CN115279177A - 实现烟草中超低烟碱含量的遗传学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自包含突变的小檗碱桥酶样核酸和隐性nic1和/或nic2等位基因的植物的烟草产品及其制备方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月8日提交的美国申请第62/958,505号的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明涉及来自包含突变的小檗碱桥酶样核酸和隐性nic1和/或nic2等位基因的植物的烟草产品及其制备方法。
技术背景
烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum L.))中的吡啶生物碱是研究最多的一类植物次生化合物。在大多数烟草基因型中，烟碱占总生物碱库的90％以上，并且是烟草产品使用者经历的药理学反应的主要原因。按照相对丰度递减的顺序，烟草中剩余的主要生物碱包括新烟草碱、降烟碱和假木贼碱。烟草中的生物碱水平受环境条件、与植物害虫的相互作用和植物遗传学的影响。
尽管烟碱是给予烟草产品使用者他们所寻求的药理作用的主要化合物，但在几种情况下，希望使用产生和积累非常低水平烟碱的烟草属植物来开发产品。例如，一些研究表明，使用低烟碱香烟作为戒烟策略的组成部分可以帮助试图戒烟的吸烟者(Hatsukami等人，2010a；Donny等人，2014)。其它报告表明，通过将烟草产品中的烟碱水平降低到临界阈值以下，它们不再能够引发或维持成瘾反应(Benowitz和Henningfield,1994；Benowitz等人，2007)。诸如此类的研究可能最终会影响监管机构，诸如美国食品和药物管理局，所述监管机构已被授权确定香烟和其它烟草产品中可允许的各种烟草成分(包括烟碱)的可接受水平。
发明简述
一方面，本技术的公开内容提供了烘烤烟草属植物的一片或多片叶子的方法，所述烟草属植物包含：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，所述方法包括：(a)变黄过程，其包括在92°F-96°F起始温度下加热所述叶，并以每小时约1°F的速率升高至104°F-108°F的温度，直至达到最大上限温度，并在所述上限温度下保持约52-58小时的时段；(b)叶子干燥过程，其包括在约120°F的温度下干燥约22小时；以及(c)茎干干燥过程，其包括在约132°F-138°F的温度下干燥约50小时至约65小时，从而烘烤烟草属植物的一片或多片叶子并产生一片或多片所述烟草属植物的烤烟叶。
在一些实施方案中，所述烟草属植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
在一些实施方案中，本技术提供了通过该方法生产的烟草属植物的烤烟叶，其中所述烤烟叶包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，烤烟叶包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，与野生型对照烟草属植物的叶对比或与nic1/nic2对照烟草属植物对比，所述叶包含降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱。在一些实施方案中，烤烟叶包含0.5mg/g或更少的烟碱含量。在一些实施方案中，烤烟叶包含0.4mg/g或更少的烟碱含量。在一些实施方案中，与根据标准烘烤方法烘烤的叶对比，所述叶包含水平升高的糖和/或水平降低的氨。在一些实施方案中，烟草属植物还包括编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达降低，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
在一些实施方案中，本发明技术提供了包含烤烟叶的烟草产品。在一些实施方案中，所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
在一些实施方案中，本发明技术的公开内容提供了提高烟草属植物产量的方法，所述方法包括：(a)在约90％萌发的阶段对幼苗施肥，所述施肥通过加肥灌溉进行，任选地，所述肥料中的N浓度为约200ppm；(b)应用塑料护盖物处理；以及(c)在移植后约4至5周、移植后约6至7周以及移植后约8至9周，以约90-120磅/英亩N总量的比率向所述幼苗施用氮，以提供所述烟草植物增加的产量和质量。在一些实施方案中，使用加肥灌溉来施用所述氮。在一些实施方案中，所述基质覆盖有地面覆盖层，从而提供覆盖有地面覆盖层的基质。在一些实施方案中，所述基质和/或覆盖有地面覆盖层的基质覆盖有护盖物。
在一个方面，本发明技术的公开内容提供了来自烟草属植物的烤烟烟叶，其中烟草属植物(1)包含隐性nic1和nic2等位基因之一或两者，并且(2)包含相对于野生型改变的BBLa、BBLb和BBLc基因，从而降低BBLa、BBLb和BBLc的活性，或者降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达，使得与对照烟草属植物对比，所述烟草属植物的烟碱类生物碱含量降低。在一些实施方案中，烟草属植物包含隐性nic1和nic2等位基因两者。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，烤烟叶包含与对照烟草属植物的烤烟叶的USDA等级指数相当或与其对比提高的USDA等级指数。在一些实施方案中，叶子包含约60或更高的USDA等级指数。在一些实施方案中，与对照烟草属植物对比，烤烟叶的产量相当或增加。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱。
在一些实施方案中，本发明技术提供了包含烤烟叶的烟草产品。在一些实施方案中，所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
一方面，本发明技术的公开内容提供了生产烟碱类生物碱含量降低的烟草属植物的方法，其包括在烟草属植物中组合：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，烟草属植物包含nic1隐性等位基因。在一些实施方案中，烟草属植物包含nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，所述方法还包括降低编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达，所述烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
在一些实施方案中，与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低至少40％的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱，并且与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟碱含量降低约40％至约90％。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱，并且烟碱含量为约0.014％至约0.098％。在一些实施方案中，植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。
在一些实施方案中，本发明技术提供了由植物产生的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。
一方面，本发明技术的公开内容提供了包含来自烟草属植物的烟草的烟草产品，其中烟草属植物包含：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，nic1隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，nic2隐性等位基因是纯合隐性等位基因。在一些实施方案中，烟草属植物经修饰以降低BBLa、BBLb和BBLc的活性和/或编码BBLa、BBLb和BBLc的核酸的表达，并且包含nic1隐性等位基因。在一些实施方案中，烟草属植物经修饰以降低BBLa、BBLb和BBLc的活性和/或编码BBLa、BBLb和BBLc的核酸的表达，并且包含nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，所述烟草属植物具有与仅根据(A)修饰的植物对比降低至少40％的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，所述烟碱类生物碱为烟碱，且与仅根据(A)修饰的植物对比，所述烟碱含量降低约40％至约90％。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱，并且烟碱含量为约0.014％至约0.098％。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱，烟碱含量为约0.014％。在一些实施方案中，所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，烟草属植物还包括编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达降低，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
一方面，本发明提供了来自烟草属植物的烤烟烟叶，其中(A)烟草属植物(1)包含隐性nic1和nic2等位基因中之一或两者，和(2)相对于野生型包含被改变的BBLa、BBLb和BBLc基因，使得烟草属植物的烟碱类生物碱含量与所述野生型(例如，无BBLabc、无nic1和nic2)对比降低；以及(B)烤烟烟叶具有色泽强度好、宽度正常和质地均匀的一般至优质烟叶的特征，任选地其中所述烤烟烟叶具有超过60的USDA等级指数，或者根据USDA标准等级(“美国烤烟的官方标准等级，类型11、12、13、14和外国类型92”("Official StandardGrades for Flue-Cured Tobacco U.S.Types 11,12,13,14,and Foreign Type 92”))具有良好至一般至低的质量或优良至良好至一般的质量。
一方面，提供了生产烟碱类生物碱含量降低的烟草属植物的方法，该方法包括在烟草属植物中组合：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅通过(A)修饰的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
一方面，烘烤烟草属植物的一片或多片叶子的方法包括：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅通过(A)修饰的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，所述方法包括：(a)变黄过程，其包括在92°F-96°F起始温度下加热所述叶，并以每小时约1°F的速率升高至104°F-108°F的温度，直至达到最大上限温度，并在所述上限温度下保持约52-58小时的时段；(b)叶子干燥过程，其包括在约120°F的温度下干燥约22小时；以及(c)茎干干燥过程，其包括在约132°F-138°F的温度下干燥约50小时至约65小时，从而烘烤烟草属植物的一片或多片叶子并产生一片或多片所述烟草属植物的烤烟叶。在一些实施方案中，叶子干燥过程在约116°F-120°F的温度下进行约28-34小时。在一些实施方案中，叶子干燥过程在约116°F-118°F的温度下进行约28-34小时。在一些实施方案中，本发明技术的公开内容涉及通过烘烤方法生产的烟草属植物的烤烟叶。在一些实施方案中，叶子是包含0.04％或更少烟碱的超低烟碱叶子。
在一些实施方案中，与根据标准烘烤方法烘烤的叶子对比，所述叶子包含升高水平的糖和/或氨。在一些实施方案中，烟草属植物还包括编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达降低，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。在一些实施方案中，本发明技术的公开内容涉及包含通过本文所述的烘烤方法生产的烤烟叶的烟草产品。在烟草产品的一些实施方案中，烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，烟草产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
一方面，提供了提高本发明的烟草属植物的产量和质量的方法，所述方法包括：(a)在约90％萌发的阶段对幼苗施肥，所述施肥通过加肥灌溉(例如滴灌)进行，任选地，N浓度为约200ppm；(b)应用塑料护盖物处理；例如，添加塑料护盖物以覆盖加肥灌溉设备(例如滴灌带/滴管)；(c)在移植后约4至5周、移植后约6至7周以及移植后约8至9周，以约90-120磅/英亩N总量的比率向所述幼苗施用氮，以提供烟草属植物增加的产量和质量。
一方面，提供了烟草产品，所述烟草产品包含来自烟草属植物的烟草，其中烟草属植物包含：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅通过(A)修饰的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
本发明还提供了通过本发明的方法产生的植物及其植物部分，以及从所述植物及其部分产生的作物、后代和产品，以及来自植物的种子。本发明还提供了用于实施本发明方法的载体和表达盒。
本发明的这些和其它方面将在下面的发明描述中更详细地阐述。
附图说明
图1示出了用于评估生物碱水平、产量和质量测定的烤烟遗传物质的输入方法。平均值是2016年和2017年北卡罗来纳州六个现场环境的平均值。不同字母的平均值在P<0.05的显著性水平上彼此差异显著。
图2示出了BC2F3个体植物顶部两片叶子的基于干重百分比的平均生物碱含量，所述植物的BBL-a、BBL-b和BBL-c中的突变是固定的，但在nic1和nic2基因座处的隐性等位基因是分离的。在打顶后21天收集样品。在括号内指示了每个基因型类别中的植物数目。基因型平均值显示在各个条块上，具有相同字母的平均值在通过t-检验确定的P>0.05的显著性水平上彼此没有显著差异。
发明详述
现在将在下文中参考附图和实例来描述本发明，在附图和实例中示出了本发明的实施方案。该描述并不旨在成为实施本发明的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以并入其它实施方案，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本发明设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。另外，对于本领域技术人员来说，根据本公开内容，对本文提出的各种实施方案的许多变化和添加将是显而易见的，所述变化和添加不偏离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定实施方案，而不是详尽地说明其所有排列、组合和变化。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不是旨在限制本发明。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入，以用于与其中出现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
除非上下文中另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以任意组合使用。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书陈述了组合物包含组分A、B和C，则特别意图是A、B或C中的任一个或其组合可以被省略，并且单独地或以任何组合的形式被放弃。
如在本发明和所附权利要求的描述中所使用的，除非上下文清楚地另外指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式。
此外，如本文中所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关列出项的任何和所有可能的组合，以及当以替代(“或(or)”)解释时没有组合。
如本文中所用，术语“约”，当指可测量的值诸如量或浓度等时，意味着包括指定值的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化以及指定值。例如，“约X”(其中X是可测量的值)意味着包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可包括任何其它范围和/或其中的单个值。
如本文中所用，诸如“在X与Y之间”和“在约X与Y之间”的短语应该解释为包括X和Y。如本文中所用，诸如“在约X与Y之间”的短语意指“在约X与约Y之间”，而诸如“从约X至Y”的短语意指“从约X至约Y”
除非本文中另有说明，否则本文中数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独数值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独引用一样。例如，如果公开了范围10至15，那么也公开了11、12、13和14。
如本文中所用，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”指定所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。
如本文中所用，过渡短语“基本上由......组成”意指权利要求的范围应被解释为包括权利要求中所述的指定材料或步骤，以及不会实质上影响所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由......组成”不旨在解释为等同于“包含”。
如本文中所用，术语“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“增加(increased)”、“增强(enhance)”、“增强(enhanced)”、“增强(enhancing)”和“增强(enhancement)”(及其语法变型)描述与对照对比，至少约15％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。
如本文中所用，术语“降低(reduce)”、“降低的(reduced)”、“降低(reducing)”、“降低(reduction)”、“减少(diminish)”、“抑制(suppress)”和“减少(decrease)”(及其语法变型)，描述例如与对照对比至少约5％,10％,15％,20％,25％,35％,50％,75％,80％,85％,90％,95％,97％,98％,99％或100％的减少。在一些实施方案中，降低可导致无或基本上无(即，可忽略的量，例如，小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。因此，例如，一种或多种靶DNA的降低的转录可意指与对照(例如，在BBLa、BBLb和BBLc核酸中不包含突变的植物)对比，至少约30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的靶基因的转录降低。
如本文中所用，术语“极低烟碱”或“VLN”烟草是指包含0.5mg烟碱/克烟草或更少的烟草。
如本文中所用，术语“标准烘烤方法”、“烘烤的标准方法”、“标准烘烤方案”或“标准烟草烘烤方法”等是指已知的烟草烘烤方法(例如，Powell 1987(标题为PowellManufacturing,Co.’s Bulk Curing/Drying Owner’s Operator’s Manual for FlueCured Tobaccos的手册,Powell Manufacturing,Co.(1987年1月20日)中描述的)已知的烟草烘烤方法。
如本文中所用，“嵌合的”是指其中至少两种组分源自不同的来源(例如，不同的生物体，不同的编码区)的核酸分子或多肽。
如本文中所用，“互补”可以指与比较核苷酸序列100％的互补性或同一性，或者其可以指小于100％的互补性(例如，约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％等的互补性)。
如本文中所用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
如本文中所用，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的术语“表达(express)”、“表达(expresses)”、“表达(expressed)”或“表达(expression)”等表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录，并且任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达例如目标多肽或功能性非翻译RNA。
核苷酸序列的“片段”或“部分”将被理解为意指相对于参考核酸或核苷酸序列长度减少(例如，减少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20个或更多个核苷酸)并且包含与参考核酸或核苷酸序列相同或基本上相同(例如，70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由其组成和/或由其组成的核苷酸序列。在适当的情况下，根据本发明的这种核酸片段或部分可以包含在其为构成部分的更大的多核苷酸中。
如本文中所用，术语“基因”指能够用于产生mRNA、反义RNA、RNAi(miRNA、siRNA、shRNA)、抗微小RNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可以能够或不可以用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区)。基因可以是“分离的”,其意指大体上或基本上不含通常发现的与其天然状态下的核酸缔合的组分的核酸。此类组分包括来自重组生产的其它细胞材料、培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学物质。
“异源”或“重组”核酸是不与其所被引入的宿主细胞天然相关联的核酸，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多重拷贝。或者，异源核苷酸序列可以是不与与其相关联的另一核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。例如，包含与核酸分子可操作地相关联的“异源启动子”的核酸构建体是不与与其相关联的所述核酸分子天然存在的启动子。
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同和其它物种的同源序列以及来自相同和其它物种的直向同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间在位置同一性百分比(即，序列相似性或同一性)方面的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文中所用，“直向同源”是指不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列，它们在物种形成过程中来自共同的祖先基因。本发明核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有基本序列同一性(例如，至少约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％和/或100％)。
如本文中所用，杂交(hybridization)、杂交(hybridize)、杂交(hybridizing)及其语法变型是指两个完全互补的核苷酸序列或其中可能存在一些错配的碱基对的基本互补的序列的结合。杂交的条件是本领域公知的，并且基于核苷酸序列的长度和核苷酸序列之间的互补程度而变化。在一些实施方案中，杂交条件可以是高度严格的，或者它们可以是中等严格或低严格的，这取决于待杂交序列的互补性的量和长度。构成用于核苷酸序列之间杂交的低、中和高严格性的条件是本领域公知的(参见，例如，Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:E2579-E2586；M.R.Green和J.Sambrook(2012)MolecularCloning:A Laboratory Manual.第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。
如本文中所用，“修饰(modify)”、“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”(及其语法变型)意指BBL多核苷酸(例如，BBLa、BBLb、BBLc)和/或BBL多肽或其它多肽或多核苷酸的任何改变，所述改变导致核酸的表达和/或多肽的产生和/或活性的减少或消除。此类修饰可包括但不限于删除或插入一个或多个核苷酸或整个核酸区域(转录区和非转录区)，和/或引入一个或多个点突变，所述点突变降低或消除了核酸的表达和/或多肽的产生和/或活性。
如本文中所用，术语“调节(modulate)”、“调节(modulates)”、“经调节的(modulated)”或“调节(modulation)”是指特定活性(例如，被调节的烟碱产量/含量)的增强(例如，增加)或抑制(例如，减少)。因此，在一些实施方案中，可以观察到与对照对比，活性(例如，核酸酶活性)升高或增强约15％,25％,50％,75％,100％,150％,200％,300％,400％,500％或更多。在其它实施方案中，可观察到与对照相比，表达水平或活性(例如，BBLa、BBLb和BBLc表达水平或BBLa、BBLb和BBLc多肽活性)降低约30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如,“野生型核酸”是生物体中天然存在的核酸或对于生物体是内源的核酸。“同源”核酸序列是与其所被引入的宿主细胞天然相关联的核苷酸序列。如本文中所用，“野生型”烟草品株系或品系是指不包含BBLabc突变或隐性nic1和/或nic2等位基因的烟草株系或品系。如本文中所用，“nic1/nic2对照”烟草株系或品系是指不包含纯合隐性nic1和/或nic2等位基因的烟草株系或品系。
在一些实施方案中，如本文中所述，本发明技术的植物包含对于三种主要bbl突变(例如，bbl-a/bbl-a,bbl-b/bbl-b,bbl-c/bbl-c)是纯合的BBLabc突变，并且对于隐性nic1和/或nic2等位基因也是纯合的(例如，nic1/nic1、nic2/nic2)。
此外，如本文中所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”是指线性或分枝的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。当合成产生dsRNA时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的强效反义抑制剂。也可以进行其它修饰，诸如对磷酸二酯骨架或RNA的核糖的糖基团中的2’-羟基的修饰。本公开的核酸构建体可以是DNA或RNA，但优选是DNA。因此，尽管本发明的核酸构建体可以以DNA的形式描述和使用，但取决于预期的用途，它们也可以以RNA的形式描述和使用。
如本文中所用，术语“核苷酸序列”是核苷酸的异聚体或这些核苷酸从核酸分子的5’末端至3’末端的序列，并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成(例如，化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其任一种都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换使用，指核苷酸的异聚体。本文提供的所有核酸都具有5’和3’末端。另外，除非另有说明，本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以5’至3’方向从左至右呈现，并且使用美国测序规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中阐述的用于表示核苷酸特征的标准代码来表示。
如本文中所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“同一性百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
如本文中所用,“序列同一性”指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在整个组分(例如，核苷酸或氨基酸)的比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk,A.M.，编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.，编辑)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.，编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology(von Heinje,G.，编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.，编辑)Stockton Press,New York(1991)。
如本文中所用，“靶DNA”、“靶区域”或“基因组中的靶区域”是指生物体基因组中与基因的区域完全互补或基本互补(例如，70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更多)的区域，任何类别的定制设计的核酸酶(例如，ZFN、TALEN、大范围核酸酶、CRISPR-Cas等)已被工程化来与所述基因的区域结合并切割其。
如本文中所用，在至少两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列的上下文中，短语“基本相同”或“基本同一性”是两个或更多个序列或子序列，当就最大相应性进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的，它们具有至少约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％和/或100％核苷酸或氨基酸残基序列同一性。
对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且可通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法等工具，以及任选地通过这些算法的计算机化实现(诸如，可作为
Wisconsin
(Accelrys Inc.,San Diego,CA)的一部分能够使用的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)来进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列所共有的相同组分的数量除以参考序列区段中组分的总数(即，整个参考序列或参考序列的较小的确定部分)。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分的比较，或者是与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，还可以使用BLASTX 2.0版(对于翻译的核苷酸序列)和BLASTN 2.0版(对于多核苷酸序列)来确定“同一性百分比”。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高评分序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的词比对时，所述短词匹配或满足某个正-值阈值分数T。T被称为邻域词得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，1990)。这些初始邻域词检索(word hits)充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。然后沿着每个序列在两个方向上扩展词检索，直至可以增加累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩分；始终<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当累积比对分数从其达到的最大值下降数量X时，累积分数由于一个或多个负-评分残基比对的累积而变为零或更低，或者到达任一序列的末端时，停止词检索在每个方向上的扩展。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用为11的字长(W)、为10的期望值(E)、为100的截止值、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用为3的字长(W)、为10的期望值(E)以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较的最小和概率(smallest sum probability)小于约0.1至小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似。因此，在本发明的一些实施方案中，测试核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较的最小和概率小于约0.001。
当两个核苷酸序列在严格条件下相互杂交时，也可以认为这两个序列是基本互补的。在一些代表性实施方案中，被认为基本互补的两个核苷酸序列在高度严格条件下相互杂交。
诸如Southern和Northern杂交等核酸杂交实验中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸杂交的详细指南可在Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部分第2章"Overview of principles ofHybridization and the strategy of Nucleic Probes assays"，Elsevier，New York(1993)中找到。通常，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在确定的离子强度和pH值下的热解链点(thermal melting point)(Tm)低约5℃。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或northern印迹中，在滤膜上具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列杂交的严格杂交条件的实例是42℃下的50％甲酰胺和1mg肝素，以及进行杂交过夜。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.1 5M NaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见，Sambrook，同下)。通常，高严格性洗涤之前是低严格性洗涤，以去除本底探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格性洗涤的实例是45℃下的1x SSC持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的实例是40℃下的4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及低于约1.0M Na离子的盐浓度，在pH 7.0至8.3下通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度通常为至少约30℃。还可通过添加诸如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。一般来说，在特定的杂交测定中，信噪比为对于无关探针观察到的信噪比的2倍(或更高)表明检测到了特异性杂交。如果在严格条件下相互不杂交的核苷酸序列编码的蛋白质基本相同，则它们仍然是基本相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核苷酸序列的拷贝时，这可能发生。
以下是可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列的多组杂交/洗涤条件的实例。在一个实施方案中，将参考核苷酸序列与“测试”核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交，并在50℃下于2X SSC,0.1％SDS中洗涤。在另一个实施方案中，将参考核苷酸序列与“测试”核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交，并在50℃下于1X SSC,0.1％SDS中洗涤，或者在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交，并在50℃下于0.5X SSC,0.1％SDS洗涤。在又一另外的实施方案中，将参考核苷酸序列与“测试”核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交，并在50℃下于0.1X SSC,0.1％SDS中洗涤，或者在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交，并在65℃下于0.1X SSC,0.1％SDS中洗涤。
目标核苷酸序列(例如，编码用于突变BBL核酸的核酸酶的核酸)可以与多种启动子、终止子和/或用于在植物细胞中表达的其它调控元件可操作地相关联。任何在植物细胞中有功能的启动子、终止子或其它调控元件都可以与本发明的核酸一起使用。在一些实施方案中，启动子可以与用于实施本发明的多核苷酸和/或核酸可操作地连接。在一些实施方案中，终止子可以与本发明的多核苷酸和/或核酸可操作地连接。
“启动子”是控制或调节与启动子可操作地连接的核苷酸序列(即，编码序列)的转录的核苷酸序列。编码序列可以编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指含有RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。通常，相对于相应编码序列的编码区的起始，启动子存在于5’或上游。启动子区可以包含其它作为基因表达的调控因子的元件。这些元件包括TATA盒共有序列，并且通常是CAAT盒共有序列(Breathnach和Chambon，(1981)Annu.Rev.Biochem.50:349)。在植物中，CAAT盒可以用AGGA盒代替(Messing等人，(1983)in Genetic Engineering of Plants,T.Kosuge,C.Meredith和A.Hollaender(eds.),Plenum Press，第211-227页)。
用于本发明的启动子可以包括，例如，组成型、诱导型、时间调控型、发育调控型、化学调控型、组织优选型和/或组织特异性启动子，用于制备重组核酸分子，即“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。启动子的选择将根据表达的时间和空间要求以及待转化的宿主细胞而变化。许多不同生物体的启动子是本领域公知的。基于本领域存在的广泛知识，可以为特定的目标宿主生物体选择合适的启动子。因此，例如，关于在模式生物体中高度组成型表达的基因上游的启动子的许多知识是已知的，并且这些知识可以容易地在其它合适的系统中获得和实施。在一些实施方案中，目标核苷酸序列可以在任何植物和/或植物部分中(例如，在叶中、茎或茎杆中、穗中、花序中、根中、种子中和/或幼苗中等)表达，并且相应地选择启动子。
在一些实施方案中，可将本发明的一种或多种多核苷酸和核酸与启动子以及终止子和/或其它调控元件可操作地相关联以用于在植物细胞中表达。任何在植物细胞中具有功能的启动子、终止子或其它调控元件都可以与本发明的核酸一起使用。可用于本发明的启动子的非限制性实例包括拟南芥U6 RNA聚合酶III启动子、35S启动子、肌动蛋白启动子、遍在蛋白启动子、Rubisco小亚基启动子、诱导型启动子，包括但不限于AlcR/AlcA(乙醇诱导型)启动子、糖皮质激素受体(GR)融合启动子、GVG启动子、pOp/LhGR(地塞米松诱导型)启动子、XVE/OlexA(β-雌二醇诱导型)启动子、热休克启动子和/或双向启动子(参见，例如Current Opinion in Biotechnology 7(2):168-172(1996)；Borghi L.Methods MolBiol.655:65-75(2010)；Baron等人Nucleic acids research 23(17)(1995),3605；Kumar等人Plant molecular biology 87(4-5):341-353(2015))。
如本文中所用，“可操作地连接”或“可操作地关联”意指所指示的元件在功能上彼此相关，并且通常在物理上也相关。因此，如本文中所用，术语“可操作地连接”或“可操作地相关联”是指单个核酸分子上功能上相关联的核苷酸序列。因此，与第二核苷酸序列可操作地连接的第一核苷酸序列意指第一核苷酸序列与第二核苷酸序列处于功能性关系中。例如，如果启动子影响所述核苷酸序列的转录或表达，则该启动子与该核苷酸序列可操作地相关联。本领域技术人员将会理解，控制序列(例如，启动子)不需要与其可操作相关联的核苷酸序列连续，只要控制序列发挥指导其表达的功能即可。因此，例如，居间非翻译但转录的序列可存在于启动子与核苷酸序列之间，并且启动子仍然可以被认为与所述核苷酸序列“可操作地连接”。
在一些实施方案中，用于修饰或突变BBL核酸和任何其它目标多核苷酸(例如，编码正向调控烟碱类生物碱生物合成的烟碱类生物碱生物合成酶转录因子的其它多核苷酸)的组分可包含在“表达盒”中。如本文中所用，“表达盒”意指包含目标核苷酸序列(例如，用于突变BBL核酸的核酸酶)的核酸构建体，其中所述核苷酸序列与至少一个控制序列(例如，启动子)可操作地连接。表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个其组分相对于其至少一个其的其它组分是异源的。因此，例如，待表达的核酸可以与启动子或与待表达的核酸异源(例如，与CRISPR引导DNA异源)的其它调控元件可操作地连接。表达盒也可以是天然存在的，但，是已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
除了启动子以外，表达盒还可以任选地包括在植物细胞中具有功能的其它调控元件，包括但不限于转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子可用于表达盒，并负责终止目标异源核苷酸序列以外的转录和正确的mRNA多聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目标核苷酸序列可以是天然的，对于宿主细胞可以是天然的，或者可源自另一来源(即，对于启动子、目标核苷酸序列、宿主或其任意组合来说是外源的或异源的)。在植物中具有功能并可用于本发明的终止子的非限制性实例包括肌动蛋白终止子；Rubisco小亚基终止子、Rubisco大亚基终止子、胭脂碱合酶终止子和/或遍在蛋白终止子。
已知许多来源自病毒的非翻译前导序列能增强基因表达。具体而言，来自烟草花叶病毒(TMV，“ω序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已被证明能有效增强表达(Gallie等人(1987)Nucleic Acids Res.15:8693-8711；和Skuzeski等人(1990)Plant Mol.Biol.15:65-79)。本领域已知的其它前导序列包括但不限于微小核糖核酸病毒前导序列，诸如脑心肌炎(EMCV)5’非编码区前导序列(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列诸如烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列(Allison等人(1986)Virology 154:9-20)；玉米矮花叶病毒(MDMV)前导序列(Allison等人(1986)，同上)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak&Samow(1991)Nature 353:90-94)；AMV外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4；Jobling&Gehrke(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶TMV前导序列(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA 237-256)；和MCMV前导序列(Lommel等人(1991)Virology 81:382-385)。另见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968。
表达盒还可以任选地包括在植物中具有功能的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子可用于表达盒，并负责终止目标异源核苷酸序列以外的转录和正确的mRNA多聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目标核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一来源(即，对于启动子、目标核苷酸序列、植物宿主或其任意组合是外源的或异源的)。合适的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或pea rbcs E9终止子。这些可以用于单子叶植物和双子叶植物。另外，可以使用编码序列的天然转录终止子。
表达盒也可包括选择标记的核苷酸序列，其可用于选择转化的宿主细胞。如本文中所用，“选择标记”意指这样的核苷酸序列，当其被表达时，赋予表达该标记的宿主细胞独特的表型，从而使此类转化的细胞与那些没有该标记的细胞相区别。这种核苷酸序列可以编码可选择标记或筛选标记，这取决于所述标记是否赋予可通过化学手段，诸如通过使用选择剂(例如，抗生素等)选择的性状，或者取决于所述标记是否仅仅是可通过观察或测试，诸如通过筛选(例如，荧光)鉴定的性状。合适的选择标记的许多实例是本领域已知的，并且可用于本文所述的表达盒中。
除了表达盒以外，本文所述的核酸可以与载体结合使用。术语“载体”是指用于将一种或多种核酸转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含含有待转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列的核酸分子。用于转化宿主生物体的载体是本领域公知的。一般类别的载体的非限制性实例包括但不限于呈双链或单链线性或环状形式的病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体或土壤杆菌二元载体，其可以是或可以不是可自传递的或可移动的。本文定义的载体可以通过整合入细胞基因组或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化真核宿主。另外还包括穿梭载体，所述穿梭载体意指能够天然地或通过设计在两种不同的宿主生物中复制的DNA媒介物。在一些代表性实施方案中，载体中的核酸处于合适的启动子或其它调控元件的控制之下并与其可操作地连接，以用于在宿主细胞中转录。载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可能包含其自身的启动子或其它调控元件，而在cDNA的情况下，这可能在合适的启动子或其它调控元件的控制下，以便在宿主细胞中表达。因此，多核苷酸和/或表达盒可以包含在本文所述和本领域已知的载体中。
如本文中所用，“烟碱类生物碱”是指源自烟酸的生物碱。这些生物碱通常含有3-吡啶基环结构，其中烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱代表烟草属中的主要烟碱类生物碱。在一些实施方案中，烟碱类生物碱可以包含烟碱、降烟碱、新烟草碱和/或假木贼碱，或基本由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，烟碱类生物碱是烟碱。
如本文中所用，“生物碱含量”是指植物中发现的例如以干重百分比(干重％)或鲜重百分比(鲜重％)表示的生物碱总量。
可用于本发明的植物可以是任何产生烟碱和/或其它相关生物碱的烟草属植物。因此，在一些实施方案中，植物可以是烟草、黄花烟草(Nicotiana rustica)或本生烟草(Nicotiana benthamiana)。任何种类的烟草均可用于本发明，包括但不限于芳香烤烟、明叶烟草(Brightleaf tobacco)、白肋烟；板烟(Cavendish)；Corojo；Criollo；东方烟草(Oriental Tobacco)；Perique；遮蔽烟草(遮荫烟草)；Thuoc lao；22型；NC95、K326、K346、白肋烟(White Burley)、野烟(Wild Tobacco)、Y1等。
如本文中所用，术语“植物部分”包括但不限于生殖组织(例如，花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子、胚胎)；营养组织(例如，叶柄、茎杆、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎、幼苗、枝、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如，韧皮部和木质部)；特化细胞，诸如表皮细胞、薄壁细胞、胆细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；胼胝组织；和插枝。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)等。如本文中所用，“幼苗”是指地上部分，包括叶和茎杆。如本文中所用，术语“组织培养物”包括组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。
如本文中所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包括细胞壁，但也包括原生质体。本发明的植物细胞可呈分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单位的一部分，例如植物组织(包括愈伤组织)或植物器官。在一些实施方案中，植物细胞可以是藻类细胞。
“植物细胞培养物”意指植物单位的培养物，例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同发育阶段的胚胎。在本发明的一些实施方案中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。
如本文中所用，“植物器官”是植物的独特且明显结构化和分化的部分，诸如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文中所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括在植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括但不限于完整植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。该术语与上面列出的或以其他方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织结合使用，或在所述任何特定类型的植物组织不存在的情况下时使用，不旨在排除任何其它类型的植物组织。
在目标多核苷酸(例如，用于突变BBL核酸的核酸酶)的上下文中，“引入(Introducing)”、“引入(introduce)”、“引入(introduced)”(及其语法变型)意指将目标多核苷酸呈递至宿主生物体或所述生物体的细胞(例如，宿主细胞)，使得多核苷酸能够进入细胞内部。当引入不止一种多核苷酸时，这些多核苷酸可以作为单一多核苷酸或核酸构建体的一部分组装，或者作为单独的多核苷酸或核酸构建体组装，并且可以位于同一或不同的表达构建体或转化载体上。因此，这些多核苷酸可以在单个转化事件中、在单独的转化/转染事件中被引入细胞被引入细胞，或者，例如，它们可以通过常规育种方案被整合到生物体中。因此，在一些方面，可将一种或多种编码用于修饰或突变BBL核酸的核酸酶(例如，Crispr-Cas核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)和/或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))的多核苷酸在单个表达盒和/或载体中单独或组合引入宿主生物体或所述宿主生物体的细胞中。在一些实施方案中，引入nic1隐性等位基因，或nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因可以包括通过常规育种将一种或多种隐性等位基因整合到例如在BBLa、BBLb和BBLc中包含修饰的植物中，使得BBLa、BBLb和BBLc基因表达降低或无表达，或者由经修饰的BLa、BBLb和BBLc基因编码的多肽活性降低或无活性。
如本文中所用，术语“转化”或“转染”是指将异源核酸诸如编码核酸酶的核酸引入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的，或者可以是部分稳定转化和部分瞬时转化的。因此，在一些实施方案中，对植物基因组的修饰可以是稳定的，而在一些实施方案中，修饰可以是瞬时的。在一些实施方案中，在稳定转化后，引入植物基因组的核酸构建体可以通过例如与未修饰的植物杂交或非纯合植物的分离来去除。
多核苷酸上下文中的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞，但不整合到细胞的基因组中。
在多核苷酸的上下文中,“稳定引入(stably introducing)”或“稳定引入的(stably introduced)”意指引入的多核苷酸稳定地整合到细胞基因组中，因此细胞被多核苷酸稳定转化。
如本文中所用，“稳定转化(Stable transformation)”或“稳定转化的(stablytransformed)”意指将核酸构建体引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸构建体能够被其后代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如本文中所用，“基因组”可包括核基因组、质体基因组和/或线粒体基因组，因此可包括将核酸构建体至核基因组、质体基因组和/或线粒体基因组中的整合。如本文中所用，稳定转化也可指例如作为微小染色体或质粒保持在染色体外的转基因。
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，所述酶联免疫吸附测定或蛋白质印迹可以检测由引入植物或植物细胞的一种或多种转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过，例如，用核酸序列对细胞的基因组DNA进行Southern印迹杂交测定来检测，所述核酸序列与引入生物体(例如，细菌、古生菌、酵母、藻类等)的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化可以通过例如用核酸序列对细胞DNA进行Southern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与引入植物或其它生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化也可以通过采用与转基因的一个或多个靶序列杂交的特异性引物序列，进行例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域公知的其它扩增(导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法来检测)来检测。叶子化也可以通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案来检测。
转化植物的程序是本领域公知的和常规的，并在整个文献中进行了描述。用于转化植物的方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如，通过土壤杆菌(Agrobacteria))、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击进行的转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、渗透、PEG介导的核酸摄取以及导致将核酸引入植物细胞的任何其它电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任意组合。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人("Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.,编辑(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)，第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.7:849-858(2002))。
土壤杆菌介导的转化是用于转化植物(特别是双子叶植物)的常用方法，因为其转化效率高，并且对许多不同物种具有广泛的用途。土壤杆菌介导的转化通常包括将携带目标外源DNA的二元载体转移到合适的土壤杆菌菌株中，这可能依赖于宿主土壤杆菌菌株携带的vir基因的互补体，该互补体位于共驻留(co-resident)Ti质粒上或染色体上(Uknes等人(1993)Plant Cell 5:159-169)。重组二元载体向土壤杆菌的转移可以通过三亲交配法，使用携带重组二元载体的大肠杆菌、携带能够将重组二元载体动员到靶土壤杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株来完成。或者，可以通过核酸转化将重组二元载体转移到土壤杆菌中(
&Willmitzer(1988)Nucleic Acids Res.16:9877)。
通过重组土壤杆菌转化植物通常涉及土壤杆菌与来自植物的外植体的共培养，并遵循本领域公知的方法。于选择培养基上再生在二元质粒T-DNA边界之间携带抗生素或除草剂抗性标记的转化的组织。
另一种转化植物、植物部分和/或植物细胞的方法包括在植物组织和细胞处推进惰性或生物活性颗粒。参见例如美国专利第4,945,050号、第5,036,006号和第5,100,792号。通常，这种方法包括有效穿透细胞外表面并提供在其内部掺入的条件下，在植物细胞处推进惰性或生物活性颗粒。当使用惰性颗粒时，可以通过用含有目标核酸的载体包被颗粒来将载体引入细胞。或者，可用载体包围一个或多个细胞，使得载体被颗粒的尾流带入细胞。生物活性颗粒(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一种或多种试图引入的核酸)也可以被推进植物组织中。
因此，可以以本领域公知的多种方式将核苷酸序列引入植物、植物部分和/或植物细胞。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入植物的特定方法，只要它们能够进入植物的至少一个细胞的内部即可。因此，在本发明的具体实施方案中，可以使用多种已知技术中的任一种从这些转化的细胞中再生完整的植物。来自植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生描述于例如Evans等人(Handbook of Plant CellCultures，第1卷，MacMilan Publishing Co.New York(1983))；和Vasil I.R.(编辑)(CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants,Acad.Press,Orlando，第I卷(1984)和第II卷(1986))。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法是本领域的常规方法，并且可用于本文提供的本发明的方法中。
如本文中所用，“烟草产品”是指包含由烟草属植物生产的材料的产品，包括例如用于戒烟的烟碱口香糖和贴剂、包括膨胀(膨化)和再造烟草在内的香烟烟草、雪茄烟草、烟斗烟草、香烟、雪茄和诸如咀嚼用烟草、鼻烟、湿鼻烟(Snus)和锭剂等的所有形式的无烟烟草。“香烟”包括电子香烟和“加热而非燃烧的”产品，它们是加热烟草而非燃烧烟草的香烟-样装置。在一些实施方案中，烟草产品可包括但不限于小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和/或咀嚼用烟草。
本发明部分涉及发现：烟草属植物包含(a)编码小檗碱桥样(BBL)多肽BBLa、BBLb和BBLc的多核苷酸，其已经被修饰以减少或消除多核苷酸的表达和/或由其产生的多肽的活性，和(b)nic1隐性等位基因，或nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因提供了与不包含经修饰的BBLa、BBLb和BBLc多核苷酸和nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因的烟草属植物对比，或者与仅包含经修饰的BBLa、BBLb和BBLc多核苷酸的烟草属植物对比，降低的烟碱类生物碱含量。
烟碱是被高度研究的由物种Nicotiana tabacumL.(通常称为烟草)和烟草属的许多其它成员大量产生的植物天然产物。这种吡啶生物碱在烟草根中合成，随后在受植物受伤或顶端花序损失刺激的过程中转移到气生植物部分。烟碱的积累可能在植物抵御食草动物的天然防御中发挥作用。烟碱在人社会中也起着重要的作用，因为其是人造烟草产品中的主要成瘾性物质，诸毒性特征已得到充分研究的可燃香烟。美国食品和药物管理局(FDA)列出了93种烟草和烟草烟雾化学成分，由于它们与致癌作用、成瘾或呼吸、心血管、生殖或发育毒性的关联，被指定为“有害和潜在有害的”(美国食品和药物管理局，2012年)。
烟碱本身并不被认为是致癌物质，但世界卫生组织(2015年)和美国食品和药物管理局(2018年)已经建议强制将可燃香烟中的烟碱含量降低到不会上瘾的水平，以减少对此类产品的整体成瘾，并降低相应的有毒物暴露。常规烟草栽培品种中基于干重的烟碱百分比通常在1.0％与5.0％之间，其中观察到的可变性归因于市场类型(白肋烟、烤烟、深色烟、雪茄或东方烟)、植物遗传学、生长环境和叶位(stalk position)。制造商掺混采购的烤烟叶来生产香烟烟草填料，其具有基于干重为1.0％至2.0％的烟碱。可燃香烟中烟碱变得不成瘾的具体浓度可能难以确定，并且可能因人而异，但是Benowitz和Henningfield(NewEngl.J.Med.331,123-125(1994))预测0.02至0.03％的烟草填料烟碱含量低于“成瘾的亚阈值水平”。世界卫生组织(2015年)建议将烟草填料中的烟碱含量降至0.04％以下。
据报道，已经使用了各种化学提取方法来实现烟草填料中烟碱含量的80％至98％的降低。然而，与化学提取相关的成本增加，以及对感官特性有积极影响的化合物的共提取的可能性，使得这些方法没有吸引力。改良的植物遗传学的使用是降低香烟烟碱水平的优选途径。
开发烟碱积累潜力降低的新烟草品种的遗传方法包括使用(1)天然存在于烟草或近缘物种中的遗传变异性，(2)通过基因编辑或诱变剂处理诱导的遗传变异性，或(3)通过遗传工程产生的新型变异。在美国烟草种质保藏中心的不同烟草材料中，生物碱积累存在很大的差异，基于干重从0.02％至6.55％不等。然而，世界卫生组织推荐的0.04％的超低烟碱水平在最低生物碱材料中并不常见。已发现nic1和nic2(也称为A和B)基因座处的隐性等位基因有助于烟碱和相关生物碱(降烟碱、假木贼碱和新烟草碱)从1.5-4.5％显著降低至约0.20-0.45％。然而，众所周知，这种等位变异性与降低的烤烟叶产量和质量相关联，使得烤烟叶在商业上不受欢迎。
经鉴定参与烟碱生物合成的特定基因的知识允许使用诸如RNA干扰的技术来降低它们的表达并实现烟碱积累的相应减少。然而,“GMO”烟草品种的商业化在世界范围内受到不同程度的复杂监管。作为基因工程的替代方案，通过诱导的突变或基因编辑实现的基因沉默可能用于实现烟碱的下降。由于烟草的多倍体性质，多个基因拷贝中的突变通常是实现所需表型所必需的。多倍体物种中突变育种增加的复杂性可以被这样的事实抵消，即在世界许多地方，不认为此类育种方法的结果是受管制的。
小檗碱桥样(BBL)基因家族先前被鉴定为编码参与烟草烟碱生物合成途径的最后步骤之一的酶，尽管其精确作用目前还不清楚。该家族由六个密切相关的成员组成，其中三个成员表达至显著程度(BBL-a、BBL-b和BBL-c)，并且三个成员低表达(BBL-d1、BBL-d2和BBL-e)。我们之前证明了携带RNA干扰转基因以降低该基因家族表达的常规大田种植的烤烟植物中烟碱含量显著降低(Lewis等人，PLOS ONE 10,e0117273(2015))。我们还报告了关于在三个最高表达的BBL基因家族成员中诱导突变的效果的初步结果(Lewis等人，PLOSONE 10,e0117273(2015))。本发明涉及烟草品系的开发和测试，所述烟草品系将BBLabc突变与在nic1和nic2基因座处天然存在的隐性等位基因相组合。
因此，本发明提供了生产烟碱类生物碱含量降低的烟草属植物的方法，所述方法包括在烟草属植物中组合：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因，或nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰的植物(例如，未根据(A)和(B)修饰的植物)相比，烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，所述方法包括在烟草属植物中组合：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因。在一些实施方案中，所述方法包括在烟草属植物中组合：(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。在一些实施方案中，产生烟碱类生物碱含量降低的烟草属植物的方法还可包括减少编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达的修饰。在一些实施方案中，额外的烟碱类生物碱生物合成酶可以包括但不限于天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和/或A622。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的烟草属植物可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，降低至少40％(例如，至少约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％或更多；或基中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，在通过本发明的方法产生的烟草属植物中下降的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，烟碱含量可降低约40％至约90％(例如，约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％或91％或更多；或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的烟草属植物可包含约0.014％至约0.098％的烟碱含量，所述烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰和(B)nic1隐性等位基因的烟草属植物，可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比下降至少约30％(例如，约30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％或更多，或其中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，在本发明的烟草属植物中降低的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅根据(A)修饰的(例如，未根据(A)和(B)修饰的)的植物相比，烟碱含量可以降低约40％。在一些实施方案中，本发明的具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰和(B)nic1隐性等位基因可包含约0.098％的烟碱含量。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰和(B)nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因的烟草属植物，可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比下降至少约40％(例如，至少约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％或更高，或其中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，在本发明的烟草属植物中降低的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅根据(A)修饰的(例如，未根据(A)和(B)修饰的)的植物相比，烟碱含量可减少约90％(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或更多)。在一些实施方案中，本发明的具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰和(B)nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因的烟草属植物可包含约0.014％的烟碱含量。
在一些实施方案中，与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，通过本发明的方法产生的烟草属植物可包含增加的叶绿素(例如，增加的绿度)，任选地，其中叶绿素的增加在植物的叶中或在植物的叶和茎中。在一些实施方案中，与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，通过本发明的方法产生的烟草属植物可包含较低的糖含量，任选地，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，糖含量可降低约7％-28％(例如，约7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％,26％,27％,28％或更多，或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，通过本发明的方法产生的烟草属植物可包含较低的氮含量，任选地，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，氮含量可降低约10％-25％(例如，约10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％或更多，或其中的任何范围或值)。
本发明还提供了烘烤本发明的烟草属植物的叶和茎的方法。包含本文所述遗传修饰的本发明的烟草属植物产生在使用标准烟草烘烤方法(例如，Powell 1987(标题为Powell Manufacturing,Co.'s Bulk Curing/Drying Owner's Operator's Manual forFlue Cured Tobaccos的手册,Powell Manufacturing,Co.(1987年1月20日))中描述的方法)烘烤时，不能提供具有用于烟草产品的足够质量的烟草的叶和茎。与标准烘烤方法相反，本文所述的烘烤方法当应用于本发明烟草属植物(例如，具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因或者nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因)的叶和茎时，提供了与使用标准烘烤方案(例如，变黄过程，其包括在约92°F至约96°F(例如，约92°F、93°F、94°F、95°F或96°F或其中的任何范围或值)的起始温度下加热叶,并以每小时约1℉的速率升高至约104℉至约108℉(例如，约104℉、105℉、106℉、107℉、108℉或其中的任何范围或值)的最大上限温度，直至达到最大上限温度，将所述上限温度保持约52-58小时的时段(例如，约52小时、53小时、54小时、55小时、56小时或其中的任何范围或值)；在约120℉的温度下进行约22小时的叶子干燥过程；以及(c)在约132℉-138℉(例如，约132℉、133℉、134℉、135℉、136℉、137℉或138℉或其中的任何范围或值)的温度下进行约50小时至约65小时(例如，约50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时或65小时或其中的任何范围或值)的茎干干燥过程，同时进行连续监测,从而烘烤烟草属植物的一片或多片叶子并产生烟草属植物的一片或多片烤烟叶)烘烤的本发明的烟草属植物的叶和茎对比具有改善的质量的烟草。在一些实施方案中，叶子干燥过程在约116℉-120℉或约116℉-118℉(例如，约116℉、117℉、118℉、119℉、120℉或其中的任何范围或值)的温度下进行约28-34小时(例如，约28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时或34小时，或其中的任何范围或值)。与使用标准烘烤方案烘烤的本发明技术的烟草属植物对比，根据本发明技术的方法烘烤的本发明技术的烟草属植物的质量改善包括但不限于更好的指数等级、改善的质地、改善的颜色、高品质、升高的糖水平和降低的氨水平。烤烟品种中的糖水平是良好风味亮叶的指标，氨水平通常用作烟草异味的指标。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了烘烤烟草属植物的一片或多片叶和/或茎的方法，所述烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1隐性等位基因，或nic1隐性等位基因和nic2隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰的植物对比，烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，所述方法包括：(a)变黄过程，其括在从92℉-96℉起始温度下加热叶子，并以约1℉/小时的速率升高至104℉-108℉(例如，104℉、105℉、106℉、107℉或108℉，或其中的任何范围或值)的温度，直到达到最大上限温度，并在该上限温度下保持约52-58小时(例如，约52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时或58小时和其中的任何范围或值),任选地其中该过程长度为约54小时；(b)任选地，在约120℉的温度下进行约22小时的叶子干燥过程；以及(c)在约132℉-138℉(132℉、133℉、134℉、135℉、136℉、137℉或118℉，或其中的任何范围或值)(任选134℉)的温度下进行约50小时至约65小时(例如，约50小时、51小时、52小时、53小时、54、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时或65小时，或其中的任何范围或值)的茎干干燥过程，同时进行连续监控，从而烘烤烟草属植物的一片或多片叶子并产生烟草属植物的一片或多片烤烟叶。在一些实施方案中，叶子干燥过程在约116℉-120℉或约116℉-118℉(116℉、117℉、118℉、119℉、120℉或其中的任何范围或值)的温度下进行约28-34小时。
在一些实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法生产的烤烟。在一些实施方案中，本发明的烤烟(例如，上二棚叶(leaf)、完熟叶(smoking leaf)、下二棚叶(lugs)、腰叶(cutters)、脚叶(primings))具有色度好、宽度正常和质地均匀的一般至优良品质的特征，任选地，其中烤烟具有超过60的USDA等级指数。在一些实施方案中，根据USDA标准等级(“美国烤烟的官方标准等级11型、12型、13型、14型和外国92型”)(如在USDA农业营销服务网站(ams.usda.gov/grades-standards/tobacco)上公布的)和根据烟草检验法(49Stat.731；7U.S.C.511)(生效日期1989年3月27日(54F.R.7925)授权发布的第29部分第1章标题7。表1中描述了示例性USDA标准等级。
表1.
在一些实施方案中，提供了来自烟草属植物的烤烟烟叶，其中(A)所述烟草属植物(1)包含隐性nic1和nic2等位基因之一或两者，和(2)包含相对于野生型改变的BBLa、BBLb和BBLc基因，使得所述烟草属植物的烟碱类生物碱含量与所述野生型相比降低；和(B)与来自未使用本发明的方法栽培和烘烤，从而产生劣质至低品质的叶子的相同烟草属植物的叶子对比，烤烟烟叶(包括上二棚叶、完熟叶、顶叶、腰叶、下二棚叶)具有色度好、宽度正常和质地均匀的良好至一般品质的特征。在一些实施方案中，本发明的烤烟可具有超过60的USDA等级指数。
在一些实施方案中，通过本发明的方法从烟草属植物生产的烤烟可包括但不限于上二棚叶、完熟叶、顶叶、腰叶、脚叶和/或下二棚叶，所述烟草属植物具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因(相对于野生型)(其中烟草属植物的烟碱类生物碱含量相较于所述野生型降低)。在一些实施方案中，本发明提供的完熟叶可具有H3F(品质优良的橘黄色完熟叶)至4F(品质一般的橘黄色完熟叶)至5F(低品质橘黄色完熟叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的完熟叶具有H6F(劣质橘黄色完熟叶)至H6FR(劣质橘红色完熟叶)至H6K(劣质杂色完熟叶)的USDA质量等级。在一些实施方案中，本发明提供的上二棚叶(B组)可具有B2L(优质柠檬黄色上二棚叶)至B3L(品质优良的柠檬黄色上二棚叶)至B4L(品质一般的柠檬黄色上二棚叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的上二棚叶(B组)具有B5L(低品质柠檬黄色上二棚叶)至B6L(劣质柠檬黄色上二棚叶)的USDA质量等级。
在一些实施方案中，本发明提供的腰叶(C组)可以具有USDA质量等级C2L(优质柠檬黄色腰叶)至C3L(品质良好的柠檬黄色腰叶)至C4L(品质一般的柠檬黄色腰叶)，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的腰叶(C组)，具有C5L(低品质柠檬黄色腰叶)的USDA质量等级。在一些实施方案中，本发明提供的腰叶(C组)可具有C2F(优质橘黄色腰叶)至C3F(品质良好的橘黄色腰叶)至C4F(品质一般的橘黄色腰叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的腰叶(C组)具有C5F(低品质的橘黄色腰叶)的USDA质量等级。
在一些实施方案中，本发明提供的下二棚叶(X组)可具有X2L(优质柠檬黄色下二棚叶)至X3L(品质良好的柠檬黄色下二棚叶)至X4L(品质一般的柠檬黄色下二棚叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的下二棚叶(X组)具有X5L(低品质柠檬黄色下二棚叶)的USDA质量等级。在一些实施方案中，本发明提供的下二棚叶(X组)可具有X2F(优质橘黄色下二棚叶)至X3F(品质良好的优质橘黄色下二棚叶)至X4F(品质一般的橘黄色下二棚叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的下二棚叶(X组)具有X5F(低品质橘黄色下二棚叶)的USDA质量等级。
在一些实施方案中，本发明提供的脚叶(P组)可以具有P2L(优质柠檬黄色脚叶)至P3L(品质良好的柠檬黄色脚叶)至P4L(品质一般的柠檬黄色脚叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的脚叶(P组)具有P5L(低品质柠檬黄色脚叶)的USDA质量等级。在一些实施方案中，本发明提供的脚叶(P组)可具有P2F(优质橘黄色脚叶)至P3F(品质良好的橘黄色脚叶)至P4F(品质一般的橘黄色脚叶)的USDA质量等级，相比之下，尚未使用本发明的方法烘烤或种植的具有隐性nic1和nic2等位基因之一或两者以及改变的BBLa、BBLb和BBLc基因的烟草属植物的脚叶(P组)具有P5F(低品质的橘黄色脚叶)的USDA质量等级。
如本文中所用，“上二棚叶”是指烟草植物的主要组分，其中尺寸、形状和在茎上的位置可以是上二棚叶质量的指标。烤烟植株上的“上二棚叶”是指从顶部开始的第二组叶，而在火烤和阴晾烟中，“上二棚叶”是位于烟草植株顶部三分之一的所有叶的总称。
“完熟叶”就长在茎的中部上方。
如本文中所用，“下二棚叶”是指烤烟植株上从地面开始的第二组叶；白肋烟植株上最大的叶子，其位于烟梗中部附近和/或火烤和阴晾烟植株上的中间叶组。
如本文中所用，“腰叶”是指烤烟植物上最大的叶子，其位于茎的中部附近。
如本文中所用，“顶叶”是指烤烟植株或白肋烟植株上最上面的叶子，和/或在加工过程中经常被除去的烟叶的尖端(离茎最远)。
在一些实施方案中，提供了包含来自烟草属植物的烟草的烟草产品，所述烟草属植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物相比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，提供了包含来自烟草属植物的烟草的烟草产品，所述烟草属植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因。在一些实施方案中，提供了包含来自烟草属植物的烟草的烟草产品，所述烟草属植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比降低至少约40％(例如，至少约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％或更多，或其中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量，所述本发明的烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因或者nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。在一些实施方案中，在用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物中降低的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，烟碱含量可下降约40％至约90％(例如，约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％或91％，或更多；或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含约0.014％至约0.098％的烟碱含量，所述烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因或者nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比降低至少约30％(例如，约30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％或更多，或其中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量，所述本发明的烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因。在一些实施方案中，在用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物中降低的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅根据步骤(A)修饰的植物对比，烟碱含量可下降约40％。在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含约0.098％的烟碱含量，所述本发明的烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因。
在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比降低至少约40％(例如，至少约40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％或更多，或其中的任何范围或值)的烟碱类生物碱含量，所述本发明的烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。在一些实施方案中，在用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物中减少的烟碱类生物碱可以是烟碱，其中与仅按照(A)修饰的植物对比，烟碱含量可以降低约90％(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或更多或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，用于生产烟草产品的本发明的烟草属植物可包含约0.014％的烟碱含量，所述本发明的烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
测定烟碱类生物碱含量的方法在本领域中是公知的和常规的，并描述于整个本文献中。此类方法的非限制性实例包括气相色谱法、质谱法(Domino等人1992Med SciRes.20:859-860；Sheen等人2006 J Food Sci 53(5):1572-1573)、HPLC(
等人2001 J Agric Food Chem 49:3553-3558；Halitschke和Baldwin 2003Plant J 36:794–807)、紫外线吸收(Willits等人2005Analytical Chemistry 22:430-433)，等等。
在一些实施方案中，如本文所述用于生产烟草和烟草产品的烟草属植物还可包含遗传修饰。例如，烟草属植物还可包含编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的降低的表达。在一些实施方案中，另外的烟碱类生物碱生物合成酶可以包括但不限于天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和/或A622。
还可修饰本发明的烟草属植物，以降低另外的烟碱类生物碱生物合成酶的活性或者降低编码所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶的核酸的表达。此类另外的烟碱类生物碱生物合成酶包括但不限于另外的小檗碱桥酶样多肽、天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。因此，例如，可以进一步修饰烟草属植物以降低BBLe、BBLd-1和/或BBLd-2的表达和/或降低另外的小檗碱桥酶样多肽诸如BBLe、BBLd-1和/或BBLd-2的活性。
在一些实施方案中，本发明还包括降低编码转录因子的多核苷酸的表达，所述转录因子正向调节烟草属植物或植物部分中烟碱类生物碱的生物合成。因此，在一些实施方案中，烟草属植物或植物部分可被进一步修饰以降低至少一种编码正向调节烟碱类生物碱生物合成的转录因子的多核苷酸的表达。正向调节烟碱类生物碱生物合成的转录因子的非限制性实例包括ERF家族转录因子诸如ERF189、ERF221和ERF32，和/或bHLH家族转录因子诸如NtMYC1和NtMYC2，和COI1。
在一些实施方案中，可以进一步修饰本发明的烟草属植物以过表达至少一种编码负调节烟碱类生物碱生物合成的转录因子的多核苷酸。负调节烟碱类生物碱生物合成的转录因子的非限制性实例包括JAZ。
如本文中所用，“过表达(overexpress)”、“过表达(overexpression)”、“过表达(overexpressed)”(及其语法变型)是指转基因烟草属植物或植物部分中基因产物的产生超过对照烟草属植物或植物部分中同一基因产物的产生水平，所述转基因烟草属植物或植物部分用赋予基因产物增加的产生的重组核酸构建体转化，而对照烟草属植物或植物部分未用所述重组核酸构建体转化。
可通过任何已知的用于引入突变的方法，包括基因编辑和/或通过向烟草属植物中引入干扰RNA来降低本发明的烟草属植物中待改变的任何另外的多核苷酸的表达，所述干扰RNA被开发用于靶向编码任何一种或多种另外的烟碱类生物碱生物合成酶的核酸。如本领域所公知的，“干扰RNA”是能够引起基因沉默的RNA。如本文中所用，干扰RNA包括能够下调或沉默目标烟碱类生物碱生物合成核酸表达的任何类型的RNA分子，包括但不限于有义RNA、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、发夹RNA(RNA)等。
在一些实施方案中，提供了本发明的烟草属植物的种子和由该种子产生的烟草属植物，其中所述种子包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，提供了本发明的烟草属植物的种子和由所述种子产生的烟草属植物，其中所述种子包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。在一些实施方案中，提供了本发明的烟草属植物的种子和由所述种子产生的烟草属植物，其中所述种子包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
在一些实施方案中，本发明提供了由本发明的烟草属植物产生的后代烟草属植物。在一些实施方案中，还提供了包含一起种植在农田中的多种本发明的烟草属植物的作物。
本发明的其它方面包括从本发明的烟草属植物或植物部分生产的收获产品，以及从所述收获产品生产的加工产品。收获的产品可以是整个植物或任何植物部分，其中所述收获的产品包含本发明的重组核酸分子/构建体。因此，在一些实施方案中，收获产品的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。
使用本发明的烟草属植物可以生产任何烟草或烟草产品。在一些实施方案中，所生产的烟草可包括但不限于烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。在一些实施方案中，使用本发明的烟草制造的烟草产品可以包括但不限于小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和/或咀嚼用烟草。
在一些实施方案中，本发明提供了烟草产品，其中所述产品可以是掺混烟草产品。在本发明的一些实施方案中，本发明的烟草产品可以是烟碱含量降低的烟草产品。在其它实施方案中，本发明的烟草产品可以是烟碱含量降低的掺混烟草产品。因此，本发明的烟草产品可以是掺混的烟碱含量降低的烟草产品。
在一些实施方案中，本发明提供了从本发明的烟草属植物或其植物部分生产的烟碱类生物碱降低的烟草产品，所述烟草属植物或其植物部分具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物或其植物部分具有降低的烟碱类生物碱含量。
本发明还提供了生产掺混烟草的方法，包括：a)提供第一烟草；b)提供第二烟草，其中所述第二烟草由烟碱类生物碱含量降低的本发明的烟草属植物产生，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因；以及c)将所述第一烟草与所述第二烟草掺混，以生产所述掺混烟草。在一些实施方案中，第一和第二烟草可以由本发明的烟草属植物产生，其中，在一些实施方案中，第一烟草和第二烟草来自不同的烟草属植物品种，两者都具有降低的烟碱类生物碱含量，并且在(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰中包含突变；以及包含(B)nic1的隐性等位基因或者nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
在本发明的其它方面，提供了生产掺混的烟碱含量降低的烟草的方法，所述方法包括：a)提供第一烟草；b)提供第二烟草，其中所述第二烟草由烟碱类生物碱含量降低的本发明的烟草属植物产生，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因；以及c)将所述第一烟草与所述第二烟草掺混，以生产所述掺混的烟碱含量降低的烟草。在一些实施方案中，第一和第二烟草可由本发明的烟草属植物产生，其中，在一些实施方案中，第一烟草和第二烟草来自不同的烟草属植物品种，两者都具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。例如，烤烟和晾烟都是普通美国混合型卷烟的组分。因此，在本发明的一些实施方案中，可以通过将低烟碱白肋烟品种与高烟碱烤烟品种掺混来生产低烟碱类生物碱烟草产品，每个品种具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，由此降低生物碱烟草产品的总烟碱类生物碱(例如，烟碱、新烟草碱、降烟碱、假木贼碱等)含量。
如本领域所公知的，用于烟草产品的烟草制剂除了烟草之外，还可以掺入其它组分，所述组分可以改变制剂的苦味、甜味、酸味或咸味；增强制剂的感觉到的干度或湿度；或者制剂所表现出的烟草味道的程度。此类其它组分可以是盐(例如，氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、乙酸钠、乙酸钾等)；天然甜味剂(例如，果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、乳糖等)；人造甜味剂(例如，三氯蔗糖、糖精、阿斯巴甜、乙酰舒泛K等)，有机和无机填充剂(例如，谷物、经加工的谷物、膨化谷物、麦芽糖糊精、葡萄糖、碳酸钙、磷酸钙、玉米淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇、细碎纤维素等)；粘合剂(例如，聚维酮、羧甲基纤维素钠和其它改性纤维素类型的粘合剂、海藻酸钠、黄原胶、淀粉基粘合剂、阿拉伯树胶、卵磷脂等)；pH调节剂或缓冲剂(例如，金属氢氧化物，优选碱金属氢氧化物，诸如氢氧化钠和氢氧化钾，以及其它碱金属缓冲剂，诸如碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠等)；着色剂(例如，染料和色素，包括焦糖色素和二氧化钛等)；湿润剂(例如甘油、丙二醇等)；防腐剂(例如，山梨酸钾等)；糖浆剂(例如，蜂蜜、高果糖玉米糖浆等)；崩解助剂(例如，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、淀粉羟乙酸钠、预胶化玉米淀粉等)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、葡萄籽提取物和油、含多酚物质诸如绿茶提取物和红茶提取物、花生内酯(peanut endocarb)、马铃薯皮等(参见Santhosh等人，Phytomedicine,122:16-220(2005)；通过引用并入本文)；和调味剂。调味剂可以是天然的或合成的，包括但不限于鲜味的、甜味的、草本味的、糖果味的、花香味的、水果味的或香料味的。特定类型的调味剂包括但不限于香草、咖啡、巧克力、奶油、薄荷、留兰香、薄荷醇、薄荷、鹿蹄草、薰衣草、小豆蔻、肉豆蔻、肉桂、丁香、西印度苦香皮(cascarilla)、檀香、蜂蜜、茉莉、生姜、大茴香、鼠尾草、甘草、葡萄、柠檬、橙子、苹果、桃、酸橙、樱桃和草莓。(参见Leffingwill等人，Tobacco Flavoring for Smoking Products,R.J.Reynolds Tobacco Company(1972))。调味剂还可以包括被认为是润湿剂、冷却剂或平滑剂的组分，包括但不限于桉树。这些调味剂可以单独提供或以复合物形式提供(例如，留兰香和薄荷醇，或橙和肉桂)。在属于White等人的美国专利第5,387,416号和属于Quinter等人的PCT申请公布第WO 2005/041699号中也阐述了代表性类型的组分，所述每一个文献的相关部分通过引用并入本文。因此，在一些实施方案中，本发明的烟草产品可以包含调味组分或香味。
烟草制剂中烟草的量可以变化。在特定的实施方案中，烟草制剂中烟草的量为基于干重至少约25％至至少约40％(例如，25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％干重，和其中的任何值或范围)。烟草制剂中其它组分的量优选超过基于干重约25％至约40％。
在本发明的一些实施方案中，提供了其中降低使用烟草的人体内烟碱量的方法，所述方法包括向所述人提供本发明的任何烟草产品。
在本发明的其它方面，提供了降低烟草使用者的烟碱消耗量的方法，所述方法包括：(a)向所述烟草使用者提供第一烟草产品，其包含由本发明的烟草属植物生产的烟草，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因；以及(b)向所述烟草使用者提供第二烟草产品，其包含由本发明的烟草属植物生产的烟草，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因；其中所述第二烟草产品包含的烟碱比所述第一烟草产品包含的更少。
在本发明的一些方面，可以向烟草使用者提供另外的烟草产品，其包含由本发明的烟草属植物生产的烟草，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因；其中所述另外的烟草产品包含从包含比所述第一或第二烟草产品更少的烟碱的第三产品开始依次降低量的烟碱。
在本发明的一些实施方案中，提供了烟草使用停止试剂盒(tobacco-usecessation kit)，其中烟草使用停止试剂盒包括选自由本发明的烟草属植物生产的本发明的任何产品的烟草产品的烟草产品，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括含有烟碱的第一烟草产品和烟碱含量低于第一烟草产品中烟碱含量的第二烟草产品，其中所述第一或第二烟草产品包含由本发明的烟草属植物生产的烟草产品，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。
在一些方面，本发明提供了由本发明的烟草属植物生产的产品，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量，并且包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因，其中所生产的产品选自由以下各项组成的组：工业酶、药物、化妆品组分、人和牲畜饲料、食品添加剂和发酵产物。
本发明还提供了用于提高/增加本发明烟草属植物的产量和质量的方法，所述烟草属植物具有(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因。在一些实施方案中，提高本发明的烟草属植物的产量的方法包括：(a)在约90％萌发的阶段对幼苗施肥，所述施肥通过加肥灌溉(例如，滴灌)进行，任选地，所述肥料中的N浓度为约200ppm；(b)应用塑料护盖物处理；例如，添加塑料护盖物以覆盖加肥灌溉设备(例如，滴灌带/管)；以及(c)在移植后约4至5周、移植后约6至7周以及移植后约8至9周，以约90-120磅/英亩N总量的比率向所述幼苗施用氮，以提供增加的所述烟草植物的产量和质量。
如本文中所用，其中生长/种植烟草属植物和/或其植物部分(例如，种子)的“基质”是指用于萌发种子和/或种植/生长烟草属植物的任何介质，并且可包括但不限于天然土壤、合成土壤、种植介质、无土介质(例如，泥煤苔、珍珠岩、蛭石等)和/或其任意组合。
如本文中所用，“增加的产量”是指对于烟草植物(其包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的隐性等位基因，或nic1的隐性等位基因和nic2的隐性等位基因)在本文所述的改良条件下生长时观察到的对比在标准烟草生长条件(例如，在地面上施用肥料，然后添加在侧面(例如，搁置在旁边)和单独供应水(雨水或外部灌溉)；塑料护盖物既不是标准种植程序的一部分，也不是通过滴灌带的加肥灌溉(水加肥料)的使用)下生长的相同植物的增加的生物量、增加的叶片数、增加的叶面积和/或增加的茎围。
在一些实施方案中，可以使用加肥灌溉将氮施加到基质上(种植前和/或种植后)。如本文中所用，“加肥灌溉”是指通过滴灌系统将肥料掺入灌溉水中的施肥方法。加肥灌溉通过灌溉使肥料溶液均匀分布。
在一些实施方案中，其中种植烟草属植物的基质可以被覆盖以减少杂草生长和水分损失，以及更好地控制基质的温度(例如，保持更恒定土壤温度和/或升高土壤温度)。在一些实施方案中，覆盖物可以是塑料护盖物(例如，地面覆盖层)，包括但不限于塑料地面覆盖层(例如，白色塑料层、黑色塑料层)。
现在将参考以下实施例来描述本发明。应该理解的是，这些实施例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而是旨在作为某些实施方案的实例。本领域技术人员想到的示例性方法的任何变化都将落入本发明的范围内。
具体实施方式
实施例1
在BBL-a、BBL-b和BBL-c中含有突变(BBL突变(a、b和c))的K326烤烟等位基因系的评估
在六个大田环境中对八个K326纯合BBL突变型品系和相应的对照品系的评估表明，添加非单一BBL基因突变对降低烟碱积累具有显著效果(图1)。只有在BBL-a和BBL-b中都有突变的基因型与K326对比，才表现出烟碱的显著(P＜0.05)降低。K326(220)和K326(222)突变型品系分别积累0.45％和0.38％的烟碱，而K326为2.69％。在NC95的遗传背景中，随着nic1和nic2基因座处的隐性等位基因数量增加，观察到烟碱逐渐减少。三纯合突变型品系K326(222)中的烟碱水平不低于LAFC53的烟碱水平，即烤烟栽培品种NC95的nic1/nic1nic2/nic2等位基因系。
在单突变型品系中对于新烟草碱的百分比而不是对于假木贼碱的百分比观察到一些小的显著(P<0.05)的降低(图1)。经测量K326(220)和K326(222)的新烟草碱百分比极度降低。发现这两种基因型的假木贼碱百分比的下降更适度，但仍然很显著。与烟碱类似，在NC95遗传背景中，随着在nic1和nic2基因座处添加隐性等位基因，发现新烟草碱和假木贼碱的积累逐渐减少。对于双突变基因型K326(220)和K326(222)观察到降烟碱百分比的显著增加(P<0.05)(图1)。在K326等位基因系或NC95等位基因系中没有发现还原糖百分比的显著变化。表2提供了本实施例中就生物碱积累和农艺性状而进行评估的基因型的概述。
表2.对其生物碱积累和农艺性状进行评估的基因型
| 品系名称 | BBL基因型 | Nic1+Nic2基因型 |
| K326 | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(000) | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(002) | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b bbl-c/bbl-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(020) | BBL-a/BBL-a bbl-b/bbl-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(200) | bbl-a/bbl-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(022) | BBL-a/BBL-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(202) | bbl-a/bbl-a BBL-b/BBL-b bbl-c/bbl-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(220) | bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(111) | BBL-a/bbl-a BBL-b/bbl-b BBL-c/bbl-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| K326(222) | bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| NC95 | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| MAFC5 | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 |
| LMAFC34 | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | nic1/nic1 nic2/nic2 |
| LAFC53 | BBL-a/BBL-a BBL-b/BBL-b BBL-c/BBL-c | nic1/nic1 nic2/nic2 |
实施例2
Nic1和Nic2基因座处的隐性等位基因至BBL突变(a、b和c)中的导入和大田评估
本发明部分涉及确定将诱导的BBL突变与nic1和nic2基因座处天然存在的隐性等位基因组合是否能进一步降低烟草中烟碱的积累。为此，将nic1或nic2基因座处的隐性等位基因导入到K326(222)中，K326(222)的遗传背景包括三个最高度表达的BBL基因家族成员(BBL-a、BBL-b和BBL-c)中的诱导突变。最初将K326(222)与LAFC53(nic1/nic1 nic2/nic2)杂交。随后在与K326(222)回交，同时使用前述KASP标记选择BBL-a、BBL-b和BBL-c基因座处的纯合突变条件，并使用Adams等人(2016)描述的SNP标记选择隐性nic1和nic2等位基因之后，开发出BC2F1后代。对bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c nic1/nic1 nic2/nic2 BC2F1个体进行了自花授粉，通过基因分型鉴定出三个纯合bbl突变体BC2F2，它们是nic1/nic1 nic2/nic2、nic1/nic1 nic2/nic2或nic1/nic1 nic2/nic2。将此类BC2F2植物自花授粉以产生BC2F3家族，将其与K326、K326(222)和LAFC53进行比较，评估其在Clayton,NC附近的单一2019大田环境中的烟碱积累。根据North Carolina的标准烤烟生产实践管理工厂。实验设计是完全随机的设计，其中每种基因型由12至37株植物代表。在打顶后21天收获每株植物的顶部两片叶子，晾干，并如前所述分析生物碱谱。
实施例3
在Nic1和Nic2基因座处具有不同隐性等位基因的BBL突变(a、b和c)的生物碱分析
如图2所示，bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c遗传组合的基因型在K326遗传背景(“222Nic1/Nic1 nic2/nic2”)中仅与nic2基因座处的隐性等位基因组合时，通常表现出较低但不显著较低的生物碱水平(降烟碱除外)。对于也仅在nic1基因座处携带隐性等位基因(“222 nic1/nic1 Nic2/Nic2”)的bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c个体观察到所有生物碱的显著降低(P<0.05)(图2)。对于对Nic1和Nic2两个基因座处的隐性等位基因也均为纯合的(“222 nic1/nic1 nic2/nic2”)的bl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c植物，测量出了最低的生物碱水平(图2)。具有这种基因型的植物的平均烟碱含量非常低(0.014％)(图2)。
实施例4
包含BBL突变(a、b和c)并在nic1和nic2基因座处具有不同隐性等位基因的烤烟的评估
与K326(WT)和K326(222)植物相比，评价本技术的烟草属植物(K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2)的产量、质量和烤叶化学(cured leaf chemistry)。将来自四个K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2品系、两个K326(222)品系以及K326(WT)的植物种植在两行中，每行大约60-90株，重复3次，并根据North Carolina的标准烤烟生产实践进行管理。基于公开可得的烤烟价格指数计算每百重量的值($/Cwt)和值($/A)。在收获和烘烤后，测量生物碱水平和烤叶等级指数值。将烘干的样品研磨以通过1-mm的筛子，并如之前由Lewis等人，PLOS ONE 10,e0117273(2015)所概述的，分析生物碱谱(以干重的百分比表示)。
如表3所示，具有降低的烟碱水平的本发明技术的烟草属植物(K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2)维持了与野生型对照(K326)和nic1/nic2对照(K326(222))相当或与之对比提高的烤烟叶的产量和USDA等级指数。
表3.对其生物碱水平、产量和质量测定进行评估的烤烟遗传物质的输入方法
平均值以烟碱％的升序排列。
K326(222)＝bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c植物，也称为“K326abc”；K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2＝bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c植物，所述植物对于nic1和nic2基因座处的隐性等位基因也均为纯合的,即，bbl-a/bbl-a,bbl-b/bbl-b,bbl-c/bbl-c,nic1/nic1,nic2/nic2。
实施例5
包含BBL突变(a、b和c)并在nic1和nic2基因座处具有不同隐性等位基因的大田种植的烟草的优化
烟草幼苗生产
除一些改进外，与野生型类似地进行BBLabc/nic1-2品系的烟草幼苗生产。温室需要干净，无杂草、腐烂的植物材料、碎片、藻类和任何其它可能为昆虫和其它害虫提供食物或庇护所的物品。不同的浮床用于不同年龄和遗传的幼苗。确保浮床之间保持至少1英尺的缓冲，并经常更新。用标准幼苗基质/生长混合物(例如，幼苗预混合物)填充浮盘(floattray)。当萌发达到90％时，冲洗浮床水，并用混有肥料(40-10-20)(N-P-K)的淡水替换其，其中氮浓度约为200ppm。第一次修剪应在肥料加入水中2或3周后进行，随后应定期进行修剪，以确保幼苗的一致性。当茎变粗并且它们在土壤线以上至少长出约3英寸时，幼苗应准备好进行移植。
种植和收获
育苗的土壤组成应该是大约20％的粘土、25％的淤泥和55％的沙子。排水等级应为中等至排水良好，其中pH值约为6.5。加肥灌溉用于在种植前施一半的氮，另一半在移植后约4周、6周和8周分三个单独的施用期施用。添加塑料护盖物以覆盖加肥灌溉滴灌带或管。加肥灌溉的时间安排旨在如下获取植物三个时期的N需求。在移植后四周，植物被“建立”并进入“快速生长”阶段，在此阶段将达到总生物量的约80％，并且植物将需要大量的氮。两周后，预期植物将会进入“快速生长”阶段。在移植后的第8周，植物将进入“开花期”，在此期间需要水和N来帮助完全展开的叶子成熟并获得高GRI质量。
该实验以随机完全区组设计建立，具有三个区组，每个区组包含不同的测试品系。翻耕土地，并以规定的处理量施用种植前的氮，然后喷洒除草剂和杀真菌剂。在喷雾与将幼苗移植到苗床之间使用塑料护盖物。移植后4-5周，对塑型培养物(plasticulture)进行加肥灌溉。6-7周后再施一次，最后一次施肥是移植后8-9周。在开花阶段，给植株打顶并喷洒吸穗控制剂(sucker control)。由于BBLabc/nic1-2组合与野生型对照以不同的速率成熟，因此不同的品系不是同时或以常规方式收获的。通常，野生型烟叶在完全尚熟(mature)和成熟时收获。成熟的叶子在叶脉之间显示出轻微的变黄和起皱，并且比未成熟的叶子更容易折断茎。在BBLabc/nic1-2组合品系中，与野生型品系对比，该过程在底部叶中加速，并且不同于上部叶。叶子的变黄和纹理不同于正常的野生型。收获产量数据是对投影到栽培面积估计中的两个内部样本行中获得的生物量的测量。
实施例6
在Nic1和Nic2基因座处具有不同隐性等位基因的BBL突变(a、b和c)的烘烤工艺优化
一次用来自一个遗传背景的新鲜收获的叶子填充窑(完全且均匀地填充)。放入窑中的叶材料尽可能具有相似的质量。模拟温度计和数字传感器用于跟踪干球温度(DBT)和湿球温度(WBT)。在烘烤过程中对叶子进行监控。初始参数如下，并基于作同一些修改的Powell 1987(标题为Powell Manufacturing,Co.'s Bulk Curing/Drying Owner'sOperator's Manual for Flue Cured Tobaccos的手册,Powell Manufacturing,Co.(1987年1月20日))。例如，使温度上限升至104-108℉，温度下限降至92-96℉，每小时的升温速率为1℉，直至达到最高温度上限，并在该温度上限下保持约52-58小时。烘烤中的变黄步骤通常为48小时；然而，此处将该步骤延长至52-58小时，同时连续监测温度和叶子颜色。时间长度和温度的改变是由于引入了nic1和/或nic2的隐性等位基因而导致的较高叶绿素含量(叶绿度)。一旦每片叶子的大部分变成黄色，并且大部分绿色被限制在叶子的叶脉中，黄化阶段就结束了。
下一步是“叶子干燥”阶段。这一阶段通常约为24小时，但此处减少至22小时。对于叶子干燥，使上限温度(ULT)升高到120℉。在此步骤之后，叶子是橘黄色/红棕色的。烘烤的最后一个阶段是茎干燥。通过将ULT升高到135℉开始茎干燥，导致叶子完全干燥(18％的湿度)。
当通过本发明技术的方法栽培和烘烤时，本发明技术的烘烤烟叶(包括上二棚叶、完熟叶、顶叶、腰叶、下二棚叶)具有色度好、宽度正常和质地均匀的良好至一般品质的特征，相比之下，标准烟草种植(包括雨养)和烘烤程序利用这种烟草属植物产生了劣质至低品质的烟叶。例如，通过本发明技术的方法栽培和烘烤的BBLabc/nic1-2株系产生了品质一般的橘黄色完熟叶(H4F)、品质一般的柠檬黄色腰叶(C4L)和品质一般的橘黄色脚叶(P4F)。在一些实施方案中，通常本发明的烤烟烟叶可具有超过60的USDA等级指数。因此，本发明技术的栽培和烘烤方法可用于生产具有超低烟碱含量的商业品质的烤烟烟叶。
实施例7
在Nic1和Nic2基因座处具有不同隐性等位基因的包含BBL突变(a、b和c)的大田生长的烟草植物的优化
世界卫生组织推荐的0.04％的超低烟碱水平在目前可获得的最低生物碱烟草中并不常见。迄今为止，唯一已知的实现了低于0.04％的超低烟碱水平的烟草品系是Vector21-41GMO品种。在Nic1和Nic2基因座(也称为A和B)处的隐性等位基因的遗传背景下，使用反义RNA特异性抑制编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因的表达来开发该品种，所述喹啉酸磷酸核糖基转移酶是参与烟草根中烟碱生物合成的酶(Xie等人，2004)。已经发现这些基因座有助于烟碱和相关生物碱(例如，降烟碱、假木贼碱和新烟草碱)从1.5％至4.5％显著降低至大约0.20％至0.45％(Legg等人Can.J.Genet Cytol.13:287-291(1971)；Lewis,Nicotine&Tobacco Res.第1-5页(2018)doi:10109/ntr/nty022)。
Chaplin和Weeks的开创性工作(Crop Sci.16:416-418(1976))表明10个品系中有7个表现出产量降低，在所述工作中他们将Nic1和Nic2的隐性等位基因导入10种不同的烟草遗传背景中。此外，与轮回亲本相比，三个品系未显示任何烟碱降低。7个品系中有3个品系的USDA等级指数较低，这是因为与轮回亲本对比，烤烟叶的7个低生物碱品系的烤烟叶的颜色较深。三个nic1和nic2导入品系表现出等于或优于亲本的等级指数。可能存在可能有助于减轻这些品系中nic1和nic2隐性等位基因的影响的遗传背景成分。另外，与轮回亲本对比，大多数nic1和nic2导入品系表现出糖含量(7-28％)和氮含量(10-25％)的降低。一个普遍的特征是，与亲本相比，叶子的外观更绿，并且可能含有更高含量的叶绿素。另外，观察到叶的成熟是不正常的(即，与轮回亲本植物不同)。
在导入到包含BBL突变(a、b和c)但具有较温和表达的烟草植物中的nic1和nic2隐性等位基因的组合中观察到了这些相同的特征。含有BBL突变(a、b和c)的品系提供较低的产量(10-30％)(取决于生长条件)和较低的等级指数(9-16％)(Lewis等人，PLOS ONE 10:e0117273(2015))；然而，叶绿素含量和糖含量不受响。包含BBL突变(a、b和c)与隐性nic1和nic2等位基因(单独或一起)组合的烟草植物提供了较低的烟碱水平，但这种组合可能对烟草植物的产量和叶片等级指数产生负面影响。用于烟草品系(包含BBLabc突变与隐性nic1和nic2等位基因(单独或一起)的组合)种植和烘烤的本发明技术的方法和改进的目的在于减轻诸如氮含量降低、糖含量降低和叶绿素含量高的问题，所述问题可能对由这些品系生产的叶的产量和质量产生负面影响。因此，可用于本发明的烟草品系(例如，BBLabc加nic1；BBLabc加nic1和nic2)的本发明技术的烟草栽培和烘烤方案如下：
(a)在约90％幼苗萌发的阶段，冲洗浮床水并用混有肥料(40-10-20)(N-P-K)的淡水代替。氮的含量比标准生长条件下高约200ppm。当幼苗的高度达到土壤线以上至少约3英寸时，应该转移幼苗。
(b)加肥灌溉用于在种植前施用约一半的氮(例如，通过滴灌带)，另一半在移植后第4-5周、第6-7周和第8-9周植物生长的特定时期分三次施用(见第43页，最后一段)。施肥主要通过滴灌完成，N的总施用率为约90-120磅/英亩。
(c)为了帮助升高温度和促进幼苗生长，使用塑料护盖物覆盖育苗床。
(d)BBLabc/nic1-2品系中的叶子成熟过程对烟草来说不是典型的。在这种情况下，与野生型品系相比，该过程在下部叶中加速，并且不同于上部叶。打顶前施以额外的氮(以约90-120磅/英亩的比率)。叶子的变黄和质地不同于典型的野生型烟叶。当叶子为黄绿色时就应该收获叶子了。
(e)已经确定，为了烘烤，需要更宽的温度范围和更长的变黄过程。因此，使温度上限升高至108℉，温度下限降低至92℉，从温度下限至温度上限的升高速率为每小时1℉。烘烤中的变黄步骤通常为48小时；然而，此处，在连续监测温度和叶色的情况下，此步骤延长至52至58小时(或者更长，这取决于变黄)。
实施例8
与根据标准方法栽培和烘烤的植物的烟叶对比，根据本发明技术的方法栽培和烘烤的来自在Nic1和Nic2基因座处具有不同隐性等位基因的包含BBL(a、b和c)突变的植物的烟叶的特征在于提高的质量
根据本领域已知的标准方法诸如Powell 1987(标题为Powell Manufacturing,Co.'s Bulk Curing/Drying Owner's Operator's Manual for Flue Cured Tobaccos的手册,Powell Manufacturing,Co.(1987年1月20日)(“标准NC”)或如实施例5-7中所述的本发明技术的方法(“New-H”)栽培和烘烤对照烟草植物(K326(Wt))以及K326(222)烟草植物(其包含BBL a、b和c突变(bbl-a/bbl-a,bbl-b/bbl-b,bbl-c/bbl-c)和根据实施例2制备的K326(222)nic1/nic1nic2/nic2烟草植物(其包含BBL a,b和c突变(bbl-a/bbl-a,bbl-b/bbl-b,bbl-c/bbl-c)并且nic1和nic2两个基因座处的隐性等位基因也都是纯合的(nic1/nic1,nic2/nic2))。
进行了两次大田试验。将来自“标准NC”和“New-H”组的烟草植物都种植在同一块地里。对于每个个体遗传背景，从几个品系(>10)收获叶子。通过将100克烤烟叶样品送到实验室(Global Lab Services and Enthalpy Analytical)进行化学评估，测量各种烟草质量参数。
结果
如表4所示，在从对照和K326(222)和K326(222)nic1/nic1烟草植物收获的叶子中测量了指示烟叶质量的几个参数，根据标准方法或本发明技术的方法栽培和烘烤所述对照和K326(222)nic1/nic1烟草植物。
表4.烤烟烟叶的质量
*结果基于大田试验(数据从GLS和Enthalpy A获得)
对照＝K326(WT)；测试品系＝K326(222)bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-b bbl-c/bbl-c植物，也称为“K326abc”；K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2＝bbl-a/bbl-a bbl-b/bbl-bbbl-c/bbl-c植物，其对于nic1和nic2两个基因座处的隐性等位基因也是纯合的，即bbl-a/bbl-a,bbl-b/bbl-b,bbl-c/bbl-c,nic1/nic1,nic2/nic2；DWB＝基于干重
总的来说，与根据标准方法种植和烘烤的植物的叶子对比，根据本发明技术的方法种植和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1nic2/nic2烟草植物的叶子具有更好的等级、质地、颜色和高度良好的品质。如表4所示的结果所证明的，与根据标准方法栽培和烘烤的植物(即，根据“标准NC”方法栽培和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2烟草植物)的叶子对比，根据本发明技术的方法种植和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2烟草植物(即，根据“New-H”法栽培和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1nic2/nic2)的叶子含有更多的糖。烤烟品种中的糖水平是良好风味亮叶的良好指标。另外，与根据标准方法种植和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1 nic2/nic2品系的叶子相比，根据本发明技术的方法种植和烘烤的K326(222)和K326(222)nic1/nic1nic2/nic2品系的叶子的特征在于氨百分比降低。氨百分比通常用作烟草异味的指标。用总氮获得了类似的结果(数据未显示)。乙醛和甲醛的评估没有显示出显著的差异(数据未显示)。
因此，这些结果表明，本发明技术的栽培和烘烤方法可用于生产具有改善的质量和非常低的烟碱水平的烤烟烟叶。
前述内容是对本发明的说明，不应被解释为对本发明的限制。本发明由以下权利要求限定，权利要求的等同物包括在其中。
Claims (46)
1.一种烘烤烟草属(Nicotiana)植物的一片或多片叶子的方法，所述烟草属植物包含：
(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和
(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因，
所述方法包括：
(a)变黄过程，其包括在92℉-96℉的起始温度下加热所述叶，并以每小时约1℉的速率升高至104℉-108℉的温度，直至达到最大上限温度，并在所述上限温度下保持约52-58小时的时段；
(b)叶子干燥过程，其包括在约120℉的温度下干燥约22小时；以及
(c)茎干干燥过程，其包括在约132℉-138℉的温度下干燥约50小时至约65小时，
从而烘烤烟草属植物的一片或多片叶子并产生一片或多片所述烟草属植物的烤烟叶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述烟草属植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1的纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
4.通过权利要求1或权利要求2的方法产生的烟草属植物的烤烟叶，其中所述烤烟叶包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
5.如权利要求4所述的烤烟叶，其中所述叶包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
6.如权利要求5所述的烤烟叶，其中与野生型对照烟草属植物的叶对比或与nic1/nic2对照烟草属植物对比，所述叶包含降低的烟碱类生物碱含量。
7.如权利要求6所述的烤烟叶，其中所述烟碱类生物碱是烟碱。
8.如权利要求7所述的烤烟叶，其中所述烟叶包含0.5mg/g或更少的烟碱含量。
9.如权利要求8所述的烤烟叶，其中所述烟叶包含0.4mg/g或更少的烟碱含量。
10.如权利要求4-9中任一项所述的烤烟叶，其中与根据标准烘烤方法烘烤的叶对比，所述叶包含水平升高的糖和/或水平降低的氨。
11.如权利要求4-10中任一项所述的烘烤叶，其中所述烟草属植物还包含编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的降低的表达，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
12.一种烟草产品，其包含权利要求4-11中任一项的烤烟叶。
13.如权利要求12所述的烟草产品，其中所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。
14.如权利要求13所述的烟草产品，其中所述产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
15.一种来自烟草属植物的烤烟叶，其中所述烟草属植物(1)包含纯合隐性nic1和nic2等位基因之一或两者，并且(2)包含相对于野生型改变的BBLa、BBLb和BBLc基因，从而降低BBLa、BBLb和BBLc的活性，或者降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达，使得与对照烟草属植物对比，所述烟草属植物的烟碱类生物碱含量降低。
16.如权利要求15所述的烤烟叶，其中所述烟草属植物包含纯合隐性nic1和nic2等位基因两者。
17.如权利要求15或权利要求16所述的烤烟叶，其中所述叶包含与来自对照烟草属植物的烤烟叶的USDA等级指数相比，相当或提高的USDA等级指数。
18.如权利要求16所述的烤烟叶，其中所述叶包含约为60或更高的USDA等级指数。
19.如权利要求15-18中任一项所述的烤烟叶，其中与对照烟草属植物对比，所述烤烟叶的产量相当或增加。
20.如权利要求15-19中任一项所述的烤烟叶，其中所述烟碱类生物碱是烟碱。
21.一种烟草产品，其包含权利要求15-20中任一项的烤烟叶。
22.如权利要求21所述的烟草产品，其中所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。
23.如权利要求22所述的烟草产品，其中所述产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
24.一种生产烟碱类生物碱含量降低的烟草属植物的方法，其包括在烟草属植物中组合：
(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和
(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的烟碱类生物碱含量。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述烟草属植物包含nic1纯合隐性等位基因。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述烟草属植物包含nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括降低编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的表达，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低至少40％的烟碱类生物碱含量。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述烟碱类生物碱是烟碱，并且与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟碱含量降低约40％至约90％。
30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述烟碱类生物碱是烟碱，并且所述烟碱含量为约0.014％至约0.098％。
31.一种植物，其通过权利要求24-30中任一项的方法产生，其中所述植物包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
32.由权利要求31的植物产生的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
33.一种包含来自烟草属植物的烟草的烟草产品，其中所述烟草属植物包含：
(A)降低BBLa、BBLb和BBLc活性的修饰或降低编码BBLa的核酸、编码BBLb的核酸和编码BBLc的核酸的表达的修饰；和
(B)nic1纯合隐性等位基因或者nic1纯合隐性等位基因nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因，
其中与仅根据(A)修饰(例如，未根据(A)和(B)修饰)的植物对比，所述烟草属植物具有降低的的烟碱类生物碱含量。
34.如权利要求33所述的烟草产品，其中所述烟草属植物经修饰以降低BBLa、BBLb和BBLc的活性和/或编码BBLa、BBLb和BBLc的核酸的表达，并且包含nic1纯合隐性等位基因。
35.如权利要求33所述的烟草产品，其中所述烟草属植物经修饰以降低BBLa、BBLb和BBLc的活性和/或编码BBLa、BBLb和BBLc的核酸的表达，并且包含nic1纯合隐性等位基因和nic2纯合隐性等位基因。
36.如权利要求33-35中任一项所述的烟草产品，其中所述烟草属植物具有与仅根据(A)修饰的植物对比降低至少40％的烟碱类生物碱含量。
37.如权利要求33-35中任一项所述的烟草产品，其中所述烟碱类生物碱为烟碱，且与仅根据(A)修饰的植物对比，所述烟碱含量降低约40％至约90％。
38.如权利要求33-37中任一项所述的烟草产品，其中所述烟碱类生物碱是烟碱，并且所述烟碱含量为约0.014％至约0.098％。
39.如权利要求35所述的烟草产品，其中所述烟碱类生物碱是烟碱，并且所述烟碱含量为约0.014％。
40.如权利要求33-39中任一项所述的烟草产品，其中所述烟草选自由以下各项组成的组：烟叶、经切丝的烟草、经切碎的烟草、经研磨的烟草、粉末烟草、烟草提取物、无烟烟草、湿或干鼻烟、烟斗丝、雪茄烟叶、小雪茄烟叶、香烟烟草和咀嚼用烟草。
41.如权利要求33-39中任一项所述的烟草产品，其中所述产品选自由以下各项组成的组：小雪茄、丁香烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、含烟草的口香糖、含烟草的锭剂和咀嚼用烟草。
42.如权利要求33-41中任一项所述的烟草产品，其中所述烟草属植物还包含编码另外的烟碱类生物碱生物合成酶的多核苷酸的降低的表达，所述另外的烟碱类生物碱生物合成酶选自由以下各项组成的组：天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、甲基腐胺氧化酶和A622。
43.一种提高权利要求1的烟草属植物产量的方法，所述方法包括：
(a)在约90％萌发的阶段对幼苗施肥，所述施肥通过加肥灌溉进行，任选地，肥料中的N浓度为约200ppm；
(b)应用塑料护盖物处理；以及
(c)在移植后约4至5周、移植后约6至7周以及移植后约8至9周，以约90-120磅/英亩N总量的比率向所述幼苗施用氮，以提供增加的所述烟草植物的产量和质量。
44.如权利要求43所述的方法，其中使用加肥灌溉来施用所述氮。
45.如权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述基质覆盖有地面覆盖层，从而提供覆盖有地面覆盖层的基质。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述基质和/或覆盖有地面覆盖层的基质覆盖有护盖物。
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