约3倍至约10倍，合适地约3倍至约5倍。合适地，所述修饰可以是生物碱含量的增加或减少。合适地，所述修饰可以是一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱的生物碱的修饰。合适地，所述修饰是烟碱含量的修饰。
在本发明的一个实施方案中，与未根据本发明修饰的植物(例如烟草植物)或其部分相比，植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量可以被调节1%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。当与未修饰的植物(例如烟草植物)或其部分相比时，所述调节可以是生物碱含量的增加或减少。合适地，所述调节可以是总生物碱含量的调节。合适地，所述修饰可以是一种或多种选自烟碱、新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)和降烟碱的生物碱的修饰。合适地，所述修饰是烟碱含量的修饰。
在一个实施方案中，与未修饰以调节Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达的植物(例如，烟草植物)或其部分相比，且更具体地与没有引入调节的植物(例如，烟草植物)的表达相比或相对于没有引入调节的植物(例如，烟草植物)的表达，所述方法或用途导致生物碱含量被调节。
在一个实施方案中，与未被修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达的分别植物(例如，烟草植物)或其部分相比，植物(例如，烟草植物)或其部分已被修饰以实现生物碱含量的调节。
如本文所用的术语“修饰”或“修饰的”意指已经改变或变化的植物(例如，烟草植物)。本发明包括使用用于遗传修饰植物或非遗传修饰植物的技术修饰植物。此类方法是本领域中众所周知的，并且遗传修饰技术的实例包括转化、转基因、顺式基因(cisgenics)和基因编辑方法。非遗传修饰技术的实例包括快中子诱变、化学诱变(例如，甲磺酸乙酯(EMS)诱变)和现代群体分析方法。
在一个实施方案中，选择具有修饰的Nic1 ERF基因的天然变体，并将该性状或基因培育为具有商业上期望的性状的第二植物。
在一个实施方案中，根据本发明的植物(例如烟草植物)可以是转基因植物。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物(例如烟草植物)可以是非转基因植物。
合适地，在LA白肋烟21中不存在至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的调节。
合适地，在白肋烟21中不存在至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的调节。
在一些实施方案中，降低至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达且由此降低生物碱含量的修饰选自：降低、防止或减弱至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者)的转录、翻译或表达；
抑制由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者组合)编码的多肽的合成或其从细胞内储存的释放；或
增加由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者组合)编码的多肽的降解速率。
在一个实施方案中，降低至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的修饰(或降低至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的活性的组合的一种或多种修饰)在一种或多种ERF基因中包含突变。
在一个实施方案中，所述突变缺失整个一种或多种ERF基因。
在一个实施方案中，一种或多种ERF基因可以在所述基因内包含一个或多个突变。合适地，一个或多个突变导致突变的基因中的基因活性降低或消除。在一个实施方案中，所述一个或多个突变导致基因失活。在一个实施方案中，所述突变可以是缺失。在一个实施方案中，所述突变可以是插入。在一个实施方案中，所述突变可以引入提前终止密码子。在一个实施方案中，所述靶标位点对于靶标ERF基因是独特的，并且不存在于其他ERF基因中。在一个实施方案中，所述突变靶向蛋白编码区的5'末端。在一个实施方案中，所述突变是无义突变。
在一个实施方案中，所述突变体具有降低的总生物碱和/或降低的烟碱水平。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.4或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.8或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.12或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.16或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.20或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.24或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.28或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.32或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No.36或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 3中所示的编码序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 5中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 9中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 13中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 17中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 21中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 25中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
在一个实施方案中，本发明提供了Nic1 ERF基因中的一个或多个突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
通过实例的方式，本方法可以包括：
● 提供核酸序列中的突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 4；或SEQ IDNo. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供ERF基因的核酸序列中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 1；或SEQ IDNo. 3，SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ IDNo. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
● 提供ERF基因的核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
● 提供降低核酸序列的水平的反义RNA、siRNA或miRNA，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No.20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供反义RNA、siRNA或miRNA，其降低核酸序列SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3，SEQID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列的水平。
在一个实施方案中，除了调节(例如突变)一种或多种Nic1 ERF基因以外，还调节(例如突变)一种或多种Nic2 ERF基因。
合适地，本文教导的Nic1 ERF基因修饰(例如突变)中的任一种可以与Nic2 ERF基因的一种或多种修饰组合使用，其中所述Nic2 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 40；或SEQID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或所述Nic2 ERF基因包含如SEQ ID No. 37；或SEQ IDNo. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
通过实例的方式，本方法可以包括：
● 提供核酸序列中的突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 40；或SEQ IDNo. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No.60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供ERF基因的核酸序列中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 37；或SEQ IDNo. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
● 提供ERF基因的核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No.57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
● 提供降低核酸序列的水平的反义RNA、siRNA或miRNA，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No.56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白；
● 提供反义RNA、siRNA或miRNA，其降低核酸序列SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No.61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列的水平。
在一个实施方案中，组合使用至少一种Nic1 ERF基因中的突变，其选自编码包含显示为SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ IDNo. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列中的一个或多个突变，或ERF基因的核酸序列中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No.9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ IDNo. 29；或SEQ ID No. 33；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；和至少一种Nic2 ERF基因中的突变，尤其是编码氨基酸序列SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 52或SEQ ID No.56、SEQ ID No. 64、SEQ ID No. 68或SEQ ID No. 72或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列中的一个或多个突变，或核酸序列中的一个或多个突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 37、SEQ IDNo. 41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49或SEQ ID No. 53或SEQ ID No. 57或SEQ ID No.61或SEQ ID No. 65或SEQ ID No. 69或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列，更具体地，所述Nic2 ERF突变是编码氨基酸序列SEQ ID No.72或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列中或核苷酸序列SEQ ID No.69或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，组合使用至少一种Nic1 ERF基因中的突变，其由以下组成：核酸序列中的一个或多个突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No.8的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白，或ERF基因的核酸序列中的一个或多个突变，所述核酸序列包含SEQ IDNo.5；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；和至少一种Nic2 ERF基因中的突变，尤其是编码氨基酸序列SEQ IDNo. 40、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 64、SEQ ID No. 68或SEQ ID No. 72或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列中的一个或多个突变，或包含SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49、SEQ IDNo. 53、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 65或SEQ ID No. 69的核苷酸序列或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，组合使用至少一种Nic1 ERF基因中的突变，其由以下组成：核酸序列中的一个或多个突变，所述核酸序列编码包含显示为SEQ ID No.8的氨基酸序列；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列的蛋白，或ERF基因的核酸序列中的一个或多个突变，所述核酸序列包含SEQ IDNo.5；或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；和至少一种Nic2 ERF基因中的突变，其由以下组成：核苷酸序列中的一个或多个突变，所述核苷酸序列编码显示为SEQ ID No.72的氨基酸序列或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或显示为SEQ ID No.69的核苷酸序列或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一个或多个突变。
一种或多种Nic2 ERF基因可以是选自表2的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种或八种或九种Nic2 ERF基因。
在一些实施方案中，降低至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达且由此降低生物碱含量的修饰是选自以下的一种或多种：一种或多种ERF基因中的点突变、缺失、插入、重复和倒置。合适地，通过选自随机诱变和靶向诱变的方法引入修饰。合适地，例如，可以通过选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、基因编辑和CRISPR的靶向诱变方法来引入修饰。
如本文所用，术语“突变”包括天然遗传变体和工程改造的变体。
具体而言，术语“突变”是指与显示为SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ IDNo. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQID No. 32；或SEQ ID No. 36的序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列相比氨基酸序列中的变化，其减少蛋白的表达或功能。
术语“突变”可以指与显示为SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33的序列或与其具有至少70%序列同一性的核苷酸序列相比，核苷酸序列中的变异。
在一个优选的实施方案中，存在于植物中的包含如SEQ ID No. 1；或SEQ ID No.3；SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No.21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33所示的核酸序列或与其具有至少70%序列同一性的序列或编码包含如SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No.32；或SEQ ID No. 36所示的序列或与其具有至少70%序列同一性的序列的蛋白的核酸序列的每一拷贝如本文限定被突变(例如，植物中编码所述蛋白的基因的每个基因组拷贝被突变)。例如，普通烟草(N. tabacum)异源四倍体基因组中的基因的每个拷贝都可以被突变。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞对于所述突变是纯合的。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的植物或植物细胞只表达突变的核酸。换言之，在一些实施方案中，根据本发明的植物中不存在内源(或内源和功能性)蛋白。换言之，如果存在任何内源蛋白，则其优选处于无活性和/或截短形式。
突变可以中断编码如本文所详述的蛋白的核酸序列。
中断可能导致核酸序列不被转录和/或翻译。
例如，可以通过缺失或另外修饰核酸序列的ATG起始密码子来中断核酸序列，从而减少或阻止蛋白的翻译。
核酸序列可包含一个或多个减少或阻止蛋白表达或影响蛋白运输的核苷酸改变。例如，可通过在可读框中引入一个或多个提前终止密码子、移码、剪接突变体或非可接受的氨基酸取代来减少或阻止蛋白的表达。
提前终止密码子是指将终止密码子引入可读框并且阻止整个氨基酸序列翻译的突变。提前终止密码子可以是TAG(“琥珀”)、TAA(“赭石”)或TGA(“蛋白石”或“棕土”)密码子。
合适地，可以将提前终止密码子引入Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)；如SEQID No.5-7中任一者中所示。
合适地，Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)中的提前终止密码子；如SEQ IDNo.5-7中任一者中所示；可以是TGA(“乳白色”或“琥珀色”)提前终止密码子。
移码突变(也称为框架错误或阅读框移位)是由核酸序列中不能被3整除的多个核苷酸的插入缺失(插入或缺失)引起的突变。由于通过密码子的基因表达的三联体性质，插入或缺失可以改变阅读框，从而导致与原始翻译完全不同的翻译。移码突变通常会导致阅读突变后的密码子以编码不同的氨基酸。移码突变通常会导致引入提前的终止密码子。
剪接突变体在将前体信使RNA加工成成熟信使RNA期间在剪接发生的特定位点中插入、缺失或改变多个核苷酸。剪接位点的缺失导致一个或多个内含子保留在成熟mRNA中并可能导致产生异常蛋白。
非可接受的氨基酸取代是指导致蛋白中非同义氨基酸取代的突变，其导致蛋白功能减少或消除。
本领域中已知的用于在核酸序列中提供突变的任何方法可用于本方法中。例如，可以使用同源重组，其中产生其中相关核酸序列被突变并用于转化植物或植物细胞的载体。然后可以选择表达突变序列的重组植物或植物细胞。
核酸序列可以全部或部分缺失。缺失可以是连续的，或者可以包括多个序列部分。缺失优选去除足够量的核苷酸序列，使得核酸序列不再编码功能性蛋白。例如，缺失可以去除核酸序列编码部分的至少50%、60%、70%、80%或90%。
与可比较的未修饰植物的相应基因组相比时，缺失可能是全部的，在这种情况下，100%的核酸序列的编码部分不存在。
在植物中缺失核酸序列的方法是本领域中已知的。例如，可以使用同源重组，其中产生其中相关核酸序列缺失并用于转化植物或植物细胞的载体。然后可以选择表达序列的新的部分的重组植物或植物细胞。
用如本文所述的载体转化的植物细胞可以根据众所周知的组织培养方法生长并维持，例如通过在提供有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。
可以使用靶向诱变方法(也称为靶向核苷酸交换(TNE)或寡核苷酸定向诱变(ODM))来进行核酸序列的修饰。靶向诱变方法包括但不限于采用锌指核酸酶、TALEN(参见WO2011/072246和WO2010/079430)、Cas9样、Cas9/crRNA/tracrRNA或Cas9/gRNA CRISPR系统(参见WO 2014/071006和WO2014/093622)、大范围核酸酶(参见WO2007/047859和WO2009/059195)的那些或采用诱变寡核苷酸的靶向诱变方法，所述寡核苷酸可能含有化学修饰的核苷酸用于增强与基因序列互补的诱变并进入植物原生质体(例如，KeyBase®或TALENs)。
或者，诱变系统诸如TILLING(靶向诱导的局部病灶IN基因组学；McCallum等人,2000, Nat Biotech 18:455, 和McCallum等人 2000, Plant Physiol. 123, 439-442，两者均通过引用并入本文)可用于生成包含编码具有突变的蛋白的基因的植物株系。TILLING使用传统的化学诱变(例如甲磺酸乙酯(EMS)诱变)，随后为高通量筛选突变。因此，可以获得包含具有期望的突变的基因的植物、种子和组织。
所述方法可以包括以下步骤：诱变植物种子(例如EMS诱变)，合并植物个体或DNA，PCR扩增目标区域，异源双链体形成和高通量检测，鉴定突变体植物，将突变体PCR产物测序。应理解，其他诱变和选择方法可以等同地用于产生此类修饰的植物。种子可以例如进行辐射或化学处理，并且可以针对修饰的表型筛选植物。
通过分子方法，诸如DNA中存在的突变，以及通过修饰的表型特征，可以将修饰的植物与未修饰的植物(即野生型植物)区分开。修饰的植物对于所述突变可以是纯合的或杂合的。
合适地，所述方法可以包括用能够抑制至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的基因构建体(或能够抑制至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合的活性或表达的构建体)转化植物(例如烟草植物)的细胞。
在一些实施方案中，增加至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达且由此降低生物碱含量的修饰选自：
增加、促进或加强至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)的转录、翻译或表达；
增加由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)编码的多肽的合成或其从细胞内储存的释放；或
降低由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者组合)编码的多肽的降解速率。
合适地，所述方法可以包括用基因构建体转化植物(例如烟草植物)的细胞，所述基因构建体编码至少一种外源Nic1 ERF基因(或编码至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的组合)，或包含编码能够促进或加强至少一种内源Nic1 ERF基因(或至少一种内源Nic1 ERF基因和至少一种内源Nic2 ERF基因的组合)的蛋白的核苷酸序列。应理解，这些选项各自将导致由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)编码的多肽的活性和表达增加。所述方法可包括从转化细胞再生植物。
因此，提供了能够增加由至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的组合)编码的多肽的活性和/或表达的基因构建体用于增加用所述构建体转化的植物中的生物碱含量的用途。
所述基因构建体可以编码包含如SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 32或SEQ IDNo. 36中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽。所述构建体可以包含如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13、SEQID No. 17、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一些实施方案中，根据本发明的方法或用途包括通过增加Nic1 ERF基因的活性或表达并增加Nic2 ERF基因的活性或表达来增加植物(例如烟草植物)的生物碱含量。
合适地，用于增加生物碱含量的方法或用途包括增加至少一种Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因的活性或表达，其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含实质上如SEQ ID No.4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No.24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含实质上如SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物，且其中所述Nic2 ERF基因编码包含实质上如SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No.56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述Nic2 ERF基因包含实质上如SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 69中所示的核苷酸序列。
合适地，用于增加生物碱含量的方法或用途包括增加至少一种Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因的活性或表达，其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 4；或SEQID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 1；或SEQ ID No.3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No.21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物，且其中所述Nic2 ERF基因编码包含如SEQ ID No.72中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述Nic2 ERF基因包含如SEQ ID No. 69中的核苷酸序列。
如本文所用的术语“抑制”(例如抑制Nic1 ERF基因的活性或表达)意味着与可比较的产品中的基因活性或基因表达相比，Nic1 ERF基因的活性或表达降低或减少，或由Nic1 ERF基因产生的蛋白的量或活性降低。
在一个实施方案中，如本文所用的术语“抑制”(例如抑制Nic1 ERF基因的活性或表达)意味着与可比较的产品中的基因活性或基因表达相比，Nic1 ERF基因的活性或表达降低。
特定Nic1 ERF基因的活性可以通过测量基因的转录来测量。用于测量转录的方法是本领域中众所周知的，并且尤其包括northern印迹、RNA-Seq、原位杂交、DNA微阵列和RT-PCR。或者，可以通过测量基因产物(例如由所述基因编码的蛋白)的水平间接测量基因的活性。
在一些实施方案中，当与未根据本发明修饰的植物(例如，烟草植物)中的Nic1 ERF基因的活性或表达相比时，Nic1 ERF基因的活性或表达可被调节，即增加或降低至少约10%、20%、30%或40%，合适地至少约50%、60%、70%，更合适地至少约80%、90%、95%或100%。
合适地，Nic1 ERF基因的表达或功能可被降低、部分失活、抑制、消除、敲除或丢失，使得Nic1 ERF的蛋白表达或功能不可检测。
在一个方面，至少一种Nic1 ERF基因被敲除。换言之，Nic1 ERF基因已经被使得完全不起作用。
在一个方面，敲除Nic1 ERF基因，其编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或包含如SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个优选实施方案中，所述Nic1 ERF基因可以实质上没有活性或表达，这意味着植物可以包含小于约1%(合适地小于约0.1%)的活性或表达，优选地当与未经修饰以抑制Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比时。
在一些实施方案中，当与未根据本发明修饰的植物(例如，烟草植物)中的Nic2 ERF基因的活性或表达相比时，Nic2 ERF基因的活性或表达可被调节，即增加或降低至少约10%、20%、30%或40%，合适地至少约50%、60%、70%，更合适地至少约80%、90%、95%或100%。
在一个优选实施方案中，所述Nic2 ERF基因可以实质上没有活性或表达，这意味着植物可以包含小于约1%(合适地小于约0.1%)的活性或表达，优选地当与未经修饰以抑制Nic2 ERF基因的活性或表达的植物相比时。
如本文所用的“ERF基因”是指属于乙烯应答因子(ERF)亚家族的转录因子基因。
如本文所用的“Nic1 ERF基因”是指本发明人在本文的实施例中已鉴定为作图至Nic1区域的ERF基因。如本文所用的Nic1 ERF基因连同其对应的核苷酸、cDNA、cds和氨基酸序列标识符列于下表1中。
合适地，用于本发明中的至少一种Nic1 ERF基因是表1中所列的那些中的任一种。
上表中列出的Nic1 ERF和Nic2 ERF各自的基因组序列与它们相应的编码序列相同，除了Nic1 ERFERF17L3。ERF17L3 (SEQ ID No. 1)的基因组序列与ERF17L3 (SEQ IDNo. 3)的编码序列不同。
如本文所用的“Nic2 ERF基因”是指本发明人在本文的实施例中已鉴定为作图至Nic2区域的ERF基因。如本文所用的Nic2 ERF基因连同其对应的核苷酸、cDNA、cds和氨基酸序列标识符列于下表2中。
合适地，用于本发明中的Nic2 ERF基因是表2中所列的那些中的任一种。
在一个实施方案中，至少一种本文提及的Nic1 ERF基因可以由包含以下的多核苷酸序列编码：
i) 本文中显示为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3；SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 33的多核苷酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic1 ERF合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No. 4、SEQ ID No.8、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 28、SEQID No. 32或SEQ ID No. 36的氨基酸序列，或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v)与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选80%，优选85%，优选90%，优选95%，更优选96%，更优选97%，更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，至少一种本文提及的Nic2 ERF基因可以由包含以下的多核苷酸序列编码：
i) 本文中显示为SEQ ID No. 37、SEQ ID No.41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49、SEQID No. 53、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 65或SEQ ID No. 69的多核苷酸序列；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic1 ERF基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No. 40、SEQ ID No.44、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 64、SEQID No. 68或SEQ ID No. 72的氨基酸序列，或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选80%，优选85%，优选90%，优选95%，更优选96%，更优选97%，更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，至少一种根据本发明使用的Nic1 ERF基因对植物(例如，烟草植物)可以是內源的。
在一个实施方案中，至少一种根据本发明使用的Nic2 ERF基因对植物(例如，烟草植物)可以是內源的。
本文提及“内源的”基因不仅指所讨论的基因在植物中以其天然形式发现(即不存在任何人为干预)，也指该相同基因(或基本上同源的核酸/基因)随后以分离的形式被(重新)引入植物(转基因)或植物细胞中。例如，含有这种转基因的转基因植物可能遇到转基因表达的实质性减少和/或内源基因的表达的实质性减少。分离的基因可以分离自生物体或可以是人工制备的，例如，通过化学合成。
在另一个实施方案中，至少一种根据本发明使用的Nic1 ERF基因对植物(例如，烟草植物)可以是外源的。
在另一个实施方案中，至少一种根据本发明使用的Nic2 ERF基因对植物(例如，烟草植物)可以是外源的。
术语“外源基因”可以意味着被转化至未修饰的植物中的基因来自外部来源，即来自与被转化的物种不同的物种。外源ERF基因可以包含与未修饰植物中的内源ERF基因实质上相同或不同的核酸序列。所述外源基因可以源自对应于来自任何物种的ERF基因的基因组或cDNA序列。所述外源基因可以形成嵌合基因。所述外源基因可以编码包含如表1中所列的氨基酸序列的多肽或其功能变体或片段或直向同源物。所述外源基因可以包含如表2中所列的核苷酸序列或其功能变体或片段或直向同源物。
本发明还提供了Nic1 ERF基因用于调节植物的生物碱含量的用途。
在一个实施方案中，本发明进一步提供了额外的ERF基因的用途，其中额外的ERF基因是如本文表2中所述的Nic2 ERF基因。
用于降低基因或基因产物的表达的方法是本领域中充分记载的。本文描述的用于调节Nic1 ERF基因的活性或表达的任何方法可以用于修饰Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。
在一个实施方案中，可以通过本领域中已知的任何方法抑制Nic1 ERF基因的活性或表达或两种Nic1 ERF基因的活性或表达。在另一个实施方案中，可以通过本领域中已知的任何方法抑制Nic1 ERF基因的活性或表达和Nic2 ERF基因的活性或表达。
用于抑制Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的方法可以包括基因编辑、定向诱变、RNA干扰、反义或有义共抑制(参见Wang和Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686–691，其通过引用并入本文)。在一个实施方案中，可以通过使用基因编辑来实现基因的活性或表达的抑制。可以使用本领域中已知的任何方法实施基因编辑。本文呈现了几个非限制性实例。
在一个实施方案中，可以使用包括CRISPR(包括使用CRISPR/Cas9系统)的基因编辑方法实现Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的抑制。CRISPR/Cas9基因组编辑工具是商业可得的，诸如来自Clontech (Avenue duPresident Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)的“Guide-it”。
合适地，为了生成基因编辑载体pRGEB-M24，可以通过用HindIII和BsaI辅助的输注克隆，将载体pRGEB31中的水稻snoRNA U3启动子用从pSiM24扩增的M24启动子取代(Sahoo等人, 2014，其通过引用并入本文)。为了维持载体pRGEB-M24中sgRNA序列和BsaI识别位点的完整性，可以首先用附接有BsaI识别位点的引物(HindIII_EcoRI_M24F:GATTACGCCAAGCTTTCCCGTATACCCCGGGGAATTCGT (SEQ ID No. 139))；BsaI_M24pro_R:cgagacctcggtctccAGATGAGAGATTTCGATTCCG (SEQ ID No. 140))扩增M24启动子。将用附接有缺失的sgRNA序列的引物(HindIII_EcoRI_M24F; gRNA_ BsaI_R:ttctagctctaaaacCGAGACCTCGGTCTCCAGATGA (SEQ ID No. 141))扩增稀释的PCR产物。可以设计一对寡核苷酸以特异性靶向下表中的每种候选基因。
上表3中加下划线的碱基代表靶向位点的有义或反义序列。
首先将寡核苷酸对退火以产生在两个末端具有4-nt 5’突出端的双链片段，且然后将其连接至BsaI消化的pRGEB-M24载体中。
另一种基因编辑方法包括使用试剂盒商业可得(例如来自Addgene, 1KendallSq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA)的TALEN(转录激活因子样效应因子核酸酶)技术。在一个实施方案中，可以使用TALEN来实现至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达的抑制。
在另一个实施方案中，该方法可包括使用锌指核酸酶，诸如可得自Sigma-Aldrich的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一个实施方案可包括使用Silva等人 Curr Gene Ther.Feb 2011; 11(1):11–27(其教导通过引用并入本文)中描述的大范围核酸酶(或另外的方法)。
在一个实施方案中，用于抑制Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因的活性或表达的方法可以是定向诱变。可以使用任何靶向诱变的方法。在一个实施方案中，所述方法可以是寡核苷酸定向诱变(ODM)，诸如可得自Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PWWageningen, The Netherlands)的KeyBase®。在另一个实施方案中，可以通过使用构建体或载体(例如质粒)来实现Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的抑制。
本发明的基因构建体可以呈表达盒的形式，其可以适合于抑制宿主细胞中的Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达或增加宿主细胞中的Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。可以将基因构建体引入宿主细胞中，而不将其引入载体中。例如，可以是核酸分子的基因构建体可以并入脂质体或病毒颗粒内。或者，可以通过合适的方式(例如，直接内吞摄取)将纯化的核酸分子(例如无组蛋白DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可以通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击将基因构建体直接引入宿主主体(例如植物)的细胞中。或者，可以使用粒子枪将本发明的基因构建体直接引入宿主细胞中。
或者，所述基因构建体可包含重组载体或携带于重组载体内，用于在合适的宿主细胞中表达。重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体非常可用于用本发明的基因构建体转化宿主细胞，以及用于复制其中的表达盒。技术人员将理解，本发明的基因构建体可以与许多类型的骨架载体组合用于表达目的。骨架载体可以是双元载体，例如可以在大肠杆菌和根癌土壤杆菌两者中复制的载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，诸如pBIN19 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21)。
除了抑制至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达的序列以外，重组载体可以包括多种其他功能元件。例如，载体可以包含启动子。另外，可以设计重组载体，使得其在宿主细胞的胞质溶胶中自主复制。在该情况下，重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可以设计重组载体，使得其整合至宿主细胞的基因组中。在该情况下，设想有利于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以在克隆过程中用作选择标记，即使得能够选择已经转染或转化的细胞，并且使得能够选择携带并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含参与调节编码序列的表达或用于将表达的多肽靶向至宿主细胞的特定部分(例如，至毛状体或腺状毛状体)的DNA。因此，载体可以包含至少一种选自以下的额外元件：选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白靶向序列(例如转运肽)。
在一个实施方案中，所述方法或用途可以包括使用干扰寡核苷酸抑制Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。在一个实施方案中，寡核苷酸是基于RNA的。在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)，例如dsRNAi。在一个实施方案中，所述方法可以包括用抑制Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的RNAi分子(例如dsRNAi)转化植物(例如，烟草植物)的细胞。
在一个实施方案中，与野生型植物中的所述多肽的活性或表达相比，至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达降低至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或100%。
在一个实施方案中，与野生型植物中的所述多肽的活性或表达相比，至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达降低至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或100%。
在一个实施方案中，与野生型植物中的所述多肽的活性或表达相比，至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达降低至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或100%。
可以通过本领域中已知的任何方法抑制至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达。在任何前述实施方案中，至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达可以通过任何方法抑制，所述方法包括包括CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR-Cas9系统，RNA干扰(RNAi)，反义或有义共抑制，基因编辑或定向诱变。在任何前述实施方案中，可以使用RNAi方法例如使用miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA抑制至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达。
在一个实施方案中，调节Nic1 ERF基因活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达的构建体可以包含在载体中。合适地，所述载体可以是质粒。
在一个实施方案中，用于本发明中的载体是基于土壤杆菌的质粒。
因此，在一个实施方案中，提供了植物(例如烟草植物)和植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、叶(例如烟叶)、切割收获的叶、加工的叶(例如加工的烟叶)或切割和加工的叶(例如切割和加工的烟叶)，其中调节Nic1 ERF基因的表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。
在另一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分和/或植物繁殖材料可以包含调节Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的构建体。在一个实施方案中，所述构建体降低Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。在另一个实施方案中，所述构建体增加Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。
在一个进一步实施方案中，根据本发明的细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分和/或植物繁殖材料可以包含：
i) 本文中显示为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3；SEQ ID No.5、SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 33的多核苷酸序列；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic1 ERF基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No. 4、SEQ ID No.8、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 28、SEQID No. 32或SEQ ID No. 36的氨基酸序列，或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选80%，优选85%，优选90%，优选95%，更优选96%，更优选97%，更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，使细胞(例如烟草细胞)在细胞培养物中生长。
在一个实施方案中，至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者)用于调节细胞或细胞培养物(例如烟草细胞培养物)中的生物碱含量(例如烟碱含量)。
在一个有利的实施方案中，至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达的抑制可以导致生物碱含量的降低。合适地，至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者的活性或表达的抑制可以导致烟碱含量的降低。
在另一个实施方案中，增加Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达可以导致生物碱含量的降低。合适地，增加Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达可以导致烟碱含量的降低。
在一个实施方案中，所述植物或其部分是烟草植物。在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物或其部分是根据本发明修饰的白肋或烟道烤制的植物。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明修饰的白肋或烟道烤制的植物。在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物(例如修饰的烟草植物)是东方或土耳其烟草植物。
在一个实施方案中，所述烟草植物或其部分是调制的。在一个实施方案中，所述烟草植物或其部分是调制的，例如晾制的、烟道烤制的、明火烤制的或晒制的。在一个进一步方面，所述烟草植物或其部分是烟道烤制的。在一个进一步方面，所述烟草植物或其部分是晾制的。
烟道烤制是本领域中众所周知的，并且是指用烟道烤制烟草的方法，所述烟道由火箱或燃气系统供给。该过程热烤制烟草而不使其暴露于烟雾中，在烤制过程中缓慢升高温度。该方法产生的烟草糖含量高且具有中等至高水平的尼古丁。史密斯烟草谷仓是传统的烟道烤制的烟草谷仓的一个实例。
晾制的烟草包括白肋、马里兰和深色烟草。常见的因素是调制主要在没有人为的热量和湿度下进行。白肋烟草的颜色为浅棕色至深棕色，油含量高，且糖含量低。白肋烟草在谷仓中晾制。主要的白肋烟生长国家是阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。白肋烟草植物包括，例如，Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R711、R 712、NCBH 129、Bu 21xKy10、HB04P、Ky 14xL 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。
马里兰烟草具有良好的燃烧特性、低尼古丁和中性香气。主要马里兰烟生长国家包括美国和意大利。深色晾制的烟草与其他类型的主要区别在于其发酵过程，其给予深色晾制的烟草中等棕色至深棕色和独特的香气。它们的叶子具有低糖量，但具有高尼古丁含量。深色晾制的烟草主要用于生产嚼用烟草和鼻烟。深色明火烤制的烟草的主要生长区域是美国田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。
如本文所用的术语“功能片段”是指能够以与多核苷酸相同的方式发挥功能的多核苷酸的一部分。例如，如果多核苷酸是ERF基因，则功能片段必须能够作为ERF基因发挥功能，例如所述功能片段保留ERF基因的活性。所述功能片段可以具有等于或大于全长多核苷酸的活性水平的活性水平。
在一个实施方案中，功能片段可以是如本文所讨论的Nic1 ERF基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述功能片段可以包含本文所讨论的Nic1 ERF基因的至少150个核苷酸。
在一个实施方案中，Nic2 ERF基因的功能片段可以是如本文所讨论的Nic2 ERF基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述功能片段可以包含本文所讨论的Nic2 ERF基因的至少150个核苷酸。
如本文所用的术语“功能变体”是指可在基因组序列中出现而在基因功能和/或蛋白功能中活性没有显著损失的变异性。例如，可以取代存在于多肽中的一些氨基酸(或存在于多核苷酸中的一些核苷酸)，而活性没有显著损失。所述功能变体可以具有等于或大于非变体多核苷酸和/或多肽的活性水平的活性水平。由于遗传密码的简并性而与本文公开的ERF基因不同的序列是功能变体。变体与目标序列可以差异少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸。
如本文所用的术语“遗传密码的简并性”是指编码多肽序列的密码子的冗余，其表现为指定氨基酸的三密码子组合的多样性。例如，在编码具有异亮氨酸氨基酸的多肽的mRNA分子中，异亮氨酸可以由AUU、AUC或AUA编码。这意味着编码RNA的DNA分子可以具有多种序列，但所得多肽将具有相同的序列。换言之，多态的核苷酸序列可以编码相同的多肽产物。这意味着一个核酸序列可以包含与第二个序列具有非常低序列同一性的序列、但编码相同的多肽序列。
与具有本文所述的特定特性的多肽的氨基酸序列或本文所述的任何核苷酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列可以是功能变体。
如本文所用的术语“直向同源物”是指源自共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。直向同源物可以在核苷酸序列和/或氨基酸序列水平共有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性。直向同源基因通常共有相同或相似的功能，即具有保守功能。
在本发明的一些实施方案中，可以提供启动子。用于本发明中的启动子可以选自以下中的一种或多种：组成型启动子、衰老特异性启动子、组织特异性启动子、发育调节型启动子和诱导型启动子。在一个实施方案中，启动子可以是组成型启动子。
组成型启动子在植物发育过程中持续地在整个植物的各个部分中指导基因的表达，尽管所述基因在所有细胞类型中可能不以相同水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与以下相关的那些：花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell JT, Nagy F, Chua NH.(1985).Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter.Nature.313 810-2)、稻肌动蛋白1基因(ZhangW, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity intransgenic rice plants. (Plant Cell 3 1155-65)和玉米泛素1基因(Cornejo MJ,Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE.(1993).Activity of a maizeubiquitin promoter in transgenic rice.Plant Molec.Biol.23 567-81)，其通过引用并入本文。组成型启动子包括香石竹蚀环病毒(CERV)启动子。The sequence of carnationetched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus andretroviruses ((Hull R, Sadler J, Longstaff M 1986 EMBO Journal, 5(2):3083-3090)，其通过引用并入本文。
组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV35S启动子)、来自稻肌动蛋白1基因或玉米泛素1基因的启动子。合适地，启动子是CERV启动子。
或者，在一个实施方案中，启动子可以不是花椰菜花叶病毒(CaMV 35S启动子)。在一个实施方案中，启动子可以是衰老特异性启动子。“衰老特异性启动子”(SAG)可以是与控制衰老相关基因的表达相关的启动子。因此，启动子可以将与其可操作连接的编码序列(即基因)的表达基本上排他地限制于正衰老的组织中。因此，衰老特异性启动子可以是能够以发育调节方式在植物组织中偏好地促进基因表达、使得3’蛋白编码区域的表达基本上仅在植物组织经受衰老时发生的启动子。应理解，衰老倾向于发生在植物的较老部分，诸如较老的叶子，而不是在植物的较年轻部分，诸如种子。
已知表达许多衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥。因此，可以从拟南芥的衰老相关基因分离启动子。通过引用并入本文的Gepstein等人(The Plant Journal,2003, 36, 629-642)使用拟南芥作为模型进行SAG和其启动子的详细研究。基因构建体可以包含来自该文献中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可以选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18或其功能变体或功能片段。
在一个实施方案中，启动子可以是SAG12或SAG13启动子。在一个实施方案中，启动子可以是熟练技术人员已知的SAG12启动子，或其功能变体或功能片段(Gan & Amasino,1997, Plant Physiology, 113: 313-319，其通过引用并入本文)。合适的启动子和其序列可见于WO2010/097623(其通过引用并入本文)。
在另一个实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。组织特异性启动子是指导基因在植物的一个(或几个)部分、通常在这些植物部分的整个寿命期间表达的启动子。组织特异性启动子的种类通常还包括其特异性不是绝对的启动子，即它们也可以在优选组织以外的组织中指导较低水平的表达。许多组织特异性启动子是本领域中已知的并且包括与在马铃薯块茎中表达的马铃薯糖蛋白基因和在小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的那些。这些启动子的任一种可用于本发明中。
合适地，组织特异性启动子可以是叶特异性启动子。合适地，叶特异性启动子可以包括ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1)。
在一个特别优选的实施方案中，所述组织特异性启动子不是根特异性启动子。
在另一个实施方案中，启动子可以是发育调节型启动子。发育调节型启动子在植物发育期间的特定时间指导植物的一个或多个部分中基因表达的改变。基因可以在其他时候以不同的(通常较低的)水平在该植物部分中表达，并且也可以在其他植物部分中表达。
在一个实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子能够响应诱导物而指导基因的表达。在没有诱导物的情况下，基因不会被表达。诱导物可以直接作用于启动子序列，或者可以通过抵消阻抑蛋白分子的作用而起作用。诱导物可以是化学试剂例如代谢物、蛋白、生长调节剂或有毒元素，生理应激例如热、创伤或渗透压，或者病原体或害虫的作用的间接结果。发育调节型启动子可以被描述为对由植物产生的内源诱导物或植物生命周期中特定时间点的环境刺激物起反应的特定类型的诱导型启动子。已知的诱导型启动子的实例包括与以下相关的那些：创伤反应，诸如由Warner SA, Scott R, Draper J.(1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and itscharacterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.)(其通过引用并入本文)所述，如由Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N.,和Chua, N-H. (1989) Regulatedgenes in transgenic plants. Science 244 174-181)(其通过引用并入本文)所公开的温度响应以及化学诱导，如由Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424)(其通过引用并入本文)所述。
因此，在一个实施方案中，启动子可以选自：CERV启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(完全或截短的)、rubisco启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂碱合酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α、β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子和马铃薯糖蛋白启动子。
在一个实施方案中，所述启动子可以是CaMV 35S启动子或具有重复增强子区或双重增强子区的修饰的35S启动子(R. Kay等人 Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302，其通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，所述启动子可以是天然启动子。
如本文所用，“天然启动子”是指对基因内源、即与天然基因可操作连接的启动子。
重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以在克隆过程中用作选择标记，即使得能够选择已经转染或转化的细胞，并且使得能够选择携带并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含参与调节编码序列的表达或用于将表达的多肽靶向至宿主细胞的特定部分(例如，至叶绿体)的DNA。因此，载体可以包含至少一种选自以下的额外元件：选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白靶向序列(例如叶绿体转运肽)。
合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因，诸如赋予对卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II，hyg-B)的抗性的那些；除草剂抗性基因，诸如赋予对基于草丁膦和磺酰胺的除草剂的抗性的那些(分别为bar和suI；EP-A-242246，EP-A-0249637)，其通过引用并入本文；和可筛选的标记，诸如β-葡糖醛酸酶(GB2197653)，其通过引用并入本文、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记基因可以由第二启动子控制，所述第二启动子允许在细胞中表达，其可以在种子中或可以不在种子中，由此允许在植物发育的任何阶段选择含有所述标记的细胞或组织。合适的第二启动子是土壤杆菌的胭脂碱合酶基因的启动子和衍生自编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以使用任何其他合适的第二启动子。
商业上期望的性状
在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的总生物碱含量和/或降低的一种或多种选自烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)、新烟草碱的生物碱的含量和/或降低的烟碱，而至少维持风味特征和/或其他商业上期望的性状。在一个实施方案中，本发明的植物产生具有与未根据本发明修饰的植物相似等级和/或品质的叶。
在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的烟碱含量，而植物的风味特征没有显著变化(例如，与未根据本发明修饰的同一植物相比)。
在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的烟碱含量，而植物的其他商业上期望的性状没有显著变化(例如，降低)(例如，与未根据本发明修饰的同一植物相比)。具体而言，与未根据本发明修饰的同一植物相比，修饰的植物的产率优选不降低。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法和用途涉及降低总生物碱含量和/或减少一种或多种选自烟碱、降烟碱、新烟碱和新烟草碱的生物碱和/或降低烟碱，同时维持风味特征和/或其他商业上期望的性状(例如产率)。
术语“商业上期望的性状”将包括性状诸如产量、成熟植株高度、可收获叶数、平均节长、切叶长度、切叶宽度、品质、非生物(例如干旱)胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物(例如昆虫、细菌或真菌)胁迫耐受性。
如本文所教导的术语“商业上期望的性状”将包括诸以下的性状：抗旱性、抗害虫性、成熟植株高度、可收获叶数、平均节长、切叶长度、切叶宽度和产量的一种或多种性状，其与当在相似的田间条件下生长时在可比较的植物的烟道烤制的亲本中的那些所述性状相当。
除非另有说明，否则本文使用的烟草产量是指调制叶产量，其基于遵循标准农业和调制实践在标准田间条件下每英亩的调制烟叶的重量计算。
在一个方面，本发明的植物(例如，烟草植物)具有当在类似的田间条件下生长时可比较植物的产量的50%至150%、55%至145%、60%至140%、65%至135%、70%至130%、75%至125%、80%至120%、85%至115%、90%至110%、95%至105%, 50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%的产量。
在另一个方面，本发明的植物(例如，烟草植物)产量为当在类似的田间条件下生长时可比较植物的产量的近似1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。
在另一个方面，本发明的烟草植物的产量与当在类似的田间条件下生长时烟道烤制的可比较植物的产量相当。
在一个方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至2700、2100至2600、2200至2500和2300至2400磅/英亩。
在另一个方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500和3100至3500磅/英亩。
在一个进一步方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1200至3400、1200至3300、1200至3200、1200至3100、1200至3000、1200至2900、1200至2800、1200至2700、1200至2600、1200至2500、1200至2400、1200至2300、1200至2200、1200至2100、1200至2000、1200至1900、1200至1800、1200至1700、1200至1600、1200至1500和1200至1400磅/英亩。
植物
根据本发明的合适的植物包括植物的茄科，其包括例如曼陀罗草、茄子、曼德拉草、致命的茄属植物(颠茄)、辣椒(红辣椒、辣椒)、马铃薯和烟草。
在一个实施方案中，茄科的合适属是茄属，例如，番茄。
在一个实施方案中，茄科的合适属是烟草，例如普通烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(Nicotiana rustica)。
烟草的合适物种可以是普通烟草。烟草的物种在本文中可以称为烟草植物，或简称为烟草。
烟草植物
本发明提供了针对植物(例如，烟草植物)的方法、用途以及植物(例如，烟草植物)、植物(例如，烟草植物)和植物繁殖材料。
如本文所用的术语“烟草”是指用于生产烟草产品的烟草属(Nicotiana)的植物。合适的“烟草”植物的非限制性实例包括普通烟草(N. tabacum)和黄花烟草(N. rustica)(例如普通烟草L.、LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。
在一个实施方案中，合适的烟草植物可以是任何普通烟草种质、株系或品种。
在另一个实施方案中，合适的烟草植物可以是非烟草物种。
烟草材料可以来源于或获得自普通烟草类型的多种品种，通常称为白肋烟(Burley)品种、烟道或浅色(flue or bright)品种和深色(dark)品种。在一些实施方案中，烟草材料来源于白肋烟、弗吉尼亚或深色烟草植物。烟草植物可选自白肋烟草、稀有烟草、特种烟草、膨胀烟草等。
本文也考虑烟草栽培种和优质烟草栽培种的使用。用于本文的烟草植物因此可以是烟草品种或优质烟草栽培种。特别有用的普通烟草品种包括烟道烤制的弗吉尼亚类型、白肋烟型和东方类型。
在一些实施方案中，烟草植物可以例如选自以下品种中的一种或多种：L.栽培种T.I. 1068、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、KT D#3 Hybrid 107、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、来自BU21 x Hoja Parado杂交的F4、株系97、KTRDC#2 Hybrid 49、KTRDC#4 Hybrid 1 10、Burley 21、PM016、KTRDC#5 KY 160 SI、KTRDC#7 FCA、KTRDC#6 TN86 SI、PM021、K 149、K 326、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、KY 10、KY 14、KY 160、KY17、KY 8959、KY 9、KY 907、MD 609、McNair 373、NC 2000、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG11、RG 17、RG 8、Speight G-28、TN 86、TN 90、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker319、Coker 347、Criollo Misionero、PM092、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、GalpaoComum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、PM102、Kutsage E1 、KY 14 x L8、KY 171、LA BU 21、McNair 944、NC 2326、NC 71、NC 297、NC 3、PVH 03、PVH 09、PVH 19、PVH21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、PM132、Wislica、Yayaldag、NC4、TR Madole、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、ΤΊ-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、PM204、PM205、Basma、TKF 4028、L8、 TKF 2002、TN 90、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153和Petit Havana。
品种或栽培种的非限制性实例是：BD 64、CC 101 、CC 200、CC 27、CC 301 、CC400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1 、DT 538 LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171 、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291 、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC606、NC 71 、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51 、R610、R 630、R 7-1 1 、R 7-12、RG 17、RG 81 、RG H51 、RGH 4、RGH 51 、RS 1410、Speight168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1 、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、SamsunHolmes NN、KTRDC第2杂交种49、Burley 21 、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01 、PG 04、P01 、P02、P03、RG 1 1 、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1 、Basma Drama B84/31 、Basma IZichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、CriolloMisionero、Delcrest、Djebel 81 、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1 、LA BU 21 、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、RedRussian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、PrilepP23、Prilep PB 156/1 、Prilep P12-2/1 、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文没有具体指出，也可以考虑上述的低转化子亚变种(Lowconverter subvarieties)。
所述烟草植物可以是白肋烟、烟道烤制的弗吉尼亚烟或东方烟。
在一个实施方案中，所述植物繁殖材料可以可获自本发明的植物(例如，烟草植物)。如本文所用的“植物繁殖材料”是指由其可以产生进一步的植物的从植物获取的任何植物物质。合适地，植物繁殖材料可以是种子。合适地，所述植物繁殖材料可以是花粉。
在一个实施方案中，本发明的细胞(例如，烟草细胞)、植物(例如，烟草植物)和/或植物繁殖材料可以包含调节的Nic1 ERF基因的活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达。在另一个实施方案中，细胞(例如，烟草细胞)、植物(例如，烟草植物)和/或植物繁殖材料可以包含根据本发明的构建体或载体。在另一个实施方案中，细胞(例如，烟草细胞)、植物(例如，烟草植物)和/或植物繁殖材料可以通过根据本发明的方法可获得(例如获得)。
合适地，当与未经修饰以调节Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的活性或表达的植物(例如，烟草植物)或其部分相比时，根据本发明的植物(例如，烟草植物)或其部分可以包含调节的Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的活性或表达。
在一个实施方案中，根据本发明的植物(例如，烟草植物)或其部分包含本发明的细胞(例如，烟草细胞)。在另一个实施方案中，植物繁殖材料可以可获自(例如获得自)本发明的植物(例如，烟草植物)。
在一个实施方案中，提供了如前述实施方案中提供的细胞(例如，烟草细胞)用于生产产品(例如，烟草产品)的用途。此外，提供了如本文所述的植物(例如，烟草植物)用于培育植物(例如，烟草植物)的用途。
在另一个实施方案中，本发明还提供了前述实施方案的植物(例如，烟草植物)用于生产产品(例如，烟草产品)的用途。在另一个实施方案中，提供了本发明的植物(例如，烟草植物)用于生长作物的用途。在一个实施方案中，根据本发明的Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的使用导致植物(例如烟草植物)的生物碱含量的调节。
在一个实施方案中，根据本发明的Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的方法或使用可以导致生物碱含量的调节。在另一个实施方案中，Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的使用(例如降低的其活性或表达)可以导致一种或多种生物碱的含量的降低。合适地，新烟草碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)、降烟碱或烟碱中的一种或多种的含量可以降低。合适地，所述烟碱含量被降低。合适地，当Nic1 ERF基因活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达与野生型植物相比降低时，可以观察到这一点。
在另一个实施方案中，Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的方法或使用(例如增加的其活性或表达)可以导致一种或多种生物碱的含量的增加。合适地，新烟草碱、新烟碱、降烟碱或烟碱中的一种或多种的含量可以增加。合适地，所述烟碱含量被降低。合适地，当Nic1 ERF基因活性或表达与野生型植物相比增加时，可以观察到这一点。
在一个实施方案中，合适地，所述植物(例如烟草植物)或其部分，例如叶，或收获的叶或收获的加工的叶或包含所述植物的产品(例如烟草产品)包含本发明的修饰的(例如突变或缺失的)Nic1 ERF基因(或根据本发明的修饰的(例如突变或缺失的)Nic1 ERF基因与修饰的(例如突变或缺失的)Nic2 ERF基因的组合)。
在一个实施方案中，本发明提供了烟草细胞培养物(例如在体外培养中)。所述烟草细胞培养物可以是烟草细胞悬浮培养物。体外培养的这些烟草细胞可以并入烟草产品中，例如作为常规烟草颗粒、碎片、细切或长切烟草薄片的替代品，作为添加剂成分或作为替代品和添加剂两者。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的烟草细胞培养物、例如收获和/或加工的烟草细胞培养物或其提取物用于生产烟草产品的用途。
从体外培养物收获的烟草细胞可以干燥，例如，冷冻干燥，例如以生产粉末。
技术人员将了解用于建立烟草细胞的体外培养物的已知方法。通过实例的方式，可以仅使用以下方法：从目标烟草植物收集种子并对其外部进行灭菌以消除不需要的生物，将所述种子种植以使目标烟草植物生长，从烟草植物移取组织(例如，来自烟草茎)用作外植体，从烟草外植体建立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物建立细胞悬浮培养物，和收获培养物材料(例如包括烟草细胞)以产生烟草细胞培养物。
烟草细胞可以通过各种方法(包括过滤，例如真空过滤)收获。可以通过添加水在过滤器中洗涤样品，并用过滤(例如真空过滤)除去剩余的液体。
收获的烟草细胞培养物可以进一步加工，例如，干燥，诸如晾干和/或冷冻干燥。收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物或其提取物可以掺入根据本发明的烟草产品中。
在一个实施方案中，本发明提供了用于分子农作中的烟草植物或其部分。合适地，根据本发明修饰的植物或其部分可用于制造蛋白诸如治疗剂，例如抗生素、病毒样颗粒、营养药物(neutraceuticals)或小分子。
在一个实施方案中，本发明提供了用于产生蛋白(例如治疗性蛋白)的方法；所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰能够产生所述蛋白(例如治疗性蛋白)的植物或其部分：其中至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 4；或SEQID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 1；或SEQ ID No.3；或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No.21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物；和将所述植物在足以产生所述蛋白(例如治疗性蛋白)的条件下培养。
产品
本发明还提供了可获自或获得自根据本发明的烟草的产品。提供了可获自或获得自烟草植物的产品，在所述烟草植物中，Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF 基因两者的活性或表达已被调节并且其包含调节的生物碱含量。
如本文所用，术语“烟草工业产品”旨在包括可燃吸烟制品，诸如香烟、小雪茄、雪茄、用于烟管或用于手工卷制的香烟的烟草(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草、烟草替代品或其他可吸烟材料)，不可燃气雾剂供应系统，诸如从基质材料释放化合物而不燃烧的加热产品，诸如电子烟，烟草加热产品和从基质材料的组合产生气雾剂的混合系统，例如含有液体或凝胶或固体基质的混合系统，以及在这些气雾剂供应系统内使用的可气雾化的基质材料；和无气雾剂的递送制品，诸如锭剂，口香糖，贴剂，包含适合吸入的粉末的制品和无烟烟草产品，诸如鼻烟(snus)和鼻烟(snuff)，所述无气雾剂递送制品可以递送尼古丁或可以不递送尼古丁。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草植物或其部分制备(例如可以包含根据本发明的烟草植物或其部分)。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草细胞培养物制备。
合适地，所述烟草工业产品可以由从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分制备(例如可以包含从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分)。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草植物的收获的叶制备(例如可以包含根据本发明的烟草植物的收获的叶)。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的加工的烟叶制备(例如可以包含根据本发明的加工的烟叶)。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的调制烟草材料制备(例如可以包含根据本发明的调制烟草材料)。
合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草共混物制备(例如可以包含根据本发明的烟草共混物)。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品是可燃吸烟制品，其选自香烟、小雪茄和雪茄。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品包含可燃吸烟制品的一种或多种组分，诸如过滤器，滤棒，滤棒段，烟草，烟草棒，烟草棒段，溢出物，添加剂释放组分诸如胶囊，线，珠粒，纸诸如成型纸、接装纸或卷烟纸。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品是不可燃气雾剂供应系统。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品包含不可燃气雾剂供应系统的一种或多种组件，诸如加热器和可气雾化的基质。
在一个实施方案中，所述气雾剂供应系统是电子烟，也称为蒸汽电子烟装置。
在一个实施方案中，所述电子烟包含加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基质诸如液体或凝胶、壳体和任选吹嘴。
在一个实施方案中，可气雾化的基质包含在基质容器中。在一个实施方案中，所述基质容器与加热器组合或包含加热器。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品是加热产品，其通过加热、但不燃烧基质材料来释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化的材料，其可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或不含有尼古丁。在一个实施方案中，所述加热产品是烟草加热产品。
在一个实施方案中，所述加热产品是电子装置。
在一个实施方案中，所述烟草加热产品包含加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基质、诸如固体或凝胶材料。
在一个实施方案中，所述加热产品是非电子制品。
在一个实施方案中，所述加热产品包含可气雾化的基质，诸如固体或凝胶材料；和热源，其能够在没有任何电子手段的情况下向可气雾化的基质提供热能，诸如通过燃烧燃烧材料，诸如木炭。
在一个实施方案中，所述加热产品还包含能够过滤通过加热可气雾化基质产生的气雾剂的过滤器。
在一些实施方案中，可气雾化基质材料可以包含蒸气或气雾剂发生剂或保湿剂，诸如甘油、丙二醇、三醋酸甘油酯或二甘醇。
在一个实施方案中，所述烟草工业产品是通过加热、但不燃烧基质材料的组合来产生气雾剂的混合系统。基质材料可以包含例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含尼古丁。在一个实施方案中，混合系统包含液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或不含有尼古丁。在一个实施方案中，混合系统包含液体或凝胶基质和烟草。
在另一个实施方案中，所述产品可以包含本发明的构建体，其调节Nic1 ERF基因活性或表达并降低生物碱含量。
在另一个实施方案中，所述产物可以包含一种或多种本发明的构建体，其调节Nic1 ERF基因活性或表达和Nic2 ERF基因活性或表达两者，其中所述产物具有调节的生物碱含量。
在一个实施方案中，提供了本发明的植物(例如，烟草植物)用于生产叶(例如，烟叶)的用途。合适地，叶(例如，烟叶)可以经受下游应用诸如加工。因此，在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供加工的叶(例如，加工的烟叶)。合适地，烟叶可以经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合。
在另一个实施方案中，叶(例如，烟叶)可以被切割。在一些实施方案中，叶(例如，烟叶)可以在经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合之前或之后被切割。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的植物的收获的叶叶(例如，烟叶)。在一个实施方案中，收获的叶可以获自植物(例如，烟草植物)，所述植物(例如，烟草植物)具有调节的Nic1 ERF基因活性或表达或调节的Nic1 ERF和Nic2 ERF 基因活性或表达两者。合适地，收获的叶具有调节的生物碱含量。在进一步的实施方案中，收获的叶可以可获自(例如获得自)从本发明的繁殖材料繁殖的植物(例如，烟草植物)。在另一个实施方案中，提供了可获自本发明的方法或用途的收获的叶。合适地，收获的叶可以是切割收获的叶。在一些实施方案中，收获的叶可以包含活细胞(例如，活烟草细胞)。在一些实施方案中，收获的叶不包含活细胞(例如，活烟草细胞)。在其他实施方案中，收获的叶可以进行进一步加工。
可以通过同时切割茎秆和收获所有叶来收获一些烟草植物(例如与白肋烟草一样)。其他烟草植物(例如烟道烤制的烟草)可以在诸如灌注的过程中分阶段收获，其中当其成熟时从茎秆移除个别叶。
如本文所用，“引发物(priming)”是指从烟草植物移取叶子。这可以是指移取烟道烤制的植物的成熟或熟的叶子。
还提供了加工的叶(例如，加工的烟叶)。加工的叶(例如，加工的烟叶)可以可获自本发明的植物(例如，烟草植物)。合适地，加工的叶可以可获自根据本发明的任何方法和/或用途获得的植物。在一个实施方案中，加工的叶(例如，加工的烟叶)可获自植物(例如，烟草植物)，所述植物(例如，烟草植物)，优选地当与对照叶相比，即与来自未根据本发明修饰的植物(例如，烟草植物)的叶相比时，具有调节的Nic1 ERF基因或Nic1 ERF和Nic2 ERF 基因两者的活性或表达和调节的生物碱含量。加工的叶(例如，加工的烟叶)可以包括Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF 基因两者的活性或表达的调节和调节的生物碱含量。
在另一个实施方案中，加工的叶(例如，加工的烟叶)可以可获自从根据本发明的植物(例如，烟草植物)繁殖材料繁殖的植物(例如，烟草植物)。本发明的加工的叶(例如，加工的烟叶)通过加工本发明的收获的叶而可获得。
如本文所使用的术语“加工的叶”是指已经历了本领域中叶经受的一个或多个加工步骤的叶。“加工的叶”不包含或实质上不包含活细胞。
如本文所使用的术语“加工的烟叶”是指已经历了本领域中烟草经受的一个或多个加工步骤的烟叶。“加工的烟叶”不包含或实质上不包含活细胞。
术语“活细胞”是指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果一个细胞被认为不是活的，也称为“无活力的”，那么细胞不会显示活细胞的特征。
术语“实质上无活细胞”是指小于约5%的全部细胞是活的。优选地，小于约3%、更优选小于约1%、甚至更优选小于约0.1%的全部细胞是活的。
在一个实施方案中，加工的烟叶可以通过以下一种或多种来加工：调制、发酵和/或巴氏灭菌。合适地，加工的烟叶可以通过调制来加工。烟叶可以通过本领域中已知的任何方法来调制。在一个实施方案中，烟叶可以通过选自以下的调制方法中的一种或多种来调制：晾制、明火烤制、烟道烤制和晒制。合适地，烟叶可以是晾制的。合适地，烟叶可以是烟道烤制的。
通常，晾制通过将烟叶悬挂在充分通风的仓房中并允许干燥来实现。这通常在四到八周的时间内进行。晾制特别适合于白肋烟。
合适地，烟叶可以明火烤制。明火烤制通常通过以下来实现，将烟叶悬挂在大型仓房中，其中取决于工艺和烟草，以持续或间歇性低闷烧(low smoulder)保持硬木火焰，且通常需要三天至十周。
在另一个实施方案中，烟叶可以烟道烤制。烟道烤制可以包括将烟叶串到烟草梗上并将它们从烤架(tier-poles)上悬挂在烤房中。仓房通常具有一个从外部供料的火箱进入的烟道。通常，这产生已经被热烤而不暴露于烟的烟草。通常，温度会在调制过程中缓慢升高，且整个过程大约需要1周。
合适地，烟叶可以被晒制。这种方法通常涉及将未覆盖的烟草暴露在太阳下。
合适地，加工的烟叶可以通过发酵来加工。可以以本领域中已知的任何方式进行发酵。通常，在发酵过程中，将烟叶堆积成覆盖在例如麻袋内的烤烟垛(堆)以保留水分。叶内剩余水分与烟草重量的组合产生使烟草成熟的自然热量。每天监测堆中心的温度。在一些方法中，每周将整个堆打开。然后移动叶以摇动和润湿，并将堆翻转，使得内部叶到外面且底部叶放置于堆的顶部。这确保了整个堆的均匀发酵。叶上的额外水分加上叶本身的实际翻转产生热量，释放烟草的天然氨并减少尼古丁，同时也加深了颜色并改善了烟草的香气。通常，发酵过程持续长达6个月，这取决于烟草的品种、叶上的秆位置、叶的厚度和预期用途。
合适地，加工的烟叶可以通过巴氏灭菌来加工。当烟叶将用于制造无烟烟草产品(最优选鼻烟)时，可以特别优选巴氏灭菌。烟叶巴氏灭菌可以通过本领域中已知的任何方法进行。例如，巴氏灭菌可以如以下中详述进行：J Foulds, L Ramstrom, M Burke, KFagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public healthin Sweden. Tobacco Control (2003) 12:349–359，其教导通过引用并入本文。
在鼻烟生产期间，通常通过其中用蒸汽对烟草热处理24-36小时(达到大约100℃的温度)的过程来进行巴氏灭菌。这产生几乎无菌的产品，并且不希望受到理论的束缚，这样的后果之一被认为是限制进一步的TSNA形成。
在一个实施方案中，巴氏灭菌可以是蒸汽巴氏灭菌。
在一些实施方案中，加工的烟叶可以被切割。加工的烟叶可以在加工之前或之后被切割。合适地，加工的烟叶可以在加工后被切割。
在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获的叶和/或加工的烟叶可用于提取尼古丁。尼古丁的提取可以使用本领域中已知的任何方法来实现。例如，从烟草中提取尼古丁的方法教导于US 2,162,738，其通过引用并入本文。
在一个方面，本发明提供了由根据本发明的烟草植物或其部分制成的调制的烟草材料。
在另一个方面，本发明提供了烟草共混物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分制成的烟草材料。在一个方面，本发明提供了烟草共混物，其包含根据本发明的调制的烟草材料。
合适地，根据本发明的烟草共混物可以包含近似10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似10%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似20%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似30%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似40%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似50%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似60%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似70%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似80%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似90%的来自根据本发明的烟草植物或其部分的烟草。
在一个方面，本发明的烟草共混物产品包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%干重的从根据本发明的烟草植物或其部分调制的烟草。
合适地，调制的烟草材料可以是晾制的。合适地，调制的烟草材料可以是烟道烤制的。合适地，调制的烟草材料可以是晒制的。
根据本发明的烟草产品或吸烟制品可以包含根据本发明的烟草材料(例如，调制的烟草材料)。
在另一个方面，本发明提供了烟草产品。合适地，烟草产品可以是共混的烟草产品。在一个实施方案中，烟草产品可以从本发明的烟草植物或其部分制备。在一个实施方案中，所述烟草产品可以从具有调节的Nic1 ERF基因活性或表达或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因活性或表达两者的烟草植物制备。所述烟草产品可以包括Nic1 ERF基因活性或表达的降低和降低的生物碱含量。合适地，烟草植物或其部分可以从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
如本文在植物(例如，烟草植物)上下文中使用的术语“其部分”是指植物(例如，烟草植物)的部分。优选地，“其部分”是植物(例如，烟草植物)的叶。
在另一个实施方案中，烟草产品可以从本发明的收获的叶制备。在进一步的实施方案中，烟草产品可以从本发明的加工的烟叶制备。合适地，烟草产品可以从通过以下中一种或多种加工的烟叶制备：调制、发酵和/或巴氏灭菌。合适地，烟草产品可以包含切丝烟叶，任选地，其根据前述实施方案加工。
在一个实施方案中，烟草产品可以是吸烟制品。如本文所用，术语“吸烟制品”可包括可点燃抽吸产品，例如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草或烟草替代品。
在另一个实施方案中，烟草产品可以是无烟烟草产品。如本文所用的术语“无烟烟草产品”是指不旨在被点燃抽吸和/或经受燃烧的烟草产品。在一个实施方案中，无烟烟草产品可以包括鼻烟(snus)、鼻烟(snuff)、嚼用烟草等。
在进一步的实施方案中，烟草产品可以是烟草加热装置或混合装置或电子烟等。通常，在加热装置或混合装置中，通过将热量从热源传递到物理上分离的气雾剂形成基质或材料(其可位于热源内部、周围或下游)而产生气雾剂。在吸烟过程中，挥发性化合物通过来自热源的热传递而从气雾剂形成基质释放并且夹带在通过吸烟制品吸入的空气中。当释放的化合物冷却时，它们冷凝形成被使用者吸入的气雾剂。
用于消耗或吸烟烟草加热装置的气雾剂产生物品和装置在本领域中是已知的。它们可以包括例如电加热的气雾剂产生装置，其中通过将热量从气雾剂产生装置的一个或多个电加热元件传递到烟草加热装置的气雾剂形成基质而产生气雾剂。合适地，烟草加热装置可以是气雾剂产生装置。
优选地，烟草加热装置可以是加热但不燃烧装置(heat-not-burn device)。加热但不燃烧装置在本领域中是已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。合适的加热但不燃烧装置的实例可以是WO2013/034459或GB2515502中教导的装置，所述公开通过引用并入本文。
在一个实施方案中，烟草加热装置的气雾剂形成基质可以是根据本发明的烟草产品。
在一个实施方案中，烟草加热装置可以是混合装置。
多核苷酸/多肽/构建体
在本发明的某些实施方案中，可以将调节至少一种Nic1 ERF基因(或至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因两者)的活性或表达的构建体合适地在启动子的方向下转化至植物细胞中。
在本发明的某些实施方案中，可以将降低(即抑制)Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的活性或表达的构建体在启动子的方向下转化至植物细胞中。所述基因构建体可以是基因编辑构建体，或者可以包含RNAi分子，其可以包含小干扰RNA(siRNA)分子或短发夹环(shRNA)分子。
在本发明的某些实施方案中，可以将增加Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的活性或表达的构建体在启动子的方向下转化至植物细胞中，例如，编码内源Nic1 ERF基因的构建体。
可以通过合适的载体例如植物转化载体的方式将构建体引入根据本发明的植物中。植物转化载体可以包含表达盒，所述表达盒在转录方向上5'-3'包含：启动子序列，靶向Nic1 ERF基因(或靶向Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的构建体序列，和任选地3'非翻译终止子序列，所述终止子序列包括用于RNA聚合酶的终止信号和用于聚腺苷酸化酶的聚腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这样的拷贝可以是相同的或如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可以从植物、细菌或病毒基因获得。例如，合适的终止子序列是豌豆rbcS E9终止子序列、来源于根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因的nos终止子序列和来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员将容易地意识到其他合适的终止子序列。
本发明的构建体还可以包含提高启动子强度的基因表达增强机制。这种增强子元件的一个实例是来源于豌豆质体蓝素基因启动子的一部分的增强子元件，并且其是国际专利申请号WO 97/20056(其通过引用并入本文)的主题。例如，合适的增强子元件可以是来源于根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶基因的nos增强子元件和来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。
这些调节区可以与启动子DNA序列来源于相同的基因，或者可以来源于不同的基因，所述基因来自普通烟草(Nicotiana tabacum)或其他生物体，例如来源于茄科(Solanaceae)的植物，或来自亚香树亚科(Cestroideae)。所有调节区都应该能够在待转化组织的细胞中起作用。
启动子DNA序列可以与本发明中使用的目的基因、例如启动子将要指导的基因、例如编码本发明的Nic1 ERF的基因、编码序列来源于相同的基因，或者可以来源于不同的基因，所述基因来自普通烟草(Nicotiana tabacum)或其他生物体，例如来源于茄科(Solanaceae)的植物，或来自亚香树亚科(Cestroideae)。
可以将表达盒整合到基础植物转化载体中，例如pBIN 19 Plus、pBI 101、pKYLX71:35S2、pCAMBIA2300或本领域中已知的其他合适的植物转化载体。除表达盒之外，植物转化载体将含有如转化过程所需的这样的序列。这些序列可包括土壤杆菌vir基因、一个或多个T-DNA边界序列、以及可选择标记物或鉴定转基因植物细胞的其他手段。
术语“植物转化载体”是指能够体内或体外表达的构建体。优选地，表达载体被整合到生物的基因组中。术语“整合的”优选涵盖稳定整合入基因组。
用于转化植物的技术在本领域中是众所周知的，并且包括例如土壤杆菌介导的转化。遗传修饰植物的构建的基本原则是在植物基因组中插入遗传信息，从而获得插入的遗传物质的稳定维持。在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27)(其通过引用并入本文)的文章中可以找到关于一般技术的综述。
通常，在土壤杆菌介导的转化中，通过将土壤杆菌与来自目标植物的外植体共培养，将携带目的外源DNA的双元载体(即Nic1 ERF构建体)从合适的土壤杆菌菌株转移至目标植物中。然后在选择培养基上再生转化的植物组织，所述选择培养基包含可选择标记物和植物生长激素。可选择的方法是花浸法(Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43，其通过引用并入本文)，其中使完整植物的花芽与含有嵌合基因的土壤杆菌菌株的悬浮液接触，并且在种子形成后，使转化的个体萌发并在选择性培养基上通过生长鉴定。通过土壤杆菌直接感染植物组织是简单的技术，其已被广泛采用并且其描述于ButcherD. N. 等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, 编辑:D. S.Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208，其通过引用并入本文。
其他合适的转化方法包括使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、微量注射以及例如使用碳化硅纤维将基因直接转移到原生质体中。使用弹道转化(ballistictransformation)包括碳化硅晶须技术转化植物教导于Frame B R, Drayton P R,Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A& Wang K (1994)，其通过引用并入本文。通过碳化硅晶须介导的转化产生可育的转基因玉米植物教导于The Plant Journal 6:941-948，其通过引用并入本文)并且病毒转化技术教导于例如Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992)，其通过引用并入本文。木薯花叶病毒作为植物的载体系统的用途教导于Gene 110:213-217，其通过引用并入本文。关于植物转化的其他教导可见于EP-A-0449375，其通过引用并入本文。
在进一步的方面，本发明涉及载体系统，其携带构建体并将其引入生物、诸如植物、合适地烟草植物的基因组中。载体系统可以包含一种载体，但它也可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统更详细地描述于Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3,1-19，其通过引用并入本文。
用于转化植物细胞的一种广泛使用的系统使用来自根癌土壤杆菌的Ti质粒或来自发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒An等人, (1986), PlantPhysiol.81, 301-305和Butcher D. N. 等人, (1980), Tissue Culture Methods forPlant Pathologists, 编辑:D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208，其通过引用并入本文。在植物中根据本发明的期望的外源基因的每种引入方法之后，进一步的DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经被深入研究，并描述于EP-A-120516；Hoekema, 于:The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij KantersB. B., Amsterdam, 1985, 第V章；Fraley,等人, Crit.Rev. Plant Sci., 4:1-46；和Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284，其通过引用并入本文。
用调节Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者的活性或表达的构建体转化的植物细胞可以根据众所周知的组织培养方法生长并维持，例如通过在提供有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。
与本发明相关的术语“转基因植物”包括包含根据本发明的调节Nic1 ERF基因(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因两者)的活性或表达的构建体的任何植物。因此，转基因植物是已用根据本发明的构建体转化的植物。优选地，根据本发明，所述转基因植物表现出调节的Nic1 ERF活性或表达(或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因活性或表达两者)和调节的生物碱含量。术语“转基因植物”不涵盖当天然核苷酸编码序列在其天然启动子（所述启动子也在其天然环境中）的控制下时的在其天然环境中的所述天然核苷酸编码序列。
在一个方面，根据本发明的Nic1 ERF基因、构建体、植物转化载体或植物细胞呈分离的形式。术语“分离的”意味着序列至少基本上不含至少一种其他组分，所述序列在自然界中与该组分天然地相关并且如在自然界中发现的那样。
在一个方面，根据本发明的Nic1 ERF基因、构建体、植物转化载体或植物细胞呈纯化的形式。术语“纯化的”意指呈相对纯的状态，例如，至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。
如本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的，并且可以是双链的或单链的，无论代表有义链或反义链。
与本发明相关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选其意指DNA，更优选编码本发明的cDNA序列。
在一个优选实施方案中，核苷酸序列，当涉及本发明本身的范围并由本发明本身的范围涵盖时，即Nic1 ERF基因，当在其自然环境中时和当与其自然相关的序列(也在其自然环境中)相关时，包括天然核苷酸序列。为了易于参考，我们应当将这种优选的实施方案称为“天然核酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指在其天然环境中并且当与整个启动子(其是该序列天然相关的)可操作连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也在其天然环境中。
编码具有特定特性的蛋白作为如本文所定义的Nic1 ERF基因或适用于修饰的蛋白的核苷酸序列可以从产生所述蛋白的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。本领域内众所周知多种用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的方法。通过实例的方式，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列，就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。
在一个又进一步替代方案中，编码ERF转录因子的核苷酸序列可以通过建立的标准方法合成制备，所述方法例如由Beucage S.L. 等人, (1981) Tetrahedron Letters22, p 1859-1869(其通过引用并入本文)描述的亚磷酰胺方法(phosphoroamiditemethod)或由Matthes 等人,(1984) EMBO J. 3, p 801-805(其通过引用并入本文)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接和克隆于适当的载体中。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
本发明还覆盖使用与本文定义的具有特定特性的多肽的氨基酸序列或任何核苷酸序列(即编码这种多肽的ERF基因)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列(以下简称“同源序列”)。在此，术语“同源物”意指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有某一同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应当提供和/或编码保留ERF基因的功能活性和/或增强ERF基因的活性的多肽。通常，同源序列将包含与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等，或者将编码相同的活性位点。尽管同源性也可以在相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)方面来考虑，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表示同源性。同源序列通常保留功能结构域或基序。
在一个实施方案中，同源序列被包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，与主题序列相比，其有一个、两个或几个添加、缺失和/或取代。
同源性或同一性比较可以通过目视进行，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的%同源性。可以在连续序列上计算%同源性或%同一性，即将一个序列与另一序列对齐，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“未加空位的(ungapped)”比对。通常，这种未加空位比对仅在相对少数量的残基上进行。
尽管这是非常简单且一致的方法，但它没有考虑到，例如，在其他方面相同的一对序列中，一个插入或缺失会导致随后的氨基酸残基无法对齐，从而可能导致在进行全局比对时%同源性大大降低。因此，设计大多数序列比较方法以产生最佳比对，其考虑到可能的插入和缺失，而不会过度地惩罚总体同源性评分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尽量将局部同源性最大化来实现的。
然而，这些更为复杂的方法对比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对 - 反映两个比较的序列之间的更高关联性 - 将获得比具有很多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其使空位存在承担相对高的成本并且使空位中每个后续残基承担较小罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生空位更少的优化的比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这些软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，考虑到空位罚分，最大%同源性的计算首先需要产生最佳比对。实施此类比对的合适的计算机程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST程序包(参见 Ausubel 等人 1999 Short Protocols inMolecular Biology, 第四版 - 第18章)、BLAST 2 (参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA (Altschul 等人 1990 J. Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于线下和线上检索(参见Ausubel 等人 1999, 第7-58至7-60页)。
尽管最终的%同源性可以按照同一性来测量，但比对过程本身通常不是基于全或无的对比较。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个成对比较。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵 - BLAST程序套件的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(更多详细信息参见用户手册)。对于某些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。
或者，可以基于与CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1),237-244)类似的算法，使用Vector NTI (Invitrogen Corp.)中的多比对特征来计算百分比同源性。一旦软件已产生最佳比对，就可以计算%同源性，优选%序列同一性。该软件通常将其作为序列比较的一部分来完成并生成数值结果。
如果在确定序列同一性时使用空位罚分，则优选以下参数用于成对比对：
| 对于BLAST | |
| 空位开放 | 0 |
| 空位延伸 | 0 |
| 对于CLUSTAL | DNA | 蛋白 | |
| 字符大小 | 2 | 1 | K三连(K triple) |
| 空位罚分 | 15 | 10 | |
| 空位延伸 | 6.66 | 0.1 |
在一个实施方案中，可以用如上所限定的空位罚分和空位延伸来使用CLUSTAL。在一些实施方案中，用于BLAST或CLUSTAL比对的空位罚分可以不同于以上详述的那些。技术人员将会理解，用于执行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可以定期改变，并且将能够基于当时针对BLAST或CLUSTAL比对算法详述的标准参数来选择适当的参数。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少70个连续核苷酸上、优选在至少80个连续核苷酸上、优选在至少90个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上、优选在至少150个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少250个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少350个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少450个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少550个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少650个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上测定。
合适地，可以在整个序列上测定关于核苷酸、cDNA、cds或氨基酸序列的同一性程度。
序列还可以具有产生沉默改变并导致功能等同物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要物质的二级结合活性得到保留，就可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且有具有相似亲水性值的不带电荷极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如根据下表可以进行保守取代。第二列中同一区块中和优选第三列中同一行中的氨基酸可以彼此取代：
本发明还包括可能以即同类(like-for-like)取代(诸如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等)发生的同源取代(取代和替换两者在本文用于表示现有氨基酸残基与可选残基的交换)。非同源取代也可以发生，即从一类残基到另一类残基，或可替代地涉及包括非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
替换还可以通过非天然氨基酸进行，包括：α*和α双取代的* 氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物诸如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物诸如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)＃、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe (4-苄基)*。符号*已用于上述讨论(涉及同源或非同源取代)的目的，以表明衍生物的疏水性质，而＃已被用于指示衍生物的亲水性质，＃*表示两亲性特征。
变体氨基酸序列可以包括除了氨基酸间隔子例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间的合适的间隔基团，包括烷基例如甲基、乙基或丙基基团。变化的其他形式涉及存在以类肽形式的一个或多个氨基酸残基，其将被本领域技术人员完全理解。为避免疑问，使用“类肽形式”来指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而不是α-碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域中已知的，例如SimonRJ 等人, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371和Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995)13(4), 132-134。
用于本发明中的核苷酸序列可以包括在其中的合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是领域中已知的。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明的目的，应理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法修饰本文描述的核苷酸序列。可以实施此类修饰以增强本发明的核苷酸序列的体内活性和寿命。
本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列、或能够与本发明的序列或与其互补的序列杂交的序列。本文所用术语“杂交”应包括“经其核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还涉及可与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文呈现的那些序列的互补序列)。优选地，杂交在严格条件下(例如50℃和0.2xSSC {1xSSC = 0.15 MNaCl、0.015 M 柠檬酸三钠 pH 7.0})测定。更优选地，杂交在高严格条件下(例如65℃和0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M 柠檬酸三钠 pH 7.0})测定。
在一个方面，用于本发明中的序列是合成序列-即通过体外化学或酶促合成制备的序列。其包括但不限于用针对宿主生物体的最佳密码子使用制成的序列。
术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。在一个实施方案中，本发明的载体表达如本文所述的Nic1 ERF基因。在一个实施方案中，本发明的载体进一步表达如本文所述的Nic2 ERF基因。优选地，表达载体被并入合适宿主生物体的基因组中。术语“并入”优选地涵盖稳定并入基因组中。
用于本发明中的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接至能够提供由合适宿主生物体表达核苷酸序列的调节序列。用于本发明中的构建体可以转化至本文描述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。载体的选择例如质粒、粘粒或噬菌体载体经常取决于待引入载体的宿主细胞。载体可以体外使用，例如，用于产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
在一些应用中，用于本发明中的核苷酸序列可操作连接至能够提供核苷酸序列的表达(诸如通过选择的宿主细胞)的调节序列。通过实例的方式，本发明涵盖包含可操作连接至这种调节序列的如本文所述的Nic1 ERF基因的核苷酸序列的载体，即，所述载体为表达载体。合适地，所述载体可以另外包含如本文所述的Nic2 ERF基因的核苷酸序列，其可操作连接至调节序列。
术语“可操作连接”是指这样的并置(juxtaposition)，其中所述的组分处于允许它们以其预期的方式发挥功能的关系中。“可操作连接”至编码序列的调节序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。术语“启动子”以本领域的通常意义使用，例如，RNA聚合酶结合位点。编码Nic1 ERF基因或Nic1 ERF基因和Nic2 ERF基因的构建体内的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作连接。
术语“构建体”-其与术语诸如“盒”或“载体”同义-包括用于根据本发明使用的核苷酸序列，其直接或间接附接至启动子。
间接附接的实例是在本发明的启动子和核苷酸序列中间提供合适的间隔基诸如内含子序列，诸如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合”也是如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，所述术语不涵盖通常与野生型基因启动子相关的编码蛋白的核苷酸序列的天然组合(并且当它们均在其自然环境中时)。所述构建体甚至可以含有或表达允许选择基因构建体的标记。
可以在Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)(其通过引用并入本文)的文献中找到用于转化植物的一般技术的综述。关于植物转化的进一步教导可见于EP-A-0449375(其通过引用并入本文)中。
在一个实施方案中，本文提供了用于对植物(例如烟草植物)中的Nic1基因座进行基因分型的SNP。
在一个实施方案中，本文提供了用于对植物(例如烟草植物)中的Nic1基因座进行基因分型的标记。在一个实施方案中，本文提供了用于对植物(例如烟草植物)中的Nic1基因座进行基因分型的引物对。在一个实施方案中，用于堆烟草植物中的Nic1基因座进行基因分型的引物提供于表4中。
在一个实施方案中，本文提供了用于对植物(例如烟草植物)中的Nic2基因座进行基因分型的标记。在一个实施方案中，本文提供了用于对植物(例如烟草植物)中的Nic2基因座进行基因分型的引物对。在一个实施方案中，用于堆烟草植物中的Nic2基因座进行基因分型的引物提供于表5和6中。
如本文所用，“SNP”或“单核苷酸多态性”意指当基因组序列中的单一核苷酸(A、T、C或G)相对于参考序列改变或可变时发生的序列变异。当将SNP作图至基因组上的位点时，存在“SNP标记”。
如本文所用，“标记”或“SNP标记”意指足够独特以表征基因组上的特定基因座的核酸或氨基酸序列。如果多态性性状是差异遗传的并且表现出与目标表型性状的连锁不平衡，则其可以用作标记。当将性状被称为与给定标记连锁时，应理解其序列影响该性状的实际DNA区段通常与该标记共分离。
在一个实施方案中，表4中标识的任何SNP可用于对植物(例如烟草植物)进行基因分型以鉴定Nic1基因座的存在、不存在或修饰的方法中。在一个实施方案中，表4中标识的任何引物对可用于对植物(例如烟草植物)进行基因分型以鉴定Nic1基因座的存在或不存在的方法中。
在一个实施方案中，表5或表6中标识的任何SNP用于对植物(例如烟草植物)进行基因分型以鉴定Nic2基因座的存在或不存在的方法中。在一个实施方案中，表4或表7中标识的任何引物对可用于对植物(例如烟草植物)进行基因分型以鉴定Nic1基因座的存在或不存在的方法中。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton, 等人, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)和Hale &Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)为技术人员提供了本公开中所用的众多术语的一般字典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数值范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则分别地，任何核酸序列均以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制，其可作为整体参考说明书而具有。因此，下文直接定义的术语通过参考说明书整体更全面地定义。
氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文所用，术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
在本公开和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码如按照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(IUPACIUB Joint Commissionon Biochemical Nomenclature, JCBN)所定义。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可以在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施例之前，应理解的是，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解本文所用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的，这是由于本公开的范围仅由所附的权利要求书来限定。
在提供数值范围的情况下，应该理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个介于中间的值至下限单位的十分之一也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或介于中间的值与该规定范围内的任何其他规定值或介于中间的值之间的每个较小范围包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每一范围也包括在本公开中，服从于规定范围中任何具体排除的限值。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“酶”或“硝酸还原酶”包括多种本领域技术人员已知的此类候选试剂及其等同物等等。
优点
令人惊讶地发现，通过如本文所教导调节Nic1 ERF基因的活性或表达，可以调节植物的生物碱含量和/或TSNA含量。由此，可以生产具有调节的生物碱和/或TSNA含量和烟草产品的消费者追求的商业上期望的性状的烟草产品。
本发明人已令人惊讶地确定通过调节Nic1 ERF基因的活性或表达来调节烟草植物的生物碱含量、例如烟碱含量和/或TSNA含量的方法。可以通过抑制Nic1 ERF基因的活性或表达来减少烟草植物的烟碱含量或TSNA。在本发明之前，还不知道如本文所述的Nic1 ERF基因的活性或表达的调节可用于调节生物碱和/或TSNA含量。
本发明人已经确定Nic1 ERF基因的调节可以将修饰植物的生物碱含量降低至令人惊讶的低水平。
● 如本文所表明，在野生型背景中的ERF199的单一敲除突变导致生物碱含量的降低大于LI (aaBB)中的nic1突变。
与HA(高生物碱，AABB)株系相比，LI(低中等，aaBB)株系通常产生约一半的生物碱含量。然而，在实施例13中，产生与LI株系等效的EMS株系。产生在Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)中具有突变的EMS株系。这些突变型EMS株系产生与HA株系相比约三分之一的生物碱含量 - 远低于对于LI株系所预期。
● 如本文所表明，在HI背景(AAbb)中，ERF199中的敲除突变给出比LA白肋烟21(aabb)令人惊讶地低得多的生物碱含量。
通过HI株系(AAbb)的基因编辑敲除Nic1 ERF Nitab4.5_0003090g0030.1(ERF199)，敲除株系的生物碱含量远低于等效LA株系(aabb)的生物碱含量(参见实施例)。这些数据令人惊讶地表明，调节单独的Nic1 ERF基因(例如Nitab4.5_0003090g0030.1或ERF199)的活性或表达(例如敲低或敲除活性或表达)足以调节(例如降低)植物或其部分的生物碱含量。
● 当HI (AAbb)中的nic2突变与ERF199突变组合时，生物碱的减少远大于它们的组合累加效应，其表明异位显性。
提供本文讨论的出版物仅用于其在本申请的申请日之前的公开内容。本文中任何内容都不应被解释为承认此类出版物构成了本文所附权利要求书的现有技术。
实施例
实施例1：白肋烟21的近等基因株系的生物碱分析
本发明人试图鉴定负责植物中的生物碱含量改变的Nic1基因。使白肋烟21 (B21)的四个NIL –正常/高生物碱B21(HA-B21)、高中等生物碱B21(HI-B21)、低中等生物碱B21(LI-B21)和低生物碱B21(LA-B21)(下文称为HA、HI、LI和LA)在温室中在6.5英寸深x 6.5英寸直径的盆(具有5个排水孔)中的PRO-MIX土壤中生长，直至它们为两个月龄，并收集根样品用于RNA-seq分析。三个不同的F2分离群体独立地源自HA (AABB) x LI (aaBB)、HA (AABB) xLA (aabb)和HI (AAbb) x LA (aabb)的杂交物。使来自HA x LA和HA x LI的杂交物的各自的200个F2个体在田间生长，并在三个月龄时对于所有株系测量生物碱水平。使600个HI xLA的F2在田间生长，直至它们为三个月龄，并如上测定生物碱含量。
结果 – 源自HA (AABB) x LI (aaBB)和HA (AABB) x LA (aabb)的杂交物的F2的 表型分析
发现源自HA x LI和HA x LA的杂交物的F2植物的总生物碱水平是连续的(图1，小图A显示亲本株系和源自HA x LI的杂交物的F2的总生物碱水平。小图B显示亲本株系和源自HAx LA的杂交物的F2的烟碱水平(B))，因此不能基于表型值明确推断两个群体的Nic1的基因型。在来自HA x LI的F2群体中尤其如此，其中亲本株系的表型值的范围重叠(图1A)。为了定位至Nic1基因座，我们分别从HA x LI和HA x LA的群体选择最低的20株和24株F2株系，以及最高的24株和20株F2株系。具有最低或最高生物碱水平的F2植物(总共88个)将能够被基因分型为纯合隐性(aa)或显性(AA)。
实施例2：标记开发和连锁分析
为了确定负责生物碱含量改变的候选基因，选择来自实施例1的具有来自HA x LA和HAx LI的F2群体的最极高或低生物碱水平的44株F2，用于用定制烟草30K Infinium iSelectHD BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA)进行SNP基因分型，作为其各自的亲本。使用GenomeStudio版本2011.1 (Illumina Inc., San Diego, CA)生成SNP簇，并将鉴定的所有多态性标记用于进一步分析。使用软件Joinmap版本3.0 (Stam, 1993)使用回归作图功能(以默认设置)构建两个群体的遗传连锁图。为了粗略作图Nic1和Nic2基因座，使用MapQTL版本6.0 (Van Ooijen, 2009，通过引用并入本文)用选择的选择性基因分型选项和1cM步长对两个群体实施间隔作图。
通过对各自的基因型进行测序并针对HA的序列进行比较，可以验证从RNA序列或通过使用定制的330K Infinium iSelect HD BeadChip对两个上述群体鉴定的SNP。将所有证实的SNP转化为CAPS或dCAPS标记(Neff等人, 2002，通过引用并入本文)，并用于生成HIx LA F2群体的图谱。使用如上的设置，使用Joinmap构建该群体的遗传图谱。使用CTAB方法从所有株系的叶样品提取用于基因分型的DNA (Doyle, J. J.和J. L. Doyle. 1987. Arapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin 19: 11-15，通过引用并入本文)。
RNA分离和RNA测序
根据制造商的手册，使用QIAGEN Plant Rneasy小型试剂盒(QIAGEN)分离总RNA，并用DNase I处理以除去残余的DNA污染。用BioAnalyzer 2100 (Agilent Genomics)评价RNA样品的数量和质量。使用Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina)构建RNA-seq文库。所有文库均在Illumina Hiseq Rapid Mode 150-Cycle平台上测序。使用IlluminaHiSeq控制软件和CASAVA流水线软件进行碱基调用和样品去多重化。
RNA-seq数据分析和SNP调用
使用标准Illumina软件进行样品分离和衔接子/条形码修整，并用FastQC检查修整读取值的质量。两个参考转录组用于RNA测序的数据挖掘。一个含有239种ERF基因，其通过Rushton等人(2008 通过引用并入本文)注释。另一个在TN 90草图基因组中通过基因预测生成(Sierro等人, 2014，通过引用并入本文)。使用称为Bowtie2 v2.1.0的TopHat v2.0.9用通用特征格式文件(GFF)将RNA-seq读取值与烟草参考转录组进行比对(Langmead和Salzberg, 2012，通过引用并入本文)。使用基因组分析工具包统一基因型分析仪(GATK；版本2.8-1-g932cd3a)来调用四种登录的SNP，产生多样品变体调用格式(VCF)文件(McKenna等人，2010，通过引用并入本文)。随后，使用VCF过滤器除去具有小于20的质量的变体调用。
物理作图和候选基因鉴定
将发现与Nic1或Nic2基因座密切遗传连锁的SNP标记针对烟草的高密度共有基因图谱进行比对(普通烟草30k Infinium HD共有图谱2015;
，通过引用并入本文)。Nic1和Nic2基因座周围的目标区域内能够独特地锚定至改进的烟草基因组装配体的标记(Edwards等人, 2017，通过引用并入本文)用于鉴定对向两个区域的BioNano杂交支架(即伪染色体区域)。随后通过在Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)版本2.2.24+ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中使用具有默认设置的megablast选项鉴定含有与在来自Edwards等人(同上2017)基因组的两个目标区域中的基因模型的序列(编码区域)相同的匹配的来自烟草品种TN 90(Sierro等人，2014，通过引用并入本文)的等效超级支架来填充序列中的空位。然后在TN 90超级支架上实施相互BLAST比较，以进一步鉴定无法作图至BioNano超级支架的两个区域中的Edwards等人 (同上2017)基因组支架。仅在大多数Edwards等人(2017)支架不能被作图至TN 90超级支架的情况下，其被包括在列表中。能够独特地作图至基因组支架、但在BioNano杂交支架上不存在的标记也用于基于其在共有的HA x LA或HA x LI基因图谱中的相对位置将对应的支架置于两个目标区域内。然后将两个更新区域中的基因模型候选物针对RNA-seq数据(Edwards等人, 同上 2017)进行比较，并在必要时进行修改。
为了将该研究中鉴定的区域与Adams等人(2016，通过引用并入本文)的区域进行比较，如上所述使用来自Adams等人(同上，2016)的基因组序列针对Edwards等人(同上2017)基因组实施BLAST分析。在至少1 kb上显示最少99%同一性的序列命中被视为匹配的证据。
结果
源自HA x LA和HA x LI的选择的F2的iSelect HD BeadChip基因分型
使用定制的30K Infinium iSelect HD BeadChip，我们在HAxLI和HAxLA群体两者中鉴定几个其他未连接的组(数据未显示)，表明多于Nic1和Nic2区域在HA和LA之间分离。这将表明仅从两个亲本之间多态性的标记的作图不可能找到Nic1区域。使用MapQTL中的选择性基因分型方法的QTL分析鉴定含有对于HAxLI和HAxLA F2群体两者共有的许多标记的连锁组，其与总生物碱含量显著相关(最大LOD评分分别为31.13和26.95)，解释分别该性状中的51.2%和46.2%变异。这些标记与普通烟草30k Infinium HD共有图谱2015的连锁群7(Edwards等人(同上2017)基因组的假染色体7)上的标记共定位。
图2显示来自HA x LI和HA x LA的杂交物的选择的F2个体的遗传图谱与普通烟草30k Infinium HD共有图谱2015的比较。 虚线表明在F2图谱和共有图谱之间鉴定的标记，点虚线表明两个F2图谱之间鉴定的标记。粗体字表明多于一个图谱共有的标记。仅在HA xLA或HA x LI图谱中鉴定的标记显示于共有图谱中，其他标记位置显示为水平黑线。
除了该群以外，还鉴定另一群，其与HA x LA F2群体中的总生物碱含量具有显著关联(14.01的最大LOD评分)，但仅将该性状的约一半的变异解释为连锁群7上的标记(解释最大27.6%方差)。该群还含有Nic2的显性基因特异性标记(Qin等人，2015；图2上标记为NIC2)。来自该群的标记与共有图谱的连锁群19(Edwards等人(2017)基因组的伪染色体19)上的标记共定位，这与提出的Nic2基因座的基因组区域一致(Kajikawa等人，2017)。
基于RNA-测序的ERF基因的SNP鉴定
用烟草基因组对转录因子的注释揭示烟草基因组中的239种ERF基因(Rushton等人，2008，通过引用并入本文)。基于HA、HI、LI和LA的RNA-seq分析的SNP鉴定揭示ERF110 (Nitab4.5_0006382g0040.1；表1)中的一个SNP。用限制性酶BstZ17I辅助，ERF110中的SNP被转化为CAPS标记，命名为SNP4(表7)。与源自HA x LI和HA x LA的杂交物的选择的88个F2个体的连锁分析表明SNP4与Nic1基因座连锁，从44个F2检测到6个重组体，其具有最低的生物碱水平(图3)。
此外，SNP4与30K Infinium iSelect HD BeadChip标记的连锁分析表明，其与连锁群7上与两个群体中的总生物碱含量显著相关的标记紧密连锁(图2)。然而，由于不能如前所述从其表型数据准确确定单独F2植物的基因型，因此观察到的重组可能是由于错误表型分型。因此，需要更适合于Nic1基因座作图的分离群体。
实施例3：B21的NIL的表型的比较
然后针对B21的每个NIL选择30株植物以测量其生物碱含量(图4)。可以容易地在表型上平均地确定不同株系的总生物碱或烟碱水平。然而，基于单一植物的鉴定并不一致，因为不同株系(诸如LI和HI，LI和HA以及HI和HA)的单独植物之间存在相当大的表型重叠(图4)。
甚至在同一株系内，总生物碱或烟碱水平在单独植物之间可能差异很大，除了LA株系。因此，我们生成源自HI和LA之间的杂交物的F2群体，并实施该群体的总生物碱分析(图5)。
实施例4：用SNP4 CAPS标记对600个HI x LA的F2进行基因分型
基于来自HA x LI和HA x LA群体的基因分型的结果，我们决定测试SNP4 CAPS标记在较大群体中的诊断能力。
用SNP4对600株源自HI x LA的F2植物的基因分型揭示，AA:Aa:aa的150:289:161的分离比，其符合预期的1:2:1 (χ2 = 1.21，df = 2，P = 0.55)。我们选择150株预测的纯合显性(AA)和161株预测的纯合隐性(aa) F2植物用于生物碱分析。两个F2组是离散的，其中没有重叠。所有具有预测的aa基因型的个体具有低生物碱水平(0.17-0.41%)，在LA亲本的范围内(0.18-0.38%)(图5)。
类似地，预测的AA植物的生物碱水平是高的，而且其中无一落入LA亲本的范围内。然而，观察到预测的AA植物中的一些在HI亲本的范围外。为了证实基因分型为AA、但含有最低烟碱含量的植物中的Nic1基因型(通过图5中的箭头指示)，我们检查该个体的下一代中的基因型和生物碱表型的分离。当用SNP4标记测定时，所有F3株系都保留预测的AA基因型。
40株源自该株系的F3的化学分析揭示，所有植物均含有与HI相当水平的生物碱(图6)，并且没有植物落入LA生物碱水平的范围内，证实选择的F2是纯合的且我们开发的SNP标记与Nic1基因座共分离的假设。
实施例5：HI x LA的F2群体中的Nic1的遗传作图
我们实施四个B21 NIL的DNA测序，以证实已使用30K Infinium iSelect HD BeadChip被鉴定为与Nic1基因座密切连锁的序列多态性(图3)。这些SNP中的六个能够转化为基于PCR的CAPS或dCAPS标记(表4显示基于Nic1区域的定制的30K Infinium iSelect HDBeadChip分析鉴定的SNP和转化的标记)。为了鉴定用于Nic1基因座的遗传作图的更多标记，我们使用公开的TN 90基因组参考序列(Sierro等人，2014，通过引用并入)基于RNA-测序进行SNP鉴定。在对于Nic1分离的B21的NIL之间检测到另外六个SNP，其全部转化为CAPS或dCAPS标记(表7)。我们还从先前的研究生成两个SNP的CAPS标记，所述先前的研究分析潜在的Nic1缺失区域，在图7和表7上标记为SNP13和SNP14 [分别为Adams等人(2016，通过引用并入本文)中的SEQ.ID 133和136]。另外，我们利用用于表征同一出版物中的500kb缺失的引物[Adams等人(2016)中注释为SEQ.ID 3和4]，以开发该缺失区域的显性标记(在图7上标记为INDEL1)。通过使用161株源自HI x LA的隐性F2植物(aa)，用表4和表7中的标记进行Nic1基因座的遗传作图(图7)。如从遗传图谱可见，与SNP4共分离的Nic1基因座侧接SNP3和SNP5(图7)，并且在遗传上不同于Adams等人(2016，通过引用并入本文)鉴定的区域。
实施例6：HA x LA的F2群体中的Nic2的遗传作图
为了在Nic2周围的区域中开发基于PCR的标记，我们基于HA x LA F2群体对发现与该基因座连锁的SNP芯片标记实施上述测序。这些SNP中的六个能够转化为基于PCR的CAPS或dCAPS标记(表5)。
根据Nic1基因座，我们利用RNA-seq来鉴定更多与Nic2基因座连锁的SNP。鉴定能够转化为dCAPS标记的另外三个SNP(表6)。通过使用188株HA x LA的F2，用表5和表6上的标记进行Nic2基因座的遗传作图(图8)。如从遗传图谱可见，Nic2基因座(通过来自Qin等人(2015)的NIC1标记定义)与SNP17和18共分离(图8)。
实施例7：基于Edwards等人(2017)基因组序列的Nic1和Nic2的物理定位
使用从普通烟草30k Infinium HD共有图谱2015与HA x LI和HA x LA F2遗传图谱的比较鉴定为密切连锁的标记，我们鉴定了涵盖由标记Nt1AB6591和Nt1AA9777对向的Nic1基因座的融合基因组区域。利用Edwards等人(2017，通过引用并入本文)的BioNano杂合组装物，我们能够鉴定作图至覆盖大多数该区域的假染色体的支架(参见图82，表8中的“证据”列)。对来自Sierro等人(2014，通过引用并入本文)基因组组装物的TN 90超级支架的相互BLAST分析能够进一步鉴定该区域中的Edwards等人(2017)支架以填充序列组装物中的潜在空位(参见图82，表8中的“TN 90超级支架”列)。最后，不能基于上述方法中的任一种整合、但能够独特地作图至Edwards等人(2017)基因组中的支架的标记，基于其在共有的、HAx LA或HA x LI遗传图谱上的位置进行整合(图82)。在支架的位置的证据相互矛盾的情况下，使用BioNano杂交组装物中的支架的位置。
为了对Nic1区域进行精细定位，我们利用源自HI x LA的F2群体的遗传图谱(图7)。将从30K Infinium iSelect HD BeadChip和RNA-seq两者生成的SNP标记(表4和5)作图至上面鉴定的标记对向的融合基因组区域。根据上述共有、HA x LA和HA x LI遗传图谱，将含有该区域内的新SNP标记的支架添加至融合基因组区域。基于在HI x LA F2群体中鉴定的重组体(图7)，我们将我们的目标区域限制至以支架Nitab4.5_0003553和Nitab4.5_0007027为边界的融合基因组区域(图82)。该区域特别地含有被注释为ERF转录因子的九个基因的簇(表8)。然后，我们利用Edwards等人(2017，通过引用并入本文)的RNA-seq信息，以便改善表8中该鉴定区域内的基因的基因模型；序列ID显示于表1中。
然后，我们将鉴定的Nic1区域与由Adams等人(2016，通过引用并入本文)鉴定的LI株系中缺失的支架[SEQ.ID 85]进行比较。这通过该序列与Edwards等人(2017，通过引用并入本文)基因组支架的BLAST分析来进行。与遗传作图结果一致(图7)，先前由Adams等人(2016)鉴定的区域位于我们鉴定的Nic1区域上游的物理区域中(参见图82)。
为了更好地表征Nic2区域，我们对由标记Nt1AA9370和Nt1AC6499对向的基因组区域实施与上述相同的分析(图2)。该区域进一步由Nic2的精细作图中使用的标记SNP15和SNP18/19界定(图8)。该区域中的基因的评估表明，其含有9个基因的簇，所述基因被注释为ERF转录因子(表9)，包括先前鉴定的许多基因(Shoji等人, 2010; Kajikawa等人, 2017)。我们利用来自Edwards等人(2017)的RNA-seq信息，以便改进该鉴定区域内的ERF基因的基因模型(表9；序列ID显示于表2)。根据Nic1区域，还通过BLAST分析将该区域与Adams等人(2016，通过引用并入本文)鉴定的序列[Adams等人.(2016)中的SEQ.ID 2]进行比较。该比较的结果表明，Nic2的Adams等人(2016，通过引用并入本文)序列与我们的Nic2的基因组区域一致(参见图83)，与先前的结果(Shoji等人，2010，通过引用并入本文和Kajikawa等人，2017，通过引用并入本文))一致。
实施例8：目标Nic1/Nic2区域中的基因的生物信息学分析
考虑到两个目标区域中的ERF转录因子的簇的发生率，我们对于它们是否可以代表同源基因(即祖先基因组N. sylvestris和N. tomentosiformis的等效基因)感兴趣。针对Edwards等人(2017，通过引用并入本文)基因组的每个ERF基因的当前基因模型的编码序列的BLAST分析(使用具有默认设置的blastn选项)表明，对于许多基因，最高的相似性命中物是在等效相互位置中的ERF(表10)。这表明两个区域中的许多ERF代表同源基因。
为了扩展由表8和表9中的支架界定的两个目标区域的分析，我们对整个区域是否可以代表同源染色体区段感兴趣。假定的Nic1和Nic2区域中的支架的检查表明，它们分别主要是N. sylvestris或N. tomentosiformis来源的(数据未显示)，支持它们来自同源染色体的假设。
两个目标区域中的每个基因的BLAST分析(如上所述)表明，对于大量基因的最佳命中物在相互区域中。另外，两个区域的基因的顺序很大程度上不变，表明自普通烟草形成以来，在这两个区域中已发生非常少的基因组重排。基于鉴定的两个基因组区域之间的同源基因的存在，我们集中于被注释为Nic1区域中的ERF转录因子的基因用于进一步分析。
实施例9：载体构建
为了生成用于Nic1候选基因的过表达载体，将蛋白编码区的cDNA片段扩增，并通过gateway克隆技术(Chakrabarty等人，2007 Bacterial Artificial Chromosomes，通过引用并入本文)插入pSITE-4NB载体。用于扩增Nic1候选物的编码序列的具有gateway重组序列的引物列于表11中。Attb是指gateway重组序列。
为了构建在其天然启动子的控制下的Nic1候选基因的载体，用附接有HindIII识别位点的衔接子的引物(表12)扩增包括编码区、启动子和3’-UTR的基因组序列。与线性化载体的末端同源的16个碱基用小写字母表示，而大写字母表明烟草基因序列。用HindIII消化后，通过输注克隆将扩增的产物克隆至载体pCAMBIA1305.1中(Zhu等人，2007，通过引用并入本文)。
实施例10：细菌人工染色体(BAC)测序
全基因组概况分析(WGP)序列标签与Edwards等人(2017)基因组支架进行比对，以鉴定细菌人工染色体(BAC)，其与SNP标记对向的目标Nic1区域内的支架一致匹配，以进一步用支架组装物辅助。使用QIAGEN质粒Midi试剂盒根据制造商的说明(QIAGEN)从BAC克隆提取DNA，线性化，并使用Oxford Nanopore MinION装置根据制造商的说明(Oxford NanoporeTechnologies)进行测序，以便提供长读取值以作图。Illumina配对的末端序列读取值提供BAC克隆的准确的短读取值。将鉴定为位于Nic1区域内的烟草基因组支架重新作图至重叠BAC克隆的组合的Oxford Nanopore/Illumina序列读取值，以创建连续序列。根据Edwards等人(2017)，对于改进的Nic1区域开发基因模型。
实施例11：通过毛状根转化过表达Nic1 ERF
材料和方法
候选Nic1 ERF基因通过毛状根转化在烟草植物中过表达。从品红色盒子生长用于毛状根转化的烟草植物，并将叶切成0.5 cm x 0.5 cm的片。携带二元载体的发根农杆菌菌株Aqua1用于感染叶片。在含有150 mg/L硫酸卡那霉素和250 mg/L替卡西林的固化的Murashige和Skoog培养基上进行消毒和耐药性选择。使用共聚焦显微镜用红色荧光报告子区分转基因根。通过每两周在10 ml液体Gamborg B5培养基中在黑暗中以80 rpm恒定摇动下进行亚培养来维持选择的根系。
烟草转化
通过根癌农杆菌介导的转化生成稳定的转基因植物(Schardl等人，1987 Gene，第61卷，第1期，1987，第1-11页，其通过引用并入本文)。农杆菌菌株GV3101用于感染无菌叶盘。将用于烟草转化的生长室编程为在23℃下在光照下16h，且在20℃下在黑暗下8h。简而言之，从品红色盒子中生长的植物切下烟叶，并切成0.4cm叶盘。将叶盘在含有靶标质粒的根癌农杆菌的悬浮液(OD600 = 0.3-1)中孵育30分钟。在MS培养基中共培养三天后，将叶盘转移至TOM培养基中用于再生或选择(含有20 g蔗糖/L；1 mg/L IAA、2.5 mg/L BAP的MS培养基)。替卡西林(250 mg/L)用于杀死过量农杆菌。用于pSITE-4NB构建体的硫酸卡那霉素(300mg/L)或用于pCAMBIA1305.1和基因编辑构建体的潮霉素B(40 mg/L)分别用作转化选择。从叶盘除去再生的嫩枝，并转移至含有替卡西林(250 mg/L)的MS培养基中用于生根。3或4个嫩枝(至少2厘米)发育后，将小植株转移至土壤中。
结果
我们使用毛状根转化来评估Nic1 ERF的基因功能。化学分析揭示，所有构建体都增加LA毛状根中的生物碱水平(图9)。然而，我们未能收获Nitab4.5_0004620g0090.3的毛状根。用该基因转化的毛状根在亚培养期间逐渐变黑，并且无法存活，尽管它们最初发育正常。在这些毛状根中的烟碱酸的高水平可能触发致命作用，这需要进一步研究。基于毛状根转化，Nic1基因座上的至少六个ERF能够以不同的作用调节生物碱生物合成：
Nitab4.5_0003090g0030.1(ERF199)；Nitab4.5_0003665g0040.1 (JRE5L2)；Nitab4.5_0004620g0010.1 (ERF210)；Nitab4.5_0004620g0030.1 (ERF91)；Nitab4.5_0004620g0080.1 (ERF29)和Nitab4.5_0004620g0095.1 (ERF16)。
实施例12：Nic1 ERF基因在稳定的转基因植物中的表达
我们还用稳定的转化测定法验证Nic1 ERF的功能。获得至少十二株转基因植物，其用于过表达在35S启动子的控制下的Nic1 ERF。化学分析揭示，在LA植物中的Nitab4.5_0003090g0030.1、Nitab4.5_0004620g0080.1和Nitab4.5_000462g0090.3的过表达显著增加生物碱含量。具体地，Nitab4.5_0003090g0030.1的过表达导致与HI植物相当的生物碱水平。
我们将包括Nitab4.5_0003090g0030.1的天然启动子、编码区和3'-UTR(非翻译区)的基因组序列转移至LA植物中。用T0植物的化学分析显示，通过Nitab4.5_0003090g0030.1的基因转化，生物碱产生显著提高。
值得注意的是，含有Nitab4.5_0003090g0030.1的基因组构建体的转化体中的生物碱水平略低于HI的生物碱水平，这可能由T0植物的半合子性引起。
实施例13：诱导的EMS Nic1突变体
经由Nic1 ERF的稳定转化的互补测试表明，可以恢复nic1表型。然而，我们希望确定敲除这些基因中的任一种是否可以对nic1表型本身进行拟表型。
因此，对于鉴定含有突变基因的烟草植物的目的，从品种TI 1068开发近似2000株EMS突变株系。根据Rigola等人(2009，通过引用并入本文)，使用来自该群体的合并的M2株系，通过DNA测序鉴定来自上表1的目标Nic1区域中的ERF基因中的突变，以及来自Nic2区域的ERF189 (Nitab4.5_0015055g0010.2)中的突变。
使来自被鉴定为在Nitab4.5_0003090g0030.1中含有突变的M2种子合并物的M2突变株系在温室中生长，并在11周龄时如上所述测定生物碱含量。
通过DNA测序鉴定对于该基因为纯合和杂合M2突变株系；无效分离子(nullsegregant)用作每个突变株系的对照植物。从每个基因型类别测定平均生物碱水平；通过Student氏t检验确定野生型和突变/杂合子组之间的显著差异(图84)。每个基因型类别中最少四个个体用于该分析。化学分析表明，Nitab4.5_0003090g0030.1中引起提前终止密码子(氨基酸变化Q25*)的纯合突变导致植物的生物碱含量为野生型对照相比的近似三分之一。
实施例14：基因编辑
基因编辑用于在HI背景中突变Nic1 ERF基因，以确定是否可以生成与LA株系等效的植物。
在T0，对于Nitab4.5_0003090g0030.1鉴定了杂合突变株系，命名为L1，其由A的一个bp插入引起。
将提前终止密码子引入L1中的Nitab4.5_0003090g0030.1的突变等位基因中，并相应地破坏基因功能(图85)。为了更好地表征由Nitab4.5_0003090g0030.1贡献的表型效应，我们收获了L1的种子并在T1世代中进行化学分析。通过DNA测序确定T1植物、野生型(WT-T1)、杂合子(Het-T1)和纯合突变体(Mut-T1)的基因型。WT-T1的总生物碱水平与HI植物的总生物碱水平相当(图86A)。
尽管Het-T1植物中的生物碱水平的降低不显著，但平均而言，它们的表型值降低至WT-T1植物的一半水平。对于纯合突变体Mut-T1，生物碱含量几乎不可辨别，其远低于LA植物的生物碱含量(图86A)。从图86B可见，HI株系中的Nitab4.5_0003090g0030.1的敲除导致LA植物的生物碱水平为几乎1/10。
为了理解为什么Mut-T1的生物碱水平比LA植物低得多，我们研究HI和LA株系之间的Nitab4.5_0003090g0030.1等位基因的序列和表达水平多态性。
我们对起始密码子上游近似2.2 kb、编码序列和终止密码子下游近似1.2 kb进行测序，但在这两个等位基因之间未鉴定到SNP。实时(RT) PCR分析揭示Nitab4.5_0003090g0030.1在根中特异性表达，这解释了烟碱生物合成为什么是根特异性的。
与HI株系相比，Nitab4.5_0003090g0030.1的表达在LA株系中下调(图87)。因此，HI和LA之间的表型差异通过Nic1基因的差异表达引入。
尽管Nic1的弱表达导致LA中的低生物碱水平，但预期，可以通过完全破坏Nic1来实现超低的生物碱含量，这与我们对Mut-T1植物的观察一致(图86B)。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本发明所述的方法和系统的各种改变和变化对于本领域技术人员是显而易见的，且不会背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经关于具体优选的实施方案进行了描述，但应理解要求保护的本发明不应过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域中的技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种改变均旨在以下权利要求书的范围之内。
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Claims (43)
1.调节植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物或细胞培养物：其中所述至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No.20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3或SEQ IDNo. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ IDNo. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
2.调节烟草植物或其植物部分中的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达来修饰所述植物或细胞培养物：其中所述至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No.17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
3.至少一种Nic1 ERF基因用于调节细胞或植物或其部分或细胞培养物的生物碱含量的用途，其中：所述至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28中所示的氨基酸序列；或SEQ ID No. 32；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽，或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No.17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
4.用于生产具有调节的生物碱含量的植物或其部分、细胞培养物、植物繁殖材料、叶、切割收获的叶、加工的叶或切割和加工的叶的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞培养物以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，其中：所述至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ IDNo. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽，或其中所述ERF基因包含如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5；或SEQID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29中所示的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中与未经修饰以调节所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物或细胞培养物相比，生物碱含量被调节。
6.植物或其部分或细胞培养物，与未修饰的植物或未修饰的细胞培养物相比，其已被修饰以实现生物碱含量的调节，其中所述修饰是至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的调节。
7.植物繁殖材料，其可获得自根据权利要求6所述的植物，或通过权利要求4或5中任一项的方法产生的植物或细胞培养物。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法或用途，或根据权利要求6所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7所述的植物繁殖材料，其中与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物或细胞培养物相比，所述植物的生物碱含量降低。
9.根据权利要求8所述的方法或用途、根据权利要求8所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求8所述的植物繁殖材料，其中至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达降低。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或用途，或根据权利要求6所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7所述的植物繁殖材料，其中与未经修饰以调节至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比，植物或细胞培养物的生物碱含量增加。
11.根据权利要求1-5或10中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或10所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7或10所述的植物繁殖材料，其中所述植物经修饰以增加至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且与未经修饰以调节所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达的植物或细胞培养物相比，所述植物或细胞培养物表现出增加的生物碱含量。
12.根据权利要求1-5或5至11中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8至11所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7至11所述的植物繁殖材料，其中所述植物或细胞培养物的总生物碱含量被调节。
13.根据权利要求1-5或8至12中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8至12所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7至12所述的植物繁殖材料，其中一种或多种选自烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明和新烟草碱的生物碱的含量被调节，优选地，烟碱的含量被调节。
14.根据权利要求1-5或8至13中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8至13所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7至13所述的植物繁殖材料，其中所述植物或植物细胞来自茄科。
15.根据权利要求1-5或8至14中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8至14所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7至14所述的植物繁殖材料，其中所述植物或植物细胞来自茄属。
16.根据权利要求1-5或8至14中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8至14所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7至14所述的植物繁殖材料，其中所述植物或植物细胞来自烟草属。
17.根据权利要求16所述的方法或用途、根据权利要求16所述的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物，或根据权利要求16所述的植物繁殖材料，其中所述烟碱含量被调节。
18.根据权利要求16所述的方法或用途、根据权利要求16所述的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物，或根据权利要求16所述的植物繁殖材料，其中所述烟碱含量降低。
19.根据权利要求1-5或8至18中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8或11至18所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7或11至18所述的植物繁殖材料，其中所述至少一种Nic1 ERF基因编码包含如SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或所述至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物。
20.根据权利要求1-5或8至19中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8或11至19所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7或11至19所述的植物繁殖材料，其中额外的ERF基因被调节，其中：所述额外的ERF基因是至少一种Nic2 ERF基因，且编码包含如SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No.56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68；或SEQ ID No. 72中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物的多肽；或所述额外的ERF基因是至少一种Nic2 ERF基因，且包含如SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ IDNo. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQID No. 69中所示的核苷酸序列。
21.根据权利要求1-5或8至20中任一项所述的方法或用途、根据权利要求6或8或11至20所述的植物或其部分或细胞培养物，或根据权利要求7或11至20所述的植物繁殖材料，其中额外的ERF基因被调节，其中所述额外的ERF基因是至少一种Nic2 ERF基因，且包含如SEQID No.69中所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段或直向同源物，或编码包含如SEQID No.72中所示的氨基酸序列或其功能变体或功能片段或直系同源物的多肽。
22.根据权利要求6或8-21中任一项所述的植物或其部分或细胞培养物，或通过权利要求4或5，或8至20中任一项所述的方法产生的植物用于培育植物的用途。
23.根据权利要求6或8-21中任一项所述的植物或其部分或细胞培养物，或通过权利要求4或5，或8至21中任一项所述的方法产生的植物用于产生产品的用途。
24.根据权利要求6或8-21中任一项所述的植物或其部分，或通过权利要求4或5，或8至21中任一项所述的方法产生的植物用于使作物生长的用途。
25.根据权利要求6或8-21中任一项所述的植物或其部分，或通过权利要求4或5，或8至21中任一项所述的方法产生的植物用于产生叶的用途。
26.根据权利要求6或8-21中任一项所述的植物的收获的叶，或可获得自从根据权利要求6-21中任一项所述的繁殖材料繁殖的植物或可获得自通过根据权利要求2或22-24中任一项所述的用途获得的植物或可获得自通过权利要求4或5，或8至21中任一项的方法产生的植物的收获的叶。
27.根据权利要求26所述的植物的收获的叶，其中植物的收获的叶是切割收获的叶。
28.加工的叶，优选加工的烟叶，优选非活性的加工的烟叶，其：
可获得自可从根据权利要求2或22-24中任一项的用途获得的植物；
可通过加工根据权利要求5或7-21中任一项所述的植物获得；
可获得自从根据权利要求6-21中任一项所述的植物繁殖材料繁殖的植物；或
可通过加工根据权利要求26或27所述的植物的收获的叶获得；或
可获得自通过权利要求4或5，或8至21中任一项的方法产生的植物。
29.根据权利要求28所述的加工的叶，其中所述叶通过调制、发酵、巴氏杀菌或其组合加工。
30.根据权利要求28或29所述的加工的叶，其中所述加工的叶是切割加工的叶。
31.由根据权利要求16至21中任一项的植物或其部分制成的调制的烟草材料或其提取物。
32.烟草共混物，其包含权利要求31的所述调制的烟草材料。
33.烟草工业产品，其由以下制备：
根据权利要求16-21中任一项所述的烟草植物或其部分或根据权利要求16-21中任一项所述的烟草细胞培养物；
从根据权利要求16中任一项所述的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
根据权利要求25或26所述的植物的收获叶，其中所述植物是烟草；
根据权利要求27-29中任一项所述的加工的叶，其中所述植物是烟草；或
通过权利要求16的方法产生的植物。
34.根据权利要求33所述的烟草工业产品，其中所述烟草产品是可燃吸烟制品。
35.根据权利要求33所述的烟草工业产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
36.根据权利要求33所述的烟草产品，其中所述烟草产品是不可燃气雾剂供应系统，诸如烟草加热装置或气雾剂产生装置。
37.根据权利要求16所述的烟草细胞用于调节细胞培养物中的生物碱含量的用途。
38.可燃吸烟制品、不可燃气雾剂供应系统、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含根据权利要求6-21中任一项所述的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)，或根据权利要求16-21中任一项所述的烟草细胞培养物；或根据权利要求31所述的调制的烟草材料；或根据权利要求32所述的烟草共混物。
39.至少一种选自SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29的Nic1 ERF基因的核苷酸序列；或其功能变体或功能片段或直系同源物，用于选择具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的(例如降低的)烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量的植物的用途。
40.在至少一种Nic1 ERF基因的核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，其中所述Nic1 ERF基因选自：SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No.13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直向同源物；其中所述可遗传突变调节(例如降低)所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且其中相对于不携带所述可遗传突变的可比较的植物，突变型植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量。
41.携带根据权利要求40所述的可遗传突变的突变型植物的后代或种子。
42.从植物产生的收获的叶、加工的叶或调制的烟草材料，所述植物在至少一种Nic1 ERF基因的核苷酸序列中包含修饰，其中所述至少一种Nic1 ERF基因选自：SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或其功能变体或功能片段或直向同源物；其中所述修饰调节(例如降低)所述至少一种Nic1 ERF基因的活性或表达，且其中相对于在至少一种Nic1 ERF基因中不携带所述修饰的可比较的植物，所述植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA的前体的含量。
43.如本文中参考说明书和附图所述的方法、叶、植物、植物繁殖材料、收获的叶、加工的烟草、烟草产品、用途或其组合。
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