CN112105257B - 用于生产具有改变的生物碱含量和期望的叶质量的烟草植物和制品的组合物和方法 - Google Patents

用于生产具有改变的生物碱含量和期望的叶质量的烟草植物和制品的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容包括例如通过结合诱导型启动子和非编码RNA以抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因来改善低生物碱烟草植物中叶质量的方法和组合物。还提供了具有正常、被抑制或改变的多胺水平的低生物碱烟草植物。还提供了具有改变的总生物碱、烟碱水平、商业上可接受的叶等级的烟草植物，其通过育种或转基因途径的开发，以及从这些烟草植物生产烟草制品。

Description

用于生产具有改变的生物碱含量和期望的叶质量的烟草植物 和制品的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月5日提交的美国临时申请No.62/638,928的权益，其全部内容通过引用并入本文。
并入序列表
序列表包含在88011字节(在
Figure GDA0002760190040000011
中测量)的于2019年3月4日创建的名为“P34584WO00_SL.txt”的ASCII文件中，其以电子方式提交并且其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开包括具有改变的总生物碱和烟碱含量以及商业可接受的叶等级的烟草植物，其通过育种或转基因途径的开发，以及从这些烟草植物生产烟草制品。
背景技术
烟草是世界上生长最广泛的非粮食作物之一，全球产量超过740万吨(FAOSTAT，联合国粮食及农业组织(FAO)(2014年)，faostat.fao.org)，每年所产生的烟草制品的全球市场规模为7700亿美元(Euromonitor International，2016年)。烟碱是烟叶中积聚的主要生物碱。烟碱和其他次要生物碱也是烟草特有亚硝胺(TSNA)的前体。存在开发烟碱含量较低的烟草品种的需求。
在商业烟草品种中，烟碱占总生物碱库的90-95％或占叶片总干重的2-5％(Saitoh F,Nona M,Kawashima N(1985).The alkaloid contents of sixty Nicotianaspecies.Phytochem.24:477–480)。烟碱在根部合成(Dawson RF(1942)Accumulation ofnicotine in reciprocal grafts of tomato and tobacco.Am.J.Bot.29:66-71)，并通过木质部转运(Baldwin IT(1988).The alkaloidal responses of wild tobacco to realand simulated herbivory.Oecologia 77:378–381)至植物的地上部分(Hildreth SB,Gehman EA,Yang H,Lu RH,Ritesh KC,Harich KC,Yu S,Lin J,Sandoe JL,Okumoto S,Murphyd,AS,Jeleskoaet JG(2011).Tobacco nicotine uptake permease(NUP1)affectsalkaloid metabolism.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:18179–18184)，其中它在叶片中积聚并响应于昆虫食草性通过毛状体渗出(Kessler A,Baldwin IT(2002).Plant responsesto insect herbivory:the emerging molecular analysis.Annu Rev.Plant Biol.53:299–328)。烟碱生物合成受到遗传因素、植物发育、生物和非生物胁迫、植物激素信号以及农艺管理方法(例如打顶和分株)的影响(Wang SS,Shi QM,Li WQ,Niu JF,Li CJ,Zhang FS(2008).Nicotine concentration in leaves of flue-cured tobacco plants asaffected by removal of the shoot apex and lateral buds.J.Integr.Plant Bio.50:958–964；Shoji T,Hashimoto T(2015).Stress-induced expression of NICOTINE2-locus genes and their homologs encoding Ethylene Response Factortranscription factors in tobacco.Phytochem.113:41-49)。烟碱生物合成的遗传调控与两个独立的基因座Nic1和Nic2相关，它们对烟碱含量具有协同作用，但Nic1的作用比Nic2强约2.4倍(Legg PD,Collins GB(1971).Inheritance of percent total alkaloidsin Nicotiana tabacum L.II.Genetic effects of two loci in Burley 21x LA Burley21populations.Can.J.Genet.Cytol.13:287–291)。两个基因座还影响与烟碱生物合成途径不相关的众多其他基因的表达(Kidd SK,Melillo AA,Lu RH,Reed DG,Kuno N,UchidaK,Furuya M,Jelesko JG(2006).The A and B loci in tobacco regulate a network ofstress response genes,few of which are associated with nicotinebiosynthesis.Plant Mol.Biol.60:699–716；Shoji T,Kajikawa M,Hashimoto T(2010).Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis intobacco.Plant Cell 22:3390–3409)。转录分析表明，Nic2基因座是编码至少七个乙烯响应转录因子(ERF)的基因簇(Shoji et al.2010)。
一个或两个基因座的纯合突变可用于制备生物碱含量降低的近等基因Burley 21品系，即具有基因型nic2的高中级(HI)变种，具有基因型nic1的低中级(LI)变种，以及具有基因型nic1nic2的低生物碱(LA)品种(Legg PD,Chaplin JF,Collins GB(1969).Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.J.Hered.60:213-217；Legg et al.1971)。LA Burley 21植物仅包含的总生物碱含量仅为正常生物碱(NA)野生型品种中的约5.7％(Legg PD,Collins GB,Littion CC(1970).Registration ofLA Burley 21tobacco germplasm.Crop.Sci.10:212)。在LA植物中，nic1和nic2突变的协同作用还导致不利的叶表型，其特征是产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高以及熟化后的最终制品质量差(Chaplin JF,Weeks WW(1976).Associationbetween percent total alkaloids and other traits in flue-cured tobacco.CropSci.16:416–418；Legg et al.1970；Chaplin JF,Burk LG(1983).Agronomic,chemical,and smoke characteristics of flue-cured tobacco lines with different levelsof total alkaloids.Crop Sci.75:133–136)。
需要鉴定在LA品种的烟草植物中恢复不利的叶表型的基因，并开发含有改变的烟碱含量(例如烟碱降低)，同时保持(如果不能使品质更优)烟叶质量的烟草植物和制品。
发明简述
在一个方面，本公开提供一种烟草植物，其包含可操作地连接至可转录DNA序列的诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA。
在另一个方面，本公开提供一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包括：提供较低含量的烟碱或总生物碱的第一基因组修饰，和提供相当含量的一个或多个选自以下的性状的第二基因组修饰：总叶片多胺含量、总根多胺含量、总叶片叶绿素含量、每叶面积单位的叶肉细胞数和叶表皮细胞大小；并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
在一个方面，本公开提供一种用于改进生物碱降低的烟草植物的叶片质量的方法，所述方法包括：种植烟草植物，降低所述烟草植物中的腐胺含量，从所述烟草植物收获叶片。
在另一个方面，本公开提供一种用于改进生物碱降低的烟草植物的叶片质量的方法，所述方法包括：种植烟草植物，抑制所述烟草中鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达或活性，从所述烟草植物收获叶片。
在一个方面，提供通过转基因抑制、诱变或靶向基因组编辑而具有抑制的MYB8活性的烟草植物。
附图说明
图1：在温室中生长的红花烟草(N.tabacum L.)栽培品种Burley21正常生物碱(NA)野生型植物和三个突变品种的表型表征。图1A：温室中生长的野生型(NA)高中级(HI，nic2)、低中级(LI，nic1)和低生物碱(LA，nic1nic2)品系的总叶绿素含量。在不同的发育阶段测量长于15cm的所有叶片中的每片叶的叶绿素两次：开花前(打顶前2.5周)、打顶、打顶后1周(WPT)、2.5WPT和收获。值是四次生物学重复的平均值。图1B：收获时NA和LA植物的代表性照片。图1C：叶15中叶肉细胞数的时程评估。图1D：来自NA和LA植物在不同植物发育阶段的叶15的叶肉细胞的显微图像。Bar＝100μm。A和C中的值是六次生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。显示了与NA的统计性差异：*p<0.05。
图2：田间和温室生长的NA和LA植物中的多胺分析。图2A：来自打顶后1周的NA和LA植物的五片舒展良好的上部叶片的游离(F)和缀合(C)的腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)的含量(田间生长的三次生物重复)。图2B：温室中生长NA和LA植物中总多胺含量的时程监测。在发育的相同阶段从叶片收集叶片样品：开花前(叶12)、打顶(叶19)和收获叶(24)。在打顶和收获时收集根样品。值是三(A)/四(B)次生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。显示了与NA的统计性差异：*p<0.05；**p<0.005。PA：多胺；FW：鲜重。
图3：温室中生长的NA、HI、LI和LA植物的叶和根中的多胺含量。显示了在开花前(叶6)、打顶(幼叶23，根)和收获时(成熟叶23，根)的NA、HI、LI和LA植物的叶(图3A)和根(图3B)中的游离(F)和缀合(C)的腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)的级分。照射后4小时收集样品，立即在液氮中冷冻并通过LC MS/MS分析。值是三次生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。显示了统计性差异：*p<0.05；**p<0.001，表明在相同条件下LI和LA植物与NA植物显著不同。只有从打顶和收获的样品才可获得根。FW：鲜重。
图4：多胺生物合成酶的活性。在打顶(幼叶23，根)和收获(成熟叶23，根)时分析NA和LA植物的叶片和根中精氨酸脱羧酶(ADC)(图4A)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)(图4B)的活性。值是三次生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。显示了与NA的统计性差异：*p<0.05；**p<0.001。
图5：收获时来自未处理的NA和LA植物以及用多胺生物合成抑制剂和/或植物生长调节剂处理的LA植物的叶23的代表性照片。D-精氨酸(5mM)是ADC的抑制剂；DFMO(二氟甲基鸟氨酸，2mM)是ODC的抑制剂，ETH(
Figure GDA0002760190040000051
0.5mM)是生长调节剂。
图6：用多胺生物合成抑制剂和/或
Figure GDA0002760190040000052
处理LA植物。比较在打顶和收获时未处理和处理的LA植物的叶片(图6A)和根(图6B)中的总、游离和缀合多胺的比较。在不存在(NA和LA)或存在(LA)多胺生物合成抑制剂和/或
Figure GDA0002760190040000053
(5mM D-精氨酸、2mMDFMO、2mM DFMO/0.5mM
Figure GDA0002760190040000054
或单独的0.5mM
Figure GDA0002760190040000055
)的情况下，在温室中生长烟草植物。从开花前到收获，每周施用D-精氨酸和DFMO三次，持续6周，而
Figure GDA0002760190040000061
处理则是在打顶后(2.5周后)开始直到收获。照射后4小时，从每种基因型或处理的四个生物学重复的叶23或根收集样品。将未处理的LA植物(灰色条)或用D-精氨酸(黑色条)、DFMO(白色条)、DFMO/
Figure GDA0002760190040000062
(水平横线条)和
Figure GDA0002760190040000063
(草条)处理的植物中的平均多胺含量之间的倍数变化作图。误差条代表平均值的标准偏差(n＝4)。显示了与LA/NA平均值的统计性差异：*p<0.05。红线代表NA中的多胺含量。
图7：渐狭叶烟草(N.attenuata)植物中的DCS的时间-和组织-级别的积聚。
图8：渐狭叶烟草植物中的绿原酸(CGA)和类黄酮芦丁的时间-和组织-级别的积聚。
序列简述
SEQ ID NO：1-11示出了响应打顶的根特异性或优选表达的示例性启动子的序列。
SEQ ID NO：11-21示出了响应打顶的叶特异性或优选表达的示例性启动子的序列。
SEQ ID NO：22示出了编码抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)的非编码RNA的示例性DNA构建体的序列。
SEQ ID NO：23-28示出了示例性烟草ODC基因的cDNA序列。
SEQ ID NO：29-34示出了示例性ODC基因编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35和36示出了根据本公开的靶向ODC基因的两个miRNA序列。
各种序列包括核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如A、T、G、C，或一个或多个核苷酸的缺失或插入。在一些情况中会显示一串“N”。“N”的数目不一定与该位置上未确定的核苷酸的实际数目相关。实际的核苷酸序列可以长于或短于所示的“N”片段。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或多个氨基酸的缺失或插入。同样，“X”的数目不一定与该位置上未确定的氨基酸的实际数目相关。实际的氨基酸序列可以长于或短于所示的“X”片段。尽管在描述序列表中的任何SEQ ID时使用A、T、G、C(与A、U、G、C相比)，但取决于SEQ ID被提及的上下文，该SEQ ID也可以指RNA序列。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的相同。本领域技术人员将理解，在可以使用许多方法实施本发明。实际上，本公开不限于所描述的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
本文引用的任何参考文献(例如，包括所有专利和出版物)的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”(a)、“一”(an)和“所述”(the)包括复数形式。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
本文所用的术语“约”是指大约、大体上、左右或在其区间。当术语“约”与数值范围一起使用时，它通过将边界延伸至设定的数值之上或之下来改变所述范围。为了避免任何疑问，如本文所用的术语或短语例如“约”、“至少”、“至少大约”、“至多”、“小于”、“大于”、“在...内”等，当用于一系列百分比数字的列表时，这些术语或短语被认为可以修改该系列或列表中的每个百分比数字。
如本文所用，烟草植物可以来自烟草(Nicotiana)属的任何植物，其包括但不限于红花烟草(Nicotiana tabacum)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)PI 555478；毕基劳式烟草(Nicotiana bigelovii)PI555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；高烟草(Nicotiana excelsior)PI224063；粘烟草(Nicotiana glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)PI241012；哥西氏烟草(Nicotiana gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana hesperis)PI271991；奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；Nicotiana maritima PI555535；特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)PI555536；Nicotiana nudicaulis PI555540；圆锥烟草(Nicotiana paniculata)PI 555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana repanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；Nicotiana suaveolens PI 230960；林烟草(Nicotianasylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI 266379；绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)PI555572。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含可操作地连接至可转录DNA序列的诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA。在一个方面，烟草植物包含赋予降低的烟碱含量的突变或转基因。在一个方面，烟草植物是低生物碱烟草植物。在一个方面，本公开的烟草植物包含nic1突变、nic2突变或两者。在另一个方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱含量低于对照植物烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在另一个方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱或总生物碱含量低于对照植物烟碱或总生物碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在另一个方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的总生物碱含量少于对照植物烟碱含量的3％、2.75％、2.5％、2.25％、2.0％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％和0.05％，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在另一个方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱或总生物碱含量少于对照植物烟碱或总生物碱含量的3％、2.75％、2.5％、2.25％、2.0％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％和0.05％。
在一个方面，烟草植物包含直接抑制编码选自以下蛋白的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、或全部21个基因或基因座的表达或活性的转基因或突变：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、nic1、nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。参见Dewey and Xie,Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in Nicotianatabacum,Phytochemistry 94(2013)10–27。
在一个方面，烟草植物还包含选自ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、或全部10个基因中的1个或更多个突变。在一个方面，烟草植物还包含ERF189、ERF115或两者中的1个或更多个突变。在一个方面，烟草植物还包含1个或更多个转基因，其靶向并抑制编码选自ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、或全部10个蛋白的基因。
在一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值与在相似条件下生长和熟化的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为在相似条件下生长的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的叶，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。
在一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：50-95、55-95、60-95、65-95、70-95、75-95、80-95、85-95、90-95、55-90、60-85、65-80、70-75、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90以及90-95。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为在相似条件下生长的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。
在一个方面，本公开还提供包含选自下组的突变的烟草品种、栽培种或品系：nic1突变、nic2突变及它们的组合，其中当在相似的生长条件下生长时，该烟草品种、栽培种或品系的叶等级与对照烟草品种、栽培种或品系的叶等级相当，其中对照烟草品种与该烟草品种、栽培种或品系具有除该突变之外基本上相同的遗传背景。
在一个方面，本公开还提供非转基因烟草植物或其部分，其包含选自下组的烟碱或总生物碱含量：低于3％、低于2.75％、低于2.5％、低于2.25％、低于2.0％、低于1.75％、低于1.5％、低于1.25％、低于1％、低于0.9％、低于0.8％、低于0.7％、低于0.6％、低于0.5％、低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％、低于0.1％、和低于0.05％，其中当熟化时，该烟草植物能够生产USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的叶。在另一个方面，这种非转基因烟草植物包含低于2.0％的烟碱含量并且当熟化时能够生产USDA等级指数值为70或更高的叶。在进一步的方面，该非转基因烟草植物包含低于1.0％的烟碱含量并且当熟化时能够生产USDA等级指数值为70或更高的叶。
在一个方面，本公开还提供烟草植物或其部分，其包含非转基因突变，其中当在相似的生长条件下生长时，该非转基因突变将烟草植物的烟碱或总生物碱含量降低至低于在相似条件下生长的对照植物的烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，其中当熟化时，该烟草植物能够生产USDA等级指数值与对照植物的USDA等级指数值相当的叶，并且其中对照植物与该烟草植物具有除该非转基因突变之外基本上相同的遗传背景。
在一些方面，本公开提供烟草植物或其部分，其在基因或基因座中包含突变，其中该突变在LA Burley 21中不存在。在一个方面，与LA Burley 21相比，本文提供的烟草植物在目标基因座处包含较短的染色体基因渗入。在另一个方面，本文提供的烟草植物在目标基因座中不包含完整基因或完整基因编码序列的缺失。在一个方面，本文提供的烟草植物在目标基因座处是纯合的。在另一个方面，本文提供的烟草植物在目标基因座处是杂合的。在一个方面，本文提供的烟草植物在目标基因或基因座处包含选自下组的突变：点突变、缺失、插入、复制和倒置。在一个方面，本文提供的烟草植物中的突变通过选自随机诱变和定向诱变的方法引入。在另一个方面，本文提供的烟草植物中的突变通过选自下组的定向诱变方法引入：大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。
如本文所用，突变是指引入基因中以改变由该基因编码的产物的表达或活性的可遗传基因修饰。这种修饰可以在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5'UTR、外显子、内含子、3'UTR或终止子区域中。在一个方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一个方面，突变增加、升高、加强或增强基因产物的表达或活性。在一个方面，突变不是特定烟草品种或栽培种中存在的天然多态性。如本文所用，“突变等位基因”是指来自其中等位基因包含突变的基因座的等位基因。如本文所用，“诱变”是指产生突变而不涉及转基因或在最终的突变体中不保留与突变相关的转基因。在一个方面，诱变是顺基因的。在另一个方面，诱变通过基因或基因组编辑。在另一个方面，诱变通过随机诱变，例如化学(例如EMS)或物理(r-辐照)诱变。
在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，该基因包含与选自SEQ ID NO：23-28的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列，及它们的片段。在一个方面，一个或多个突变降低一个或多个基因的表达或活性，该基因包含与选自SEQ ID NO：23-28的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列，及它们的片段。
在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，该基因编码与选自SEQ ID NO：29-34的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽，及它们的片段。在一个方面，一个或多个突变降低一个或多个基因的表达或活性，该基因编码与选自SEQ ID NO：29-34的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽，及它们的片段。
LA Burley 21(也称为LA BU21)是低总生物碱烟草品系，其通过几次回交将来自古巴雪茄品种的低生物碱基因引入Burley 21中来生产(Legg等.1970)。与其母本Burley21的约3.5％(干重)相比，它具有约0.2％的总生物碱(干重)。LA BU21的叶等级远低于商业上可接受的标准。LA BU21还呈现其他不利的叶表型，其特征是产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高以及熟化后的最终制品质量差(Chaplin and Weeks,1976；Legg et al.1970；Chaplin-Burk 1983)。LA BU21的叶还呈现例如较高的多胺含量、较高的叶绿素含量和每单位叶面积更多的叶肉细胞等性状。
据报道，在植物中，多胺参与发育、生理和代谢过程，例如细胞生长和分裂、胁迫耐受性、导管分化、木质素聚合、病原体防御、衰老和成熟(Fariduddin Q,Varshney P,YusufM,Ahmad A(2013)Polyamines:potent modulators of plant responses tostress.J.Plant Interac.8:1–16；Kusano T,Suzuki H(2015).Polyamines a universalmolecular nexus for growth,survival and specialized metabolism.Tokyo:Springer.)。多项研究已将多胺与植物细胞衰老的调节相联系(Sobieszczuk-Nowicka,E.,Kubala,S.,Zmienko,A.,Malecka,A.,Legocka,J.2016.From accumulation todegradation:Reprograming polyamine metabolism facilitates dark-inducedsenescence in Barley leaf cells.Front.Plant Sci.doi:10.3389/fpls.2015.01198)。在水果和植物组织中，多胺充当抗衰老和抗成熟调节剂，其防止叶绿体光系统复合物的衰退和细胞壁/膜组成的变化(Lester GE(2000).Polyamines and their cellular anti-senescence properties in honey dew musk melon fruit.Plant Sci.160:105–112；Mattoo AK,Handa AK(2008).Higher polyamines restore and enhance metabolicmemory in ripening fruit.Plant Sci.174:386–393；Serafini-Fracassini D,DiSandro A,Del Duca S(2010).Spermine delays leaf senescence in Lactuca sativaand prevents the decay of chloroplast photosystems.Plant Physiol.Biochem.48:602–611).Higher levels of polyamines increase the longevity of tomato vines(Mehta RA,Cassol T,Li N,Ali N,Handa AK,Mattoo AK(2002).Engineered polyamineaccumulation in tomato enhances phytonutrient content,juice quality and vinelife.Nat.Biotechnol.20:613–618)，并在过量表达酵母亚精胺合成酶的转基因番茄植物中观察到了延迟的成熟和叶片衰老(Nambeesan S,Datsenka T,Ferruzzi MG,Malladi A,Mattoo AK,Handa AK(2010).Overexpression of yeast spermidine synthase impactsripening,senescence and decay symptoms in tomato.Plant J.63:836–847)。多胺可以通过稳定细胞壁或与植物激素(例如乙烯、脱落酸、细胞分裂素和赤霉素)的串扰直接发挥作用(Kussano和Suzuki，2015年)。
在大多数植物中，腐胺可以通过鸟氨酸脱羧酶(ODC)从鸟氨酸直接合成，或经过由精氨酸脱羧酶(ADC)开始的三个酶促步骤从精氨酸直接合成(Michael AJ,Furze JM,Rhodes MJ,Burtin D(1996).Molecular cloning and functional identification of aplant ornithine decarboxylase cDNA.Biochem.J.314:241-248；Piotrowski M,Janowitz T,Kneifel H(2003).Plant C-N hydrolases and the identification of aplant N-carbamoylputrescine amidohydrolase involved in polyamine biosynthesisJ.Biol.Chem.278:1708-1712；Illingworth C,Mayer MJ,Elliot K,Hanfrey C,WaltonNJ,Michael AJ(2003).The diverse bacterial origins of the Arabidopsispolyamine biosynthetic pathway FEBS Letters 549:26-30)。之前的研究表明，腐胺的ADC途径对烟草的生物碱谱仅具有次要作用，而ODC途径在烟碱生物合成中起主要作用(Chintapakorn Y,Hamill JD(2007).Antisense-mediated reduction in ADC activitycauses minor alterations in the alkaloid profile of cultured hairy root andregenerated transgenic plants of Nicotiana tabacum.Phytochem.68:2465–2479；DeBoer KD,Dalton HL,Edward FJ,Hamill JD(2011).RNAi-mediated down-regulationof ornithine decarboxylase(ODC)leads to reduced nicotine and increasedanatabine levels in transgenic Nicotiana tabacum L.Phytochem.72:344–355；DeBoer KD,Dalton HL,Edward FJ,Ryan SM,Hamill JD(2013).RNAi-mediated down-regulation of ornithine decarboxylase(ODC)impedes wound-stress stimulation ofanabasine synthesis in Nicotiana glauca.Phytochem.86:21–28；Dalton HL,Blomstedt CK,Neale AD,Gleadow R,DeBoer KD,Hamill JD(2016).Effects of down-regulating ornithine decarboxylase upon putrescine-associated metabolism andgrowth in Nicotiana tabacum L.J.Exp.Bot.67:3367–3381)。在分别通过亚精胺合成酶和精胺合成酶催化的反应中，通过依次加成来自脱羧S-腺苷蛋氨酸(SAM)的氨丙基将腐胺转化为亚精胺，然后转化为精胺。SAM也是乙烯生物合成的底物(Tiburcio AF,AltabellaT,Bitrián M,Alcázar R(2014).The roles of polyamines during the lifespan ofplants:from development to stress.Planta 240:1–18)，而乙烯调节衰老和果实成熟(Fluhr R,Mattoo AK(1996).Ethylene-biosynthesis and perception.Crit.Rev.PlantSci.15:479–523)。多胺和乙烯的生物合成途径竞争共同的前体SAM，但具有相反的发育效应，特别是在从营养生长到成熟/衰老的发育转换过程中(Nambeesan S,Handa AK,MattooAK(2008).Polyamines and regulation of ripening and senescence.In:Paliyath G,Murr DP,Handa AK,Lurie S(eds)Postharvest biology and technology of fruits,vegetables and flowers.Willey-Blackwell Publ,Ames.pp 319–340,Harpaz-Saad S,Yoon GM,Mattoo AK,Kieber JJ(2012).The formation of ACC and competitionbetween polyamines and ethylene for SAM.Annu.Plant Reviews.44:53–81,Gupta A,Pal RK,Rajam MV(2013).Delayed ripening and improved fruit processing qualityin tomato by RNAi-mediated silencing of three homologs of 1-aminopropane-1-carboxylate synthase gene.J.Plant Physiol.170:987–995)。在番茄的果实成熟启动期间，多胺水平下降并且乙烯水平上升((Saftner RA,Baldi BG(1990).Polyamine levelsand tomato fruit development:possible interaction with ethylene.PlantPhysiol.92:547–550；Morilla A,Garcia JM,Albi MA(1996).Free polyamine contentsand decarboxylase activities during tomato development andripening.J.Agri.Food Chem.44:2608–2611)和鳄梨(Kushad MM,Yelenosky G,Knight R(1988).Interrelationship of polyamine and ethylene biosynthesis duringavocado fruit development and ripening.Plant Physiol.87:463–467)，这反应了乙烯对多胺生物合成的相互拮抗作用，反之亦然(Harpaz-Saad et al.2012；Anwar R,MattooA,HandaA(2015).Polyamine interactions with plant hormones:crosstalk atseveral levels in Kusano T,Suzuki H(eds).Polyamines a Universal MolecularNexus for Growth,Survival and Specialized Metabolism.Tokyo:Springer.pp 267–303)。然而，在成熟特异性E8启动子控制下，表达酵母S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)的转基因番茄植株在果实成熟过程中同时产生较高水平的乙烯和多胺，这表明在该系统中没有任何对SAM的竞争(Mehta RA,Cassol T,Li N,Ali N,Handa AK,Mattoo AK(2002).Engineered polyamine accumulation in tomato enhances phytonutrient content,juice quality and vine life.Nat.Biotechnol.20:613–618)。
不受任何科学理论的束缚，在LA烟草植物中对烟碱生物合成的抑制可影响烟碱、多胺和乙烯途径之间的串扰，导致腐胺的积聚。反过来，这会增加更高的多胺亚精胺和精胺的代谢通量，同时抑制乙烯的生物合成，对叶片成熟和衰老产生显著影响。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言含量相当的一种或多种多胺的叶。在一个方面，相当的一种或多种多胺含量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的一种或多种多胺含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的一种或多种多胺含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶绿素含量的叶。在一个方面，相当的叶绿素含量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的叶绿素含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的叶绿素含量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶肉细胞数/单位叶面积的叶。在一个方面，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的叶肉细胞数/单位叶面积是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的表皮细胞大小的叶。在一个方面，相当的表皮细胞大小是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的表皮细胞大小是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的表皮细胞大小是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶产量的叶。在一个方面，相当的叶产量是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的叶产量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的叶产量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或生物碱的突变或转基因，并且能够产生包含相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶而言相当的昆虫食草敏感性的叶。在一个方面，相当的昆虫食草敏感性是在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。在一个方面，相当的昆虫食草敏感性是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。在另一个方面，相当的昆虫食草敏感性是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶水平的0.5％-5％、5％-10％或10％-20％。
可以通过本领域已知的方法，例如在昆虫饲喂试验中测定昆虫食草敏感性水平。简言之，将水中四分之一英寸的0.7％琼脂层添加到100mm培养皿中并使其固化。从培养皿盖上切下叶盘，将其放在培养皿中，然后轻轻推入琼脂中。叶盘取自4-5叶期的植物。从叶片中取出叶盘只是为了去除主要的中脉。从植物的4个最大叶片中的每个叶片中取出单个叶盘，每个植物产生4个重复。采样了四株植物，总共有16条生物学重复测试线。将第二龄期的单个芽虫添加到叶片中，并使其在环境温度下进食48小时。48小时后称重芽虫幼虫，并记录最终幼虫的重量。
除非另外指明，否则本文提到的烟草植物、品种、栽培种或品系的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶的化学或性质表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，例如，根据上下文，包括单株植物的多片叶的平均值或来自单个品种、栽培种或品系的烟草植物群体的平均测量值。在一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量打顶后的叶号3、4和5收集的合并叶样本。在另一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)在打顶后测量具有最高水平的烟碱、生物碱或多胺(或另一片叶化学或性质表征)的叶。在一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量在打顶后测量叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在另一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量选自叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的两片或多片具有连续叶号的叶的组。在另一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自以下的叶号的叶：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30的叶号的两片或多片叶的组。在另一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30的叶号的三片或多片叶的组。
生物碱含量可以通过本领域已知的方法测定，例如基于气相-液相色谱、高效液相色谱、放射性免疫测定和酶联免疫吸附测定进行定量。
如本文所用，叶片编号基于烟草茎上的叶片位置，其中叶号1是打顶后最老的叶片(在根部)，并且最高的叶片编号被分配给最新的叶片(在尖端)。
用于测定平均测量值(例如生物碱或烟碱水平或叶等级)的烟草植物群或烟草叶集合可以具有任何大小，例如5、10、15、20、25、30，35、40或50。遵循行业认可的标准协议来测定平均测量或等级指数值。
如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养生长成熟或在生殖生长开始时去除茎尖，包括SAM、花、并且直至几片相邻的叶。通常，在现蕾期(在花开始出现后不久)将烟草植物打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放花时，可以将温室或田间种植的烟草植物打顶。烟草植物的打顶会导致顶端优势丧失，并导致生物碱产量增加。
通常，在打顶后约2周测量烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)。也可以使用其他时间点。在一个方面，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)。在一个方面，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶化学或性质表征)。
如本文所用，“相似的生长条件”是指用于生长的相似环境条件和/或农艺实践，其能够在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较，使得环境条件或农艺实践都不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。例如，环境条件包括光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。例如，农艺实践包括播种、修剪、根切、移栽、打顶和分株。参见Tobacco,Production,Chemistry-Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford(1999),pp 70-103的第4B章和第4C章。
如本文所用，“可比叶”是指具有相似大小、形状、年龄和/或茎位置的叶。
在一个方面，本公开提供一种烟草植物，其包含可操作地连接至可转录DNA序列的诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA。在一个方面，诱导型启动子是打顶诱导的启动子。在一个方面，诱导型启动子还是组织特异性或组织优选性的启动子。在一个方面，组织特异性或组织优选性的启动子是对于选自以下的一个或多个组织或器官而言具有特异性或优选的：芽、根、叶、茎、花、分枝、根尖、叶肉细胞、表皮细胞和导管。在进一步的方面，打顶诱导的启动子包含来自烟草烟碱脱甲基酶基因，例如CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10的启动子序列。
本文可以使用各种类型的启动子，其根据与可操作地连接至该启动子的编码序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的各种标准进行分类，例如组成型、发育型、组织特异性、组织优选性、诱导型等。在植物的所有或大多数组织中起始转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中表达增强的启动子被称为“组织增强性”或“组织优选性”启动子。因此，“组织优选性”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但是在植物的其他组织中引起较低的表达水平。在植物的特定组织内表达而在其他植物组织中表达很少或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。在植物的某种细胞类型中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(例如冷、干旱、热或光照，或其他刺激例如受伤或化学施用)而起始转录的启动子。启动子也可以按照其起源分类，例如是异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同起源的启动子序列，和/或在要转化的植物物种中不是天然存在的启动子序列。术语“异源”更广泛地包括两个或更多个DNA分子或序列的组合，当这种组合在自然界中通常不存在时。例如，如果两个或更多个DNA分子或序列通常在不同的基因组中或在同一基因组的不同基因座处发现，或者如果它们在自然界中不是相同组合，则它们彼此之间是异源的。
在一个方面，诱导型启动子提供根特异性或优选性表达。在一个方面中，根特异性或优选性诱导型启动子包括选自SEQ ID NO：1-11的序列及其功能片段。表1提供了由SEQID NO：1-11驱动的估计的叶vs根特异性表达水平的比较。
在一个方面，诱导型启动子提供叶特异性或优选性表达。在一个方面中，叶特异性或优选性诱导型启动子包括选自SEQ ID NO：12-21的序列及其功能片段。表2提供了由SEQID NO：12-21驱动的估计的叶vs根特异性表达水平的比较。
Figure GDA0002760190040000241
Figure GDA0002760190040000251
在一个方面，诱导型启动子与可操作连接的可转录DNA序列是异源的。在一个方面，可转录DNA序列编码选自microRNA(miRNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta siRNA)和发夹RNA(hpRNA)的非编码RNA。在一个方面，非编码RNA包含与选自SEQID NO：35和36的序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％同一性的核苷酸序列及其任何部分。在一个方面，非编码RNA提供于包含与SEQID NO：22具有至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％同一性的核苷酸序列的ODC RNAi构建体中。
“生物碱”是天然存在于植物中的复杂的含氮化合物，并且在人和动物中具有药理作用。“烟碱”是商业化卷烟中的主要天然生物碱，其在红花烟草中约占生物碱含量的90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、降烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要的烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假氧烟碱、2,3-联吡啶等。
在一个方面，当在相似生长条件下生长时，与没有nic1突变和/或nic2突变的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含更低的总生物碱或单个生物碱含量。在另一个方面，当在相似生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含更低含量的选自下组的一种或多种生物碱：可替宁、降烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。在一个方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量低于对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在其它方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量为对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、24％-25％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％或29％-30％。在进一步的方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量为对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％。
生物碱含量可以通过本领域已知的方法测定，例如基于气相-液相色谱、高效液相色谱、放射性免疫测定和酶联免疫吸附测定进行定量。例如，烟碱生物碱含量可以通过基于CORESTA推荐方法No.7(1987)的GC-FID方法和ISO标准(ISO TC 126N 394E，也可参见Hibiet al.,Plant Physiology 100:826-35(1992))的使用配备有毛细管柱和FID检测器的气相-液相色谱的方法来测量。除非另有说明，否则本文描述的所有生物碱含量均采用根据CORESTA方法No 62的方法，Determination of Nicotine in Tobacco and TobaccoProducts by Gas Chromatographic Analysis,2005年2月，以及疾病控制中心和Prevention’s Protocol for Analysis of Nicotine,Total Moisture and pH inSmokeless Tobacco Products，如联邦公报第1999年3月23日第64卷第55期(以及如2009年1月7日第74卷第4期修改)定义的那些测量。
或者，烟草总生物碱可以使用由Skalar Instrument Co(West Chester，PA)改良并且如文献Collins等,Tobacco Science 13:79-81(1969)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法测量。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，将烟草样品干燥、研磨并提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取并采用木炭进行脱色。总生物碱的测定基于芳胺存在下氯化氰与烟碱生物碱反应形成在460nm处测量的有色复合物。除非另有说明，否则本文显示的总生物碱含量或烟碱含量是基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。
在一个方面，当在相似生长条件下生长时，与没有nic1突变和/或nic2突变的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含更低的烟碱含量。在一个方面，更低的烟碱含量是指平均烟碱含量低于对照烟草植物的平均烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在另一个方面，更低的烟碱含量是指平均烟碱含量为对照烟草植物的平均烟碱含量的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、24％-25％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％或29％-30％。在进一步的方面，更低的烟碱含量是指平均烟碱含量为对照烟草植物的平均烟碱含量的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％。
在一个方面，基于干重，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面，基于干重，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％和3.5％-3.6％。在进一步的方面，基于干重，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。
本公开还提供对其他烟草性状(例如叶等级指数值)没有负面影响的具有改变的烟碱含量的烟草植物。在一个方面，本文公开的低烟碱或无烟碱烟草品种提供商业上可接受等级的熟化烟草。烟草等级的评估基于包括但不限于以下的因素：叶柄位置、叶大小、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶颜色的强度和深度以及光泽有关)、吸湿性(烟叶吸收和保持环境湿度的能力)以及绿色的细微差别或偏色。例如，可以使用由美国农业部农业市场服务部公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来确定叶等级。例如，参见1990年11月5日生效的白肋烟(Burley Tobacco)(美国31型和外国93型)官方标准等级(55F.R.40645)；1989年3月27日生效的烤制熟化烟草(Flue-Cured Tobacco)(美国11、12、13、14型和外国92型)官方标准等级(54F.R.7925)；1965年1月8日生效的宾夕法尼亚州子叶烟草(Seedleaf Tobacco)(美国41型)官方标准等级(29F.R.16854)；1963年12月8日生效的俄亥俄州雪茄叶烟草(Cigar-Leaf Tobacco)(美国42、43和44型)官方标准等级(28F.R.11719和28F.R 11926)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄混合型烟草(美国54和55型)官方标准等级(34F.R.17061)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄混合型烟草官方标准等级(美国54和55型)(34F.R.17061)；1971年4月生效的佐治亚州和佛罗里达州荫下种植雪茄包装烟草(美国62型)的官方标准等级。USDA等级指数值可以根据行业接受的等级指数来确定。例如，参见Bowman等,Tobacco Science,32:39-40(1988)；传统烟草文献图书馆(Bates文件#523267826-523267833，1988年7月1日，拟议的白肋烟等级指数备忘录)；和Miller等,1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有上述参考文献的全部内容通过引用并入本文)。在一个方面，USDA等级指数以0-100的数字代表接收的联邦等级，并且是所有叶柄位置的加权平均值。等级指数越高表示质量越高。或者，可以通过超光谱成像确定叶等级。例如，参见WO 2011/027315(2011年3月10日公开，并且全部内容通过引用并入本文)。当比较相似叶柄位置的叶时，相当的叶等级指数是指叶等级指数的变化比合适的对照或对比物高或低不超过30％。在一个方面，当比较相似叶柄位置的叶时，相当的叶等级指数是指叶等级指数的变化比合适的对照或对比物的高或低不超过25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在一个方面，当在相似生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似含量的选自下组的一种或多种烟草香气化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。在其它方面，本文提供的烟草植物包含Nic1突变、Nic2突变或它们的组合，其对选自下组的一种或多种烟草香气化合物的含量没有影响：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。
如本文所用，烟草香气化合物是与烟草烟气的风味和香气相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷和labdenoid二萜、和糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物谱分析方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱(GC-MS)、核磁共振光谱、液相色谱-质谱联用。参见Weckwerth和Kahl编辑的“TheHandbook of Plant Metabolomics”(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。
如本文所用，“还原糖(S)”是具有游离的或潜在游离的醛基或酮基的任何糖(单糖或多糖)。通过降低烟气pH并且有效地减少“游离”未质子化烟碱的量，葡萄糖和果糖在香烟烟气中作为烟碱缓冲物。例如，通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感官影响，还原糖平衡烟味。已经报道在各种烟草品种间、同一品种内，以及在因种植条件引起的同一株系内，糖含量和生物碱含量之间呈反比关系。还原糖含量可以使用由Skalar Instrument Co(WestChester，PA)改良并如文献Davis,Tobacco Science 20:139-144(1976)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法测量。例如，样品用碳酸钠溶液透析。将铜新亚铜试剂(Copper neocuproin)添加到样品并且加热溶液。在糖存在下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，形成在460nm处测量的有色复合物。
在一个方面，本文提供的烟草植物在nic1和/或nic2基因座处包含一个或多个非天然存在的突变等位基因，其降低或消除来自nic1和/或nic2基因座的一个或多个基因活性。在一个方面，这些突变等位基因导致烟碱含量降低。可通过本领域已知的任何方法引入突变Nic1或Nic2等位基因，包括随机或定向诱变方法。
这种诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering和Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp317-320,1965)或UV-辐射、X-射线、和快中子辐照(例如，参见Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman,Breeding Field Crops,VanNostrandReinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)、转座子标签(Fedoroff等,1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)以及T-DNA插入法(Hoekema等,1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变包括在基因组长度上化学诱导随机点突变。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大量缺失。转座子标签包含在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。例如，可能存在于烟草基因中的突变类型包括点突变、缺失、插入、复制和倒置。该突变期望存在于烟草基因的编码区；但是，烟草基因的启动子区、和内含子、或非翻译区中的突变也可能是期望的。
此外，用于筛选化学诱导的突变的快速并且可自动化的方法，TILLING(在基因组中靶诱导局部病变)也适用于本公开，其使用变性HPLC或选择性核酸内切酶消化选择的PCR产物。参见McCallum等(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因功能的突变可以使用本领域公知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变。保守性残基中的突变可以特别有效地抑制蛋白的功能。在一个方面，烟草植物包含美国临时申请No.62/616,959和62/625,878(其两者的全文通过引用并入本文)中所述的一个或多个NCG基因中的无义(例如终止密码子)突变。
在一个方面，本公开还提供具有改变的烟碱含量并同时保持商业上可接受的叶质量的烟草品系。通过精确的基因组工程技术，例如转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、锌指核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISOR/Csm1系统及其组合，可以在nic1和/或nic2基因座的一个或多个基因中引入突变来制备这些品系(参见例如US专利申请公开2017/0233756)。例如参见Gaj等,Trends in Biotechnology,31(7):397-405(2013)。
诱变的烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、用于检测酶或多肽和多核苷酸的核酶活性的酶测定、以及蛋白凝胶电泳、蛋白印迹法、免疫沉淀法以及用于检测多肽的酶联免疫测定法。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。实施所有引用技术的方法是已知的。
在一个方面，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶、CRISOR/Csm1核酸酶的核酸酶进行突变或编辑。
在一个方面，本文提供的包含nic1突变、nic2突变或两者的烟草植物还包含提供早期衰老性状的转基因或突变。在一个方面，提供早期衰老性状的突变是黄色burley 1(-yb1)。在一个方面，提供早期衰老特征的突变是黄色burley 2(-yb2)。在一个方面，提供早期衰老性状的突变是浅黄色(PY)。
在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的一个或多个选自以下的性状的第二基因组修饰：总叶片多胺水平、总根多胺水平、总叶片叶绿素水平、叶肉细胞数/叶面积单位和叶片表皮细胞大小，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总叶片多胺水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总根多胺水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的总叶片叶绿素水平的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的叶肉细胞数/叶面积单位的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。在一个方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包括：提供较低的烟碱或总生物碱含量的第一基因组修饰，和提供相当水平的叶片表皮细胞大小的第二基因组修饰，并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
在一个方面，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因、突变或两者。在一个方面，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因。在一个方面，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含突变。在一个方面，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于转基因。在一个方面，第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于突变。
在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其提供与对照烟草植物相比较低的烟碱含量。在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其包含nic1突变、nic2突变或两者。本文提供的烟草植物包含靶向Nic1基因座的转基因、靶向Nic2基因座的转基因，或两者。
在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因或基因座的转基因：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。在一个方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因或基因座的转基因：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG35的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG21的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因中具有1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在另一个方面，具有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个NCG突变的编辑的或突变的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个ERF基因中包含1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG35的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG21的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因中具有2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在另一个方面，具有2个或更多个NCG突变的编辑的或突变的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的2个或更多个ERF基因中包含2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG35的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG21的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因中具有3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在另一个方面，具有3个或更多个NCG突变的编辑的或突变的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的3个或更多个ERF基因中包含3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG35的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1至NCG21的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，突变或编辑提供的烟草植物或植物基因组以在选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因中具有4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在另一个方面，具有4个或更多个NCG突变的编辑的或突变的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的3个或更多个ERF基因中包含4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG35的1个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的1个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述一个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG21的一个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的1个或更多个NCG基因的1个或更多个转基因，其中所述1个或更多个转基因降低或消除所述1个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，具有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个ERF基因中包含1个或更多个突变，其中所述1个或更多个突变降低或消除所述1个或更多个ERF基因的活性或表达。在另一个方面，具有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还包含1个或更多个转基因，所述转基因靶向选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或5个或更多个ERF基因，其中所述1个或更多个靶向ERF的转基因降低或消除所述1个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG35的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG21的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的2个或更多个NCG基因的2个或更多个转基因，其中所述2个或更多个转基因降低或消除所述2个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，具有2个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的2个或更多个ERF基因中包含2个或更多个突变，其中所述2个或更多个突变降低或消除所述2个或更多个ERF基因的活性或表达。在另一个方面，具有2个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还包含2个或更多个转基因，所述转基因靶向选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的2个或更多个ERF基因，其中所述2个或更多个靶向ERF的转基因降低或消除所述2个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG35的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG21的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的3个或更多个NCG基因的3个或更多个转基因，其中所述3个或更多个转基因降低或消除所述3个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，具有3个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的3个或更多个ERF基因中包含3个或更多个突变，其中所述3个或更多个突变降低或消除所述3个或更多个ERF基因的活性或表达。在另一个方面，具有3个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还包含3个或更多个转基因，所述转基因靶向选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的3个或更多个ERF基因，其中所述3个或更多个靶向ERF的转基因降低或消除所述3个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG35的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG13、NCG15、NCG16、NCG17、NCG21、NCG22、NCG24、NCG26、NCG29、NCG30和NCG35的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1至NCG21的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG1、NCG2、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG2、NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，提供的烟草植物或植物基因组包含靶向选自NCG12、NCG15、NCG16和NCG17的4个或更多个NCG基因的4个或更多个转基因，其中所述4个或更多个转基因降低或消除所述4个或更多个NCG基因的活性或表达。在一个方面，具有4个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还在选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的4个或更多个ERF基因中包含4个或更多个突变，其中所述4个或更多个突变降低或消除所述4个或更多个ERF基因的活性或表达。在另一个方面，具有3个或更多个靶向NCG的转基因的烟草植物还包含4个或更多个转基因，所述转基因靶向选自ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168的4个或更多个ERF基因，其中所述4个或更多个靶向ERF的转基因降低或消除所述4个或更多个ERF基因的活性或表达。
在一个方面，本文提供的烟草植物包含第二基因组修饰，其包含与可转录DNA序列可操作连接的诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA。在另一个方面，提供的烟草植物具有经由转基因抑制、诱变或靶向基因组编辑抑制的MYB8活性。为了简化的目的，本文提及的ODC抑制(例如，与任何特定类型的启动子可操作连接)的每个情况同样适用于MYB8抑制。
在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少的总缀合多胺含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。如本文所用，缀合多胺包括但不限于可溶性缀合多胺，例如含有由以下组成的骨架的酚酰胺：与一种或多种苯基丙烷(例如阿魏酸、咖啡酸和香豆酸)缀合的游离多胺(例如腐胺、精胺和/或亚精胺)。缀合多胺还包括但不限于整合入结构聚合物如木质素中的不溶性缀合多胺。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少的总游离多胺(例如腐胺、精胺和亚精胺)含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总缀合形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总缀合形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总游离形式。在一个方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、精胺和亚精胺的多胺的总缀合形式。
在一个方面，在选自以下的时间测量本文所述的烟草植物的特征或性状：紧接在开花前、打顶、打顶后(WPT)1周、2WPT、3WPT、4WPT、5WPT、6WPT、7WPT、8WPT，以及收获时。在一个方面，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物能够产生具有与来自对照植物的叶片相当的叶等级的叶片。在一个方面，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物具有与对照植物相当的总叶产量。
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个核苷酸的靶向诱变，或去除或替换内源植物基因组的核酸序列。在一个方面，所提供的经编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％，至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面，所提供的经编辑的核酸序列与SEQ ID NO：23-28及其片段具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％，至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在另一个方面，所提供的经编辑的核酸序列与编码选自SEQ ID NO：29-34的多肽的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％，至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。
大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点诱导双链DNA断裂，其然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复。然后在切割位点发生序列修饰，其可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面，所提供的方法包括用所提供的核酸酶经由HR和供体多核苷酸编辑植物基因组以突变植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个核苷酸。在一个方面，所提供的突变由使用核酸酶编辑基因组引起。在另一方面，所提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。
在一方面，本文提供的突变提供了激活目标基因(例如，选自生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、一种或多种抗氧化剂的分解代谢酶或其组合的基因)的表达或活化的显性突变体。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化版本通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中交织。已经使用专门的诱变方法和高通量筛选来产生新的大范围核酸酶变体，其识别独特序列并具有提高的核酸酶活性。
ZFN是合成蛋白质，其由与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成。ZFN可以设计成切割几乎任何长链的双链DNA，用于修饰锌指DNA结合结构域。ZFN由单体形成二聚体，所述单体由与工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列融合的FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割结构域组成。
ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。可以改变和定制相对于锌指∞-螺旋的起始位置-1、+2、+3和+6的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)以适合特定的靶标列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则是本领域中已知的。
FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个具有C末端区域的ZFN来结合切割位点的相对DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可以切割靶标位点。如本文所用，术语ZFN是广义的并且包括单体ZFN，其可以在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还用于指一对ZFN(被工程化以共同作用在同一位点切割DNA)的一个或两个成员。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一进行重新工程化，理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公众可得的方法包括依赖于上下文的装配(CoDA)、寡聚化池工程(OPEN)和模块化装配。
TALEN是通过将转录激活子样效应子(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶标位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并导致靶标位点处的双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括单体TALEN，其可以在没有另一个TALEN帮助下切割双链DNA。术语TALEN还用于指一对TALEN的一个或两个成员，它们共同作用在同一位点切割DNA。
可以工程化转录激活子样效应子(TALE)以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白质是衍生自黄单胞菌(Xanthomonas)属的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。黄单胞菌病原体在感染期间将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在那里它识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有13-28个重复的33-34个氨基酸的单体组成的中心DNA结合结构域。除第12位和第13位的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都高度保守。两种可变氨基酸称为重复可变的双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。
除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，其需要两个构建体，所述构建体具有对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特性的DNA结合结构域。TALENDNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高水平活性的参数。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等,.Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。
CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代方案。CRISPR系统基于RNA引导的工程化核酸酶，其使用互补碱基配对来识别靶标位点处的DNA序列。
CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免受入侵核酸如病毒的侵害。通过在CRISPR基因座近端的两个相邻重复序列之间整合称为间隔子的入侵DNA的短片段来获得免疫力。CRISPR阵列(包括间隔子)在随后与侵入性DNA相遇时被转录，并被加工成长度约为40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)结合以激活并引导Cas9核酸酶。这切割了入侵DNA中称为原型间隔子的同源双链DNA序列。切割的前提是在靶DNA下游存在保守的原型间隔子-邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，较少具有序列NAG。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，其必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。
还在另一个方面，本文提供的烟草植物进一步在编码烟碱脱甲基酶(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)的一个或多个基因座中包含一个或多个突变，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或多个基因座中缺少一个或多个突变的对照植物相比，其赋予减少的降烟碱含量(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面，当在可比条件下生长和熟化时，与对照植物相比，所描述的改良烟草植物还包含降低的烟碱脱甲基酶活性。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供升高水平的一种或多种抗氧化剂的一个或多个突变或转基因(参见美国专利申请号15/727,523和PCT申请号PCT/US2017/055618)。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供降低水平的一种或多种TSNA(例如N'-亚硝基鸟烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基钠(NAB))的一个或多个突变或转基因。
本公开还提供在植物中，特别是在烟草属的植物中，包括各种商业品种的烟草植物中用于抑制与多胺的生物合成或其调控有关的一个或多个基因的表达或功能的组合物和方法。
在一个方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含含有ODC抑制性序列的异源表达盒。在另一个方面，烟草植物或其部分包含含有基因的抑制性序列的异源表达盒，所述基因包含与选自SEQ ID NO：23-28的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列及其片段，其中所述抑制性序列与植物细胞种功能性的启动子可操作连接，其中所述抑制性序列与以下序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段具有至少90％序列同一性：与选自SEQ ID NO：23-28的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列及其片段。
如本文所用，术语“抑制”定义为本领域已知的或本文所述的降低目标基因产物(例如靶基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物(例如遗传改变的植物与野生型植物)之间进行比较。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在相同植物内的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间或不同植物之间进行比较，并且包括在同一植物或植物组分内的发育阶段或时间阶段之间或在植物或植物部分之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”包括下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。在一个方面，改良植物中的一个或多个基因的mRNA或蛋白水平低于不是突变体或没有被遗传改造以抑制该基因表达的植物中的同一基因的mRNA或蛋白水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
术语“抑制性序列”包括能够抑制植物中涉及从Nic1b基因座开始的烟碱生物合成调控的基因的表达或功能的任何多核苷酸或多肽序列，例如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义方向的核苷酸序列、反义方向的核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的反向区域、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物、其组合等的序列。
抑制性序列通过靶基因产物的名称来命名。因此，“ODC抑制性序列”是指能够抑制植物中参与多胺生物合成调控的ODC基因表达的抑制性序列(例如在转录和/或翻译水平)，或能够抑制基因产物的功能。当在多核苷酸抑制性序列的背景下使用短语“能够抑制”时，意指抑制性序列本身发挥抑制作用；或者，当抑制性序列编码抑制性核苷酸分子(例如发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)或编码抑制性多肽(例如抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录后(例如在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制性序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制性序列的情况下)后，转录或翻译产物分别对靶基因产物发挥抑制作用(例如抑制靶基因产物的表达或功能)。
所公开的ODC抑制性序列可以是通过本领域已知的任何沉默途径或机制触发基因沉默的序列，包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和包含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA、人工或合成的microRNA、以及人工反式作用siRNA。取决于所需的结果，抑制性序列可以为至少约20个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约350个核苷酸、至少约400个核苷酸，直至编码本公开蛋白质的全长多核苷酸。在一个方面，抑制性序列可以是长度为约50至约400个核苷酸、约70至约350个核苷酸、约90至约325个核苷酸、约90至约300个核苷酸、约90至约275个核苷酸、约100至约400个核苷酸、约100至约350个核苷酸、约100至约325个核苷酸、约100至约300个核苷酸、约125至约300个核苷酸或约125至约275个核苷酸的片段。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
在一个方面，本公开提供包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子在烟草细胞中具有功能，并且与编码RNA分子的多核苷酸可操作连接，所述RNA分子能够结合编码多肽的RNA，所述多肽具有与选自SEQ ID NO：23-28的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列及其片段，其中所述RNA分子抑制所述多肽的表达。在一个方面，RNA分子选自microRNA、siRNA和反式作用siRNA。在另一个方面，重组DNA构建体编码双链RNA。还提供包含三个重组DNA构建体的转基因烟草植物或其部分、熟化的烟草材料或烟草制品。在一个方面，与不含重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、熟化的烟草材料或烟草制品包含减少的烟碱含量。还提供降低烟草植物的烟碱含量的方法，所述方法包括用这些重组DNA构建体的任一个转化烟草植物。
如本文所用，“可操作连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。
如本文所用并且当用于指示序列时，“异源”是指序列源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体旨在表示构建体源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。异源核酸构建体包括但不限于例如通过转化方法或随后用另一种目标植物育种转基因植物而已经引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体。在一个方面，使用的启动子与该启动子驱动的序列是异源的。在另一个方面，使用的启动子是烟草异源的。还在一个方面，使用的启动子对于烟草是天然的。
在一个方面，所述的改良烟草植物是同源转基因植物。如本文所用，“同源转基因”或“顺基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。在一个方面，本文提供的改良植物、植物细胞或植物基因组是顺基因的。本文提供的顺化基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。在另一个方面，本文提供的改良烟草植物不包含非烟草的遗传物质或序列。
如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。
在一个方面，重组DNA构建体或表达盒可包含用于选择转基因细胞的选择性标记基因。选择性标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物，例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、磺酰脲类(例如氯磺隆和甲嘧磺隆)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。
在一个方面，重组DNA构建体或表达盒包含选自组成型启动子、诱导型启动子和组织优选性启动子(例如叶特异性或根特异性启动子)的启动子。示例性的组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；泛素(Christensen等人1989)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J 3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。示例性的化学诱导型启动子包括由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学诱导型启动子包括类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.US88:10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动子(参见例如，Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)。可用于本文的其他示例性启动子是那些负责热调节的基因表达、光调节的基因表达(例如豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；在豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或者阿拉伯苏启动子)、激素调节的基因表达(例如，来自小麦Em基因的脱落酸(ABA)反应序列；ABA诱导型HVA1和HVA22，以及大麦和拟南芥的rd29A启动子；和伤口诱导的基因表达(例如wunl)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性储存蛋白基因；来自玉米的23kDa玉米醇溶蛋白基因；或法国豆(β-菜豆蛋白基因)或病原体-诱导型启动子(例如PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子，以及线虫诱导型启动子，烟草和欧芹的TobRB7-5A和Hmg-1)。
在一个方面，提供的烟草植物还包括参与烟碱生物合成或运输的基因的增加或减少的活性或表达。参与烟碱生物合成的基因包括精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尚未阐明催化烟碱酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间的缩合步骤的烟碱合成酶，尽管已经提出了两个候选基因(A622和NBB1)。参见US 2007/0240728A1和US 2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。另外，几种转运蛋白可能参与烟碱的转运。已经克隆并表征了称为MATE的转运蛋白基因(Morita等,PNAS106:2447-52(2009))。
在一个方面，与对照烟草植物相比，所提供的烟草植物还包含编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的mRNA、蛋白或两者水平的升高或降低。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含直接抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的表达的转基因。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含过表达编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或多个基因的转基因。
还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法用本文所述的重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指其中引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物中并且仅在时间上表达或仅瞬时存在于植物中。
将多核苷酸引入本公开的植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Shillito等(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.US83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomes等(1995)in Plant Cell,Tissue,andOrgCultureFundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923-926)。还可以参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-674(soybean)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6:923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)InVitro CellDev.Biol.27P:175-182(soybean)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(soybean)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman等(Longman,N.Y.),pp.197-209(花药)；Kaeppler等(1990)PlantCellReports9:415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)。
在另一个方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文提供的重组构建体或表达盒引入植物。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒整合入病毒DNA或RNA分子中。已经认识到，用于本文提供的表达盒的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶的转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并表达在其中编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。
可以用重组构建体或表达盒转化可以使用克隆方法随后繁殖(无论是通过器官发生还是胚胎发生)的任何植物组织。“器官发生”是指从分生组织中心依次发育芽和根的过程。“胚胎发生”是指芽和根从体细胞或配子以协调方式(不是依次)一起发育的过程。适用于本文所述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、已有的分生组织(例如茎尖分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。
在一个方面，本文提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草和深色明火烤制熟化烟草、Galpao烟草和东方烟草。在另一个方面，本文提供的烟草植物来自选自以下的烟草类型：白肋烟、马里兰烟和深色烟。
在一个方面，本文提供的烟草植物是烤制熟化烟草背景或显示本文所述的一个或多个烤制熟化烟草特征。烤制熟化烟草(也称为弗吉尼亚烟或金黄色烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“金黄色烟”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高，油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的烤制熟化烟草背景：CC 13、CC 27、CC 33、CC35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。在另一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的烤制熟化烟草背景：Coker 48、Coker176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC606、NC 729、NC 2326、McNair 373、McNair 944、Ox 207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams 744、RG 8、RG 11、RG 13、RG17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、Speight H-20、SpeightG-28、Speight G-58、Speight G-70、Speight G-108、Speight G-l11、Speight G-l17、Speight 168、Speight 179、SpeightNF-3、V116、V182，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。参见WO 2004/041006A1。还在进一步的方面，本文提供的改良烟草植物、种子、杂交种、品种或品系是选自以下的任何烤制熟化背景：K326、K346和NC196。
在一个方面，本文提供的烟草植物是晾制熟化烟草背景或显示本文所述的一个或多个晾制熟化烟草特征。晾制熟化烟草包括白肋烟、马里兰烟和深色烟。共同因素是熟化主要没有人工的热源和湿度。白肋烟的颜色是浅棕色至深棕色，油含量高且糖含量低。白肋烟在仓房里晾制熟化。主要的白肋烟种植国家有阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。马里兰烟极度蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性的香气。主要的马里兰烟种植国家包括美国和意大利。在另一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的白肋烟背景：Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、HB4488PLC、PD 7319LC、Bu 21×Ky10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和V509。在进一步的方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系是选自以下的任何白肋烟背景：TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488。在另一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的马里兰烟背景：Md 10、Md 40、Md201、Md 609、Md 872和Md 341。
在一个方面，本文提供的烟草植物是深色晾制熟化烟草背景或显示本文所述的一个或多个深色晾制熟化烟草特征。深色晾制熟化烟草与其他类型的主要区别在于熟化过程，其给予深色晾制熟化烟草中褐色至深棕色的颜色和不同的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。在一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的深色晾制熟化烟草背景：Sumatra、Jatim、DominicCubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginisun-cured和ParaguPassado。
在一个方面，本文提供的烟草植物是深色明火烤制熟化烟草背景或显示本文所述的一个或多个深色明火烤制熟化烟草特征。深色明火烤制熟化烟草通常用封闭的熟化仓地板上的低燃烧木火熟化。深色明火烤制熟化烟草用于制造管烟、卷烟、嚼烟、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区域是美国的田纳西、肯塔基和弗吉尼亚。在一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的深色明火烤制熟化烟草背景：Narrow Leaf Madole、Improved Madole、TomRosson Madole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT518、DT 592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TND950、V309和V359。
在一个方面，本文提供的烟草植物是东方烟草背景或显示本文所述的一个或多个东方烟草特征。东方烟草也称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们通常种植在东地中海区域例如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马里亚。今天的东方品种的特征是植物和叶的尺寸小，以及它独特的香气特性，这是植物在过去的许多世纪中适应贫瘠土壤和恶劣的气候条件的结果。在一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是选自以下的东方烟草背景：Izmir、Katerini、Samsun、Basma和Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。
在一个方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上衍生自以下品种或是选自以下品种的遗传背景：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、C 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、NealSmith Madole、OXFORD 207、`Perique`烟、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4,RGH 51,RS 1410,Speight 168、Speight172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309或VA359、马里兰609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC，或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业化烟草品种。
所有前面提及的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方类型的具体品种仅出于示例性目的而列出。在本申请中还涵盖任何其他的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方品种。
本文还提供了所描述的烟草植物的群体。在一个方面，烟草植物群体的种植密度为每英亩约5,000至约8000、约5,000至约7,600、约5,000至约7,200、约5,000至约6,800、约5,000至约6,400、约5,000至约6,000、约5,000至约5,600、约5,000至约5,200、约5,200至约8,000、约5,600至约8,000、约6,000至约8,000、约6,400至约8,000、约6,800至约8,000、约7,200至约8,000、或约7,600至约8,000株植物。在另一个方面，烟草植物群体是在具有低至中等肥力的土壤类型中。
本文还提供了来自所描述烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以包含至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000粒或更多的种子。或者，容器可含有至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多种子。烟草种子的容器可以是本领域可用的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒子、袋子、小包、小袋、带卷、管或瓶子。
还提供了从所述低生物碱或低烟碱烟草植物制备的熟化烟草材料。还提供了从具有更高的总生物碱或烟碱含量的烟草植物制备的熟化烟草材料。
“熟化”是一种陈化过程，其减少水分并导致叶绿素的破坏，使烟叶呈现金黄色，淀粉也转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面，本文提供的烟草植物或植物组分可以使用常规方法熟化，例如烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于各种类型的熟化方法的描述，参见例如(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％至约25％的压缩条件下在木桶(例如大桶)或纸板箱中陈化数年(例如2至5年)。参见美国专利号4,516,590和5,372,149。然后可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制烟草。通常，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter 1inTobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford)。可以进一步加工熟化的、陈化的和发酵的烟草(例如切割、切碎、膨化或混合)。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577和4,987,907。在一个方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化、晒制熟化、晾制熟化或明火烤制熟化。
从本公开的烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制备烟草制品。如本文所用，“烟草制品”定义为意欲用于人类使用或消费的由烟草制备或衍生的任何制品。
本文提供的烟草制品包括但不限于卷烟制品(例如卷烟、比迪烟、丁香烟)、雪茄制品(例如雪茄、雪茄包皮烟和小雪茄)、烟斗烟制品、衍生自烟草的制品、来自烟草的烟碱制品、无烟烟草制品(例如湿鼻烟、干鼻烟、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟)、膜、可嚼的(例如口香糖)、含片、溶解条、标签、片剂、成形部分、凝胶、消费品单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号US 2006/0191548。
如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草制品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。
如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以模拟烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。
如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。
来自本公开的植物的烟草制品还包括卷烟和其他吸烟制品，特别是那些包括过滤元件的吸烟制品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。在一个方面，本公开的烟草制品选自：小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、比迪烟、雪茄(cigar)、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟(cigar tobacco)、卷烟、嚼烟、叶烟、水烟、烟碎(shredded tobacco)和烟丝(cut tobacco)。在另一个方面，本公开的烟草制品是无烟烟草制品。无烟烟草制品不燃烧，包括但不限于嚼烟、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其通常包装在大袋状包装中并用于塞子或捻。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且通常包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或放置在成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或用于鼻腔的精细研磨的烟草。在进一步的方面，本公开的烟草制品选自散叶嚼烟、塞嚼烟(plugchewing tobacco)、湿鼻烟和鼻烟(nasal snuff)。还在另一个方面，本公开的烟草制品选自电子加热的卷烟、e-卷烟、电子蒸发装置。
在一个方面，本公开的烟草制品可以是混合烟草制品。在一个方面，混合烟草制品包含熟化烟草材料。在一个方面，按重量计，熟化烟草材料在烟草混合物的熟化材料中占约至少10％、至少5％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个方面，按体积计，熟化烟草材料在烟草混合物的熟化材料中占约至少10％、至少5％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在一个方面，本公开的烟草制品可以是低烟碱烟草制品。在进一步的方面，本公开的烟草制品可以少于约3mg/g的水平包含降烟碱。例如，这种制品中的降烟碱含量可以是约3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750μg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g或不可检测。
在一个方面，基于干重，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面，基于干重，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％和3.5％-3.6％。在进一步的方面，基于干重，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。
本公开还提供用于育种包含所需含量的总生物碱或烟碱(例如低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培种或品种的方法。育种可以通过任何已知的程序进行。可以在标记-辅助选择(MAS)育种项目中使用DNA指纹图谱、SNP作图、单倍型作图或相似技术以将所需的性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可以使用本文公开的F1杂交植物在F2代或回交世代中生成分离群体，或者进一步将F1杂交种植物与其他具有农艺上所需基因型的供体植物杂交。可以使用本领域已知的技术或本文列出的技术之一筛选F2或回交世代的植物的所需农艺性状或所需化学特征。取决于预期的遗传模式或使用的MAS技术，可以在每个回交周期之前对所选植物进行自花授粉，以帮助鉴定所需的单个植株。回交或其他育种程序可重复进行，直到轮回亲本的所需表型恢复。本公开中的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种或东方品种。例如，其它育种技术可以在Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillanPublishingGo.,Inc.,New York,N.Y.中找到，其全部内容通过引用并入本文。
使用所描述的烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用的品系、栽培种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有将其与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。品种通常是，尽管并不总是，商业化销售的。尽管具有一个或多个区别性状，品种的进一步特征是在该品种内的个体之间的总体差异非常小。可以通过数代自花受粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖生成“纯品系”品种。品种可以基本上衍生自另一个品系或品种。根据国际公约对植物新品种保护所定义的(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；c)除了由衍生行为产生的差异，它在由所述初始品种的基因型或基因型组合导致的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变异、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化获得基本上衍生的品种。认为第一烟草品种和第二烟草品种(第一烟草品种基本衍生自第二烟草品种)具有基本相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业化使用，例如用于植物研究的一组植物。品系通常在个体间的一个或多个目标性状显示非常小的总体差异，尽管在个体间的其他性状可能存在一些差异。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定因子、基因或标记所在的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一种或多种多态性；例如，在一些个体中存在替代等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但通常更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在第二同源染色体上，例如，如出现在杂合子个体的不同染色体上，或者在群体中不同的纯合子或杂合子个体间出现。如本文所用，术语“染色体区间”是指位于单一染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。
如本文所用，“基因渗入(introgression)”或“基因渗入(introgress)”是指将遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。
如本文所用，“杂交的(crossed)”或“杂交(cross)”是指通过受精(例如细胞、种子或植物)产生后代，并且包括植物(有性)和自我受精(自交)之间的杂交。
如本文所用，“回交(backcross)”和“回交(backcrossing)”是指后代植物被反复杂交回其亲本之一的过程。在回交方案中，“供体”亲本指具有要导入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被导入其中的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，等等。在一个方面，反复进行回交，每个连续回交世代的后代个体本身回交至相同的亲本基因型。
如本文所用，“单基因转化的(single gene converted)”或“单基因转化(singlegene conversion)”是指使用已知为回交的植物育种技术或通过基因工程开发的植物，其中除了通过回交技术或通过遗传工程转移到品种的单基因之外，恢复了品种基本上全部的所需形态和生理特征。
如本文所用，“优良品种”意指由育种和选择得到的农艺学表现优异的任何品种。
如本文所用，在标记-辅助选择或育种的上下文中的“选择(selecting)”或“选择(selection)”是指基于某些预定标准，一般从群体中挑选或选取所需个体的行为。
如本文所用，术语“性状”是指可被基因型影响的细胞或生物体的一种或多种可检测特征。表型可以通过裸眼，或通过本领域已知的任何其他评估手段来观察，例如显微镜、生化分析、遗传分析、特定疾病耐受性测定等。在一些情况下，表型直接由单个基因或遗传基因座控制，例如“单基因性状”。在其他情况下，表型是几个基因的结果。
应当理解，本公开的任何烟草植物可以进一步包含额外的农艺上所需的性状，例如，通过使用本领域已知的技术用遗传构建体或转基因进行转化。非限制性地，所需性状的实例是除草剂抗性、抗虫性、抗病性；高产；高等级指数值；可熟化性；熟化质量；机械收获性能；耐熟能力；叶质量；高度、植物成熟(例如早熟、早熟到中熟、中熟、中晚熟或晚熟)；茎的大小(例如小的、中等的或大的茎)；或每株植物的叶数(例如少的(例如5-10叶)、中等的(例如11-15叶)或多的(例如16-21)叶数)或任意组合。在一些方面，本文公开的低烟碱或无烟碱的烟草植物或种子包含表达一种或多种杀虫蛋白的一种或多种转基因，所述杀虫蛋白例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体蛋白或来自蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的营养型杀虫蛋白，诸如VIP3(例如，参见Estruch等.(1997)Nat.Biotechnol.15:137)。在其它方面，本文公开的烟草植物进一步包含赋予对棕色茎腐病的抗性(美国专利号5,689,035)或对抗囊胞线虫的抗性(美国专利号5,491,081)的导入性状。
本公开还提供烟草植物，其包含改变的烟碱或总生物碱含量，但其产量与没有该改变的烟碱含量的相应的初始烟草植物的产量相当。在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种提供选自下组的产量：约1200-3500、1300-3400、1400-3300、1500-3200、1600-3100、1700-3000、1800-2900、1900-2800、2000-2700、2100-2600、2200-2500和2300-2400lbs/英亩。在另一个方面，本文公开的低烟碱或无烟碱烟草品种提供选自下组的产量：约1200-3500、1300-3500、1400-3500、1500-3500、1600-3500、1700-3500、1800-3500、1900-3500、2000-3500、2100-3500、2200-3500、2300-3500、2400-3500、2500-3500、2600-3500、2700-3500、2800-3500、2900-3500、3000-3500、3100-3500lbs/英亩。在进一步的方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供的产量为对照植物的产量的65％-130、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％、120％-130％，所述对照植物除nic1b突变、nic2突变、Nic1b转基因、Nic2转基因或其组合之外具有基本相同的遗传背景。在进一步的方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供的产量为对照植物的产量的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％，所述对照植物除nic1突变、nic2突变、Nic1转基因、Nic2转基因或其组合之外具有基本相同的遗传背景。
在一个方面，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的两个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不显示选自以下的三个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LNKY171相比，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示降低水平的选自以下的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或全部的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LN KY171相比，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示降低水平的选自以下的两个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LN KY171相比，烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)显示降低水平的选自以下的三个或更多个的LA BU21性状：产量较低、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性更高、打顶后的多胺含量增加、叶绿素更高、更高的叶肉细胞/单位叶面积和熟化后的最终制品质量差。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)而基本上不影响选自以下性状的修饰：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、叶肉细胞数/单位叶面积和熟化后的最终制品质量。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含与未改良对照植物基本上相当的性状，其中所述性状选自：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的敏感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、叶肉细胞数/单位叶面积和熟化后的最终制品质量。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的产量比未改良对照植物产量多80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、1150％、120％、125％、130％、135％或140％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的产量是未改良对照植物产量的70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的产量是未改良对照植物产量的70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％或130％-140％。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的打顶后多胺含量比未改良对照植物打顶后多胺含量多80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、1150％、120％、125％、130％、135％或140％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的打顶后多胺含量是未改良对照植物打顶后多胺含量的70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的打顶后多胺含量是未改良对照植物打顶后多胺含量的70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％或130％-140％。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶绿素水平比未改良对照植物叶绿素水平多80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、1150％、120％、125％、130％、135％或140％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶绿素水平是未改良对照植物叶绿素水平的70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶绿素水平是未改良对照植物叶绿素水平的70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％或130％-140％。
在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶肉细胞数/单位叶面积比未改良对照植物叶肉细胞数/单位叶面积多80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、1150％、120％、125％、130％、135％或140％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶肉细胞数/单位叶面积是未改良对照植物叶肉细胞数/单位叶面积的70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，改良烟草植物(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予期望性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且包含的叶肉细胞数/单位叶面积是未改良对照植物叶肉细胞数/单位叶面积的70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％或130％-140％。
在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种适用于机器收获。在另一个方面，所公开的低烟碱或无烟碱烟草品种通过机械收获。
在一个方面，提供用于提高生物碱降低的烟草植物种的叶质量的方法，所述方法包含：种植烟草植物；降低烟草植物中的腐胺含量，和从所述烟草植物收获叶。
在一个方面，提供用于提高生物碱降低的烟草植物种的叶质量的方法，所述方法包含：种植烟草植物；抑制烟草植物中的鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达或活性，和从所述烟草植物收获叶。在一个方面，抑制步骤在2、4、6或8WPT之内。在一个方面，抑制步骤包括在烟草植物打顶之前和之后都抑制ODC基因。在一个方面，抑制步骤不包括使用化学抑制剂。在一个方面，抑制步骤通过诱导用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA的表达来完成。在一个方面，抑制步骤包括向烟草植物施用ODC抑制剂。在一个方面，通过将ODC抑制剂施用于烟草植物来实现抑制。在一个方面，ODC抑制剂是DFMO。
在一个方面，本文提供的烟草植物是杂交种植物。杂交种可以通过以下来产生：阻止第一品种的雌性亲本植物(例如种子亲本)自花受粉，允许第二品种的雄性亲本植物的花粉受精雌性亲本植物，并允许F1杂交种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育早期将花去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可以使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，可以通过雄性不育(MS)或其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育或自交不亲和来产生雄性不育。包含MS的雌性亲本植物尤其有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可以从雄性可育植物收获花粉，并人工授至MS雌性亲本植物的柱头，并收获所得的F1种子。
植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自雄性亲本植物的花粉人工转移至去雄的雌性亲本植物或雄性不育的雌性亲本植物以形成F1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作母本并与不同的父本杂交。作为另一种选择，可以产生双交杂交种，其中两个不同单交的F1子代与其自身杂交。当形成双交杂交种时，自交不亲和可以特别有利地用于阻止雌性亲本的自花授粉。
在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种是雄性不育。在另一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种是细胞质雄性不育(CMS)。雄性不育的烟草植物可以通过本领域已知的任何方法产生。产生雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp。
在进一步的方面，所提供的植物部分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、果荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、嫩芽、细胞和原生质体。在一个方面，所提供的烟草植物不包括种子。在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开还提供是繁殖材料并介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本发明提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本发明提供了体细胞烟草植物细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
所提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、嫩芽、茎、果荚、花、花序、叶柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部和维管组织。另一方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在进一步的方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶毛(毛状体)、根毛或贮藏根。在另一方面，本公开提供烟草原生质体。
技术人员理解，烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。在一个方面，本公开提供烟草胚乳。另一方面，本公开提供烟草胚乳细胞。在进一步的方面，本公开提供一种雄性或雌性不育的烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。
在一个方面，本公开提供包含与选自SEQ ID NO：23-28的序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸分子及其片段。在一个方面，本公开提供的多肽或蛋白包含与选自SEQ ID NO：29-34的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在另一个方面，本公开提供具有选自SEQ ID NO：29-34的氨基酸序列的蛋白的生物活性变体。本公开的蛋白的生物活性变体与所述蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸残基。还提供了来自ODC途径的基因或蛋白的同源直系基因或蛋白。“直系同源物”是指衍生自共同祖先基因的基因，其由于特定化而发现于不同的物种。直系同源物可以在核苷酸序列和/或氨基酸序列水平具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列一致性或相似性。直系同源物的功能在物种间通常是高度保守的。
如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”指的是当在指定的比较窗口上比对最大对应性时两个序列中的残基相同。当对蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常通过保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代上不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。
本文提供的核酸分子、多肽或蛋白可以是分离的或基本纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白或其生物活性部分实质上或基本上不含通常与其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白相伴或相互作用的组分。例如，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。
本公开还提供了一种制造烟草制品的方法，所述烟草制品包含来自所提供的烟草植物的烟草材料。在一个方面，方法包括调制由本文提供的烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其水分含量从约12.5％至约13.5％增加至约21％，混合经调制的烟草材料以产生所需的混合物。在一个方面，制备烟草制品的方法进一步包含将所述混合物进行加料(casing)或调味。通常，在加料工序中，在混合物中加入加料或调味的材料，通过平衡化学组成来提高它们的质量并开发某些期望的风味特征。加料工艺的进一步细节可见于L.Davis和M.Nielsen主编的Tobacco Production,Chemistry andTechnology,Blackwell Science,1999。
所提供的烟草材料也可以使用包括但不限于热处理(例如烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法进行加工。可以使用这些技术加工发酵和非发酵烟草。合适的加工烟草的实例包括深色晾制熟化的、深色明火烤制熟化的、白肋烟、烤制熟化的和雪茄填料或包装纸，以及来自整个叶片干燥操作的制品。在一个方面，烟草纤维包括基于鲜重高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述，可通过加热、出汗和/或巴氏杀菌步骤来调制烟草。
所提供的烟草材料可以进行发酵。通常，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373和5,372,149。除了改变叶片的香气外，发酵还可以改变叶片的颜色和质地。同样在发酵过程中，可以产生演化气体，可以吸收氧气，可以改变pH值，可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,ChemistryandTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。在加入口腔用制品之前，可以进一步加工(例如切割、膨化、混合、研磨或粉碎)熟化或熟化并发酵的烟草。在某些情况下，烟草是长切发酵的熟化湿烟草，在与共聚物和任选的食用香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。
在一个方面，本文提供的烟草材料可以加工成所需的尺寸。在某些方面，烟草纤维可以加工成平均纤维尺寸小于200微米。在一个方面，烟草纤维为75至125微米。在另一个方面，将烟草纤维加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切割或切碎成宽度为约10切/英寸(cut/inch)直至约110切/英寸，长度为约0.1英寸至约1英寸。双切烟草纤维可具有一定范围的颗粒尺寸，使得约70％的双切烟草纤维落在-20目至80目的筛目尺寸之间。
本文提供的烟草材料可以加工成总烘箱挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％至约25重量％；约20重量％至约30重量％；约30重量％至约50重量％；约45重量％至约65重量％或约50重量％至约60重量％。本领域技术人员将理解，“潮湿”烟草通常是指烘箱挥发物含量为约40重量％至约60重量％(例如约45重量％至约55重量％，或约50％重量)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”通过计算在预热的强制通风烘箱中于110℃干燥样品3.25小时后样品的失重百分比来确定。口腔用制品的总烘箱挥发物含量可与用于制备口腔用制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同。本文描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
以上已经一般性地描述了本公开，通过参考以下以示例方式提供的实施例，将更容易理解本公开，除非另有说明，否则这些实施例不旨在限制本公开。
以下是本公开的示例性实施方案。
实施方案1.一种烟草植物，其包含可操作地连接至可转录DNA序列的诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA。
实施方案2.实施方案1的烟草植物，其中所述烟草植物包含赋予降低的烟碱含量的突变或转基因。
实施方案3.实施方案1或2的烟草植物，其中所述烟草植物是低烟碱烟草植物。
实施方案4.实施方案1-3任一项的烟草植物，其中所述烟草植物包含nic1突变、nic2突变或两者。
实施方案5.实施方案1-4任一项的烟草植物，其中所述烟草植物在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
实施方案6.实施方案1-5任一项的烟草植物，其中所述烟草植物在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案7.实施方案1-6任一项的烟草植物，其中所述烟草植物包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因的转基因：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
实施方案8.实施方案1-7任一项的烟草植物，其中所述烟草植物包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因的转基因：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案9.实施方案1-8任一项的烟草植物，其中所述烟草植物能够产生包含相对于不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶而言相当的一种或多种多胺含量的叶。
实施方案10.实施方案1-9任一项的烟草植物，其中所述相当含量是所述对照水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。
实施方案11.实施方案1-10任一项的烟草植物，其中所述烟草植物能够产生包含相对于不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶绿素含量的叶。
实施方案12.实施方案1-11任一项的烟草植物，其中所述相当的叶绿素含量是所述对照水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。
实施方案13.实施方案1-12任一项的烟草植物，其中所述烟草植物能够产生包含相对于不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶肉细胞数/单位叶面积的叶。
实施方案14.实施方案1-13任一项的烟草植物，其中所述相当的叶肉细胞数/单位叶面积是所述对照水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。
实施方案15.实施方案1-14任一项的烟草植物，其中所述烟草植物能够产生包含相对于不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶而言相当的表皮细胞大小的叶。
实施方案16.实施方案1-15任一项的烟草植物，其中所述相当的表皮细胞大小是所述对照水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。
实施方案17.实施方案1-16任一项的烟草植物，其中所述烟草植物包含相对于不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶而言相当的叶产量。
实施方案18.实施方案1-17任一项的烟草植物，其中所述相当的叶产量是所述对照水平的20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％或1％内。
实施方案19.实施方案1-18任一项的烟草植物，其中与不包含所述突变或所述转基因的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物显示相当的昆虫食草敏感性。
实施方案20.实施方案1-19任一项的烟草植物，其中所述鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因编码与选自SEQ ID NO：29-34的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的多肽序列。
实施方案21.实施方案1-20任一项的烟草植物，其中所述ODC基因包含与选自SEQID NO：23-28的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
实施方案22.实施方案1-21任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子是打顶诱导的启动子。
实施方案23.实施方案1-22任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子是组织特异性或组织优选性启动子。
实施方案24.实施方案1-23任一项的烟草植物，其中所述组织特异性或组织优选性启动子对于选自以下的一个或多个组织或器官而言具有特异性或优选性：芽、根、叶、茎、花、分枝、根尖、叶肉细胞、表皮细胞和导管。
实施方案25.实施方案1-24任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子调控根特异性或优选性表达。
实施方案26.实施方案1-25任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子包含选自SEQ ID NO：1-11的序列。
实施方案27.实施方案1-26任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子调控叶特异性或优选性表达。
实施方案28.实施方案1-27任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子包含选自SEQ ID NO：12-21的序列。
实施方案29.实施方案1-28任一项的烟草植物，其中所述诱导型启动子对于所述可转录DNA序列是异源的。
实施方案30.实施方案1-29任一项的烟草植物，其中所述非编码RNA选自microRNA(miRNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta siRNA)和发夹RNA(hpRNA)。
实施方案31.实施方案1-30任一项的烟草植物，其中所述非编码RNA包含与选自SEQ ID NO：35和36的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
实施方案32.实施方案1-31任一项的烟草植物，其中所述非编码RNA提供于包含与SEQ ID NO：22具有至少90％同一性的核苷酸序列的ODC RNAi构建体中。
实施方案33.一种烟草植物或其部分，其包含nic1突变、nic2突变或两者，且进一步包含提供早期衰老性状的转基因或突变。
实施方案34.实施方案33所述的烟草植物，其中所述提供早期衰老性状的突变是黄色burley 1(-yb1)。
实施方案35.实施方案33或34所述的烟草植物，其中所述提供早期衰老特征的突变是黄色burley 2(-yb2)。
实施方案36.实施方案33-35任一项所述的烟草植物，其中所述提供早期衰老性状的突变是浅黄色(PY)。
实施方案37.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的选自以下的一种或多种性状：
i.总叶多胺含量，
ii.总根多胺含量，
iii.总叶片叶绿素含量，
iv.叶肉细胞数/叶面积单位，和
v.叶片表皮细胞大小；
并且其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案38.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的总叶多胺含量，其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案39.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的总根多胺含量，其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案40.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的总叶片叶绿素含量，其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案41.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的叶肉细胞数/叶面积单位，其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案42.一种烟草植物或其部分，其相对于对照烟草植物包含：
a.第一基因组修饰，其提供较低的烟碱或总生物碱含量，和
b.第二基因组修饰，其提供相当水平的叶片表皮细胞大小，其中所述对照植物不具有所述第一和所述第二基因组修饰。
实施方案43.实施方案37-42任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在叶中包含减少的总缀合多胺含量。
实施方案44.实施方案37-43任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。
实施方案45.实施方案37-44任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在叶中包含减少的总游离多胺含量。
实施方案46.实施方案37-45任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在根中包含减少的总缀合多胺含量。
实施方案47.实施方案37-46任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总缀合形式。
实施方案48.实施方案37-47任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总缀合形式。
实施方案49.实施方案37-48任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总游离形式。
实施方案50.实施方案37-49任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物相对于所述对照烟草植物在根中包含减少量的一种或多种选自腐胺、亚精胺和精胺的多胺的总缀合形式。
实施方案51.实施方案37-50任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组提供与所述对照烟草植物相比较低的烟碱含量。
实施方案52.实施方案37-51任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因、突变或两者。
实施方案53.实施方案37-52任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含转基因。
实施方案54.实施方案37-53任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者包含突变。
实施方案55.实施方案37-54任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于转基因。
实施方案56.实施方案37-55任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰、第二基因组修饰或两者不是基于突变。
实施方案57.实施方案37-56任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰包含nic1突变、nic2突变或两者。
实施方案58.实施方案37-57任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰包含靶向Nic1基因座的转基因、靶向Nic2基因座的转基因，或两者。
实施方案59.实施方案37-58任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第二基因组修饰包含编码非编码RNA的可转录DNA序列，所述非编码RNA用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因、MYB8基因或两者。
实施方案60.实施方案37-59任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述可转录DNA序列与选自以下的异源启动子可操作连接：组成型启动子、发育型启动子、组织特异性启动子、组织优选性启动子、诱导型启动子，及其任意组合。
实施方案61.实施方案37-60任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第二基因组修饰包含过表达二胺氧化酶、抑制鸟氨酸脱羧酶，或两者。
实施方案62.实施方案37-61任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
实施方案63.实施方案37-62任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰在编码选自以下蛋白的基因或基因座中包含突变：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案64.实施方案37-63任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因或基因座的转基因：天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚氨酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、A622、NBB1、BBL、MYC2、Nic1、Nic2、乙烯响应因子(ERF)转录因子、烟碱摄取渗透酶(NUP)和MATE转运蛋白。
实施方案65.实施方案37-64任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述第一基因组修饰包含靶向并抑制编码选自以下蛋白的基因或基因座的转基因：ERF32、ERF34、ERF39、ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。
实施方案66.实施方案37-65任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述较低含量在选自以下的时间测量：紧接在开花前、打顶、打顶后(WPT)1周、2WPT、3WPT、4WPT、5WPT、6WPT、7WPT、8WPT，以及收获时。
实施方案67.实施方案37-66任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述相当水平在选自以下的时间测量：紧接在开花前、打顶、打顶后(WPT)1周、2WPT、3WPT、4WPT、5WPT、6WPT、7WPT、8WPT，以及收获时。
实施方案68.实施方案37-67任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物能够产生与所述对照植物的叶具有相当的叶等级的叶。
实施方案69.实施方案37-68任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物具有与所述对照植物相当的总叶产量。
实施方案70.前述实施方案任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含的烟碱含量选自低于3％、低于2.75％、低于2.5％、低于2.25％、低于2.0％、低于1.75％、低于1.5％、低于1.25％、低于1％、低于0.9％、低于0.8％、低于0.7％、低于0.6％、低于0.5％、低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％、低于0.1％和低于0.05％。
实施方案71.实施方案37-70任一项所述的烟草植物或其部分，其中当在相当生长条件下生长时，所述烟草植物包含的烟碱含量低于所述对照植物的烟碱含量的％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
实施方案72.前述实施方案任一项所述的烟草植物的群体。
实施方案73.来自前述实施方案任一项所述的烟草植物的熟化烟草材料。
实施方案74.实施方案73所述的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自以下的熟化过程制备：烤制熟化、晾制熟化、明火烤制熟化和晒制熟化。
实施方案75.包含实施方案73或74所述的熟化烟草材料的烟草混合物。
实施方案76.实施方案73-75任一项所述的烟草混合物，其中按重量计，所述熟化烟草材料在所述烟草混合物的熟化烟草中占约至少10％、至少5％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
实施方案77.实施方案73-76任一项所述的烟草混合物，其中按体积计，所述熟化烟草材料在所述烟草混合物的熟化烟草中占约至少10％、至少5％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
实施方案78.包含实施方案73-77任一项所述的熟化烟草材料的烟草制品。
实施方案79.实施方案78所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：卷烟、小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、雪茄(cigar)、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟(cigartobacco)、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎(shredded tobacco)和烟丝(cut tobacco)。
实施方案80.实施方案78或79所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：散叶嚼烟、塞嚼烟(plug chewing tobacco)、湿鼻烟和鼻烟(nasal snuff)。
实施方案81.一种用于提高生物碱降低的烟草植物中的叶质量的方法，所述方法包含：
a.种植烟草植物；
b.降低所述烟草植物中的腐胺含量，和
c.从所述烟草植物收获叶。
实施方案82.一种用于提高生物碱降低的烟草植物中的叶质量的方法，所述方法包含：
a.种植烟草植物；
b.抑制所述烟草植物中的鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达或活性，和
c.从所述烟草植物收获叶。
实施方案83.实施方案81或82所述的方法，其中所述抑制在2、4、6或8WPT之内。
实施方案84.实施方案81-83任一项所述的方法，其中所述抑制包括在所述烟草植物打顶之前和之后抑制ODC基因。
实施方案85.实施方案82-84所述的方法，其中所述抑制不包括使用化学抑制剂。
实施方案86.实施方案82-85所述的方法，其中所述抑制包括向所述烟草植物施用ODC抑制剂。
实施方案87.实施方案82-86所述的方法，其中所述抑制是向所述烟草植物施用ODC抑制剂。
实施方案88.实施方案82-87所述的方法，其中所述ODC抑制剂是DFMO。
实施方案89.实施方案82-88所述的方法，其中所述抑制通过诱导用于抑制所述鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的非编码RNA的表达来完成。
实施方案90.实施方案82-89所述的方法，其中所述方法还包含降低氮肥或降低硝酸盐。
具体实施方案
实施例1.植物材料和总体生长条件
红花烟草(Nicotiana tabacum L.)栽培品种Burley 21野生型NA以及HI(nic2)、LI(nic1)和LA(nic1nic2)近等基因品种的种子均获自北卡罗来纳州立大学的美国烟草种质收藏中心，并用于所有温室试验。将种子在以下温室条件下的盆中发芽：昼/夜温度为27/23℃，光照时间为16h(～200mmol s-1m-2；λ＝400-700nm)，相对湿度为70％。将五周龄的烟草苗移至带有标准底物(Einheitserde,
Figure GDA0002760190040000851
Germany)的13升盆中。将植物连接到每4小时运行～5分钟的连续滴灌系统，并在16小时的光周期中用0.7％(w/v)含16％氮的Ferty 2Mega(PlantaDüngemittel，Regenstauf，德国)灌溉5min h-1，然后再生长4周。当50％的植物有至少一朵开放花时，将温室植物打顶。打顶后，植物再生长4-7周，直至打顶后30天收获。在三个时间点从温室生长的植物收集用于多胺分析的烟叶：开花前(6.5周龄的植物)、刚好在打顶之前，即去除花尖(9周龄的植物)和收获时(13周龄的植物，打顶后4周)。在打顶和收获时收集根样品。在田间以每英亩135单位的氮种植LA和NA烟草植株，并在打顶后1周取样进行多胺分析。
对于多胺生物合成抑制剂的处理，将5mM D-精氨酸(AKos，Steinen，德国)、2mMDFMO(Synchem Ug&Co.KG，Felsberg，德国)单独或与0.5mM
Figure GDA0002760190040000852
组合，或单独的0.5mM
Figure GDA0002760190040000853
(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)稀释在等量的每日灌溉用水中，并每隔4小时分别在上午9点、12点、下午3点和6点代替滴灌系统施用于LA植物，每周三次。D-精氨酸和DFMO的处理在开花前(植物仍处于营养生长阶段，在打顶前～2.5周)开始，持续6周直至收获，而
Figure GDA0002760190040000861
的施用从打顶到收获(总共4周)，以免LA植物过早衰老。每种抑制剂处理十二株植物。NA植物作为对照，以与LA植物相同的方式处理。实验程序和数据的更多描述可以在
Figure GDA0002760190040000862
G,et al.Polyamines delay leaf maturation in low-alkaloidtobacco varieties.Plant Direct.2018；2:1-12。
实施例2.叶绿素测量
使用SPAD-502Plus装置(Minolta Camera Co.,Osaka,Japan)通过测量红色和红外区中的叶片吸光度来测定叶绿素含量。在以下五个生长阶段的每个品系的6株随机选择的植物的所有完全展开(长度>15cm)叶片(叶6-26)的不同位置处，同一天两次测量叶绿素：开花前(6.5周龄植株，打顶前2.5周)、打顶时、1和2.5WPT以及收获时(打顶后30天)。总叶绿素含量计算为每株植物测得的所有叶片叶绿素值的平均值，以将叶片位置的影响最小化。
实施例3.叶细胞显微观察
将从不同发育阶段(开花前、打顶、1WPT和收获时)的六个生物重复的叶15切下来的四个叶盘(1cm2)固定在载玻片上，并使用Leica DM R显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)的10倍空中物镜进行成像。将图像导入Image J和Adobe Photoshop CS5.1软件，并使用Photoshop CS5中的Count Tool对每单位面积的细胞进行计数。在所有图像上指定一个标准区域用于细胞计数三次，并注意避免对任何细胞计数两次。
实施例4.测量ODC和ADC活性
为了测定酶活性，将从3个生物重复的叶23中收集的500mg烟叶组织在1ml HEPES提取缓冲液(100mM HEPES、2mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM EDTA，pH 7.5)中研磨，并在研磨过程中加入100mg聚乙烯吡咯烷酮。离心(13,000g，10min，4℃)后，按照Capell等(1998)人的描述，使用同位素方法通过测量14CO2.L-[1-14C]Arg的释放来测量酶活性，并且L-[1-14C]Orn用作放射性底物。
实施例5.多胺提取和分析
为了进行多胺分析，从种植在温室中处于不同发育阶段的植物收获150μg的叶或根材料：开花前(叶6和12，从基部编号)、打顶时(叶19和23和根)和收获时(叶23和24和根)。光照4小时后，从三个生物学重复中收集样品，并在液氮中快速冷冻。对于田间生长的植物，从三个生物学重复的五片展开良好的上部叶中收集叶材料。将植物材料在1.6ml预冷的10％(v/v)高氯酸中研磨，并在4℃下孵育1h。将提取液涡旋10秒钟并离心(16,000g，15分钟，4℃)，然后将800μl上清液与100μl 1mM六亚甲基二胺混合。然后，将10μl澄清的上清液转移至新的2ml试管中，并用200μl环己烷萃取多胺，以使游离多胺丹磺酰化(dansilation)。为了提取缀合多胺，将沉淀重悬于1600μl 1M NaOH和200μl 1mM六亚甲基二胺中，并如上所述进行离心。将澄清的上清液(200μl)转移至含有12M HCl的2ml玻璃安瓿瓶中，混合并在110℃下孵育16小时过夜，以水解缀合多胺。如Flores和Galston(1982)所述，用丹磺酰氯进行游离和缀合多胺的丹磺酰化。
通过LC-MS/MS测量丹磺酰化的多胺。所有实验均在与HPLC Agilent 1200系统(Waldbronn,Germany)连接的3200QTRAPTM质谱仪(Sciex,Darmstadt,Germany)上进行。质谱仪配备有电喷雾电离源。样品在有相应的保护柱(流速为800μl/分钟)的反相SynergiFusion(孔径为
Figure GDA0002760190040000871
粒径为4μm，内径为50mm x 2.0mm(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany))上分离。将柱箱加热至30℃。为了洗脱，溶剂A包含94.9％(v/v)的水、5％(v/v)的乙腈、0.1％(v/v)的甲酸，并且溶剂B包含94.9％(v/v)的乙腈、5％(v/v)水、0.1％(v/v)甲酸。使用以下洗脱曲线进行洗脱：1分钟，以60％溶剂A/40％溶剂B保持；3分钟，线性增加至100％溶剂B，并以100％溶剂B保持3分钟；在0.1分钟内迅速线性减少至60％溶剂A/40％溶剂B；保持1分钟。总运行时间为8分钟，每次运行注入的样品量为10μl。
在Q1和Q3中将质谱仪设置为单位分辨率。所有测量均以多反应监测模式捕获。为了优化化合物，根据丹磺酰化方案制备标准品，将其以50:50(v/v)甲醇/水稀释，并用与离子源直接连接的注射器泵以10μl/min的流速注入。使用自动化合物优化功能对所有化合物的解簇电位、碰撞能量、碰撞池入口电位、碰撞池出口电位和入口电位进行优化(表3)。离子源参数设置为：毛细管电压＝5.5kV，加热器气体温度＝500℃，气帘气体＝30psi，雾化气体＝70psi，干燥气体＝70psi，碰撞气体＝介质。对于每种分析物，一个转化(transition)用于定量，另一个作为定性。使用Analyst v1.6(Sciex)处理获取的数据。根据制造商的说明，使用聚丙二醇标准品(具有低/高浓度PPG的Standards Chemical Kit，Sciex)进行3200QTRAP的质量校准。
Figure GDA0002760190040000891
实施例6.统计分析
通过应用方差单向分析(ANOVA)，然后使用Excel软件(Microsoft，Redmond，华盛顿，美国)进行事后Bonferroni检测来测定基因型之间的差异。使用两尾t检验。P值<0.05被认为具有统计学意义。
实施例7.叶成熟期四个品种之间的生化和形态学差异
过测量叶片中叶绿素a和b的损失来监测Burley 21NA、HI、LI和LA品系中的衰老进程。打顶后(WPT)1周，所有基因型的叶绿素水平均显著下降(p<0.01)(图1A)。但是，在2.5WPT(两种基因型均增加22％)和收获时(LI和LA叶分别高出36％和44％)，LI和LA植物叶片包含的叶绿素水平显著高于NA对照(p<0.001)，表明与NA对照相比叶绿素降解较慢。叶绿素的损失与NA植物叶片的形态变化有关，即，它们变皱、粗糙并带有黄色斑点，而LA叶片保持光滑、有光泽和绿色(图1B)。
考虑到LA和NA品系中不同的叶片形态，在不同时间点研究了叶肉细胞的大小和形状。开花前，与NA植物相比，LA植物的叶15(从基部编号)具有更小且更丰富的叶肉细胞(每单位叶面积更多细胞)(图1C/D)。从那个时间点直到收获，NA和LA品系中的叶肉细胞数/单位面积均以相似的速度下降，但在整个成熟过程中，LA植物保留显著更多的叶肉细胞数(p<0.05)。在叶片发育的早期阶段(开花前)，观察到最大差异的叶肉细胞数/单位面积(LA植物中的细胞比NA对照多54％)。LI植物也比NA植物含有更多的叶肉细胞，但是没有达到在LA植物中观察到的程度，并且HI和NA品系之间的叶肉细胞数没有显著差异(数据未显示)。
实施例8.LA植物比NA植物积累更高含量的多胺
为了研究nic1nic2双突变对多胺生物合成的影响，通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)比较了NA和LA植物中游离和缀合的腐胺、亚精胺和精胺的水平。首先，分析田间生长的植物叶16-18中的多胺含量。在1WPT，与NA植物相比，LA植物中的总多胺含量显著更高(1.9倍，p<0.001)(图2A)。组成分析表明，LA植物的叶中的游离腐胺(1.4倍，p<0.05)、缀合腐胺(2.3倍，p<0.005)和缀合亚精胺(1.9倍，p<0.005))水平显著较高，表明nic1nic2双突变强烈诱导了多胺的生物合成途径，或者底物无法进一步加工成烟碱导致这些物质的积累。与此相反，LA植物中的游离亚精胺水平低于NA植物，尽管差异没有统计学意义(p>0.05)。
为了使可变环境因素对多胺生物合成的影响最小化，在受控温室条件下进行了进一步的实验，该实验在温度、光和湿度方面模拟了平均田间条件(数据未显示)。收获时(打顶后30天)，温室中NA和LA植物的表型在植物高度、叶数和叶片形态方面与田间生长的相似(数据未显示)。通过设计实验将伤口对多胺生物合成的影响最小化，使得每株植物和每个时间点仅采集每个叶/根样品。时程监测相同发育阶段(即开花前的叶12、打顶时的叶19和收获时的叶24)的叶片中的总多胺含量，表明与NA对照相比，LA植物在开花前(1.5倍)和收获时(2.1倍)的多胺含量显著(p<0.05)更高(图2B)。与NA对照相比，LA植物在打顶时(2.4倍)和收获时(1.4倍)的根中也积累了显著(p<0.05)较高的总多胺水平(图2B)。
实施例9.nic1nic2双突变对于多胺生物合成的影响
在四个品种的选定叶片(开花前的叶6、打顶时的幼叶23和收获时的成熟叶23)中的多胺组成的比较分析显示，在开花前，与NA对照相比，LI和LA品系含有显著更高(p<0.05)的游离腐胺水平(分别高1.6倍和4.2倍)，以及甚至更高的缀合腐胺水平(分别高2.1倍和5倍)(图3A)。在所有四个变种的成熟过程中，缀合的腐胺和亚精胺级分均不断增加，但与NA对照相比，LI和LA植物中的比例仍然显著更高(图3A)。在收获时的LA叶片中观察到多胺含量的最大差异，与NA对照相比，总多胺水平增加了2.1倍，包括游离腐胺增加了1.8倍，缀合腐胺增加了2.9倍，缀合亚精胺增加了2.4倍。但是，NA和HI品种之间没有显著差异，表明nic2单突变对多胺积累的影响较小。
在打顶时，LA植物的根比NA植物含有显著(p<0.05)高于NA植物的游离腐胺、缀合腐胺和缀合亚精胺水平(分别增加2.6倍，2.9倍和2.5倍)，并且在收获时也观察到这种差异(分别增加1.6倍，1.4倍和2.5倍)(图3B)。
实施例10.LA植物中的多胺生物合成更活跃
通过在打顶和收获时测量NA和LA植物的叶(叶23)和根中每种酶的活性来评估ADC和ODC对腐胺生物合成的相对贡献。ADC和ODC活性在这两个品系中均以器官特异性和发育阶段特异性的方式变化(图4)。ADC活性在两个品系的叶中较高，但在根中最少，而ODC活性在幼叶和根中更高，这表明ODC主要负责根中的腐胺生物合成。在打顶和收获时，与NA对照相比，LA植物叶片中的ADC活性显著更高(1.4倍，p<0.05)(图4A)。同样，与NA对照相比，LA植物在打顶时(1.8倍)和收获时(1.7倍)的根中以及在打顶时的幼叶(1.5倍)中的ODC活性显著更高(p<0.05)(图4B)。
实施例11.抑制LA品种中的多胺生物合成
考虑到LA品种中较高的多胺水平与不良叶片形态之间的相关性，评估了用抑制ADC和ODC的化学物质处理植物的效果。初步实验确定了合适的抑制剂浓度、施用时间、处理强度和持续时间(数据未显示)。开花前和收获时，LA植物的游离和缀合的腐胺水平显著高于NA对照(图3)，因此在打顶前2.5周开始施用ADC抑制剂D-精氨酸和ODC抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)，并继续处理直至收获。此外，植物生长调节剂
Figure GDA0002760190040000921
单独或与DFMO组合使用，以通过释放乙烯来促进成熟。为了避免过早诱导衰老，从打顶到收获都施用
Figure GDA0002760190040000922
DFMO和DFMO/
Figure GDA0002760190040000931
处理部分改善了形态表型，使得LA植物的叶具有NA叶的某些特征(起皱和叶绿素降解)，而单独的
Figure GDA0002760190040000932
处理降低了叶绿素含量，但不影响叶片形态(图5)。开花前开始DFMO处理导致生长停滞，当从打顶开始处理时未观察到生长停滞(数据未显示)。D-精氨酸处理对LA植物的叶绿素水平或形态没有影响。
对多胺水平的分析显示，在打顶前2.5周的DFMO处理使LA叶中的总多胺水平增加了2.1倍，主要反映了缀合腐胺和缀合亚精胺的较高水平(图6A)。在用DFMO和DFMO/
Figure GDA0002760190040000933
处理的植物中，较高比例的缀合多胺一直保留到收获。相比之下，单独使用
Figure GDA0002760190040000934
Figure GDA0002760190040000935
处理导致收获时总多胺水平显著降低，主要反映了游离和缀合腐胺的降低。在根中，DFMO处理显著降低了(p<0.05)LA植物打顶时(1.5倍)和收获时(1.4倍)的总多胺含量，这主要归因于游离和缀合的腐胺和缀合亚精胺的减少(图6B)。添加
Figure GDA0002760190040000936
并不能抵消这种下降。与叶中的效果相反，单独施用
Figure GDA0002760190040000937
对根中的多胺含量没有影响。D-精氨酸处理对LA植物的多胺含量没有影响。因此，根中多胺的损失可能反映了ODC活性的抑制，ODC活性是负责根中腐胺生物合成的主要酶。
实施例12.通过基因工程改变多胺水平
制备改良烟草植物以抑制nic1 nic2突变体背景中的ODC活性。使用打顶响应性启动子(例如，SED ID NO：1-21)驱动ODC RNAi盒(例如，SEQ ID No：22)以抑制一个或多个ODC基因(例如，SED ID NO：23-34所示的编码序列或蛋白序列)。产生转基因植物并评估其叶表型，包括例如总叶多胺水平、总根多胺水平、总叶片叶绿素水平、叶肉细胞数/叶面积单位、叶表皮细胞大小和熟化叶等级。
还制备了改良烟草植物以调节nic1 nic2突变体Burley背景中MYB8基因的表达和活性。据报道，MYB8通过激活渐狭叶烟草中的三种羟基肉桂酸辅酶A:多胺转移酶来控制诱导型酚酰胺的水平。参见Onkokesung et al.,Plant Physiology 158(1)389-407(2012)。组成型启动子或打顶响应性启动子(例如，SED ID NO：1-21)用于驱动MYB8RNAi盒或MYB8cDNA序列，以分别实现抑制或过表达。产生转基因植物并评估其叶表型，包括例如总叶多胺水平、总根多胺水平、总叶片叶绿素水平、叶肉细胞数/叶面积单位、叶表皮细胞大小和熟化叶等级。
实施例13.育种群
低生物碱烟草杂交种、品种或品系可以制备为Burley型、深色型、明火烤制熟化型、马里兰型或东方型烟草，或可以基本上衍生自BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、`Perique`烟、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、或VA359、马里兰609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC，或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业化烟草品种。
Figure IDA0002760190050000011
Figure IDA0002760190050000021
Figure IDA0002760190050000031
Figure IDA0002760190050000041
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Claims (14)

1.来自烟草植物的熟化烟草材料，所述烟草植物包含nic1 nic2基因型并且进一步包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含可操作地连接至可转录DNA序列的打顶诱导型启动子，所述可转录DNA序列编码用于抑制选自下组的鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因序列的非编码RNA：SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28；并且其中所述诱导型启动子包含选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21的序列。
2.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物能够产生包含一种或多种多胺含量在20％之内的叶。
3.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物能够产生包含叶绿素含量在20％之内的叶。
4.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物能够产生包含叶肉细胞数/单位叶面积在20％之内的叶。
5.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物能够产生包含表皮细胞大小在20％之内的叶。
6.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的可比叶相比，所述烟草植物包含在20％之内的叶产量。
7.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中与所述对照烟草植物相比，所述烟草植物在叶或根中包含降低的总游离多胺含量。
8.权利要求1所述的熟化烟草材料，其中所述烟草植物能够产生与不包含所述重组核酸构建体的对照植物的叶具有相当的叶等级的叶。
9.包含权利要求1所述的熟化烟草材料的烟草制品。
10.权利要求9所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。
11.权利要求9所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：不通风过滤嘴香烟和通风过滤嘴香烟。
12.权利要求9所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：小雪茄和雪茄烟。
13.权利要求9所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：湿鼻烟和鼻用烟。
14.权利要求9所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自：散叶嚼烟和塞嚼烟。
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