CN111836539A - 用于产生烟草植物和具有经过改变的生物碱水平的产品的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了烟草Nic1b基因座和相关联的基因(例如，一组ERF基因)。还提供了具有改变的总生物碱和烟碱水平以及商业上可接受的叶等级的烟草植物、其通过育种方法或转基因方法的发展以及烟草制品从这些烟草植物的产生。进一步提供了用于产生具有新颖突变或等位基因的烟草植物以降低烟碱水平的组合物和方法。进一步提供了用于在保持叶等级和烟草制品质量的同时育种具有减少的烟碱或生物碱的烟草的序列多态性和分子标志物。

Description

用于产生烟草植物和具有经过改变的生物碱水平的产品的组 合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月12日提交的美国临时申请第62/616,959号、于2018年2月2日提交的美国临时申请第62/625,878号和于2018年6月15日提交的美国临时申请第62/685,844号的优先权，所有所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
序列表的并入
命名为“P34709WO00_SL.txt”、2,780,525字节(在
Figure BDA0002644790620000011
中测量)并且于2019年1月11日创建的文件中含有的序列表与本申请一起以电子方式提交并且通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开提供了一种低生物碱相关联的染色体缺失区(LA_associated_region)、一种烟草Nic1b基因座以及在所述区或基因座内或其周围的基因。还提供了具有改变的总生物碱和烟碱水平以及商业上可接受的叶等级的烟草植物、其通过育种方法或转基因方法的发展以及烟草制品从这些烟草植物的产生。
背景技术
烟草中存在四种主要生物碱：烟碱、降烟碱、假木贼碱和安那他品。烟碱是主要的生物碱，其通常占商业烟草栽培品种中总生物碱的90％以上。烟碱生物合成主要出现在烟草根部。烟草植物然后通过维管束将烟碱运输到叶子，然后烟碱在叶子处储存在液泡中。
影响烟草生物碱水平的因素有多种，包含基因型、环境、施肥和农艺措施(例如，通过打顶、伤害和食草动物损害刺激烟碱产生)。最初通过一系列回交将存在于古巴雪茄烟草变种株的低生物碱特征引入香烟变种中。低生物碱烟草种质随后被登记在栽培品种Burley21的遗传背景中(Legg等人,《作物科学(Crop Science)》,10:212(1970))。使用低生物碱Burley 21(LA BU21)品系的遗传研究表明，两个非伴性基因座有助于烟叶中的烟碱水平。这两个基因座被称为Nic1和Nic2。LA BU21中的nic1和nic2(分别与烟碱1和烟碱2相同)突变呈半显性。所述基因座表面对烟碱水平有剂量依赖性影响，其中nic1的作用比nic2的作用强2.4倍。已经报道了Nic2基因座的分子特性。nic2突变示出为含有在乙烯应答因子(ERF)科中转录因子基因簇的缺失，例如，ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(Shoji等人,《植物细胞(Plant Cell)》,(10):3390-409(2010))。
降低烟草中总生物碱的含量可以有许多益处。这样可以增加烟草作为生物质资源的价值。烟草植物中烟碱生物碱的增加可能在保护植物免受昆虫和食草动物侵害方面发挥重要作用。
据报道，与生物碱在昆虫防御中的作用相一致，LA BU21极易受到昆虫伤害(Legg等人,《作物科学》,10:212(1970))。一项将总生物碱百分比低(约0.20％)的熏烤烟草的等基因系与其“正常”重复亲本(总生物碱为1.85％到2.70％)进行比较的另外的研究报道，低生物碱系的产量、等级指数、总N和还原糖含量低于正常的熏烤的栽培品种(Chaplin和Weeks，《作物科学》,16(3):416-18(1976))。
需要鉴定调节烟草烟碱水平的基因并且发展含有已改变的烟碱水平(例如，降低的烟碱)的烟草植物和制品，同时保持(如果没有优化)烟叶质量。
发明内容
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。
另一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座和Nic2基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似生长条件下生长时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
一方面，本公开进一步提供了非转基因烟草植物或其部分，其包括选自由小于2.0％组成的组的烟碱水平，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。
另一方面，本公开还提供了一种烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的非转基因突变，其中所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱水平降低到在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的约20％或更少，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与所述对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中所述对照植物除了所述非转基因突变之外还与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座突变，其中与在类似生长条件下生长时的对照烟草植物相比，所述烟草植物包括类似水平的一种或多种烟草香气化合物，所述一种或多种烟草香气化合物选自由以下组成的组：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、二萜(labdenoid)、西松烷内酯、糖酯和还原糖。
另一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述突变在LA Burley 21中不存在。一方面，本文提供的烟草植物包括与LA Burley 21相比，位于Nic1b基因座处的更短的染色体基因渗入(chromosomal introgression)。另一方面，本文提供的烟草植物不包括Nic1b_ERF基因座中完整基因或完整的基因编码序列的缺失。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括一个或多个基因内的一或多个突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、153、154、202和203以及其片段组成的组的序列具有至少80％的同一性的序列。一方面，本文提供的烟草植物包括Nic1b_ERF基因座处的一或多个非天然存在的突变等位基因，所述突变等位基因减少或消除来自Nic1b_ERF基因座的一个或多个基因活性。一方面，这些突变等位基因导致烟碱水平降低。
另一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括一个或多个基因内的一或多个突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：38、48、49、52到54、158、159、204和205以及其片段组成的组的序列具有至少80％的同一性的编码序列。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括编码多肽的一个或多个基因内的一或多个突变，所述多肽与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87到89、180、181、206和207以及其片段组成的组的序列具有至少80％的同一性。
另一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b抑制序列，所述基因包括与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、153、154、202和203以及其片段组成的组的序列具有至少80％的同一性的序列，其中所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中所述抑制序列与序列的至少21个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性，所述序列与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、153、154、202和203以及其片段的序列的组组成的序列具有至少80％的同一性。
另一方面，本公开提供了重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接到多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码能够与编码多肽的RNA结合的RNA分子，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87到89、180、181、206和207及其片段的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列。
一方面，本公开提供了重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接到多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码具有与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87到89、180、181、206和207以及其片段组成的组的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列的多肽。
本公开进一步提供了经过烘烤的烟草、烟丝、包括来自所公开的烟草植物、品系、变种或杂交体。
本公开还提供了用于培育包括期望的总生物碱或烟碱水平(例如，低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培品种或变种的方法。一方面，本公开提供了一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于染色体间隔中，所述染色体间隔位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何两个标记物的两侧，或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何两个基因座的两侧；(c)选择包括低烟碱性状的后代烟草植物。
一方面，本公开提供了一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何一个SNP标记物或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何基因座的2cM内；(c)选择包括低烟碱性状的后代烟草植物。一方面，多态性标记物是选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物。
另一方面，本公开提供了一种选择具有低烟碱性状的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)从烟草种质集合中分离核酸；(b)检测与Nic1b基因座紧密连接的一种或多种标记物的核酸；以及(c)基于标记物检测选择具有低烟碱性状的烟草植物。
附图说明
图1：用于培育具有nic1和nic2缺失标记物等位基因的F5系的育种方案(*(x)表示自交)。
图2：基因座位g31431和基因座位g31432周围的潜在替代性剪接变种。较深的框表示检测到的转录，而较浅的框表示电子生成的CDS模型。
图3：ERF 16而不是ERF130的过表达、LA BU21中缺失的LA_associated_region(即，SEQ ID NO1，称为“Nic1bΔ”，其不含注释基因，参见实例2)或g32081(β-葡糖苷酶18样基因)的过表达导致LA BU21中烟碱和总生物碱增加。
图4：通过人工microRNA抑制单独的Nic1b_ERF(ERFnew、ERF210、ERF199、ERF29和ERF91L2)将烟碱水平降低到对照植物的约50％到90％。平均烟碱水平和标准误差基于表7中的数据。
序列说明
SEQ ID NO：1列出了从TN90×LA BU21杂交中鉴定的LA_associated_region的序列。
SEQ ID NO：2列出了Nic1b区(包含LA_associated_region)的序列。
SEQ ID NO：3到37列出了Nic1b区中的35个注释基因(NCG)的基因组编码序列(gDNA通常以ATG开始并且以终止密码子结束，但在一些情况下还含有非翻译区(UTR)序列)。
SEQ ID NO：38到72列出了Nic1b区中的35个注释基因(NCG)的cDNA序列。
SEQ ID NO：73到107列出了Nic1b区中的由35个注释基因(NCG)编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：108到119列出了用于抑制所选NCG基因的示例性成熟人工miRNA序列(有义或反义)。
SEQ ID NO：120到124列出了用于编辑所选NCG基因的示例性导向RNA序列。
SEQ ID NO：125到145列出了跨越Nic1b区或者位于所述区两侧的21个SNP标记物序列。
SEQ ID NO：146到148列出了基因座位g31432的各自基因组编码、cDNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO：149到151列出了基因座位g31446的各自基因组编码、cDNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO：152到156列出了多个蛋白质编码基因的基因组编码序列和来自Nic1b区的非编码RNA。SEQ ID NO：157到161列出了相应的cDNA序列。SEQ ID NO：162到183列出了相应的蛋白质或非编码RNA分子序列。
SEQ ID NO：184到186列出了在生物碱正常的烟草品系与生物碱减少的烟草品系之间表现出差异表达的多个转录因子基因的基因组编码序列。SEQ ID NO：187到189列出了相应的cDNA序列。SEQ ID NO：190到192列出了相应的蛋白质或非编码RNA分子序列。
SEQ ID NO：193到201列出了紧邻多个ERF基因或位于编码来自Nic1b区的非编码RNA的基因内的SNP标记物序列。
SEQ ID NO：202和203列出了与Nic1b区相关联的两个ERF基因的基因组编码序列。SEQ ID NO：204和205列出了相应的cDNA序列。SEQ ID NO：206和207列出了相应的蛋白质序列。
SEQ ID NO：208到214列出了七个Nic2_ERF基因的基因组编码序列。SEQ ID NO：215到221列出了相应的cDNA序列。SEQ ID NO：222到228列出了相应的蛋白质序列。
各种序列包含核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如，A、T、G、C或一个或多个核苷酸的缺失或插入。在一些实例中，示出了“N”的串。“N”的数量不一定与所述位置处的未测定核苷酸的实际数量相关。实际核苷酸序列可以比所示的“N”段更长或更短。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或多个氨基酸的缺失或插入。再次，“X”的数量不一定与所述位置处的未测定氨基酸的实际数量相关。实际的氨基酸序列可以比“X”所示的片段更长或更短。
具体实施方式
除非另外定义，否则在此所用的技术性和科学性术语具有与本领域中技术人员通常所理解的相同意思。本领域的技术人员将认识到，在本公开的实践中可以使用许多方法。实际上，本公开无论如何不局限于所述的方法和材料。出于本公开的目的，下文中定义了以下术语。
本文引用的任何参考文献，包含例如所有专利和出版物，都通过引用整体并入本文。
除非上下文另外清楚地指示，否则如在此所使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包含复数个指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包含多种化合物，所述多种化合物包含其混合物。
本文使用的术语“约”意指大约、大致、左右或在…的范围中。当术语“约”与数值范围结合使用时，所述术语通过将边界延伸到所给出的数值之上和之下来修改所述范围。
如本文所用，“Nic1b基因座”是指Nic1b区内或与Nic1b区紧密连接的位置或定位。“Nic1b区”是指约150万个bps长的染色体片段，其对应于TN90基因组的SEQ ID NO2，并且具有与低生物碱性状相关联的一个或多个等位基因。“nic1b突变”是指Nic1b基因座的突变。
如本文所用，Nic1b_ERF(或复数形式，Nic1b_ERF)是指位于Nic1b基因座处或其附近的ERF基因或基因座中的任何ERF基因或基因座，并且包含例如ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。参见表11和Kajikawa等人,《植物生理学(Plant physiol.)》2017,174:999-1011。“nic1b_erf突变”是指Nic1b_ERF基因的突变。如本文所用，突变或突变等位基因以小写和斜体显示。基因、基因座或蛋白质名称都以大写字母显示，或者以大写字母开头，并且可以是斜体或非斜体。
如本文所用，Nic2_ERF(或复数形式，Nic2_ERF)是指位于Nic2基因座处或其附近的ERF基因或基因座中的任何ERF基因或基因座，并且包含例如ERF221、ERF115、ERF168、ERF17、ERF179、ERF189。参见表12；Shoji等人,《植物细胞》,(10):3390-409(2010)；和Kajikawa等人,《植物生理学》2017,174:999-1011。
如本文所用，突变是指引入到基因中的可遗传基因修饰，以改变由基因编码的产物的表达或活性。此类修饰可以位于基因的任何序列区，例如启动子、5’UTR、外显子、内含子、3’UTR或终止子区。一方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。另一方面，突变增加、提升、加强或增强基因产物的表达或活性。一方面，突变不是存在于特定烟草变种或栽培品种中的天然多态性。如本文所用，“突变等位基因”是指来自等位基因包括突变的基因座的等位基因。如本文所用，“诱变”是指在不涉及转基因的情况下或者在最终突变体中不存在突变相关的转基因的情况下产生突变。一方面，诱变是顺基因的。另一方面，诱变是通过基因或基因组编辑。在另外的方面，诱变是通过随机诱变，例如，化学(例如，EMS)或物理(r-辐射)诱变。
如本文所用，烟草植物可以是来自烟草属的任何植物，所述烟草属包含但不限于普通烟草、抱茎烟草PI 271989；本氏烟PI 555478；毕氏烟草PI 555485；迪勃纳氏烟草；木丝烟草PI 224063；粘毛烟草PI 555507；古特斯比氏烟草PI 241012；野生烟草PI 230953；西烟草PI 271991；奈特氏烟草PI 555527海滨烟草PI 555535；麦格鲁希凤烟PI 555536；裸茎烟草PI 555540；野生烟草PI 555545；皱叶烟草PI 555548；残波烟草PI 555552；黄花烟草芳香烟草PI 230960；林烟草PI 555569；绒毛烟草PI 266379；茸毛烟草；以及三角叶烟草PI 555572。一方面，这里描述的烟草植物是普通烟草植物。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。一方面，烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。一方面，烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。一方面，烟草植物进一步包括ERF189、ERF115或两者中的一种或多种突变。一方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。另一方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长和烘烤时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值是在类似条件下生长时的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中对照植物除了突变之外还与烟草植物具有基本相同的遗传背景。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值介于对照植物的USDA等级指数值的65％与130％之间、70％与130％之间、75％与130％之间、80％与130％之间、85％与130％之间、90％与130％之间、95％与130％之间、100％与130％之间、105％与130％之间、110％与130％之间、115％与130％之间或120％与130％之间的叶。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值介于对照植物的USDA等级指数值的70％与125％之间、75％与120％之间、80％与115％之间、85％与110％之间或90％与100％之间。一方面，烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％，其中对照植物除了突变之外还与烟草植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，烟草植物的总生物碱水平选自由以下组成的组：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％并且小于0.05％。另一方面，烟草植物的烟碱或总生物碱水平选自由以下组成的组：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％并且小于0.05％。在另外的方面，烟草植物进一步包括直接抑制编码由以下组成的组的产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。一方面，烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。一方面，烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。一方面，烟草植物进一步包括ERF189、ERF115或两者中的一种或多种突变。另一方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。另一方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为选自由介于以下组成的组的叶：50与95之间、55与95之间、60与95之间、65与95之间、70与95之间、75与95之间、80与95之间、85与95之间、90与95之间、55与90之间、60与85之间、65与80之间、70与75之间、50与55之间、55与60之间、60与65之间、65与70之间、70与75之间、75与80之间、80与85之间、85与90之间、90与95之间。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值是对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值介于对照植物的USDA等级指数值的65％与130％之间、70％与130％之间、75％与130％之间、80％与130％之间、85％与130％之间、90％与130％之间、95％与130％之间、100％与130％之间、105％与130％之间、110％与130％之间、115％与130％之间或120％与130％之间的叶。在另外的方面，烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值介于对照植物的USDA等级指数值的70％与125％之间、75％与120％之间、80％与115％之间、85％与110％之间或90％与100％之间。另一方面，烟草植物的烟碱水平或总生物碱水平比在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平或总生物碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。另一方面，烟草植物进一步包括直接抑制编码由以下组成的组的产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
一方面，Nic1b_ERF基因座包括选自由以下组成的组的一个或多个序列：SEQ IDNO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205。一方面，Nic1b_ERF基因座包括小于50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000个核甘酸的序列或染色体片段。另一方面，Nic1b_ERF基因座包括至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000个核甘酸的序列或染色体片段。在另外的方面，Nic1b_ERF基因座包括介于100个与300个核甘酸之间、100个与400个核甘酸之间、100个与500个核甘酸之间、100个与600个核甘酸之间、100个与700个核甘酸之间、100个与800个核甘酸之间、100个与900个核甘酸之间、100个与1000个核甘酸之间、100个与1500个核甘酸之间、100个与2000个核甘酸之间、100个与3000个核甘酸之间、100个与4000个核甘酸之间、100个与5000个核甘酸之间、100个与6000个核甘酸之间、100个与7000个核甘酸之间、100个与8000个核甘酸之间或100个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。一方面，Nic1b_ERF基因座包括介于50个与100个核甘酸之间、100个与200个核甘酸之间、200个与300个核甘酸之间、300个与400个核甘酸之间、400个与500个核甘酸之间、500个与600个核甘酸之间、600个与700个核甘酸之间、700个与800个核甘酸之间、800个与900个核甘酸之间、900个与1000个核甘酸之间、1000个与1500个核甘酸之间、1500个与2000个核甘酸之间、2000个与3000个核甘酸之间、3000个与4000个核甘酸之间、4000个与5000个核甘酸之间、5000个与6000个核甘酸之间、6000个与7000个核甘酸之间、7000个与8000个核甘酸之间或8000个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。
一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物的50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000或70000个核甘酸内的序列或染色体片段。另一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物的介于100个与300个核甘酸之间、100个与400个核甘酸之间、100个与500个核甘酸之间、100个与600个核甘酸之间、100个与700个核甘酸之间、100个与800个核甘酸之间、100个与900个核甘酸之间、100个与1000个核甘酸之间、100个与1500个核甘酸之间、100个与2000个核甘酸之间、100个与3000个核甘酸之间、100个与4000个核甘酸之间、100个与5000个核甘酸之间、100个与6000个核甘酸之间、100个与7000个核甘酸之间、100个与8000个核甘酸之间或100个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。在另外的方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物的介于50个与100个核甘酸之间、100个与200个核甘酸之间、200个与300个核甘酸之间、300个与400个核甘酸之间、400个与500个核甘酸之间、500个与600个核甘酸之间、600个与700个核甘酸之间、700个与800个核甘酸之间、800个与900个核甘酸之间、900个与1000个核甘酸之间、1000个与1500个核甘酸之间、1500个与2000个核甘酸之间、2000个与3000个核甘酸之间、3000个与4000个核甘酸之间、4000个与5000个核甘酸之间、5000个与6000个核甘酸之间、6000个与7000个核甘酸之间、7000个与8000个核甘酸之间或8000个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。
一方面，Nic1b_ERF基因座包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段。另一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的序列的50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000或70000个核甘酸内的序列或染色体片段。在另外的方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的序列的介于100个与300个核甘酸之间、100个与400个核甘酸之间、100个与500个核甘酸之间、100个与600个核甘酸之间、100个与700个核甘酸之间、100个与800个核甘酸之间、100个与900个核甘酸之间、100个与1000个核甘酸之间、100个与1500个核甘酸之间、100个与2000个核甘酸之间、100个与3000个核甘酸之间、100个与4000个核甘酸之间、100个与5000个核甘酸之间、100个与6000个核甘酸之间、100个与7000个核甘酸之间、100个与8000个核甘酸之间、100个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的序列的介于50个与100个核甘酸之间、100个与200个核甘酸之间、200个与300个核甘酸之间、300个与400个核甘酸之间、400个与500个核甘酸之间、500个与600个核甘酸之间、600个与700个核甘酸之间、700个与800个核甘酸之间、800个与900个核甘酸之间、900个与1000个核甘酸之间、1000个与1500个核甘酸之间、1500个与2000个核甘酸之间、2000个与3000个核甘酸之间、3000个与4000个核甘酸之间、4000个与5000个核甘酸之间、5000个与6000个核甘酸之间、6000个与7000个核甘酸之间、7000个与8000个核甘酸之间或8000个与9000个核甘酸之间的序列或染色体片段。
一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由以下组成的组的序列中的任何两个序列两侧并且不包括所述序列中的所述任何两个序列的序列或染色体片段：SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段。一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标志物中的任何两个SNP标志物两侧并且不包括所述SNP标志物中的所述任何两个SNP标志物的序列或染色体片段。一方面，Nic1b_ERF基因座包括位于选自由以下组成的组的序列中的任何两个序列两侧并且不包括所述序列中的所述任何两个序列的序列或染色体片段：SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205。
一方面，本公开还提供了一种烟草变种、栽培品种或品系，其包括选自由nic1b_erf突变、nic2突变和其组合组成的组的突变，其中烟草变种、栽培品种或品系的叶等级与在类似生长条件下生长的对照烟草变种、栽培品种或品系的叶等级相当，其中除突变之外，对照烟草变种与烟草变种、栽培品种或品系具有基本相同的遗传背景。
一方面，本公开进一步提供了非转基因烟草植物或其部分，其包括选自由以下组成的组的烟碱水平或总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％以及小于0.05％，其中烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为以下的叶：50或更多、55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。另一方面，此类非转基因烟草植物包括小于2.0％的烟碱水平并且在烘烤时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。在另外的方面，此类非转基因烟草植物包括小于1.0％的烟碱水平并且在烘烤时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。
一方面，本公开还提供了一种烟草植物或其部分，其包括非转基因突变，其中所述非转基因突变将烟草植物的烟碱水平或总生物碱水平降低到比在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与所述对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中所述对照植物除了所述非转基因突变之外还与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述突变在LA Burley 21中不存在。一方面，本文提供的烟草植物包括与LA Burley 21相比，位于Nic1b_ERF基因座处的更短的染色体基因渗入(chromosomal introgression)。另一方面，本文提供的烟草植物不包括Nic1b_ERF基因座中完整基因或完整的基因编码序列的缺失。一方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座处是纯合的。另一方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座处是杂合的。一方面，本文提供的烟草植物包括选自由以下组成的组的Nic1b_ERF突变：点突变、缺失、插入、复制和倒置。一方面，本文提供的烟草植物的Nic1b_ERF突变是通过选自由随机诱变和靶向诱变组成的组的方法引入的。另一方面，本文提供的烟草植物的Nic1b_ERF突变是通过选自由巨核酸酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR组成的组的目标突变形成方法引入的。
一方面，本文提供的烟草植物包括一个或多个基因内的一种或多种突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17到19、153、154、202、203和208到214以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。一方面，一种或多种突变降低了一个或多个基因的表达或活性，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17到19、153、154、202、203和208到214以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
一方面，本文提供的烟草植物包括一个或多个基因内的一种或多种突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：38、48、49、52到54、158、159、204、205和215到221以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的编码序列。一方面，一种或多种突变降低了一个或多个基因的表达或活性，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：38、48、49、52到54、158、159、204、205和215到221以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的编码序列。
一方面，本文提供的烟草植物包括编码多肽的一个或多个基因内的一种或多种突变，所述多肽与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87到89、180、181、206和207以及222到228以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。一方面，一种或多种突变降低了编码多肽的一个或多个基因的表达或活性，所述多肽与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87到89、180、181、206和207以及222到228以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
一方面，本文提供的烟草植物包括一个或多个基因内的一种或多种突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。一方面，一种或多种突变降低了一个或多个基因的表达或活性，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
一方面，本文提供的烟草植物包括一个或多个基因内的一种或多种突变，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：49、52、53、204、205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的编码序列。一方面，一种或多种突变降低了一个或多个基因的表达或活性，所述一个或多个基因包括与选自由SEQ ID NO：49、52、53、204、205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的编码序列。
一方面，本文提供的烟草植物包括编码多肽的一个或多个基因内的一种或多种突变，所述多肽包括与选自由SEQ ID NO：84、87、88和89以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。一方面，一种或多种突变降低了编码多肽的一个或多个基因的表达或活性，所述多肽与选自由SEQ ID NO：84、87、88和89以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
LA Burley 21(也称为LA BU21)是通过将来自古巴雪茄变种的一个或多个低生物碱基因借助于若干次回交结合到Burley 21中的低总生物碱烟草品系(Legg等人,1970)。与其亲本Burley 21的约3.5％(干重)相比，Burley 21的总生物碱(干重)为大约0.2％。LABU21的叶等级远低于商业上可接受的标准。LA BU21还表现出其它不利的叶表型，其特征是产量较低、成熟和衰老延迟、对昆虫食草性的敏感性较高，以及熟化后的最终产品质量差(Chaplin和Weeks,《作物科学》16:416-418(1976)；Legg等人,《作物科学》10:212(1970)；Chaplin和Burk,《作物科学》75:133-136(1983))。LA BU21叶进一步表现出如多胺含量高、叶绿素含量高、单位叶面积叶肉细胞多等性状。
除非另有说明，否则本文提到的烟草植物、变种、栽培品种或品系的生物碱、多胺或烟碱水平(或另一种烟叶化学物或特性表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包含例如单个代表性植物的多叶的平均值或来自单个变种、栽培品种或品系的烟草植物的代表性群体的平均测量值。除非另有说明，否则此处所述的烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后两周在从打顶后的叶号3、4和5采集到的混合烟叶样品中测量的。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在对烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)最高的烟叶打顶后测量的。一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平是打顶后在叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中测量的。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下叶号组成的组的连续叶号的两个或更多个烟叶的池中测量的：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下组成的组的叶号的叶中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之间以及26与30之间。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下组成的组的叶号的两个或更多个烟叶的池中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之间以及26与30之间。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下叶号组成的组的叶号的三个或更多个烟叶的池中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之间以及26与30之间。
如本文所用，烟叶编号基于烟草茎上的烟叶位置，其中叶号1是打顶后最新鲜的烟叶(在顶部)，并且最高的叶号分配给最老的烟叶(在底部)。
用于测定平均测量值(例如，生物碱或烟碱水平或叶等级)的烟草植物群体或烟叶集合可以是任何大小，例如，5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循行业公认的标准协议来测定平均测量值或等级指数值。
如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养成熟时和生殖生长要开始时，除去茎尖，包含SAM、花和多大几片相邻叶片。通常，烟草植株在纽扣阶段(在花开始出现后不久)打顶。例如，当50％的温室或田间生长的烟草植物出现至少有一朵开放的花时，可以对所述植物打顶。对烟草植物打顶会导致顶端优势的丧失，并且还会诱导生物碱产生的增加。
通常，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约2周测量。也可以使用其它时间点。一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约1、2、3、4或5周测量。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量。
如本文所用，“类似生长条件”或“相当的生长条件”是指用于生长并且在两种或更多种基因型之间进行有意义的比较使得环境条件或农艺措施均不会造成或解释在所述两种或更多种基因型之间观察到的任何差异的类似环境条件和/或农艺措施。环境条件包含例如光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。农艺措施包含例如，播种、修剪、挖底、移植、打顶和吸干。参见《烟草生产、化学和技术(Tobacco,Production,Chemistry andTechnology)》,Davis&Nielsen,编辑,牛津布莱克韦尔出版社(1999),第70-103页的4B和4C章节。
“生物碱”是天然存在于植物中的复杂的含氮化合物，并且对人和动物有药理作用。“烟碱”是商业化香烟烟草中的主要天然生物碱并且约占普通烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其它主要生物碱包含可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和安那他品。次要的烟草生物碱包含烟碱-N-氧化物、N-甲基安那他品、N-甲基假木贼碱、假氧化烟碱、2,3-二吡啶基和其它。
一方面，本文提供的烟草植物的总生物碱或单个生物碱水平比在类似生长条件下生长的无nic1b_erf突变或Nic1b_ERF定向转基因的对照烟草植物的总生物碱或单个生物碱水平低。另一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包括较低水平的选自由以下组成的组的一种或多种生物碱：可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和安那他品。一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平比对照烟草植物的生物碱或烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。另一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平约为对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的0.5％到1％之间、1％到2％之间、2％到3％之间、3％到4％之间、4％到5％之间、5％到6％之间、6％到7％之间、7％到8％之间、8％到9％之间、9％到10％之间、11％到12％之间、12％到13％之间、13％到14％之间、14％到15％之间、15％到16％之间、16％到17％之间、17％到18％之间、18％到19％之间、19％到20％之间、21％到22％之间、22％到23％之间、23％到24％之间、24％到25％之间、25％到26％之间、26％到27％之间、27％到28％之间、28％到29％之间或29％到30％之间。在另外的方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平约为对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的0.5％到5％之间、5％到10％之间、10％到20％之间、20％到30％之间。
生物碱水平可以通过本领域已知的方法检测，例如通过基于气液色谱、高效液相色谱、放射免疫分析和酶联免疫吸附分析的定量检测。例如，烟碱生物碱水平可以通过基于CORESTA推荐方法7号，1987和ISO标准(ISO TC 126N 394E)的GC-FID方法进行测量。还参见Hibi等人,《植物生理学(Plant Physiology)》100:826-35(1992)使用配备有毛细管柱和FID检测器的气液色谱的方法。除非另有说明，否则此处描述的所有生物碱水平都使用根据2005年2月CORESTA方法第62号通过气相色谱分析测定烟草和烟草制品中的烟碱以及疾病控制和预防中心的无烟烟草制品中的烟碱、总水分和pH分析方案中定义的方法进行测量，如《联邦公报》1999年3月23日第64卷第55期(并且如2009年1月7日第74卷第4期修订)中发布。
可替代地，烟草总生物碱可以使用分段流动比色法进行测量，所述方法开发用于分析如由Skalar Instrument Co(宾夕法尼亚州西切斯特)改编并且由Collins等人描述，《烟草科学(Tobacco Science)》13:79-81(1969)的烟草样品。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，对烟草样品进行干燥、研磨和提取。所述方法然后采用乙酸/甲醇/水萃取和木炭以进行脱色。总生物碱的测定基于氯化氰与烟碱生物碱在存在芳香胺的情况下反应以形成在460nm下测量的有色络合物。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或烟碱水平是以干重为基础的(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。
一方面，本文提供的烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长的无nic1b_erf突变或Nic1b_ERF定向转基因的对照烟草植物的烟碱水平低。一方面，较低的烟碱水平是指平均烟碱水平比对照烟草植物的平均烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。另一方面，较低的烟碱水平是指平均烟碱水平约为对照烟草植物的平均烟碱水平的0.5％到1％之间、1％到2％之间、2％到3％之间、3％到4％之间、4％到5％之间、5％到6％之间、6％到7％之间、7％到8％之间、8％到9％之间、9％到10％之间、11％到12％之间、12％到13％之间、13％到14％之间、14％到15％之间、15％到16％之间、16％到17％之间、17％到18％之间、18％到19％之间、19％到20％之间、21％到22％之间、22％到23％之间、23％到24％之间、24％到25％之间、25％到26％之间、26％到27％之间、27％到28％之间、28％到29％之间或29％到30％之间。在另外的方面，较低的烟碱水平是指平均烟碱水平约为对照烟草植物的平均烟碱水平的0.5％到5％之间、5％到10％之间、10％到20％之间、20％到30％之间。
一方面，在干重的基础上，本文提供的烟草植物的平均烟碱或总生物碱水平选自由以下组成的组：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。另一方面，在干重的基础上，本文提供的烟草植物的平均烟碱或总生物碱水平选自由以下组成的组：约0.01％到0.02％之间、0.02％到0.05％之间、0.05％到0.75％之间、0.75％到0.1％之间、0.1％到0.15％之间、0.15％到0.2％之间、0.2％到0.3％之间、0.3％到0.35％之间、0.35％到0.4％之间、0.4％到0.5％之间、0.5％到0.6％之间、0.6％到0.7％之间、0.7％到0.8％之间、0.8％到0.9％之间、0.9％到1％之间、1％到1.1％之间、1.1％到1.2％之间、1.2％到1.3％之间、1.3％到1.4％之间、1.4％到1.5％之间、1.5％到1.6％之间、1.6％到1.7％之间、1.7％到1.8％之间、1.8％到1.9％之间、1.9％到2％之间、2％到2.1％之间、2.1％到2.2％之间、2.2％到2.3％之间、2.3％到2.4％之间、2.4％到2.5％之间、2.5％到2.6％之间、2.6％到2.7％之间、2.7％到2.8％之间、2.8％到2.9％之间、2.9％到3％之间、3％到3.1％之间、3.1％到3.2％之间、3.2％到3.3％之间、3.3％到3.4％之间、3.4％到3.5％之间和3.5％到3.6％之间。在另外的方面，在干重的基础上，本文提供的烟草植物的平均烟碱或总生物碱水平选自由以下组成的组：约0.01％到0.1％之间、0.02％到0.2％之间、0.03％到0.3％之间、0.04％到0.4％之间、0.05％到0.5％之间、0.75％到1％之间、0.1％到1.5％之间、0.15％到2％之间、0.2％到3％之间和0.3％到3.5％之间。
本公开还提供了具有在不会对其它烟草性状(例如，叶等级指数值)产生负面影响的情况下的改变的烟碱水平的烟草植物。一方面，低烟碱或无烟碱的烟草变种提供了商业上可接受等级的经过烘烤的烟草。烟草等级是基于包含但不限于以下因素进行评估的：叶柄位置、烟叶大小、烟叶颜色、烟叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与烟叶的着色强度和深度以及光泽相关)、吸湿性(烟叶吸收和保持周围水分的能力)以及绿色的细微差别或色调。例如，可以使用由美国农业部农业营销服务局公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来确定叶等级。参见例如，白肋烟的官方标准等级(美国类型31和外国类型93)，1990年11月5日生效(55F.R.40645)；熏烤烟草的官方标准等级(美国类型11、12、13、14和外国类型92)，1989年3月27日生效(54F.R.7925)；宾夕法尼亚宽叶烟草的官方标准等级(美国类型41)，1965年1月8日生效(29F.R.16854)；俄亥俄州雪茄叶烟草的官方标准等级(美国类型42、43、和44)，1963年12月8日生效(28F.R.11719和28F.R.11926)；威斯康辛州雪茄夹烟草的官方标准等级(美国类型54和55)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；威斯康辛州雪茄夹烟草的官方标准等级(美国类型54和55)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；佐治亚州和佛罗里达州阴影种植的雪茄包装纸烟草的官方标准等级(美国类型62)，有效日期1971年4月。可以根据行业认可的等级指数来确定USDA等级指数值。参见例如Bowman等人,《烟草科学》,32:39-40(1988)；传统烟草文献库(贝茨文献号523267826-523267833，1988年7月1日，关于推荐的白肋烟等级指数的备忘录)；以及Miller等人,1990,《烟草国际》,192:55-57(所有上述参考文献都通过引用整体并入本文)。除非另有规定，否则本文所述的任何植物的USDA等级指数是接收到的联邦等级的0-100得数字表示并且是所有茎杆位置的加权平均值。等级指数越高，质量越高。可替代地，可以通过高光谱成像确定叶等级。参见例如，WO2011/027315(于2011年3月10日发布并且通过引用整体并入本文)。
一方面，本公开提供了烟草植物，与在类似生长条件下生长时的对照烟草植物相比，所述烟草植物包括类似水平的一种或多种烟草香气化合物，所述一种或多种烟草香气化合物选自由以下组成的组：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、二萜、西松烷内酯、糖酯和还原糖。另一方面，本文提供的烟草植物包括nic1b_erf突变、nic2突变或其组合，上述突变或其组合对所述水平的一种或多种烟草香气化合物没有影响，所述一种或多种烟草香气化合物选自由以下组成的组：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、二萜、西松烷内酯、糖酯和还原糖。
如本文所用，烟草香气化合物是与烟草烟雾的风味和香气相关联的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷内酯和二萜和糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物分析方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱法(GC-MS)、核磁共振波谱法、液相色谱联用质谱法。参见Weckwerth和Kahl编辑的《植物代谢组学手册》(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。
如本文所用，“还原糖”是具有游离或潜在游离的醛基或酮基的任何糖(单糖或多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟雾的pH值并有效降低“游离的”未质子化烟碱的量，在香烟烟雾中充当烟碱缓冲剂。降低糖可以平衡烟雾风味，例如，通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感官影响。据报道，对于各种烟草变种，由于种植条件的不同，同一变种内以及同一株系内的糖含量与生物碱含量之间存在反比关系。降低的糖水平可以使用由Skalar InstrumentCo(宾夕法尼亚州西切斯特)改编并由Davis,《烟草科学》20:139-144(1976)描述的，用于分析烟草样品而开发的分段流比色法来测量。例如，将样品在碳酸钠溶液中透析。将铜新亚铜试剂添加到样品中并将溶液加热。在糖存在的情况下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，导致形成在460nm处被测量到的有色络合物。
一方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF或Nic2基因座处包括一个或多个非天然存在的突变等位基因，其降低或消除了来自Nic1b_ERF或Nic2基因座的一个或多个基因活性。一方面，这些突变等位基因导致烟碱水平降低。突变的Nic1b_ERF或Nic2等位基因可以通过本领域已知的任何方法被引入，包括随机或靶向诱变方法。
这样的诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering andVerkerk，In，诱导突变在植物育种中的使用。Pergamon出版社，第317-320页，1965)或紫外线照射、X射线和中子快速照射(例如，参见Verkerk，Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman，育种田作物，Van Nostrand Reinhold，纽约(1987年第3版)，转座子标签(Fedoroff等人，1984年；美国专利No.4,732,856和美国专利No.5,013,658)，以及T-DNA插入方法(Hoekema等人，1983；美国专利No.5,149,645)。EMS诱导的诱变包括在基因组长度范围内化学诱导随机点突变。快速中子诱变包括将种子暴露于中子轰击中，该中子轰击通过双链DNA断裂引起大量缺失。转座子标签包括将转座子插入内源基因内以减少或消除基因的表达。烟草基因中可能存在的突变类型包括，例如，点突变、缺失、插入、复制和倒置。理想地，这样的突变存在于烟草基因的编码区中；然而，也期望在烟草基因的启动子区和内含子或非翻译区中发生突变。
另外，使用变性的HPLC或选择的PCR产物的选择性核酸内切酶消化来筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(靶向基因组中的诱导的局部病变)也适用于本公开。参见McCallum等人,(2000)《自然生物技术》18:455-457。可以使用本领域众所周知的方法来确定影响基因表达或干扰基因功能的突变。基因外显子的插入突变通常会导致无效突变。保守性残基中的突变在抑制蛋白质功能方面可以是特别有效的。一方面，烟草植物包括无义(例如，终止密码子)突变，是本文所述的一个或多个NCG基因。
一方面，本公开还提供了烟碱水平被改变同时保持了商业上可接受的烟叶质量的烟草品系。可以通过精确的基因组工程技术(例如，转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、巨核酸酶、锌指核酸酶和规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/Csm1系统及其组合)在Nic1b_ERF或Nic2基因座的一个或多个基因中引入突变来产生这些品系(参见例如美国专利申请公布2017/0233756)。参见例如Gaj等人,《生物技术的发展趋势》,31(7):397-405(2013).
诱变烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于：Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定，以及蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定，以检测多肽。其他技术，如原位杂交、酶染色和免疫染色也可以用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有引用技术的方法是已知的。
一方面，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自由以下组成的组的核酸酶来突变或被编辑：巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶或CRISPR/Csm1核酸酶。
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个核苷酸的靶向诱变，或者内源植物基因组核酸序列的去除或替换。一方面，所提供的经编辑的核酸序列具有与内源核酸序列的至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。一方面，所提供的经编辑的核酸序列具有与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159、202到205以及208到221组成的组的多核苷酸以及其片段的至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。另一方面，所提供的经编辑的核酸序列具有与选自由SEQ IDNO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159、202到205以及208到221组成的组的编码多肽的多核苷酸的至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。
巨核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶向位点诱导双链DNA断裂，然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的天然过程修复。然后在切割位点进行序列修饰，这可以包括在NHEJ的情况下的基因破坏所导致的缺失或插入，或通过HR对供体核酸序列的整合。一方面，所提供的方法包括用所提供的核酸酶编辑植物基因组以利用供体多核苷酸经由HR使植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个核苷酸突变。一方面，所提供的突变是使用核酸酶通过基因组编辑引起的。另一方面，所提供的突变是通过非同源末端连接或同源重组引起的。
一方面，本文提供的突变提供了显性突变体，所述显性突变体激活感兴趣的基因的表达或活性，例如，选自由以下组成的组的基因：生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合，用于一种或多种抗氧化剂。
通常在微生物中被鉴定的巨核酸酶是独特的酶，具有高活性和长识别序列(>14bp)，导致靶向DNA的位点特异性消化。天然存在的巨核酸酶的工程设计版本通常具有扩展的DNA识别序列(例如14到40bp)。巨核酸酶的工程设计可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为巨核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单个域中。诱变和高通量筛选的专门方法已用于创建识别独特序列并具有改善的核酸酶活性的新型巨核酸酶变体。
ZFN是由融合到FokI限制性核酸内切酶切割域的工程设计的锌指DNA结合域组成的合成蛋白质。可以设计ZFN来切割几乎任何长链的双链DNA，以修饰锌指DNA结合域。ZFN从由融合到被工程设计为与靶向DNA序列结合的锌指阵列上的FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割域组成的单体形成二聚体。
ZFN的DNA结合域通常由3-4个锌指阵列组成。在相对于锌指∞-螺旋起点的有助于与靶向DNA的位点特异性结合的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸可以被改变和定制以适配特定的靶向序列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。选择ZFN的靶向序列的规则是本领域已知的。
FokI核酸酶域需要二聚化才能切割DNA，因此需要两个带有C端区的ZFN才能结合切割位点的相对DNA链(相距5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶向位点。如本文所用，术语ZFN是宽泛的并且包括可以在没有另一ZFN帮助的情况下切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也用于指被工程设计为共同作用以在同一位点切割DNA的一对ZFN的一个或两个构件。
不受任何科学理论的限制，因为原则上可以使用多种方法之一来重新工程设计锌指域的DNA结合特异性，所以理论上可以构建针对几乎任何基因序列的定制ZFN。公开可用的工程设计锌指域的方法包括上下文相关程序集(CoDA)、低聚池工程(OPEN)和模块化程序集。
TALEN是通过将转录激活子样效应子(TALE)DNA结合域与FokI核酸酶域融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对的每个构件与靶向位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体会二聚化并在靶向位点处引起双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是宽泛的并且包括单体TALEN，其可以切割双链DNA而无需另一TALEN的帮助。术语TALEN也用于指共同作用以在同一位点处切割DNA的一对TALEN的一个或两个构件。
转录激活子样效应子(TALE)可以被工程设计为实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白质是来源于黄单胞菌属的各种植物细菌病原体的DNA结合域。黄单胞菌病原体在感染过程中将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动至细胞核，在其中识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子域中的特定DNA序列的启动子域中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体组成的中央DNA结合域。除了第12和13位的高变氨基酸残基外，每个单体的氨基酸都是高度保守的。这两个可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且对RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择包含适当RVD的重复片段的组合来工程设计特定的DNA结合域。
除了野生型FokI切割域之外，还设计了具有突变的FokI切割域的变体，以改善切割特异性和切割活性。FokI域起着二聚体的作用，需要两个具有独特DNA结合域的构建体用于具有适当的定向和间距的靶向基因组中的位点。TALEN DNA结合域和FokI切割域之间的氨基酸残基数目以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目都是实现高水平活性的参数。
氨基酸序列与TALE结合域的DNA识别之间的关系允许设计出蛋白质。软件程序如DNA Works可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人,.《核酸研究》(2012)40:W117-122.；Cermak等人，《核酸研究》(2011).39:e82；和tale-nt.cac.comell.edu/about.
CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代方案。CRISPR系统基于RNA指导的工程设计核酸酶，该核酸酶使用互补碱基配对识别靶向位点处的DNA序列。
CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖的方式切割外源DNA来保护它们免受入侵核酸如病毒的侵害。通过在CRISPR基因座近端的两个相邻重复序列之间整合被称为间隔子的入侵DNA的短片段来获得免疫力。CRISPR阵列(包括间隔子)在随后与侵入性DNA的接触中转录并加工成长度约40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)结合以激活并引导Cas9核酸酶。这将在入侵DNA中切割被称为原间隔子的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶向DNA下游存在保守的与原间隔子相邻的基序(PAM)，该基序通常具有序列5-NGG-3，但较少出现NAG。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，其必须在RNA和靶向DNA之间匹配。Cpf1和Csm1的行为类似于Cas9，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。
仍另一方面，所提供的烟草植物在编码烟碱脱甲基酶(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)的一个或多个基因座中还包括一个或多个突变，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或多个基因座中缺少一个或多个突变的对照植物相比，其使去甲烟碱量减少(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。一方面，当在相当的条件下生长和烘烤时，与对照植物相比，所描述的修饰的烟草植物还包括降低的烟碱脱甲基酶活性。
本公开还提供了用于抑制植物，特别是烟草属植物(包括各种商业变种的烟草植物)中的Nic1b_ERF基因座的一种或多种多肽的表达或功能的组合物和方法。
一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b_ERF抑制序列，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段组成的组的序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，其中，所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中，所述抑制序列具有与以下序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段的至少90％的序列同一性：所述序列具有与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段组成的组的序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。另一方面，本公开提供了烟草植物或其部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b_ERF抑制序列，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段组成的组的序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，其中，所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中，所述抑制序列具有与以下序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段的至少90％的序列同一性：所述序列具有与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205以及其片段组成的组的序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。一方面，所述Nic1b_ERF抑制序列能够转录为抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸选自由单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸和其组合组成的组。一方面，Nic1b_ERF抑制序列包括选自由SEQ ID NO108到119组成的组的序列。
如本文所用，术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibition)”和“抑制(inhibiting)”被定义为本领域已知或本文描述的降低感兴趣的基因产物(例如靶向基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物之间进行比较的背景下进行，例如，遗传改造的植物与野生型植物。替代地，靶向基因产物的表达或功能的抑制可以在相同植物内或不同植物之间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间进行比较的背景下进行，并且包括在同一植物或植物部分内的发育阶段或时间阶段之间的比较或者植物或植物部分之间的比较。“抑制”包括感兴趣的基因产物的功能或产生的任何相对降低，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”涵盖下调靶向基因产物的翻译和/或转录或靶向基因产物的功能活性的任何方法或组合物。一方面，来自修饰的植物中的Nic1b基因座的一个或多个基因的mRNA或蛋白质水平小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％或植物中同一个基因的蛋白质水平(不是突变体，或者尚未经过基因修饰以抑制该基因的表达)。
术语“抑制序列”涵盖能够对来自植物中的Nic1b_ERF基因座的烟碱生物合成调节所涉及的基因的表达或功能进行抑制的任何多核苷酸或多肽序列，如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义定向核苷酸序列、反义定向核苷酸序列、有义或反义定向核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的反向区、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列以及其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物、其组合等的序列。
抑制序列由靶向基因产物的名称指定。因此，“Nic1b_ERF抑制序列”是指能够对来自植物中的Nic1b_ERF基因座的烟碱生物合成调节所涉及的基因的表达(例如，在转录和/或翻译水平上)进行抑制或者能够抑制基因产物的功能的抑制序列。当在多核苷酸抑制序列的上下文中使用短语“能够抑制”时，意在表示抑制序列本身发挥抑制作用；或者，其中，抑制序列编码抑制性核苷酸分子(例如，发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)，或编码抑制性多肽(例如，抑制靶向基因产物的表达或功能的多肽)，在其转录后(例如，在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制序列的情况下)之后，转录或翻译产物分别对靶向基因产物发挥抑制作用(例如，抑制靶向基因产物的表达或功能)。
公开的Nic1b_ERF抑制序列可以是经由本领域已知的任何沉默途径或机制触发基因沉默的序列，包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA、人工或合成的microRNA以及人工反式siRNA。取决于期望的结果，Nic1b_ERF抑制序列的范围可以从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约70个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸、约400个核苷酸到编码本公开的蛋白质的全长多核苷酸。一方面，Nic1b_ERF抑制序列可以是长度为约50到约400个核苷酸之间、约70到约350个核苷酸之间、约90到约325个核苷酸之间、约90到约300个核苷酸之间、约90到约275个核苷酸之间、约100到约400个核苷酸之间、约100到约350个核苷酸之间、约100到约325个核苷酸之间、约100到约300个核苷酸之间、约125到约300个核苷酸之间或者约125到约275个核苷酸之间的片段。在一些实施例中，细胞色素P450多核苷酸的片段的长度为约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约225个、约250个、约275个、约300个、约325个、约350个、约400个核苷酸以及在约70到约400个核苷酸之间的其他这样的值。一方面，Nic1b_ERF抑制序列可以包括约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包括DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本公开的多核苷酸还涵盖序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
一方面，本公开提供了重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码能够结合至编码多肽的RNA的RNA分子，所述多肽具有的氨基酸序列具有与选自由SEQ ID编码：73、83、84、87到89、180、181、206和207以及222到228以及其片段组成的组的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性，并且其中，RNA分子抑制多肽的表达。一方面，RNA分子选自由microRNA、siRNA和反式siRNA组成的组。另一方面，重组DNA构建体编码双链RNA。还提供了转基因烟草植物或其部分、经烘烤的烟草材料或包含这些重组DNA构建体的烟草产品。一方面，与没有重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、经烘烤的烟草材料或烟草产品包含较低水平的烟碱。还提供了降低烟草植物的烟碱水平的方法，该方法包括用这些重组DNA构建体中的任一种转化烟草植物。
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元素之间的功能性连接。例如，感兴趣的多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许感兴趣的多核苷酸进行表达的功能性连接。可操作地连接的元素可以是连续的或不连续的。
如本文所用并且在参考序列使用时，“异源”是指源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从其在组合物和/或基因组位点中的天然形式进行实质性修饰的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也被称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体意指源自外来物种的构建体，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从其在组合物和/或基因组位点中的天然形式进行实质性修饰的构建体。异源核酸构建体包括但不限于例如经由转化方法或随后将转基因植物与另一感兴趣的植物育种而引入植物或其植物部分中的重组核苷酸构建体。一方面，所使用的启动子与该启动子驱动的序列是异源的。另一方面，所使用的启动子与烟草是异源的。另一方面，所使用的启动子对烟草是天然的。
一方面，描述的经修饰的烟草植物是顺基因植物。如本文所用，“同源转基因”或“顺基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中，所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，没有使用非植物来源组分)。一方面，所提供的经修饰的植物、植物细胞或植物基因组是顺基因的。所提供的顺基因植物、植物细胞和植物基因组可以形成现成的烟草品系。另一方面，所提供的经修饰的烟草植物不包含非烟草遗传材料或序列。
如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。
本文还提供了用于从植物，特别是烟草属的植物(包括各种商业变种的烟草植物)中的Nic1b_ERF基因座过表达一种或多种多肽的组合物和方法。
一方面，本公开提供了重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的启动子，所述多肽具有的氨基酸序列具有与选自由SEQ ID编码：73、83、84、87到89、180、181、206和207及222到228以及其片段组成的组的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。还提供了转基因烟草植物或其部分、经烘烤的烟草材料或包含这些重组DNA构建体的烟草产品。一方面，与没有重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、经烘烤的烟草材料或烟草产品包含较高水平的烟碱。还提供了增加烟草植物的烟碱水平的方法，该方法包括用任何这些重组DNA构建体转化烟草植物。
一方面，对于每个携带Nic1b_ERF相关转基因或突变的转基因或突变品系，还提供了这样的转基因或突变品系与针对Nic2基因座的一个或多个ERF基因的突变或转基因事件的组合。这样的一个或多个Nic2 ERF基因包括但不限于ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(Shoji等人，《植物细胞》(10):3390-409(2010))。特别感兴趣并在此提供的是一种对一个或多个、两个或多个、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或者七种或更多种Nic1b ERF样基因(例如，NCG1、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF 101、ERF 110、ERF 16、ERF130)和一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF 179、ERF 17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的组合的植物。特别感兴趣并在此提供的是一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF 110、ERF 16、ERF130)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF 189、ERF115或两者具有转基因或诱变抑制作用的植物。在此还提供了一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF 101、ERF110、ERF 16、ERF 130)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF189具有转基因或诱变抑制作用的植物。另一方面，在此提供了一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF115具有转基因或诱变抑制作用的植物。特别感兴趣并在此提供的是一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG1、NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)和一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF 179、ERF 17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的组合的植物。特别感兴趣并在此提供的是一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF189、ERF115或两者具有转基因或诱变抑制作用的植物。在此提供了一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF189具有转基因或诱变抑制作用的植物。另一方面，在此提供了一种对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四个Nic1b ERF样基因(例如，NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)具有转基因或诱变抑制作用的组合和对ERF115具有转基因或诱变抑制作用的植物。
在另外的方面，提供了一种对NCG12具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(例如，ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF 17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对NCG15具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对NCG16具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对NCG17具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对ERF101具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对ERF110具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对ERF16具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。另一方面，提供了一种对ERF130具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对四种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对六种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对六种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于两个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于两个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或者少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于三个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于三个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或者少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于四个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于四个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或者少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于五个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于五个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或者少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，这种植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或者少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对四种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对六种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对六种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于两个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于两个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于三个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于三个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于四个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于四个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于五个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于五个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下缺乏转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这种植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。一方面，提供了一种对少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。
一方面，提供了一种对一种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下不具有这样的Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，前述植物中的任何植物均包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种对少于两个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个或者少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下不具有这样的Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，前述植物中的任何植物均包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种对一种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下不具有这样的Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这样的植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种对少于两个Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对少于两个、少于三个、少于四个、少于五个或者少于六个Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对两种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对三种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对四种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，提供了一种对五种或更多种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用和对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用的烟草植物。一方面，与在相当的条件下不具有Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，这样的植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87至89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对两种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对两种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对两种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对三种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对三种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对三种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于两种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于两种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于两种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于两种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于三种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于三种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于三种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于三种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87至89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于四种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于四种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于四种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于四种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87至89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于五种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于五种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于五种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少95％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性，并且所述烟草植物还对少于五种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变抑制作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少95％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变抑制作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。
在一方面，对Nic2_ERF基因的诱变抑制作用不包含整个Nic2_ERF基因或整个Nic2_ERF编码区的缺失。在一方面，对Nic2_ERF基因的诱变抑制作用包含整个Nic2_ERF基因或整个Nic2_ERF编码区的缺失。在一方面，对Nic1b_ERF基因的诱变抑制作用不包含整个Nic1b_ERF基因或整个Nic1b_ERF编码区的缺失。在一方面，对Nic1b_ERF基因的诱变抑制作用包含整个Nic1b_ERF基因或整个Nic1b_ERF编码区的缺失。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84、87到89、180、181、206和207组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。
一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述基因包括的序列具有与选自由208、212、215和219组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述基因包括的序列具有与选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54组成的组的核苷酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，提供了一种烟草植物，所述烟草植物对一种或两种编码多肽的Nic2_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述多肽包括的序列具有与选自由222和226组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且所述烟草植物还对一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种编码多肽的Nic1b_ERF基因具有转基因或诱变过表达作用，所述多肽包括的序列具有与选自由SEQ ID NO73、83、84和87到89组成的组的氨基酸序列的至少90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，与在相当的条件下缺乏这样的转基因或诱变过表达作用的对照植物相比，本段描述的植物包含较高的烟碱或总生物碱水平。
一方面，较低的烟碱或总生物碱水平是指与在相当的条件下的对照植物相比减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。
一方面，较高的烟碱或总生物碱水平是指与在相当的条件下的对照植物相比增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％。
一方面，重组DNA构建体或表达盒还可以包括用于选择转基因细胞的可选择的标记物基因。可选择的标记物基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，如草铵膦、溴氧腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)。其他可选择的标记物包括表型标记物，如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)。
一方面，重组DNA构建体或表达盒包括选自由组成性启动子、诱导性启动子和组织优选的启动子(例如，叶特异性或根特异性启动子)组成的组的启动子。示例性组成性启动子包括美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子和其他组成性启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)《自然》313：810-812)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBOJ 3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等。示例性的化学诱导性启动子包括由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。感兴趣的其他化学诱导性启动子包括类固醇响应性启动子(参见，例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美国88:10421-10425和McNellis等人(1991)植物J.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导性启动子)和四环素诱导性启动子(参见，例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美国专利No.5,814,618和5,789,156)。可以使用的其他示例性启动子是负责以下的启动子：热调节基因表达、光调节基因表达的(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；豌豆中的叶绿素alb结合蛋白基因；或Arabssu启动子)、激素调节基因表达(例如，小麦Em基因的脱落酸(ABA)响应序列；大麦和拟南芥的ABA诱导的HVA1和HVA22以及rd29A启动子；和伤口诱导的基因表达(例如，wunl的表达)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性贮藏蛋白基因的表达；来自描述的玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或薯角豆(β-菜豆素基因)或病原体诱导性启动子(例如PR-1、prp-1或(β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导性wirla启动子和分别为烟草和欧芹的线虫诱导性启动子TobRB7-5A和Hmg-1)。
一方面，所提供的烟草植物还包括与烟碱生物合成或运输有关的基因的活性的增加或减少的表达。涉及烟碱生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸酯转移酶(QPT)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尽管已经提出了两种候选基因(A622和NBB1)，但尚未阐明可催化烟碱酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间的缩合步骤的烟碱合成酶。参见US 2007/0240728A1和US 2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白质。另外，几种转运蛋白可以参与烟碱的转运。已经克隆并表征了被称为MATE的转运蛋白基因(Morita等人，PNAS106:2447-52(2009))。
一方面，所提供的烟草植物还包括对选自由PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1组成的组的产物进行编码的一种或更多种基因中的与对照烟草植物相比增加或降低水平的mRNA、蛋白质或两者。另一方面，所提供的烟草植物还包括对选自由PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1组成的组的产物进行编码的一种或更多种基因的表达进行直接抑制的转基因。另一方面，所提供的烟草植物还包括对选自由PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBBL组成的组的产物进行编码的一种或更多种基因的表达或活性进行抑制的转基因或突变。另一方面，所提供的烟草植物还包括对选自由PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1组成的组的产物进行编码的一种或更多种基因进行过表达的转基因。
还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法描述的用重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导方法。“稳定转化”是指导入植物的感兴趣的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代遗传的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物中并且仅在植物中临时表达或仅瞬时存在。
将多核苷酸引入本公开的植物细胞中的合适方法包括微量注射(Crossway等人(1986)《生物技术》4:320-334)、电穿孔(Shillito等人(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.美国83:5602-5606)、《农杆菌介导的转化》(美国专利No.5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722)和《弹道粒子加速》(参见，例如，美国专利No.4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomes等人(1995)《植物细胞、组织和器官培养基本方法》，编辑Gamborg和Phillips(施普林格出版公司，柏林)；McCabe等人(1988)《生物技术》6:923-926)。另参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou等人(1988)《植物生理学》87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)《生物/技术》6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；De Wet等人(1985)《卵子组织的实验操纵》编辑Chapman等人(朗曼出版社，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)《植物细胞报告》9:415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等人(1992)《植物细胞》4:1495-1505(电穿孔)。
另一方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将重组构建体或表达盒引入植物中。通常，这样的方法涉及将本公开的表达盒掺入病毒DNA或RNA分子内。公认的是，用于表达盒的启动子也涵盖用于病毒RNA聚合酶转录的启动子。用于将多核苷酸引入植物并表达其中编码的涉及病毒DNA或RNA分子的蛋白质的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)《分子生物技术》5:209-221。
可以随后使用克隆方法繁殖的任何植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用重组构建体或表达盒进行转化。所谓“器官发生”意指从分生组织中心依次生长出芽和根的过程。“胚胎发生”意指从体细胞或配子以一致的方式(而不是依次地)一起生长芽和根的过程。适用于所描述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚胎等。
一方面，所提供的烟草植物是选自由熏烤的烟草、晾干的烟草、深色晾干的烟草、深色火烤的烟草、Galpao烟草和东方烟草组成的组的烟草类型。另一方面，所提供的烟草植物是来自选自由以下组成的组的烟草类型：白肋烟草、马里兰烟草和深色烟草。
在一方面，所提供的烟草植物处于熏烤的烟草的背景中或表现出此处所述的一种或更多种熏烤的烟草的特征。熏烤的烟草(也被称为弗吉尼亚烟草或亮烟草)约占世界烟草产量的40％。熏烤的烟草通常也被称为“亮烟草”，因为它在烘烤过程中达到金黄色到深橙色。熏烤的烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。熏烤的烟草一般含糖量高而含油量低。熏烤的烟草的主要种植国是阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于熏烤的烟草的背景，该背景选自由以下组成的组：CC13、CC 27、CC 33、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K399、K326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、斯佩特168、斯佩特220、斯佩特225、斯佩特227、斯佩特236和基本上衍生自前述任一变种的任何变种。另一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于熏烤的烟草的背景，该背景选自由以下组成的组：Coker 48、Coker 176、Coker 371-金、Coker 319、Coker 347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、McNair 373、McNair 944、Ox 207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、斯佩特H-20、斯佩特G-28、斯佩特G-58、斯佩特G-70、斯佩特G-108、斯佩特G-111、斯佩特G-117、斯佩特168、斯佩特179、斯佩特NF-3、Va 116、Va 182和基本上衍生自前述任一变种的任何变种。参见WO 2004/041006A1。在另外的方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交体、变种或品系处于选自由K326、K346和NC196组成的组的任何熏烤的背景。
一方面，所提供的烟草植物处于晾干的烟草的背景或表现出此处所述的一种或更多种晾干的烟草的特征。晾干的烟草包括白肋烟草、马里兰烟草和深色烟草。共同因素是烘烤主要是没有热和湿气的人工源。白肋烟草的颜色为浅棕色至深棕色、含油量高且含糖量低。白肋烟草在谷仓中晾干。白肋烟草的主要种植国是阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。马里兰烟草非常蓬松、燃烧性能好、烟碱低并且香气中性。马里兰主要的种植国包括美国和意大利。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于白肋烟草的背景，该背景选自由以下组成的组：Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、Bu 21xKy 10、HB04P、Ky 14xL 8、Kt 200、Newton98、Pedigo 561、Pf561和Va509。另一方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交体、变种或品系处于选自由TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488组成的组的任何白肋背景中。另一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于选自由Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872和Md 341组成的组的马里兰烟草背景。
一方面，所提供的烟草植物处于深色晾干的烟草的背景或表现出一种或更多种此处描述的深色晾干的烟草的特征。深色晾干的烟草与其他类型的区别主要在于其烘烤过程，该烘烤过程使深色晾干的烟草具有中度至深褐色的颜色并具有独特的香气。深色晾干的烟草主要用于嚼烟和鼻烟的生产。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于选自由Sumatra、Jatim、Dominican Cubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginia晒干和Paraguan Passado组成的组的深色晾干的烟草的背景。
一方面，所提供的烟草植物处于深色火烤的烟草的背景或表现出此处所述的一种或多种深色火烤的烟草的特征。通常，在封闭的烤房地板上，用低火柴火将深色火烤的烟草进行烘烤。它们的叶子含糖量低而烟碱含量高。深色火烤的烟草用于制作烟斗混合物、香烟、嚼烟、鼻烟和味道浓郁的雪茄。深色火烤的烟草的主要生长地区是美国的田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于深色火烤的烟草的背景，该背景选自由以下组成的组：Narrow Leaf Madole、改善型Madole、TomRosson Madole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TND950、VA 309和VA 359。
一方面，所提供的烟草植物处于东方烟草的背景或表现出此处所述的一种或更多种东方烟草的特征。由于东方烟草通常生长在地中海东部地区如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚，因此也被称为希腊烟草、香气和土耳其烟草。今天的东方变种特有的小植物和小叶，以及其独特的香气特性，是由于过去几个世纪以来植物适应了生长在贫瘠的土壤和恶劣的气候条件下的结果。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于东方烟草的背景，该背景选自由以下组成的组：Izmir、Katerini、Samsun、Basma和Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir和基本上衍生自前述任一变种的任何变种。
一方面，此处所述的烟草植物、种子、杂交体、变种或品系(可以是低生物碱、低烟碱、高生物碱或高烟碱的)基本上源自或来源于以下遗传背景：BU 64、CC 101、CC 200、CC27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker319、Coker371金、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、窄叶Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、“珀里克”烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、斯佩特168、斯佩特172、斯佩特179、斯佩特斯佩特210、斯佩特220、斯佩特225、斯佩特227、斯佩特234、斯佩特G-28、斯佩特G-70、斯佩特H-6、斯佩特H20、斯佩特NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309或VA359、马里兰609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草变种。
上面提到的所有深色晾干的白肋、马里兰、深色火烤的或东方型的特定变种仅出于示例性目的列出。在本申请中还考虑了任何其他的深色晾干的白肋、马里兰、深色火烤的东方变种。
还提供了所描述的烟草植物的种群。一方面，烟草植物种群的种植密度为每英亩约5,000到约8000株之间、约5,000到约7,600株之间、约5,000到约7,200株之间、约5,000到约6,800株之间、约5,000到约6,400株之间、约5,000到约6,000株之间、约5,000到约5,600株之间、约5,000到约5,200株之间、约5,200到约8,000株之间、约5,600到约8,000株之间、约6,000到约8,000株之间、约6,400到约8,000株之间、约6,800到约8,000株之间、约7,200到约8,000株之间或约7,600到约8,000株之间。另一方面，烟草植物种群种植在具有低至中等肥力的土壤类型中。
还提供了来自所描述的烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可以容纳任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以容纳至少或大于约100颗、200颗、300颗、400颗、500颗、600颗、700颗、800颗、900颗、1000颗、1500颗、2000颗、2500颗、3000颗、3500颗、4000颗或更多颗种子。替代地，容器可以容纳至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多的种子。烟草种子的容器可以是本领域中可获得的任何容器。作为非限制性实例，容器可以是盒子、袋子、小包、小袋、带卷、管或瓶。
还提供了由所描述的低生物碱或低烟碱烟草植物制成的经烘烤的烟草材料。还提供了由所描述的烟草植物制成的经烘烤的烟草材料，其具有较高水平的总生物碱或烟碱。
“烘烤”是一种老化过程，可减少水分并破坏叶绿素，使烟草叶片呈金色并将淀粉转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，经烘烤的烟草具有较高的还原糖含量和较低的淀粉含量。一方面，所提供的绿叶烟草可以使用常规方式进行烘烤，例如，熏烤、轻度烘烤、火烤、晾干或晒干。对于不同类型的烘烤方法的描述，参见，例如，Tso(1999，《烟草、生产、化学和技术》Davis&Nielsen编辑，第1章，Blackwell出版社，牛津)。经烘烤的烟草通常在压缩条件下在木桶(例如，大木桶)或纸板箱中老化数年(例如，2到5年)，水分含量为10％到约25％之间。参见美国专利No.4,516,590和5,372,149。经过烘烤和老化的烟草然后可以被进一步加工。进一步的加工包括在引入或不引入不同温度的蒸汽、进行或不进行巴氏灭菌以及发酵或不发酵的情况下在真空下调节烟草。发酵的典型特征是具有高的初始水分含量、发热以及干重损失10％到20％。参见，例如，美国专利No.4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公布No.2005/0178398；和Tso(1999，《烟草、生产、化学和技术》第1章，Davis&Nielsen编辑，Blackwell出版社，牛津)。经烘烤、老化和发酵的烟草可以被进一步加工(例如，生切、切碎、膨化或混合)。参见，例如，美国专利No.4,528,993号；4,660,577；和4,987,907。一方面，本公开的经烘烤的烟草材料是晒干的。另一方面，本公开的经烘烤的烟草材料是熏烤的、晾干的或火烤的。
从本公开的烟草品系、变种或杂交体获得的烟草材料可以用于制作烟草产品。如本文所用，“烟草产品”被定义为旨在供人类使用或消费的由烟草制成或衍生自烟草的任何产品。
所提供的烟草产品包括但不限于香烟产品(例如，香烟和比迪烟)、雪茄产品(例如，雪茄包装的烟草和小雪茄烟)、烟斗烟草产品、衍生自烟草的产品、衍生自烟草的烟碱产品、无烟雾烟草产品(例如，湿鼻烟、干鼻烟和嚼烟)、薄膜、咀嚼片、标签，成形部件、凝胶、消耗单元、不溶性基质、空心形状、重构烟草、膨化烟草等。参见，例如，美国专利公布No.US2006/0191548。
如本文所用，“香烟”是指具有“杆”和“填充物”的烟草产品。香烟“杆”包括香烟纸、过滤嘴、卷烟纸(用于容纳过滤材料)、将香烟纸(包括填充物)保持在过滤嘴上的水松纸，以及将这些组分保持在一起的所有胶水。“填充物”包括：(1)所有烟草，包括但不限于重构和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可以随烟草卷入香烟纸中的其他佐料)，(3)肠衣，(4)调味剂和(5)所有其他添加剂(混合到烟草和替代品中并卷成香烟)。
如本文所用，“重构烟草”是指由烟草粉尘和其他烟草屑材料制成的一部分烟草填充物，被加工成片的形式并被切成条状以类似于烟草。除了节省成本外，重构烟草对于其通过利用氨与糖之间的反应来处理风味而产生的香烟味道也非常重要。
如本文所用，“膨化烟草”是指烟草填充物的一部分，其通过合适的气体的进行膨化处理，以使烟草被“抽吸”，从而导致密度降低且填充能力更大。其减轻了香烟中使用的烟草的重量。
源自本公开的植物的烟草产品还包括香烟和其他吸烟制品，特别是包括过滤元件的那些吸烟制品，其中可吸烟材料的杆包括在烟草混合物中的经烘烤的烟草。一方面，本公开的烟草产品选自由以下组成的组：小雪茄、不通风的隐蔽式过滤嘴香烟、通风的隐蔽式过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶烟草、水烟烟草、切碎的烟草和生切烟丝。另一方面，本公开的烟草产品是无烟雾烟草产品。无烟雾烟草产品不燃烧，并且包括但不限于嚼烟、潮湿的无烟雾烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗略划分的烟叶，通常装在较大的袋状包装中，并以塞子或旋拧的形式使用。潮湿的无烟雾烟草是一种湿润的、细分程度更高的烟草，以散装形式或袋装形式提供，通常包装在圆罐中，并且用作一撮或放在成年烟草消费者的脸颊和口香糖之间的袋中。鼻烟是经过热处理的无烟雾烟草。干鼻烟是放在口中或经鼻使用的细磨烟草。在另外的方面，本公开的烟草产品选自由散叶嚼烟、插塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。又一方面，本公开的烟草产品选自由电加热的香烟、电子烟、电子蒸发装置组成的组。
一方面，本公开的烟草产品可以是混合的烟草产品。另一方面，本公开的烟草产品可以是低烟碱烟草产品。在另外的方面，本公开的烟草产品可以包含小于约3mg/g的水平的去甲烟碱。例如，这样的产品中的去甲烟碱含量可以为3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750pg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g或无法检测到。
一方面，所提供的经烘烤的烟草材料或烟草产品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。另一方面，所提供的经烘烤的烟草材料或烟草产品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％到0.02％之间、0.02％到0.05％之间、0.05％到0.75％之间、0.75％到0.1％之间、0.1％到0.15％之间、0.15％到0.2％之间、0.2％到0.3％之间、0.3％到0.35％之间、0.35％到0.4％之间、0.4％到0.5％之间、0.5％到0.6％之间、0.6％到0.7％之间、0.7％到0.8％之间、0.8％到0.9％之间、0.9％到1％之间、1％到1.1％之间、1.1％到1.2％之间、1.2％到1.3％之间、1.3％到1.4％之间、1.4％到1.5％之间、1.5％到1.6％之间、1.6％到1.7％之间、1.7％到1.8％之间、1.8％到1.9％之间、1.9％到2％之间、2％到2.1％之间、2.1％到2.2％之间2.2％到2.3％之间、2.3％到2.4％之间、2.4％到2.5％之间、2.5％到2.6％之间、2.6％到2.7％之间、2.7％到2.8％之间、2.8％到2.9％之间、2.9％到3％之间、3％到3.1％之间、3.1％到3.2％之间、3.2％到3.3％之间、3.3％到3.4％之间、3.4％到3.5％之间、3.5％到3.6％之间。在另外的方面，所提供的经烘烤的烟草材料或烟草产品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％到0.1％之间、0.02％到0.2％之间、0.03％到0.3％之间、0.04％到0.4％之间、0.05％到0.5％之间、0.75％到1％之间、0.1％到1.5％之间、0.15％到2％之间、0.2％到3％之间、0.3％到3.5％之间。
本公开还提供了用于培育包括期望的总生物碱或烟碱水平(例如，低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培品种或变种的方法。可以通过任何已知过程执行育种。在标记物辅助选择(MAS)育种程序中，可以使用DNA指纹、SNP图谱、单倍型作图或类似技术以将期望的性状或等位基因转移到烟草植物中或在烟草植物中育种。例如，育种者可以使用F1杂交植物在F2或回交代中产生分离群体，或者进一步使F1杂交植物与具有农学上期望的基因型的其它供体植物杂交。F2代或回交代的植物可以使用本领域已知的或本文列出的技术之一筛选出期望的农艺性状或期望的化学特征。根据期望的遗传模式或所使用的MAS技术，可以在每个回交周期之前对所选植物进行自花授粉，以辅助鉴定期望的单个植物。可以重复回交程序或其它育种程序，直到恢复轮回亲本的期望表型。本公开中的轮回亲本可以是烤烟变种、白肋烟变种、深色风干变种、深色火烤烟变种或东方变种。可以在例如以下中找到其它育种技术：Wernsman,E.A.,和Rufty,R.C.1987.第十七章《烟草》第669-698页，栽培品种培育作物物种。W.H.Fehr(编辑),麦克米伦出版公司,Inc.,New York,N.Y.，其通过引用以其整体并入本文。
使用所描述的烟草植物的植物育种计划的结果包含本公开的有用品系、品种、变种、后代、近交体和杂交体。如本文所用，术语“变种”是指具有使其与同一物种的其它植物分开的恒定特征的植物群体。变种通常是(虽然不总是)商业销售的。虽然变种具有一个或多个独特的特征，但变种进一步表征为所述变种内个体之间的总体差异非常小。“纯系”变种可以通过若干代自花授粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本进行营养繁殖而产生。变种可以基本衍生自另一个品系或变种。如由《国际植物新变种保护公约(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants)》(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日、1991年3月19日在日内瓦修订)所定义的，在以下情况下，变种“基本衍生”自初始变种：a)所述变种主要衍生自初始变种，或衍生自主要衍生自初始变种的变种，同时保留由初始变种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达；b)所述变种与初始变种明显不同；以及c)除了由衍生行为导致的差异外，所述变种在由初始变种的基因型或基因型组合导致的基本特征的表达方面符合初始变种。基本衍生的变种可以通过例如选择天然的或诱导的突变体、体细胞克隆变体、来自初始变种植物的变种个体、回交或转化而获得。第一烟草变种和第一变种所基本衍生的第二个烟草变种被视为具有基本相同的遗传背景。区别于变种的“品系”通常指一组非商业用途的植物，例如用于植物研究中。品系通常显示个体之间的一个或多个感兴趣的特征的总体变化很小，但是个体之间的其它特征可能存在一些变化。
一方面，本公开提供了一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于染色体间隔中，所述染色体间隔位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何两个标记物的两侧；(c)选择包括低烟碱性状的后代烟草植物。另一方面，这些方法进一步包括将所选后代烟草植物与所述第二烟草变种回交。在另外的方面中，这些方法进一步包括：(d)将所述后代植物与其本身或与所述第二烟草变种杂交以产生一种或多种另外的后代烟草植物；以及(e)选择包括所述低烟碱性状的另外的后代烟草植物。一方面，所述选择步骤(e)包括标记物辅助选择。一方面，这些方法产生包括低烟碱性状的单基因转化。一方面，这些方法产生包括Nic1b_ERF基因渗入的单基因转化。一方面，所述第二烟草变种是优良变种。另一方面，这些方法的基因分型步骤涉及一种或多种分子标记物检测。另一方面，此方法所使用的多态性标记物选自由以下组成的组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。另一方面，所选后代烟草植物包括与LA Burley 21相比，位于Nic1b_ERF基因座处的更短的染色体基因渗入。
另一方面，本公开提供了一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何一个SNP标记物或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何基因座的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内；(c)选择包括低烟碱性状的后代烟草植物。一方面，此方法包括同时或并发选择与Nic1b_ERF基因座相关联或连接的一种或多种分子标志物以及与Nic2基因座相关联或连接的一种或多种分子标志物。
一方面，本公开提供了一种选择具有低烟碱性状的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)从烟草种质集合中分离核酸；(b)检测与Nic1b_ERF基因座紧密连接的一种或多种标记物的核酸；以及(c)基于所述标记物检测选择具有低烟碱性状的烟草植物。一方面，检测到的与Nic1b_ERF基因座连接的一种或多种标记物位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何一个SNP标记物或者位于具有选自由SEQ ID NO3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202到205组成的组的序列的任何基因座的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。另一方面，此方法进一步包括检测与Nic2基因座连接的一种或多种标记物。一方面，检测到的与Nic2基因座连接的一种或多种标记物位于定位于ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168之一中的多态形基因座中的任何一个多态形基因座的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。一方面，此方法进一步包括测定所选植物的所述烟碱水平以确认所述低烟碱性状。
还公开了一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于染色体间隔中，所述染色体间隔位于选自由SEQ IDNO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何两个标记物的两侧；(c)选择包括低烟碱性状的后代烟草植物。一方面，这些方法产生包括低烟碱性状的单基因转化。一方面，这些方法产生包括Nic2基因渗入的单基因转化。一方面，所述第二烟草变种是优良变种。另一方面，这些方法的基因分型步骤涉及一种或多种分子标记物检测。另一方面，此方法所使用的多态性标记物选自由以下组成的组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。另一方面，所选后代烟草植物包括与LA Burley21相比，位于Nic2基因座处的更短的染色体缺失。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标记物所定位的染色体区。本公开的基因座包括群体中的一种或多种多态性；例如，在一些个体中存在替代性等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小到1个核苷酸碱基，但其长度通常较大。例如，第一个等位基因可以出现在一条染色体上，而第二个等位基因出现在第二条同源染色体上，例如，出现在杂合个体的不同染色体上，或者群体中不同纯合子或杂合个体之间。如本文所用，术语“染色体间隔”指定驻留在单个染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。
如本文所用，厘摩(“cM”)是重组频率的测量单位。一个cM等于一个基因座位处的标记物由于单代杂交而与第二基因座处的标记物分离的概率为1％。本文所指的遗传距离可以使用科桑比函数(Kosambi function)根据重组值计算(科桑比，来自重组值的图距估算《优生学年报(Annals of Eugenics)》,12:172-75(1944))。
如本文所用，“与…紧密连接”或“与…相关联”意指标记物或基因座位于另一个标记物或基因座的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。例如，20cM意指标记物和基因座之间以小于或等于约约20％频率重组。
如本文所用，“基因渗入(introgression或introgress)”是指将基因座位的期望等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。
如本文所用，“杂交的”或“杂交”意指通过受精(例如，细胞、种子或植物)产生后代，并且包括植物间杂交(有性)和自体受精(自交)。
如本文所用，“回交(backcross和backcrossing)”是指后代植物与其亲本之一重复回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有要基因渗入的期望基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(已使用一次或多次)或“轮回”亲本(已使用两次或多次)是指基因或基因座正在基因渗入到的亲本植物。最初的杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此类推。一方面，重复执行回交，其中每个连续回交代的后代个体本身与同一亲本基因型回交。
如本文所用，“经过单基因转换”或“单基因转换”是指使用称为回交的植物育种技术或通过基因工程开发的植物，其中除了通过回交技术或通过基因工程转移到变种中的单基因之外，还基本上恢复了变种的所有期望形态特征和生理特征。
如本文所用，“优良变种”意指由于育种和选择优良农艺性状表现而产生的任何变种。
如本文所用，在标记物辅助选择或育种的上下文中，“选择(selecting或selection)”是指通常基于某些预定标准从群体中挑选或选择期望个体的行为。
如本文所用，术语“性状”是指细胞或生物体的可能受基因型的影响的一种或多种可检测的特征。表型可以用肉眼观察到，或者通过本领域已知的任何其它评估手段观察到，例如显微镜检查、生化分析、基因组分析、特定疾病耐受性的检测等。在一些情况下，表型由单基因或基因座位直接控制，例如“单基因性状”。在其它情况下，表型是若干个基因的结果。
如本文所用，“标记物检测”意指使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如测量至少一种表型(如种子颜色、花颜色或其它视觉可检测性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增片段多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等。
如本文所用，“标记物辅助选择”(MAS)是基于标记物基因型选择表型的过程。“标记物辅助选择育种”是指通过检测植物中的一种或多种核酸来选择一株或多株植物中的一种或多种期望性状的过程，其中核酸与期望性状相连，并且然后选择具有这一个或多个核酸的植物或种质。
如本文所用，“多态性”意指群体中存在一种或多种变型。多态性可能表现为核酸核苷酸序列的变型或表现为蛋白质氨基酸序列的变型。多态性包含在一个或多个个体群体中的一个或多个基因座处存在一种或多种核酸序列或核酸特征的变型。变型可以包括但不限于一个或多个核苷酸碱基的改变、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可能来自核酸复制的随机过程、通过诱变、作为可移动基因组元素的结果、来自拷贝数的变化和减数分裂过程，如不相等的杂交，基因组复制和染色体断裂和融合。变型可以在普遍存在于群体中或可能以低频率存在于群体内，前者在一般植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变型相关联。有用的多态性可以包含单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。遗传标记物、基因、DNA衍生序列、RNA衍生序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、microRNA、siRNA、耐受基因座、卫星标记物、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式还可以包括多态性。另外，前述拷贝数的存在、缺失或变型可能包括多态性。
如本文所用，“SNP”或“单核苷酸多态性”意指当基因组序列中的单核苷酸(A、T、C或G)改变或可变时发生的序列变型。“SNP标记物”在SNP映射到基因组上的位点时存在。
如本文所用，“标记物”或“分子标记物”或“标记物基因座”是用于表示足够独特以表征基因组上的特定基因座的核酸或氨基酸序列的术语。任何可检测的多态性状都可以用作标记物，只要其是有差异遗传的并且表现出与感兴趣的表型性状的连锁不平衡。因此，每个标记物是具有独特的核苷酸序列的特定DNA片段的指示剂。图位提供了特定标记物相对于彼此的相对位置的量度。在说明性状与给定标记物连接时，应理解，序列影响性状的实际DNA片段通常与标记物共分离。如果在性状的两侧都鉴定出标记物，则可以获得性状的更精确和明确的定位。通过测量杂交后代中一种或多种标记物的外观，可以在无需实际评估性状本身的外观的情况下通过相对简单的分子测试检测性状的存在，这可能是困难且耗时的，因为性状的实际评估需要植物生长到能够表达性状的阶段和/或环境条件下。一方面，所使用的标记物使用本领域已知的方法(如Qgene版本2.23(1996)和缺省参数)测量的Nic1b_ERF基因座或Nic2_ERF基因座的LOD分数为2或更大、3或更大、4或更大、5或更大、6或更大、7或更大、8或更大、或9或更大。
应理解，本公开的任何烟草植物可以进一步包括另外的农学上期望的性状，例如，通过使用本领域已知的技术用遗传构建体或反式基因转化。期望性状的实例不限于具有：除草剂抗性、害虫抗性、疾病抗性；高产；高等级指数值；可熟化性；熟化质量；机械收获能力；保持能力；叶片质量；高度、植物成熟度(如早熟、早至中熟、中熟、中至晚熟或晚熟)；茎大小(例如，小茎、中茎或大茎)；或每株植物的叶数(例如，小数量(例如，5-10片叶)，中等数量(例如，11-15片叶)，或大数量(例如，16-21片)叶片)，或任何组合。一方面，所公开的低烟碱或无烟碱的烟草植物或种子包括表达一种或多种杀虫蛋白，例如苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或蜡样芽胞杆菌的植物杀虫蛋白，如VIP3(参见例如Estruch等人,(1997)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》)15:137)的一种或多种转基因。另一方面，烟草植物进一步包括赋予对褐茎腐病抗性(美国专利第5,689,035号)或对孢囊线虫抗性(美国专利号5,491,081)的基因渗入性状。
本公开还提供了烟草植物，所述烟草植物包括经改变的烟碱水平或总生物碱水平，但在此烟碱水平未改变的情况下具有与对应初始烟草植物的产量相当的产量。一方面，低烟碱或无烟碱的烟草变种提供了选自由以下组成的组的产量：约1200到3500lbs/英亩之间、1300到3400lbs/英亩之间、1400到3300lbs/英亩之间、1500到3200lbs/英亩之间、1600到3100lbs/英亩之间、1700到3000lbs/英亩之间、1800到2900lbs/英亩之间、1900到2800lbs/英亩之间、2000到2700lbs/英亩之间、2100到2600lbs/英亩之间、2200到2500lbs/英亩之间、2300到2400lbs/英亩。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草变种提供了选自由以下组成的组的产量：约1200到3500lbs/英亩之间、1300到3500lbs/英亩之间、1400到3500lbs/英亩之间、1500到3500lbs/英亩之间、1600到3500lbs/英亩之间、1700到3500lbs/英亩之间、1800到3500lbs/英亩之间、1900到3500lbs/英亩之间、2000到3500lbs/英亩之间、2100到3500lbs/英亩之间、2200到3500lbs/英亩之间、2300到3500lbs/英亩、2400到3500lbs/英亩之间、2500到3500lbs/英亩之间、2600到3500lbs/英亩之间、2700到3500lbs/英亩之间、2800到3500lbs/英亩之间、2900到3500lbs/英亩之间、3000到3500lbs/英亩之间、3100到3500lbs/英亩之间。在另外的方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物的产量为除了nic1b_erf突变、nic2突变、Nic1b_ERF转基因、Nic2转基因或其组合之外基本上具有相同遗传背景的对照植物的产量的65％到130％之间、70％到130％之间、75％到130％之间、80％到130％之间、85％到130％之间、90％到130％之间、95％到130％之间、100％到130％之间、105％到130％之间、110％到130％之间、115％到130％之间或120％到130％之间。在另外的方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物的产量为除了nic1b_erf突变、nic2突变、Nic1b_ERF转基因、Nic2转基因或其组合之外基本上具有相同遗传背景的对照植物的产量的70％到125％之间、75％到120％之间、80％到115％之间、85％到110％之间或90％到100％之间。
一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)不表现出一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或所有的LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)不表现出两种或更多种LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)不表现出三种或更多种LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)表现出比LA BU21、LAFC53或LN KY171低的水平的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或所有的LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)表现出比LA BU21、LAFC53或LN KY171低的水平的两种或更多种LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)表现出比LA BU21、LAFC53或LN KY171低的水平的三种或更多种或所有的LA BU21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶片面积叶肉细胞较多和烘烤后最终产品质量差。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草变种)包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，而基本上不影响选自由以下组成的组的性状：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的易感性、打顶后多胺含量、叶绿素水平、单位叶面积叶肉细胞数和烘烤后最终产品质量。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步包括与未经修饰的对照植物基本相当的性状，其中所述性状选自由以下组成的组：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的易感性、打顶后多胺含量、叶绿素水平、单位叶面积叶肉细胞数和烘烤后最终产品质量。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地产量相对于未经修饰的对照植物的产量大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地产量相对于未经修饰的对照植物的产量介于70％与140％之间、75％与135％之间、80％与130％之间、85％与125％之间、90％与120％之间、95％与115％之间或100％与110％之间。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地产量相对于未经修饰的对照植物的产量介于70％与80％之间、75％与85％之间、80％与90％之间、85％与95％之间、90％与100％之间、95％与105％之间、105％与115％之间、110％与120％之间、115％与125％之间、120％与130％之间、125％与135％或130％与140％之间。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地打顶后的多胺含量相对于未经修饰的对照植物的打顶后的多胺含量大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地打顶后的多胺含量相对于未经修饰的对照植物的打顶后的多胺含量介于70％与140％之间、75％与135％之间、80％与130％之间、85％与125％之间、90％与120％之间、95％与115％之间或100％与110％之间。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地打顶后的多胺含量相对于未经修饰的对照植物的打顶后的多胺含量介于70％与80％之间、75％与85％之间、80％与90％之间、85％与95％之间、90％与100％之间、95％与105％之间、105％与115％之间、110％与120％之间、115％与125％之间、120％与130％之间、125％与135％或130％与140％之间。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地叶绿素水平相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地叶绿素水平相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平介于70％与140％之间、75％与135％之间、80％与130％之间、85％与125％之间、90％与120％之间、95％与115％之间或100％与110％之间。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地叶绿素水平相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平介于70％与80％之间、75％与85％之间、80％与90％之间、85％与95％之间、90％与100％之间、95％与105％之间、105％与115％之间、110％与120％之间、115％与125％之间、120％与130％之间、125％与135％或130％与140％之间。
一方面，所公开的经修饰的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地单位叶面积叶肉细胞数相对于未经修饰的对照植物的单位叶面积叶肉细胞数大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地单位叶面积叶肉细胞数相对于未经修饰的对照植物的单位叶面积叶肉细胞数介于70％与140％之间、75％与135％之间、80％与130％之间、85％与125％之间、90％与120％之间、95％与115％之间或100％与110％之间。一方面，所公开的经过改良的烟草植物包括赋予期望性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，并且进一步地单位叶面积叶肉细胞数相对于未经修饰的对照植物的单位叶面积叶肉细胞数介于70％与80％之间、75％与85％之间、80％与90％之间、85％与95％之间、90％与100％之间、95％与105％之间、105％与115％之间、110％与120％之间、115％与125％之间、120％与130％之间、125％与135％或130％与140％之间。
一方面，所公开的低烟碱或无烟碱的烟草变种适应于机械化收获。另一方面，所公开的低烟碱或无烟碱的烟草变种机械化地收获。
一方面，所提供的烟草植物是杂交植物。可以通过以下产生杂交体：阻止第一个变种的母本植物(例如，种子亲本)的自花授粉，从而允许来自第二个变种的父本植物的花粉使母本植物受精，并且允许F1杂交种子在母本植物上形成。可以通过在花发育的早期去雄来阻止雌株的自花授粉。可替代地，可以使用一种雄性不育的形式来阻止母本植物上的花粉形成。例如，雄性不育可以通过雄性不育(MS)、其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育产生或自交不亲和产生。含有MS的母本植物特别有用。在母本植物是MS的方面，可以从雄性可育植物中收获花粉，并将所述花粉人工施加到MS母本植物的柱头上，并且收获所得到的F1种子。
可以使用植物来形成单交烟草F1杂交体。将来自父本植物的花粉人工转移到去雄的母本植物或雄性不育的母本植物中以形成F1种子。可替代地，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交体用作母本并与不同的父本杂交。作为另一种替代方案，可以产生双杂交，其中两个不同单交的F1后代本身是杂交的。当形成双杂交杂交体时，自交不亲和性可以用于特别有利地阻止母本的自花授粉。
一方面，低烟碱或无烟碱的烟草变种是雄性不育的。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草变种是胞质雄性不育的。可以通过本领域已知的任何方法产生雄性不育烟草。以下描述了产生雄性不育烟草的方法：Wernsman,E.A.,和Rufty,R.C.1987.第十七章《烟草》第669-698页，栽培品种培育作物物种。W.H.Fehr(编辑),麦克米伦出版公司,Inc.,New York,N.Y.第761页。
在另外的方面，所提供的烟草植物包含但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚果、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。一方面，所提供的烟草植物不包含种子。一方面，本公开提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是非生殖材料的并且不介导植物的自然繁殖。另一方面，本公开还提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是生殖材料的并且介导植物的自然繁殖。另一方面，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供了烟草植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
所提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、茎、茎、荚、花、花序、茎、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。另一方面，本公开提供了烟草植物叶绿体。在另外的方面，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、叶或根毛、贮藏根或块茎。另一方面，本公开提供了烟草原生质体。
熟练的技术人员理解烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。一方面，本公开提供了烟草胚乳。另一方面，本公开提供了烟草胚乳细胞。在另外的方面，本公开提供了一种雄性或雌性不育烟草植物，其在没有人干预的情况下不能繁殖。
一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包括与选自由SEQ ID NO：1到72、147、150、157到161、187到189和202到205以及其片段组成的组的序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。一方面，本发明提供了一种多肽或蛋白质，其包括与选自由SEQ ID NO：73到107、148、151、180到183、206、207和190到192组成的组的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。另一方面，本发明提供了一种多肽或蛋白质，其包括与选自由SEQ ID NO：73到107、148、151、180到183、206、207和190到192组成的组的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％类似性。另一方面，本发明提供了一种蛋白质的生物活性变体，其氨基酸序列选自由SEQ ID NO：73到107、148、151、180到183、206、207和190到192组成的组的氨基酸序列。本公开的蛋白质的生物活性变体可以与所述蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸残基。还提供了来自Nic1b_ERF基因座的基因或蛋白质的同源基因或蛋白质。“直向同源物”是衍生自共同的始祖基因并且作为物种形成的结果存在于不同物种中的基因。直向同源物可以在核苷酸序列和/或蛋白质序列水平上具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性或相似性。直向同源物的功能在物种间通常是高度保守的。
如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”是在指定比较窗口内为了最大对应性而进行比对时对两个序列中相同的残基的提及。当参考蛋白质而使用序列同一性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常由于保守的氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并且因此不会改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面存在差异时，序列同一性百分比可以向上调整，以纠正取代的保守性质。由于此类保守取代而不同的序列被视为具有“序列相似性”或“相似性”。
所提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以分离或基本上纯化。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分基本上或基本不含通常伴随如在其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白质或与其相互作用的组成。例如，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学物质。
本公开进一步提供了一种制造烟草制品的方法，所述方法包括来自所公开的烟草植物的烟草材料。一方面，方法包括调节处理由烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其含水量从介于约12.5％与约13.5％之间增加到约21％，从而混合经调节处理的烟草材料以产生期望的混合物。一方面，制造烟草制品的方法进一步包括对混合物进行包装加工或调味。通常，在包装加工期间，向混合物添加包装材料或酱料，以通过平衡化学组成来提高混合物的质量，并形成某些期望的风味特征。包装加工的另外的细节可以在《烟草生产、化学和技术》中找到，由L.Davis和M.Nielsen编辑，布莱克威尔科学，1999中找到。
所提供的烟草材料还可以使用包含但不限于以下的方法进行加工：热处理(例如，烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨胀和/或熟化的方法进行加工。发酵和非发酵烟草两者都可以使用这些技术加工。合适的经加工烟草的实例包含深色晾烟、深色火烤烟、白肋烟、烤烟和雪茄填充料或包装纸，以及来自全叶填塞操作的制品。一方面，烟草纤维包含以鲜重计高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398所描述的，可以通过加热、渗出水分和/或巴氏灭菌步骤来处理烟草。
所提供的烟草材料可以经历发酵。发酵的典型特征是初始含水分高、发热以及干重损失10％-20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373；和5,372,149。除了改变叶的香气，发酵还可以改变叶的颜色和质地中任意一种或两者。而且，在发酵过程期间，可以产生气体排出，可以吸收氧气，可以改变pH，并且可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,《烟草生产、化学和技术》第1章，Davis和Nielsen编辑,牛津布莱克威尔出版社)。在掺入到口腔制品中之前，可以进一步加工(例如，切割、膨胀、混合、碾磨或粉碎)经熟化的烟草或经熟化并发酵的烟草。在一些情况下，烟草是在与共聚物和任选的香料和其它添加剂混合之前，烘箱挥发物含量介于48重量％与50重量％之间的长切发酵熟化潮湿烟草。
一方面，所提供的烟草材料可以加工为期望尺寸。一方面，烟草纤维可以加工为平均纤维大小小于200微米。一方面，烟草纤维介于75微米与125微米之间。另一方面，烟草纤维加工为大小为75微米或更小。一方面，烟草纤维包含长切烟草，其可以被切割或切碎成宽度为约10切/英寸到约110切/英寸并且长度为约0.1英寸到约1英寸。双切烟草纤维可以具有一定范围的粒径，使得大约70％的双切烟草纤维落入-20目与80目的目径之间。
所提供的烟草植物可以处理为烘箱总挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％到约25重量％；约20重量％到约30重量％；约30重量％到约50重量％；约45重量％到约65重量％；或者约50重量％到约60重量％。本领域的技术人员将理解，“潮湿”烟草通常是指烘箱挥发物含量介于约40重量％与约60重量％之间(例如，约45重量％到约55重量％，或约50重量％)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”是通过计算样品在110℃的预热强制通风烘箱中干燥3.25小时后的重量损失百分比来确定。口腔制品的烘箱总挥发物含量不同于用于制造口腔制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量。所述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
以下列表提供了第一组示例性实施例。
1.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括Nic1b基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。
2.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
3.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
4.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括ERF189、ERF115或两者的一种或多种突变。
5.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。
6.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长和烘烤时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
7.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值是在类似条件下生长和烘烤时的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中对照植物除了突变之外还与烟草植物具有基本相同的遗传背景。
8.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％，其中对照植物除了突变之外还与烟草植物具有基本相同的遗传背景。
9.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平选自由以下组成的组：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％并且小于0.05％。
10.根据实施例1所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括直接抑制编码由以下组成的组的产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
11.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括Nic1b基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长和烘烤时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
12.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
13.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
14.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括ERF189、ERF115或两者的一种或多种突变。
15.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。
16.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值是所述对照植物的所述等级指数的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶。
17.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的所述对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。
18.根据实施例11所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括直接抑制编码由以下组成的组的产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
19.一种烟草变种的植物或烟草基因型，其包括nic1b突变，其中所述烟草变种具有与在类似生长条件下生长的对照烟草变种的叶等级指数相当的叶等级指数，其中除了所述突变之外，所述对照烟草变种与所述烟草变种具有基本上相同的遗传背景。
20.根据实施例19所述的植物或烟草基因型，其中所述烟草变种进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
21.根据实施例19所述的植物或烟草基因型，其中所述烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
22.根据实施例19所述的植物或烟草基因型，其中所述烟草植物进一步包括ERF189、ERF115或两者的一种或多种突变。
23.一种非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括选自由以下组成的组的烟碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％以及小于0.05％，其中烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为以下的叶：50或更多、55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。
24.根据实施例23所述的非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述非转基因烟草植物包括小于2.0％的烟碱水平并且在烘烤时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。
25.根据实施例23所述的非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述非转基因烟草植物包括小于1.0％的烟碱水平并且在烘烤时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。
26.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括Nic1b基因座的非转基因突变，其中所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱水平降低到比在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与所述对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中所述对照植物除了所述非转基因突变之外还与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
27.根据实施例1到26中任一项所述的烟草植物的群体。
28.一种来自根据实施例1到26中任一项所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
29.根据实施例28所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料通过选自由熏烤、晾干、火烤和晒干组成的组的烘烤工艺制成。
30.一种烟丝，其包括根据实施例28所述的经过烘烤的烟草材料。
31.根据实施例30所述的烟丝，其中所述经过烘烤的烟草材料构成所述烟丝中的经过烘烤的烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。
32.根据实施例30所述的烟丝，其中所述经过烘烤的烟草材料构成所述烟丝中的经过烘烤的烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。
33.一种烟草制品，其包括根据实施例28所述的经过烘烤的烟草材料。
34.根据实施例33所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由以下组成的组：香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。
35.根据实施例33所述的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。
36.根据实施例35所述的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自由散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。
37.一种再造烟草，其包括根据实施例28所述的经过烘烤的烟草材料。
38.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括Nic1b基因座的突变，其中所述突变在LA Burley 21变种中不存在。
39.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包括与所述LA Burley 21变种相比位于Nic1b基因座处的更短的染色体基因渗入。
40.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的无所述突变的对照烟草植物的烟碱水平低。
41.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的无所述突变的对照烟草植物中的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。
42.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的总生物碱水平比在类似生长条件下生长的无所述突变的对照烟草植物的总生物碱水平低。
43.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物与在类似生长条件下生长时的无所述突变的对照烟草植物相比包括较低水平的选自由以下组成的组的一种或多种生物碱：烟碱、降烟碱、假木贼碱和安那他品。
44.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与在类似生长条件下生长时的无所述突变的对照烟草植物相比，所述烟草植物包括类似水平的一种或多种化合物，所述一种或多种化合物选自由以下组成的组：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、二萜、西松烷内酯(cembrenoid)、糖酯和还原糖。
45.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变是纯合的。
46.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变是杂合的。
47.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变选自由以下组成的组的突变：点突变、缺失、插入、复制和倒置。
48.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变是通过选自由随机诱变和靶向诱变组成的组的方法引入的。
49.根据实施例48所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述目标突变由巨核酸酶、锌指核酸酶、TALEN或CRISPR介导。
50.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
51.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于基因内，所述基因包括与选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
52.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变降低了所述基因的表达或活性。
53.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于基因内，所述基因包括与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
54.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于基因内，所述基因包括与选自由SEQ ID NO：14、17、18、19、49、52、53、202到205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
55.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、202到205、54和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列内。
56.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：14、17、18、19、49、52、53、202和205到54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
57.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于基因内，所述基因包括与选自由SEQ ID NO：49、52、53、204、205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的编码序列。
58.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：49、52、53、204、205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列内。
59.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于编码多肽的基因内，所述多肽与选自由SEQ ID NO：84、87、88和89以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
60.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述植物进一步与在类似生长条件下生长时的无所述突变的烟草植物相比包括一个或多个基因的降低水平的mRNA、蛋白质或两者，所述一个或多个基因编码选自由以下组成的组的制品：PMT、MPO、QPT、BBL、MATE和A622。
61.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述植物进一步包括抑制编码由以下组成的组的产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
62.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物是杂交体。
63.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述部分选自由以下组成的组：叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚果、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。
64.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物来自选自由以下组成的组的变种：熏烤烟草、晾烟、深色火烤烟和Galpao烟草以及东方烟草。
65.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物来自选自由以下组成的组的变种：白肋烟草、马里兰烟草和深色晾烟。
66.根据实施例38所述的烟草植物的群体。
67.一种来自根据实施例38所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
68.根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料的烟碱水平比来自无所述突变的对照烟草植物的经过烘烤的烟草材料的烟碱水平低。
69.根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述烟草植物的烟碱水平介于0.2％与0.6％之间。
70.根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述烟草植物的烟碱水平介于1.0％与3.0％之间。
71.根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料通过选自由熏烤、晾干、火烤和晒干组成的组的烘烤工艺制成。
72.一种烟丝，其包括根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料。
73.一种烟草制品，其包括根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料。
74.根据实施例73所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由以下组成的组：香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。
75.根据实施例73所述的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。
76.根据实施例75所述的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自由散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。
77.一种再造烟草，其包括根据实施例67所述的经过烘烤的烟草材料。
78.一种重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接到多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码具有与选自由SEQ ID NO：73到107、148、151、180到183、206、207和190到192以及其片段组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽。
79.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括根据实施例78所述的重组DNA构建体。
80.根据实施例79所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比无所述重组DNA构建体的对照烟草植物的烟碱水平高。
81.一种来自根据实施例79所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
82.一种烟草制品，其包括根据实施例81所述的经过烘烤的烟草材料。
83.一种提高烟草植物的烟碱水平的方法，所述方法包括用根据实施例78所述的重组DNA构建体转化烟草植物。
84.一种重组DNA构建体，其包括在烟草细胞中起作用并且可操作地连接到多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码能够与表面多肽的RNA相结合的RNA分子，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO：73到107、148、151、180到183、206、207和190到192以及其片段组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
85.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括根据实施例84所述的重组DNA构建体。
86.根据实施例85所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述RNA分子选自由microRNA、siRNA和反式siRNA组成的组。
87.根据实施例85所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述多核苷酸编码双链RNA。
88.根据实施例85所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比无所述重组DNA构建体的对照烟草植物的烟碱水平低。
89.一种来自根据实施例85所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
90.一种烟草制品，其包括根据实施例89所述的经过烘烤的烟草材料。
91.一种降低烟草植物的烟碱水平的方法，所述方法包括用根据实施例84所述的重组DNA构建体转化烟草植物。
92.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b抑制序列，所述基因包括选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列，其中所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中所述抑制序列与选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列的至少21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64,65个、66,67个、68,69个、70个、71,72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性。
93.根据实施例92所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述Nic1b抑制序列能够转录为抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸选自由单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸和其组合组成的组。
94.根据实施例92所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、诱导型启动子和组织优选启动子。
95.根据实施例92所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述启动子是根特异启动子。
96.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b抑制序列，所述基因包括选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列，其中所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中所述抑制序列与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列的至少21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64,65个、66,67个、68,69个、70个、71,72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性。
97.一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：
a.将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含所述低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；
b.针对连接到所述低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记物位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何两个SNP标记物两侧的染色体间隔中；以及
c.选择包括所述低烟碱性状的后代烟草植物。
98.根据实施例97所述的方法，其中所述方法进一步包括将所选后代烟草植物与所述第二烟草变种回交。
99.根据实施例97所述的方法，其中所述方法进一步包括：
d.将所述后代植物与其本身或与所述第二烟草变种杂交以产生一种或多种另外的后代烟草植物；以及
e.选择包括所述低烟碱性状的另外的后代烟草植物。
100.根据实施例99所述的方法，其中所述选择步骤(e)包括标记物辅助选择。
101.根据实施例97所述的方法，其中所述方法产生包括所述低烟碱性状的单基因转化。102.根据实施例97所述的方法，其中所述第二烟草变种是优良变种。
103.根据实施例97所述的方法，其中所述基因分型涉及一种或多种分子标记物检测。
104.根据实施例97所述的方法，其中所述多态性标记物包括选自由以下组成的组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。
105.根据实施例97所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
106.根据实施例97所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
107.根据实施例97所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：14、17、18、19、49、52、53、202到205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
108.根据实施例97所述的方法，其中所述第一烟草变种选自由LABurley 21、LAFC53和LN KY171组成的组。
109.根据实施例97所述的方法，其中所选的后代烟草植物包括与LABurley 21、LAFC53和LN KY171相比，位于Nic1b基因座处的更短的染色体基因渗入。
110.一种将低烟碱性状导入到烟草变种中的方法，所述方法包括：
a.将包含低烟碱性状的第一烟草变种与不含所述低烟碱性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；
b.针对连接到低烟碱性状的多态性标记物对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中多态性标记物位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何一个SNP标记物的或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何基因座的20cM内；以及
c.选择包括所述低烟碱性状的后代烟草植物。
111.根据实施例110所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
112.根据实施例110所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
113.根据实施例110所述的方法，其中所述基因型包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：14、17、18、19、49、52、53、202到205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
114.一种选择具有低烟碱性状的烟草植物的方法，所述方法包括：
a.从烟草种质集合中分离核酸；
b.检测与Nic1b基因座紧密连接的一种或多种标记物的核酸；以及
c.基于所述标记物检测选择具有低烟碱性状的烟草植物。
115.根据实施例114所述的方法，其中所述一种或多种标记物位于选自由SEQ IDNO125到145和193到201组成的组的SNP标记物中的任何一个SNP标记物或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何基因座的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。
116.根据实施例114所述的方法，其中所述检测包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：3到37、146、149、152到156、202、203和184到186以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
117.根据实施例114所述的方法，其中所述检测包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202到205和72以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
118.根据实施例114所述的方法，其中所述检测包括对定位在序列内的核酸序列的检测，所述序列与选自由SEQ ID NO：14、17、18、19、49、52、53、202到205和54以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
119.根据实施例114所述的方法，其中所述方法进一步包括测定所选植物的所述烟碱水平以确认所述低烟碱性状。
120.根据实施例114所述的方法，其中烟草种质的集合是单倍体育种群体。
121.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括染色体基因渗入，所述染色体基因渗入能够从LA Burley 21、LAFC53和LN KY171中的任何一个中获得，并且位于选自由SEQ ID NO125到145和193到201组成的组的SNP标志物中的任何两个SNP标志物两侧并且不包括所述SNP标志物中的所述任何两个SNP标志物，或者位于具有选自由SEQ ID NO1、3到37、146、149、152到156、202、203和184到186组成的组的序列的任何两个基因座，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为以下的叶：50或更多、55或更多、60或更多、65或更多、70或更多、75或更多、80或更多、85或更多、90或更多以及95或更多。
122.根据实施例121所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平选自由以下组成的组：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％并且小于0.05％。123.根据实施例121所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述染色体基因渗入位于选自由SEQ ID NO126到135组成的组的SNP标志物中的任何两个SNP标志物两侧并且不包括所述SNP标志物中的所述任何两个SNP标志物。
124.根据实施例121所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中染色体基因渗入位于SEQ ID NO为129到132的SNP标志物两侧并且不包括所述SNP标志物。
125.一种烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包括第一染色体基因渗入，所述第一染色体基因渗入能够从LA Burley 21、LAFC53和LN KY171中的任何一个中获得，并且位于Nic1b标记物编号1到207中的任何两个Nic1b标记物两侧并且不包括所述Nic1b标记物编号1到207中的所述任何两个Nic1b标记物，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
126.根据实施例125所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长时的所述对照植物的烟碱水平低1％、低2％、低5％、低8％、低10％、低12％、低15％、低20％、低25％、低30％、低40％、低50％、低60％、低70％或低80％。
127.根据实施例121到126和136到141中任一项所述的烟草植物的群体。
128.一种来自根据实施例121到126中任一项所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。129.根据实施例128所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料通过选自由熏烤、晾干、火烤和晒干组成的组的烘烤工艺制成。
130.一种烟丝，其包括根据实施例128所述的经过烘烤的烟草材料。
131.根据实施例130所述的烟丝，其中所述经过烘烤的烟草材料构成所述烟丝中的经过烘烤的烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。
132.根据实施例130所述的烟丝，其中所述经过烘烤的烟草材料构成所述烟丝中的经过烘烤的烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。
133.一种烟草制品，其包括根据实施例128所述的经过烘烤的烟草材料。
134.根据实施例133所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由以下组成的组：香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。
135.根据实施例133所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。
136.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：3、13、14、146、153、154、17、18、19、202和203以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
137.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：3、13、14、153、154、17、18、19、202到203以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
138.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：3、13、14、153、154、17、18、19和203以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。
139.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：3、13、17、18和19以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列内。
140.根据实施例38所述的烟草植物或其烟草部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ ID NO：3、18和19以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列内。
141.根据实施例38所述的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变定位于编码多肽的基因内，所述多肽与选自由SEQ ID NO：73、83、84、87、88、89、180、181、206和207以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
现在已经总体上描述了本公开，通过参考以下实例将更容易理解本公开，所述实施例以说明方式提供，除非指明，否则并不旨在限制本公开。
实例
实例1：具有低生物碱性状的TN90品系和含有nic1和nic2缺失标记物等位基因的具有高中间生物碱性状的植物的培育
培育群体是由LA BU21(含有nic1和nic2突变的低生物碱白肋烟21，供体亲本)与优良栽培品种TN90(受体亲本)杂交而来的。目标是获得一种低生物碱植物，与具有次等烟叶特征的亲本LA BU21品系相比，所述低生物碱植物还具有改善的烟叶质量。将具有期望特征(低生物碱水平、改善的烟叶质量)的F2植物进一步自交以获得F3代，并且随后获得F5代。图1示出了培育含有低生物碱性状的自交TN90品系所遵循的育种过程。
如图1所示，在基于大约170,000个多态性SNP开发
Figure BDA0002644790620000681
阵列上筛选出22株F3植物，所述多态性SNP是在术语不同烟草类型(烤烟、深色、东方和白肋烟)的若干个重测序品系中关于TN90烟草基因组序列数据库观察到的。植物22-6示出约40.6％的受体亲本基因组恢复并被选择用于进一步发展。F3代也表现出低生物碱水平，这与LABU21中观察到的水平一致。使用Nic1和Nic2 KASP检测法筛选F4代(参见US 2016/0374387的分别对应于Nic1KASP和Nic2KASP标记物的SEQ ID NO：135和137)。所有筛选的192株F4植物都含有2个缺失并且选择了3株(ds1059-138、ds1059-143和ds1059-192)以用于进一步研究。进一步扩大来自这3株植物的自交种子，并且评估F5代。所有220个F5植物的nic1KASP和nic2KASP两者缺失等位基因都是纯合的。F5植物中的生物碱水平通过测量从植物顶部的第3片、第4片和第5片烟叶收集的混合烟叶样品来测定并且在打顶后2周测定。并非所有植物都表现出低生物碱形状，并且还观察到了烟叶表型的显著差异，其中若干个品系表现出与在商业白肋烟中观察到的一致的良好烟叶质量(表1)。
表1：生物碱水平和烟叶表型选择F5植物和对照植物。所有F5植物的nic1KASP和nic2KASP两者缺失等位基因都是纯合的。
Figure BDA0002644790620000691
实例2：与低生物碱性状相关联的另外的基因组区的鉴定
来自实例1的具有高生物碱水平的F5植物，尽管携带纯合的nic1KASP和nic2KASP缺失等位基因，但表明nic1KASP和nic2KASP缺失标记物不表现出与低生物碱性状的100％连接。为研究此观察结果，对LAFC53(携带nic1和nic2基因渗入的烤烟版本)、LN KY171(携带nic1和nic2基因渗入的深色版本)和KY171(无nic1和nic2基因渗入的深色版本)以及两(2)个与nic1KASP和nic2KASP缺失等位基因纯合但显示高生物碱水平的F5品系(G61-36和G61-39)以及两(2)个与nic1KASP和nic2KASP纯合并且显示低生物碱水平(G61-31和G61-37)的F5品系进行了进一步的重测序。除了先前重新排序的品系，使用TN90基因组数据库映射BU21、HI BU21、LI BU21和LA BU21这7个品系。
对映射读数的覆盖范围分析产生对2000-3000bp区(SEQ ID NO1，以下简称“LA_associated_region”)的鉴定，在US 2016/0374387先前所描述的nic1缺失片段NT1.0-Scaffold0002504下游约为200万个bps。La_associated_region在LA BU21、LI BU21、LNKY171、LAFC53中以及在低生物碱、纯合的nic1KASP，nic2KASP F5品系、G61-31和G61-37中缺失。相比之下，LA_associated_region在野生型(例如，TN90、BU21、K326、NLM、Katerini)以及高生物碱、纯合nic1KASP nic2KASP F5品系G61-36和G61-39中未缺失。LA_associated_region无已知基因。在此区上游4877bps处发现丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶基因，并且在此区下游59,945bps处发现ERF(ERF189的同源物)。
进一步地，F3植物(22-6)的SNP基因分型揭示了始于nic1缺失片段NT 1.0-Scaffold0002504的下游1,256,063bps处并且终止于2,766,118bps(约1,510,055bps长，SEQ ID2号，本文称为“Nic1b区”)处的基因组区在F3植物(包含LA_associated_region)中是杂合的。这表明Nic1b区的低生物碱等位基因可能源自雪茄(LA BU21是由BU21与低生物碱古巴雪茄变种杂交而成)并且在所得的F4代和后代中分离。
而且，使用含有公理阵列的约170,000个SNP对47株F4植物和48株F5植物进行基因分型，以进一步验证生物碱水平与LA_associated_region以及Nic1b区之间的相关性。对3个祖代F4植物(ds1059-138、ds1059-143和ds1059-192)的分析表明，LA_associated_region和Nic1b区是杂合的或携带LA BU21样(B)等位基因。类似地，48株F5代植物显示在LA_associated_region和Nic1b区出现分离，其中具有B等位基因(LA BU21样)的个体表现出低生物碱水平(0.137％到0.417％，干重)，并且具有杂合状态(H)或野生型等位基因(A)的个体表现出中等到高生物碱水平(1.793％到5.419％，干重)。
实例3：Nic1b区中基因和标记物的鉴定
Nic1b区的序列分析揭示了所述区具有至少35个注释基因(表2)。这些基因被称为Nic1b雪茄基因(“NCG”)1到35。在这些NCG基因中，鉴定了六个乙烯响应转录因子样(ERF样)基因。RNA-seq数据显示根据打顶后72小时收集的根样品，10个NCG表现出在与BU21相关的LA BU21植物中的表达减少。与BU21相比，包含六个ERF样基因中的四个ERF样基因的七个NCG在LA BU21中下调，而其它三个NCG上调。
LA BU21、TN90和所选F5植物中的35个NCG中的每个NCG都重测序以鉴定LA BU21中存在的并且可能导致基因功能丧失的特定自然突变。还执行了另外的重测序分析，以鉴定非编码序列(例如，启动子)中可能导致基因表达失调的突变。
另外，还鉴定了Nic1b区内和位于其两侧的多态性以发展SNP标记物。发展了二十一种SNP标记物以用于对Nic1b区进行基因分型(表3)。表4中提供了另外的SNP标记物。这些标记物位于Nic1b区并且紧邻各种ERF基因。所述标记物具有可以用于将正常生物碱品系与低生物碱品系区分开的等位基因。
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实例4：培育期望烟碱水平的烟草变种的转基因方法。
采用过表达和抑制方法来研究NCG的功能，并培育具有期望烟碱水平的烟草变种。产生两组转基因植物，一组是使用全长编码序列的过表达方法，并且另一组是使用人工microRNA或RNAi序列的抑制方法。测试所有35个NCG(NCG1到NCG35)，其中重点是所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG在TN90与LA BU21之间表现出差异表达。在nic1 nic2双突变背景(例如，LA BU21)中执行一些过表达研究以测试已鉴定基因(单独或组合)从突变nic1等位基因中补充或拯救低生物碱突变表型的能力。
为了表达全长编码序列或人工microRNA序列，构建表达载体以具有CsVMV启动子和NOS终止子，以及具有在actin2启动子指导下的卡那霉素选择标记物(NPT II)和具有NOS终止子的盒。示例性人工microRNA序列可以在表2中找到。本领域的普通技术人员应理解，其它靶序列可以用于构建抑制构建体或其它用于基因沉默的转基因方法(例如，RNAi、反式作用siRNA等)。
使用DNA轰击或生物枪方法将携带感兴趣的转基因的核酸构建体引入烟叶盘中。参见，例如，Sanford等人,1993，《酶学方法(Methods Enzymol.)》,217:483-510；以及Okuzaki和Tabei,2012,《植物生物技术(Plant Biotechnology)》,29:307-310。简言之，含有转化盒的质粒DNA包被在1μm金颗粒(DNA/金)上，如下所示。将1μm金颗粒在180℃下烘烤12小时，并制备储备溶液(40mg/ml)。为了制备用于10次轰击的混合物，将100μl储备溶液与40μl表达载体DNA(1μg/μl)、100μl的2.5M CaCl2和40μl的0.1M亚精胺在1.5ml试管中混合。混合物在13,000xg下离心30秒，并且用500μl的100％乙醇洗涤沉淀物。将DNA/金混合物悬浮在100μl的水中，并且将10μl施加到大载体上、干燥并且然后轰击。在PDS-1000/He系统(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad实验室)中，在部分真空(711mmHg)下，使用1,100psi爆破片对每个板进行两次轰击。窄叶Madole(NLM)和田纳西90(TN90)烟叶圆盘用于用RNAi构建体和全长基因构建体进行转化。将整片烟叶(长度为约45×30mm)放置在MS培养基上过夜，并且第二天用构建体轰击叶盘。然后将叶片切成小块(约5×5mm)，并且放置在TOM培养基上(具有20g sucrose/L；1mg/L IAA和2.5mg/L BAP的MS培养基)以27℃生长3-5天，然后转移到含有300mg/l卡那霉素的TOM培养基(TOM-Kan)进行生长。每2-3周将组织转移到新的TOM-Kan平皿中4-6周(27℃，16小时光照)。轰击后4-6周，再生抗卡那霉素的初生芽。将嫩芽转移到MS-卡那霉素平皿以生长根。然后评估T1植物(和随后世代)的叶和/或根，以测定一种或多种生物碱的量。
实例5：用于在Nic1b区内或周围培育赋予低生物碱性状的新颖突变的随机诱变
使用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变或快中子轰击执行烟草植物的随机诱变。EMS诱变由在基因组长度上化学诱导随机点突变组成。快中子诱变由将种子暴露在中子轰击下组成，所述中子轰击通过双链DNA断裂导致很大的缺失。
对于EMS诱变，将一克(大约10,000粒种子)田纳西90烟草(TN90)种子在0.1％吐温中洗涤十五分钟，并且然后在30ml的ddH2O中浸泡两小时。然后，将一百五十(150)μl的0.5％EMS(西格马，目录号M-0880)混合到种子/ddH2O溶液中，并在室温(RT；大约20℃)下在盖下温育8-12小时(以30rpm旋转)。然后将液体从种子中取出，并且混合到1M NaOH中过夜以进行净化和处理。然后用100ml ddH2O洗涤种子2-4小时，两次。然后将经过洗涤的种子悬浮在0.1％琼脂溶液中。
琼脂溶液中的经过EMS处理的种子以-2000粒种子/平均匀地撒在平板上的水浸泡过的卡罗莱纳州精选烟草混合物(北卡罗来纳州金斯顿的卡罗莱纳州土壤公司)上。然后用塑料包裹膜覆盖平板，并放入生长室中。一旦幼苗从土壤中出来，塑料包裹膜就会被刺破以使湿度逐渐下降。两周之后，塑料包裹膜完全去除。将平板移到温室里，并且用NPK肥料施肥。将幼苗插在浮盘里并且一直生长到移植的大小。随后将植物移植到田地里。在生长期间，植物自花授粉以形成M1种子。在成熟阶段，从每株植物中收获五粒蒴果，并给来自每株植物的一组种子单独命名。这就形成了M1群体。来自每株M0植物的M1种子的复合物生长并且收集来自M1植物的叶以进行DNA提取。对Nic1b区内、周围或两侧的靶基因进行扩增和测序，以进行突变鉴定。在所有35个NCG(NCG1到NCG35)中鉴定突变，其中重点是所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG在TN90与LA BU21之间表现出差异表达。
实例6：用于在Nic1b区内或周围培育赋予低生物碱性状的新颖突变的靶向诱变
通过借助于精确的基因组工程技术，例如转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、巨核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR(Cas9系统、Cpf1系统或Csm1系统)将突变引入到Nic1b基因座(例如，ERF101、ERF110、ERF16、ERF130和NCG)中或周围来产生具有低烟碱同时保持高叶片质量的烟草品系。基因组修饰在商业烟草变种，如TN90，K326和窄叶Madole中进行。编辑所有35个NCG(NCG1到NCG35)，其中重点是所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG在TN90与LABU21之间表现出差异表达。
例如，CRISPR导向RNA设计和合成为从NCG基因识别特定靶序列。表2中提供了示例性的导向RNA序列。然后，使用一个或多个导向RNA和编码Cas9、Cpf1或Csm1蛋白的伴随核酸(以DNA质粒形式或以mRNA形式)来转化烟草原生质体。CRISPR-Cas9/Cpf1/Csm1核糖核蛋白复合物识别特定NCG靶序列并引入双链断裂(DSB)。内源性非同源性末端接合(NHEJ)DNA修复系统修复了DSB，这可能引入核苷酸缺失、插入或取代，并导致潜在的功能缺失突变。可替代地，在原生质体转化中包含具有期望序列的供体核酸分子以用作用于在CRISPR靶位点处或其周围引入期望序列的模板分子。
烟草原生质体与在生长室的洋红色盒子中生长的TN90烟叶分离。将3-4周大的植物的充分膨胀的叶子(5cm)从叶的中部切成0.5mm到1mm的叶条。通过浸渍条的两面，将叶条转移到已经制备的酶溶液中(1％纤维素酶R10、0.25％马其顿酶R10、0.4M甘露醇、20mMKCl、20mM MES(pH 5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA)中。使用干燥器在黑暗中真空渗透叶条30分钟，其中在室温下在黑暗中连续消化4小时到过夜，而不摇动。原生质体在100μm尼龙过滤器中过滤，并且用3ml淋巴制剂纯化。将原生质体离心，并且用W5n溶液(154mM NaCl、125mMCaCl2、5mM KCl、2mM MES、991mg/l葡萄糖pH 5.7)洗涤，并以5×105/ml的浓度悬浮在W5n溶液中。将原生质体在冰上保存30分钟，以通过重力在试管底部沉淀。移动W5n溶液，并且在室温下，将原生质体重新悬浮在P2溶液中。将50μl DNA(10-20μg的质粒)、500μl原生质体(2×105个原生质体)和550μl PEG溶液(40％、v/v 10ml 4g PEG4000、0.2M甘露醇、0.1M CaCl2)在15ml微量离心管中轻轻混合，并且混合物在室温下温育5分钟。
原生质体沉淀并用以下重新悬浮：1ml 2X 8EN1(8EN1:MS盐(不含NH4NO3)、MS维生素、0.2％肌醇、4mM MES、1mg/l NAA、1mg/l IAA、0.5M甘露醇、0.5mg/l BAP、1.5％蔗糖)。用等量的低熔点琼脂糖(LMA)将经过转化的原生质体凝胶化，并且滴加0.2ml原生质体LAM以形成珠。向珠中加入10ml 8EN1，并且在7天内，取出5ml 8EN1并加入5ml 8EN2(具有0.25M甘露醇的8EN1)；另一个7天(14天)之后，取出10ml8EN2并加入10ml 8EN2；在另一个7天(21天)之后，取出5ml 8EN2并加入5ml 8EN3(具有3％蔗糖并且无甘露醇的8EN1)；另一个7天(28天)之后，取出10ml 8EN3并加入10ml 8EN3。原生质体保存两周，直到微愈伤组织生长。将愈伤组织转移到NCM固体培养基中，直到其达到约5mm(通常约两周)。将愈伤组织转移到TOM-Kan固体培养基中以生长嫩芽，并使用本文所述的方法再生经过转化的烟草植物。对愈伤组织或再生植株进行测试并选择以用于在NCG基因中的具有期望突变的基因编辑事件。功能缺失的NCG等位基因(例如，早期终止密码子或框架移位)或其它类型的突变(例如，功能增益或新形态)两者都会产生。
类似地，还使用基因组编辑技术(例如，Cas9、Cpf1或Csm1介导的CRISPR编辑系统)编辑来自Nic2基因座的ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)。功能缺失的ERF突变(例如，早期终止密码子)或其它类型的突变(例如，功能增益或新形态)两者都会产生。
实例7：使用显性阻遏物抑制Nic1b区的ERF样基因并且产生低生物碱烟草
显性阻遏物是通过将其C末端与ERF相关联的两亲性阻遏(EAR)基序连接针对来自Nic1b区的一个或多个ERF样基因(例如，NCG1、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130和NCG17)培育的。当与转录因子连接时，EAR基序已经示出主动抑制转录因子靶基因的表达(Hiratsu等人,《植物期刊(Plant J.)》34:733-739(2003))。
简言之，ERF-EAR构建体置于组成型启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)的控制下，并且用于通过原生质体转化或农杆菌转化野生型烟草，由此为每个构建体产生转基因品系，以及用空载体(VC)转化的对照品系。转基因表达得到验证。测试烟碱生物合成相关酶(腐胺甲基转移酶(PMT)、N-甲基胞嘧啶氧化酶(MPO)、天冬氨酸氧化酶(AO)、喹啉酸合酶(QS)、喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPT)以及PIP家族氧化还原酶A622)以及液泡膜-定位的MATE家族转运蛋白MATE1和MATE2(MATE1/2)的烟碱水平和表达两者，以及鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精氨酸脱羧酶(ADC)、亚精胺合酶(SPDS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因的表达水平。
实例8：含低烟碱烟草变种的育种
在已鉴定的Nic1b区、其内的基因和与其相关联的分子标记物的辅助下，育种和产生具有商业上可接受的叶质量的低生物碱烟草杂交体、变种和包括nic1b_erf突变(例如，Nic1b区的完全或部分缺失)的品系。NCG基因和标记物还用于从各种烟草属种质，例如不同的烟草属物种或普通烟草品系中筛选另外的nic1b_erf等位基因。美国专利号7,700,834的表8中提供了可以筛选的四十三种烟草属物种、四十九个黄花烟草品系和大约六百个普通烟草品系的集合。
被鉴定为具有新颖的nic1b_erf等位基因的种质用作育种栽培烟草的来源材料。种间或种内杂交方法结合标准育种方法，如回交或系谱法可以用于将期望的nic1b_erf或nic2突变等位基因从供体来源转移到栽培烟草。例如，包括nic1、nic2或两个突变等位基因的低烟碱变种(例如，供体亲本如LA Burley 21)与具有期望遗传背景和优良农艺性状的高烟碱变种杂交。针对表3中例示的一或多个分子标记物任选地检测由此杂交而来的F1后代植物。F1后代植物然后与亲本优良高烟碱变种(轮回亲本)回交。使用在此描述和公开的分子标记物对来自BC1代的植物进行基因分型，以选择具有较小nic1b_erf或nic2缺失片段的烟草植物。经过多轮回交(例如，5-7代)，从轮回亲本优良品系获得包括低生物碱性状和其它期望性状两者的新型优良烟草变种。由于在Nic1b和Nic2基因座附近的遗传重组事件，因此此新的优良烟草变种也不受任何与低生物碱性状相关联的遗传阻力的影响。这些重组事件解除了nic1b_erf和nic2突变与任何相关联的有害突变的联系，并且因此减少或避免了遗传阻力。使用上述育种和标记物辅助选择策略，还可以实现低烟碱性状与降低生物碱或TSNA水平的其它转基因或天然等位基因的聚合或叠加。
低生物碱烟草杂交体、变种或品系可以制成白肋烟型、深色型、烤烟型、马里兰型或东方型烟草，或者可以本质上来源于以下或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草变种：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpaotobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY14xL8、窄叶Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD207、“珀里克”烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、斯佩特168、斯佩特172、斯佩特179、斯佩特210、斯佩特220、斯佩特225、斯佩特227、斯佩特234、斯佩特G-28、斯佩特G-70、斯佩特H-6、斯佩特H20、斯佩特NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN90、TN 97、TN97LC、TN D94、TND950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309或者VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC。
实例9：来自Nic1b区的另外的基因
从Nic1b区鉴定包含非编码RNA的若干个基因。所述基因列于表5中。与LA BU21和低生物碱F5同胞植物相比，除ERF16外，所有这些基因在TN90和高生物碱F5同胞植物中表现出较高的表达水平。ERF16似乎在高生物碱和低生物碱植物中以相对类似的水平表达。如实例4到7所述，进一步研究这些另外的基因。例如，采用过表达方法和抑制方法来研究这些基因的功能并开发具有期望烟碱水平的烟草变种。产生两组转基因植物，一组是使用全长编码序列的过表达方法，并且另一组是使用人工microRNA或RNAi序列的抑制方法。进一步地，还采用突变方法(随机诱变或定向编辑)来产生这些基因的突变等位基因。
表13和图3中提供了由于过表达来自Nic1b区或Nic1b区周围的所选基因或序列片段的结果。35S启动子用于驱动过表达。LA BU21中的个体T0转化体在同一天盆栽，其包含ERF130、LA BU21中缺失的LA_associated_region(即，SEQ ID NO1，称为“Nic1bΔ”，其不含注释基因，参见实例2)、g32081(β-葡糖苷酶18样基因)和ERF16的对照构建体和过表达构建体。盆栽后12周对植物进行打顶。生物碱水平通过测量从植物顶部的第3片、第4片、第5片和第6片烟叶收集的混合叶身样品来测定并且在打顶后2周测定。针对每个构建体测试四株或五株个体T0植物，其中测定其总生物碱或个体生物碱的平均水平。如图3所示，这组生物碱数据表明ERF16的过表达促进了烟碱的产生(相对于对照物增加76％)。在ERF16过表达植物中，其它次要生物碱(包含降烟碱、假木贼碱和安那他品)似乎也增加了，这都导致总生物碱相对于对照物增加了76％。从过量表达ERF130、Nic1bΔ序列或g32081未观察到烟碱或生物碱水平的明显转变。
实例10：来自染色体7的多转录因子在正常生物碱的烟草品系与减少的生物碱的烟草品系之间表现出差异表达
如表6所列，从染色体7鉴定出若干个另外的转录因子以在BU21和LA BU21之间表现出不同的表达水平。如实例4到7所述，进一步研究这些另外的基因。例如，采用过表达方法和抑制方法来研究这些基因的功能并开发具有期望烟碱水平的烟草变种。产生两组转基因植物，一组是使用全长编码序列的过表达方法，并且另一组是使用人工microRNA或RNAi序列的抑制方法。进一步地，还采用突变方法(随机诱变或定向编辑)来产生这些基因的突变等位基因。
实例11：来自Nic1b区的各种ERF基因涉及烟碱生物合成
如实例4所概述，使用MIR6147主链设计人工microRNA(“amiRNA”)构建体以抑制来自或靠近Nic1b区(统称为“Nic1b_ERF”)的各种ERF基因。一些人工microRNA设计用于特异性地抑制个体Nic1b_ERF。其它microRNA设计成同时靶向多个Nic1b_ERF。表2提供了一些示范性成熟人工microRNA序列。
用Nic1b_ERF特异性amiRNA构建体转化的T0植物与其相应的具有amiRNA-GUS构建体的对照植物在同一天盆栽。基因表达研究的根组织是从植物中收集的，同时被重新装入更大的盆中。生物碱水平通过测量从植物顶部的第3片、第4片、第5片和第6片烟叶收集的混合叶身样品来测定并且在打顶后2周测定。简言之，使用液/液萃取法将大约0.5g烟草萃取到含有内标的有机溶剂中，并通过气相色谱(GC)与火焰离子化检测(FID)进行分析。可以按原样或干重的重量百分比(Wt％)报告结果。基于干重的报告数据需要测定烘箱挥发物(OV)。除非另有说明，否则本文所示的总体或个体生物碱水平或烟碱水平是以干重为基础的(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。对QuantStudio 5或QS12K(ThermoFisherScientific)使用多重qPCR方法进行初步基因表达筛选，其中肌动蛋白作为对照物。所选植物亚单位还在定制的开放阵列(OpenArray)上筛选，其中18个基因一式三份，包含QuantStudio QS 12K仪器上的肌动蛋白控制基因。
表7总结了来自一组个体T0转化体的生物碱数据，所述转化体通过人工microRNA抑制选定的个体Nic1b_ERF。除了一些例外情况(例如，18GH2083)，通过人工microRNA抑制个体Nic1b_ERF减少HI BU21背景(即，nic2单突变体)中的烟碱，但不能减少野生型背景(例如，t-NL Madole(PhPh)SRC)中的烟碱(表7-9)。这可能暗示Nic1b_ERF之间的冗余，并且还表明nic2单突变体为评估每个个体Nic1b_ERF在烟碱调节中的作用提供了更敏感的背景。在HI BU21植物中，抑制个体Nic1b_ERF将对照植物的烟碱水平降低约50％到90％(表7和图4)。在amiRNA植物中观察到的烟碱减少与多个烟碱生物合成基因的基因表达的减少一致(表10)。
产生T1植物，并对所述植物进一步分析卡那霉素抗性分离比、生物碱水平和烟碱生物合成基因表达。杂交是为了使多个amiRNA同时带入单个植物中以抑制多个Nic1b_ERF。
实例12：通过操纵与Nic1b和/或Nic2基因座相关联的ERF基因来调节烟碱水平。
为了在烟草中实现期望的烟碱水平，通过过表达或下调以及通过转基因或诱变方法操纵两组ERF基因。每组ERF聚集在Nic1b或Nic2区周围。第一组ERF包含ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2，这些存在于此处以在Nic1b区周围聚集(单独地Nic1b_ERF和共同地Nic1b_ERF)。参见表11和Kajikawa等人,《植物生理学》2017,174:999-1011。此第一ERF组的核心成员包含ERFnew、ERF199、ERF19、ERF29、ERF210和ERF91L2。此第一组还可以包含JRE5L2。第二组ERF包含似乎在HI BU21中缺失(即，nic2单突变体)的ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(单独地Nic2_ERF和共同地Nic2_ERF)。参见Shoji等人,《植物细胞》,(10):3390-409(2010)。所述第二组的核心成员包含ERF189和ERF115。第二组还可以扩展为更大的组，包含ERF163、ERF91L1、ERF104ΔC、ERF221、ERF115、ERF168、ERF17、ERF179、ERF17L1、ERF189、ERF17L2ΔC、JRE5L1、ERF104L1ΔC和ERF168L1ΔC。参见表12和Kajikawa等人,《植物生理学》2017,174:999-1011。
转基因方法包含基于RNA干扰的基因抑制(例如，反义、共抑制、基于发夹或反向重复的RNAi、人工microRNA、人工反式小干扰(ta-si)RNA)和显性负抑制子(例如，ERF相关联的两亲性抑制(EAR)基序)。基于转基因或基于顺式基因的抑制可以特异性地针对单个ERF基因，或者同时针对ERF基因的子集。显性负抑制子可以顺向产生，例如，通过敲入与内源性EAR编码序列成帧的ERF基序编码序列产生。
诱变方法包含化学(例如，基于EMS的TILLING)或物理(例如，辐射)的随机诱变和基因组编辑。可以使用此处描述的任何基因组编辑技术，并且所述技术包含例如TALEN、巨核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR(Cas9系统、Cpf1系统或Csm1系统)。
转基因或诱变方法用于产生第一组和第二组ERF(侧重于核心成员)的突变等位基因。产生功能缺失(即，无效)等位基因和弱突变等位基因两者。产生Nic2_ERF突变等位基因的各种组合来抑制Nic2_ERF的水平或活性，并且潜在地抑制与HI BU21或LA FC53中发现的nic2突变等位基因相似的水平或活性。产生Nic1b_ERF突变等位基因的各种组合来抑制Nic1b_ERF的水平或活性，并且潜在地抑制与LI BU21或LA FC53中发现的nic1突变等位基因相似的水平或活性。产生各种Nic2_ERF和Nic1b_ERF基因中的突变等位基因的进另外的组合并将所述组合渗入到单一烟草植物中以产生具有与LA BU21、LA FC53或LN KY171中发现的烟碱和总生物碱水平类似的烟碱和总生物碱水平的低生物碱烟草品系。
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Claims (34)

1.一种烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。
2.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是普通烟草植物。
3.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
4.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物进一步包括选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因的一种或多种突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
5.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。
6.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与在类似条件下生长和烘烤时的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
7.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物的烟碱水平比在类似生长条件下生长的对照植物的烟碱水平低40％，其中所述对照植物除了所述突变之外与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。
8.根据权利要求2所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物的烟碱水平小于2.0％。
9.一种烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的非转基因突变，其中所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱水平降低到在类似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的60％以下，其中所述烟草植物在烘烤时能够产生USDA等级指数值与所述对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中所述对照植物除了所述非转基因突变之外还与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景，其中所述烟草植物是普通烟草植物。
10.一种根据权利要求1至9中任一项所述的烟草植物的群体。
11.一种来自根据权利要求1至9中任一项所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
12.根据权利要求11所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料通过选自由熏烤、晾干、火烤和晒干组成的组的烘烤工艺制成。
13.一种烟丝，其包括根据权利要求11所述的经过烘烤的烟草材料。
14.一种烟草制品，其包括根据权利要求11所述的经过烘烤的烟草材料。
15.根据权利要求14所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由以下组成的组：香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。
16.根据权利要求14所述的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。
17.根据权利要求16所述的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自由散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。
18.一种烟草植物或其部分，其包括Nic1b_ERF基因座的突变，其中所述突变在LABurley 21、LAFC53和LN KY171中不存在。
19.根据权利要求18所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物进一步包括Nic2基因座的ERF基因的突变。
20.根据权利要求18所述的烟草植物或其部分，其中所述突变定位于与选自由SEQ IDNO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54和202到205以及其片段组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列内。
21.根据权利要求18所述的烟草植物或其部分，其中所述突变定位于编码与选自由SEQID NO：73、83、84、87、88、89、180、181、206和207组成的组的序列具有至少80％的同一性的多肽的基因内。
22.根据权利要求18所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自由以下组成的组的变种：熏烤烟草、晾烟、深色火烤烟草深色火烤烟和Galpao烟草以及东方烟草。
23.根据权利要求18所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自由以下组成的组的变种：白肋烟草、马里兰烟草和深色晾烟。
24.一种来自根据权利要求18所述的烟草植物的经过烘烤的烟草材料。
25.根据权利要求24所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述烟草植物的烟碱水平介于0.2％与0.6％之间。
26.根据权利要求24所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述烟草植物的烟碱水平介于1.0％与3.0％之间。
27.根据权利要求24所述的经过烘烤的烟草材料，其中所述经过烘烤的烟草材料通过选自由熏烤、晾干、火烤和晒干组成的组的烘烤工艺制成。
28.一种烟草制品，其包括根据权利要求24所述的经过烘烤的烟草材料。
29.根据权利要求24所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自由以下组成的组：香烟、小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、嚼烟、烟叶、切碎的烟草和生切烟丝。
30.根据权利要求24所述的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。
31.一种烟草植物或其部分，其包括异源表达盒，所述异源表达盒包括基因的Nic1b_ERF抑制序列，所述基因包括选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54和202到205以及其片段组成的组的序列，其中所述抑制序列可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子，并且其中所述抑制序列与选自由SEQ ID NO：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54和202到205以及其片段组成的组的序列的至少21个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性。
32.根据权利要求31所述的烟草植物或其部分，其中所述Nic1b抑制序列能够转录为抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸选自由单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸和其组合组成的组。
33.根据权利要求31所述的烟草植物或其部分，其中所述启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子和组织优选型启动子组成的组。
34.根据权利要求31所述的烟草植物或其部分，其中所述启动子是根特异启动子。
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WO (2) WO2019140297A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305884A (zh) * 2019-08-05 2019-10-08 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用
CN110592103A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用
CN113151307A (zh) * 2021-06-11 2021-07-23 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用
CN113549704A (zh) * 2021-05-21 2021-10-26 云南省烟草质量监督检测站 一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用
CN114015699A (zh) * 2021-10-18 2022-02-08 西南大学 基因BnbHLH92a调控花青素或原花青素的应用
CN114805513A (zh) * 2022-05-05 2022-07-29 云南中烟工业有限责任公司 烟草NtOEE1基因及其在调控茎叶夹角和株高中的应用
CN115873984A (zh) * 2022-11-22 2023-03-31 云南省烟草农业科学研究院 与烟草株高相关性状基因qPH和qIL，连锁SSR标记及其应用
CN115873983A (zh) * 2022-11-22 2023-03-31 云南省烟草农业科学研究院 提高利用nic1位点选育低尼古丁烟草的分子标记及其应用
CN116063401A (zh) * 2021-08-13 2023-05-05 中国人民解放军总医院 阻断型靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019140297A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
BR112020018187A2 (pt) 2018-03-05 2021-04-27 Altria Client Services Llc composições e métodos para a produção de plantas e produtos de tabaco que possuem níveis alterados de alcaloides com qualidade de folha desejável
US11384361B2 (en) 2018-07-26 2022-07-12 Altria Client Services Llc Compositions and methods based on PMT engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
WO2020154466A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Altria Client Services Llc Tobacco plants comprising reduced nicotine and reduced tobacco specific nitrosamines
CN114501987A (zh) * 2019-08-05 2022-05-13 弗吉尼亚大学专利基金会 转录因子NtERF221及其使用方法
US11827893B2 (en) 2019-10-10 2023-11-28 Altria Client Services Llc Pale yellow locus and its applications in tobacco
CN114929880A (zh) 2019-10-10 2022-08-19 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的基于qpt工程改造的组合物和方法
CN114829605A (zh) 2019-10-10 2022-07-29 奥驰亚客户服务有限公司 用于通过操纵叶片质量基因生产具有改变的生物碱水平和期望的叶片质量的烟草植物和产品的组合物和方法
CN110684779A (zh) * 2019-10-22 2020-01-14 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用
JP2023504511A (ja) * 2019-12-03 2023-02-03 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するための組成物および方法
CN115279177A (zh) * 2020-01-08 2022-11-01 北卡罗来纳州立大学 实现烟草中超低烟碱含量的遗传学方法
US20230105789A1 (en) 2020-01-27 2023-04-06 Altria Client Services Llc Compositions and Methods Based on PMT Engineering for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels
CN111690661A (zh) * 2020-06-01 2020-09-22 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草NtbHLH13基因突变体及分子鉴定方法和应用
BR112022024801A2 (pt) * 2020-06-03 2023-05-09 Altria Client Services Llc Composições e métodos para produzir plantas e produtos de tabaco tendo níveis de alcalóides alterados
CN111996278B (zh) * 2020-08-31 2022-06-03 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草黑胫病预警基因Ntab0295850及其应用
CN112841715B (zh) * 2020-12-13 2023-05-26 云南昆船烟草设备有限公司 基于贮柜布料系统对柜内物料进行跟踪定位及布料的方法
WO2023230433A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco field
CN115137090A (zh) * 2022-07-12 2022-10-04 福建中烟工业有限责任公司 一种晒黄烟混配烟叶以及筛选或制备晒黄烟混配烟叶的方法
US20240229054A9 (en) 2022-08-05 2024-07-11 Altria Client Services Llc Methods and compositions for regulating alkaloids in tobacco
CN115807003A (zh) * 2022-08-24 2023-03-17 中国烟草总公司郑州烟草研究院 NtERF4基因及其在总黄酮与绿原酸合成调控中应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611146A (zh) * 2006-12-15 2009-12-23 美国无烟烟草制品公司 烟碱脱甲基酶活性降低的烟草植物
CN102858983A (zh) * 2010-01-15 2013-01-02 北卡罗来纳州立大学 最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法
CN105960460A (zh) * 2013-12-06 2016-09-21 奥驰亚客户服务公司 在叶中具有改变量的一种或多种生物碱的烟草植物及使用此类植物的方法
WO2016210303A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2780525A (en) 1953-10-08 1957-02-05 Cabot Godfrey L Inc Process and apparatus for the production of aluminum oxide from aluminum chloride
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
US4660577A (en) 1982-08-20 1987-04-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Dry pre-mix for moist snuff
US4528993A (en) 1982-08-20 1985-07-16 R. J. Reynolds Tobacco Company Process for producing moist snuff
US4516590A (en) 1982-11-26 1985-05-14 Philip Morris Incorporated Air-cured bright tobacco filler, blends and smoking articles
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4732856A (en) 1984-04-03 1988-03-22 Carnegie Institution Of Washington Transposable elements and process for using same
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US4848373A (en) 1987-04-13 1989-07-18 Helme Tobacco Company Nicotine removal process and product produced thereby
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5013658A (en) 1988-05-13 1991-05-07 Dna Plant Technology Corporation Transposon tagging of genes in transformed plants
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US4987907A (en) 1988-06-29 1991-01-29 Helme Tobacco Company Chewing tobacco composition and process for producing same
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5372149A (en) 1992-03-25 1994-12-13 Roth; David S. Sterilization process in the manufacturing of snuff
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5491081A (en) 1994-01-26 1996-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean cyst nematode resistant soybeans and methods of breeding and identifying resistant plants
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5689035A (en) 1995-09-26 1997-11-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brown stem rot resistance in soybeans
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US7700834B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
US7025066B2 (en) 2002-10-31 2006-04-11 Jerry Wayne Lawson Method of reducing the sucrose ester concentration of a tobacco mixture
US20040118422A1 (en) 2002-12-19 2004-06-24 Swedish Match North Europe Ab Tobacco dough and a method for its manufacture
US8627828B2 (en) 2003-11-07 2014-01-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco compositions
AU2004308498A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Conditioning process for tobacco and/or snuff compositions
ATE530656T1 (de) 2005-02-23 2011-11-15 Univ North Carolina State Veränderung des alkaloidgehaltes in tabak durch modifikation spezifischer cytochrome p450 gene.
CA2926297C (en) 2005-02-28 2018-02-27 22Nd Century Limited, Llc Reducing levels of nicotinic alkaloids in plants
US9551003B2 (en) 2006-09-13 2017-01-24 22Nd Century Limited, Llc Increasing levels of nicotinic alkaloids in plants
US8319011B2 (en) 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
EP2220231B1 (en) 2007-11-12 2017-10-11 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US8953158B2 (en) 2009-09-04 2015-02-10 Danny S. Moshe Grading of agricultural products via hyper spectral imaging and analysis
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
US20200291413A1 (en) 2017-06-23 2020-09-17 University Of Kentucky Research Foundation Method
WO2019140297A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
BR112022024801A2 (pt) 2020-06-03 2023-05-09 Altria Client Services Llc Composições e métodos para produzir plantas e produtos de tabaco tendo níveis de alcalóides alterados

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611146A (zh) * 2006-12-15 2009-12-23 美国无烟烟草制品公司 烟碱脱甲基酶活性降低的烟草植物
CN103993023A (zh) * 2006-12-15 2014-08-20 美国无烟烟草有限责任公司 烟碱脱甲基酶活性降低的烟草植物
CN102858983A (zh) * 2010-01-15 2013-01-02 北卡罗来纳州立大学 最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法
CN105960460A (zh) * 2013-12-06 2016-09-21 奥驰亚客户服务公司 在叶中具有改变量的一种或多种生物碱的烟草植物及使用此类植物的方法
WO2016210303A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA T.SEARS等: "NtERF32:a non-NIC2 locus AP2/ERF transcription factor required in jasmonate-inducible nicotine biosynthesis in tabacco.", 《PLANT MOLECUALR BIOLOGY》 *
NICOTIANA TABACUM: "PREDICTED:Nitotiana tabacum ethylene-responsive transcription factor 13-like(LOC107800084),mRNA", 《NCBI GENBANK》 *
TSUBASA SHOJI等: "Smoking out the masters: transcriptional regulators for nicotine biosynthesis in tobacco", 《PLANT BIOTECHNOLOGY》 *
TSUBASA SHOJI等: "Tobacco MYC2 Regulates Jasmonate-Inducible Nicotine Biosynthesis Genes Directly and By Way of the NIC2-Locus ERF Genes", 《PLANT CELL PHYSIOL》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305884A (zh) * 2019-08-05 2019-10-08 云南省烟草农业科学研究院 一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用
CN110592103A (zh) * 2019-10-22 2019-12-20 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用
CN113549704A (zh) * 2021-05-21 2021-10-26 云南省烟草质量监督检测站 一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用
CN113151307A (zh) * 2021-06-11 2021-07-23 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用
CN113151307B (zh) * 2021-06-11 2022-09-30 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用
CN116063401A (zh) * 2021-08-13 2023-05-05 中国人民解放军总医院 阻断型靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途
CN116063401B (zh) * 2021-08-13 2023-12-01 中国人民解放军总医院 阻断型靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途
CN114015699A (zh) * 2021-10-18 2022-02-08 西南大学 基因BnbHLH92a调控花青素或原花青素的应用
CN114015699B (zh) * 2021-10-18 2023-09-22 西南大学 基因BnbHLH92a调控花青素或原花青素的应用
CN114805513A (zh) * 2022-05-05 2022-07-29 云南中烟工业有限责任公司 烟草NtOEE1基因及其在调控茎叶夹角和株高中的应用
CN115873984A (zh) * 2022-11-22 2023-03-31 云南省烟草农业科学研究院 与烟草株高相关性状基因qPH和qIL，连锁SSR标记及其应用
CN115873983A (zh) * 2022-11-22 2023-03-31 云南省烟草农业科学研究院 提高利用nic1位点选育低尼古丁烟草的分子标记及其应用

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