CN113549704A - 一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用 - Google Patents
一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物技术领域，更具体而言，涉及一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用，所述的烟草属特异性分子标记编号为Ntsp027和Ntsp151，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。所述的应用为利用上述烟草属特异性分子标记对涉案制烟原料基因组DNA进行PCR扩增，检测是否存在特异性的PCR扩增产物核苷酸序列，据此，精确判断该涉案制烟原料中是否有烟草材料存在。本发明所述的一种烟草属特异性分子标记实现了烟与非烟的快速、有效鉴别检测，提高了涉案制烟原料鉴别检测工作的科学性、准确性和权威性，降低了司法风险，为烟草行业专卖工作中的打假缉私提供强有力的司法证据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，更具体而言，涉及一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用。
背景技术
烟草是茄科烟草属中含有特殊生物碱-烟碱(尼古丁)的草本经济作物，同时也是烟草工业的制烟原料(烟叶)基础。在国内随着中式卷烟的深入发展，制烟原料的基础性地位日益突显，其发展虽有专卖法的保驾护航，但在巨额利益的驱使下，大量涉及制烟原料的打假缉私案件(即，涉案原料中是否有烟草材料检出)仍层出不穷，此既制约着烟草行业的健康、持续发展，又对现行的涉案制烟原料鉴别检验 (前罚没烟检验)工作提出新挑战。
目前，在分子水平上对烟草资源(品种)鉴别检测的研究报道较多，如利用RFLP、RAPD、SSR、ISSR、DArT、SNP等标记或上述几种分子标记的组合对烟草资源(品种)开展遗传多样性分析、指纹图谱构建等研究工作。此外，在已知待测样品属于烟草材料条件下，利用SSR，SCAR和RAPD标记对初烤烟叶进行品种的快速鉴别研究也有少量报道(孙九喆，杨金初，苏东嬴，王二彬，王君婷，张顺峰，李萌，马林，基于SSR标记的初烤烟叶品种快速鉴别，烟草科技，2019，52 (3)：26-32；Jiuzhe Sun，Junting Wang，Dongying Su，Jinchu Yang，ErbinWang，Shixi Wu，Meng Li，Lin Ma，Discrimination of tobacco cultivars using SCARand RAPD markers，Czech Journal of Genetics and Plant Breeding，2020，56(4)：170-173)。然而，在分子水平上针对涉案制烟原料鉴别检测方面的研究在国外尚无报道。国内烟草行业针对涉案制烟原料的鉴别检验工作主要采用感观检验法和化学检验法，但该两种方法均存在较明显的缺陷：感观检验法主要依赖检验人员对涉案制烟原料的感观感受和检验经验，极易受到检验人员主观感受和经验影响，存在较高比例的误判可能性；化学检验法的主要原理是通过测定待测涉案制烟原料是否含有烟碱进而判定样品是否为烟草专卖品，但烟碱并非烟草所独有，许多非烟草(尤其是茄科)植物也可检出烟碱成分，因此，依据检测待测物中烟碱和N-亚硝胺含量的化学检验法进行鉴别检测涉案烟草制品存在较高的误判风险。随着基因组测序技术和生物信息学的发展及大量植物(尤其是茄科)基因组数据的获得，为利用烟草属特异的分子标记开展涉案制烟原料鉴定检验工作奠定了坚实的理论和技术基础。因此，研究开发一种能够快速简便的鉴别烟与非烟的方法，以提高涉案制烟原料鉴别检测工作的科学性、准确性和权威性非常必要。
发明内容
为此，本发明提供一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用，以解决目前烟草行业的打假缉私工作中对涉案制烟原料采用感观检验法和化学检验法存在的显著缺陷和不足的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的一个方面的目的在于，提供一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记，所述的烟草属特异性分子标记编号为Ntsp027和 Ntsp151，其PCR扩增产物核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述分子标记Ntsp027所对应的引物序列为：
Ntsp027F：5’-GTTGTTCGCTTCCCTGATGT-3’；
Ntsp027R：5’-AACCAAAGCAAGCGAAATGT-3’。
进一步地，所述分子标记Ntsp151所对应的引物序列为：
Ntsp151F：5’-ATTTGGCTTTGGCTATGGAA-3’；
Ntsp151R：5’-CGGAGACAAGAGACCCAAGT-3’。
本发明的另一个方面的目的在于，提供一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，包括以下步骤：
S1、提取待测样品基因组DNA；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，采用引物Ntsp027或引物 Ntsp151，进行PCR扩增反应；
S3、通过电泳检测步骤S2中PCR扩增结果：
利用引物Ntsp027对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有303bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
利用引物Ntsp151对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有300bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
若PCR扩增产物中不含有303bp和300bp的PCR扩增核苷酸片段，则表明待测样品为非烟草样品。
进一步地，步骤S1中所述DNA的提取采用CTAB法或植物组织 DNA提取试剂盒提取。
进一步地，步骤S2中所述PCR扩增反应中，引物Ntsp027或引物Ntsp151的退火温度均为60℃。
进一步地，所述步骤S3中所述303bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述300bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明具有如下优点：
本发明提供了一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用，在分子水平上对涉案制烟原料是否为烟草产品进行快速鉴别和检测；本发明提供的分子标记、引物及方法实现了烟与非烟的快速、有效鉴别检测，且方法简单易行、操作性强，为烟草行业打假缉私工作提供一种客观、高效、简易的分子水平检验技术，进而提升涉案制烟原料鉴别检测的科学性、准确性和权威性，降低了司法风险，为行业专卖打假打私提供强有力的司法证据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其他的实施附图。
本说明书所绘示的内容，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为实施例3中引物Ntsp027在108份参试材料中的PCR扩增结果。
图2为实施例3中引物Ntsp151在108份参试材料中的PCR扩增结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明公开了2对引物对以及鉴别检测涉案制烟原料中是否存在烟草材料的烟草属特异性分子标记。利用本发明公开的2对引物对，以涉案制烟原料基因组DNA为模板进行PCR，可以科学、高效、精确且快速鉴别检测出待测原料中是否含有烟草样品。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。
实施例1
实施例1提供一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记，所述的烟草属特异性分子标记编号为Ntsp027和Ntsp151，其PCR扩增产物核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
在本实施例中，所述分子标记Ntsp027所对应的引物序列为：
Ntsp027F：5’-GTTGTTCGCTTCCCTGATGT-3’，如SEQ ID No.3所示；
Ntsp027R：5’-AACCAAAGCAAGCGAAATGT-3’，如SEQ ID No.4 所示。
在本实施例中，所述分子标记Ntsp151所对应的引物序列为：
Ntsp151F：5’-ATTTGGCTTTGGCTATGGAA-3’，如SEQ ID No.5所示；
Ntsp151R：5’-CGGAGACAAGAGACCCAAGT-3’，如SEQ ID No.6 所示。
实施例2
实施例2提供一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒提取待测样品基因组DNA；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，采用引物Ntsp027或引物 Ntsp151，进行PCR扩增反应；引物Ntsp027或引物Ntsp151的退火温度均为60℃；
S3、通过电泳检测步骤S2中PCR扩增结果：
利用引物Ntsp027对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有303bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
利用引物Ntsp151对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有300bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
若PCR扩增产物中不含有303bp和300bp的PCR扩增核苷酸片段，则表明待测样品为非烟草样品。
其中，所述步骤S3中所述303bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述300bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
实施例3
在本实施例中，利用生物信息学并结合公共数据库中烟碱(尼古丁)代谢途径的相关基因序列数据、烟草基因组数据(包含未公开数据)和其他茄科基因组数据开发标记，经过对91份烟草材料和17份非烟草材料进行实验验证，获得能鉴别检测涉案制烟原料中是否含有烟草材料存在的烟草属特异性分子标记。
一、实验材料
参试的植物材料共计108份，其中，烟草材料91份(见表1)，非烟草材料17份(见表2)。91份烟草材料中，属于3个烟草亚属 11个组的野生烟草材料(种)83份，属于4种不同类型的栽培烟草材料8份；17份非烟草材料中，十字花科材料1份，豆科和山茶科材料各2份，禾本科材料4份，7个属的茄科材料8份。108份材料的选择是在充分考虑了植物材料中是否含有烟碱、涉案制烟原料中常用的主要植物材料及对已开发标记的烟草属特异性实验验证等因素下进行的。此外，为了符合涉案制烟原料的烘干状态，上述材料的 DNA提取、纯化分为两部分，即，将新鲜叶组织片分为两部分，一部分为不经过任何处理的新鲜叶片，另一部分经烘箱内高温杀青处理至类似初烤烟叶的烘干状态。具体的材料信息见表1和表2。
表1 91份烟草属材料详细信息
注：83份烟草野生种的编号是以PI编号进行统计的，即，存在同名不同PI编号的野生烟草种。
表2 17份非烟草属材料信息
本发明所公开的一组引物序列(Seq ID No.3-Seq ID No.6)及分子标记序列(SeqID No.1和Seq ID No.2)是通过以下技术方案获得的。首先，公共数据库中已知的与烟草烟碱合成、转运、转化及代谢等共计46个相关基因信息，开发了209对烟碱相关引物；其次，结合生物信息学将获得的引物与已知茄科植物基因组数据及烟草行业内未公开的烟草基因组数据(从头测序的基因组数据如：红花大金元、云烟87、Beinhart1000-1、云晒1号及黄花烟G366等；369份烟草核心资源的10-15X基因组重测序数据)进行比对，筛选获得同时满足在所有烟草基因组数据中能完全比对且结果唯一，而在除烟草外其余茄科植物基因组中不能比对的候选烟草属特异性引物；最后，利用108 份参试材料(烟草属材料：源于3个烟草亚属11个组的83个野生种和涉案样品中常用的4种类型8个栽培品种；含烟碱的茄科(除烟草属外)材料：辣椒属、茄属、番茄属、碧冬茄属、曼陀罗属、枸杞属和夜香树属等7个属的8种代表性材料；不含烟碱的植物材料：日常生活中常见(主栽)作物且涉案样品中常用的8属4科共计9份材料) 对候选烟草属特异性引物进行实验验证，最终获得2个具有烟草属特异性的标记。
二、烟草基因组DNA提取
提取待测样品基因组DNA，采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
三、PCR扩增及电泳检测
PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献；PCR扩增程序中，上述2对引物的退火温度均为60℃，具体的PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
四、烟草属特异性分子标记的实验验证与应用
利用上述2对引物分别扩增待检测的108份参试材料的基因组DNA，检测PCR扩增产物序列并根据产物序列的有无，精确鉴别待测的108份材料中是否有烟草样品存在。即，利用引物Ntsp027对108 份参试材料进行PCR扩增时，若出现大小为303bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；同理，利用引物Ntsp151对 108份参试材料进行PCR扩增，若出现大小为300bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；若无大小为303bp及大小为 303bp的PCR扩增核苷酸片段出现时，则为非烟草样品。详见图1和图2。其中，图1引物Ntsp027在108份参试材料中的PCR扩增结果。编号M001-M091为烟草属材料，其中M001-M083属于3个烟草亚属 11个组的野生烟草材料，M084-M091为4种不同类型的栽培烟草材料；编号M092-M108为非烟草属材料，其中M098-M105是7个属的茄科材料。最右边泳道为500bp DNA marker，从下往上分别为300bp 和400bp。图2引物Ntsp151在108份参试材料中的PCR扩增结果。编号M001-M091为烟草属材料，其中M001-M083属于3个烟草亚属 11个组的野生烟草材料，M084-M091为4种不同类型的栽培烟草材料；编号M092-M108为非烟草属材料，其中M098-M105是7个属的茄科材料。最右边泳道为300bp DNA marker。
本发明所述分子标记及引物的序列如下：
SEQ ID No.1
SEQ ID No.2
SEQ ID No.3
SEQ ID No.4
SEQ ID No.5
SEQ ID No.6
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 云南省烟草质量监督检测站、云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用
<130> 2021
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gttgttcgct tccctgatgt gttgaaaaac cggttggaat ctctgcaatc ggcttttgat 60
ctcgcggttc attcccaggg ctatggggcc cactaccaag gtgtttatcc cgtgaaatgc 120
aatcaagaca ggttcgtggt ggaagatatc gtgaaattcg ggtcgccatt ccggttcggg 180
ttggaagccg ggtctaaacc cgagctcctg ttagccatga gctgtctctg caagggcagt 240
gctgagggcc ttctcgtttg caatggtttc aaggacgctg agtacatttc gcttgctttg 300
gtt 303
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atttggcttt ggctatggaa tttatcacat ctatattcct ttttcttggc acattttctg 60
atgatgaagt ggatgaagaa gaggatggct cgggtgagcg cgtacgacta cgcctcgctg 120
ttactctagc cggcttaggc atgtttgagc caattaagtg gggaaaattg agccgagctc 180
tcgagccgcg gattttgaaa gcggcttgat cgtaagccaa cgctgcatcc tctgcggtct 240
cgtaagttcc taaccacagc cttgcacctt cacctttcct acttgggtct cttgtctccg 300
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gttgttcgct tccctgatgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aaccaaagca agcgaaatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atttggcttt ggctatggaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
cggagacaag agacccaagt 20
Claims (7)
1.一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记，其特征在于：所述的烟草属特异性分子标记编号为Ntsp027和Ntsp151，其PCR扩增产物核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记，其特征在于：所述分子标记Ntsp027所对应的引物序列为：
Ntsp027F：5’-GTTGTTCGCTTCCCTGATGT-3’；
Ntsp027R：5’-AACCAAAGCAAGCGAAATGT-3’。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记，其特征在于：所述分子标记Ntsp151所对应的引物序列为：
Ntsp151F：5’-ATTTGGCTTTGGCTATGGAA-3’；
Ntsp151R：5’-CGGAGACAAGAGACCCAAGT-3’。
4.一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品基因组DNA；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，采用引物Ntsp027或/和引物Ntsp151，进行PCR扩增反应；
S3、通过电泳检测步骤S2中PCR扩增结果：
利用引物Ntsp027对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有303bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
利用引物Ntsp151对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有300bp的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
若PCR扩增产物中不含有303bp和300bp的PCR扩增核苷酸片段，则表明待测样品为非烟草样品。
5.根据权利要求4所述的一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，其特征在于：步骤S1中所述DNA的提取采用CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒提取。
6.根据权利要求4所述的一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，其特征在于：步骤S2中所述PCR扩增反应中，引物Ntsp027或引物Ntsp151的退火温度均为60℃。
7.根据权利要求4所述的一种鉴别烟与非烟的烟草属特异性分子标记的应用，其特征在于：所述步骤S3中所述303bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述300bp的PCR扩增核苷酸片段为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
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