KR101166786B1 - 벼흰잎마름병원균의 ｋ3 또는 ｋ5 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼의 벼흰잎마름병의 병원균인 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 및 K5 레이스에 존재하는 특이 DNA 단편과 이의 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용하여 벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5 레이스를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머는 벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5레이스에 대해서만 증폭밴드를 형성할 수 있어, 종래의 방법들과 달리 신속, 정확하게 벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5 레이스를 특이적으로 판별할 수 있다.

Description

벼흰잎마름병원균의 Ｋ3 또는 Ｋ5 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별 방법 {Genetic Marker for K3 or K5 Race Typing of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae and Method of K3 or K5 Race Typing of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae using the same}
본 발명은 벼의 벼흰잎마름병의 병원균인 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 및 K5 레이스에 존재하는 특이 DNA 단편과 이의 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용하여 벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5 레이스를 판별하는 방법에 관한 것이다.
벼흰잎마름병은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로 주로 잎에 발생되며, 피해양상은 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질 저하를 가져온다. 벼흰잎마름병은 우리나라는 물론 아시아, 아프리카, 라틴아메리카, 호주 등 대부분의 벼 재배지역에서 발생되고 있으며, 특히 동남아시아 지역에서 피해가 매우 심한 병으로 알려져 있다.
벼흰잎마름병에 의한 피해는 그 병원균인 벼흰잎마름병원균의 종류에 따라서 차이를 보일 수 있다. 따라서, 벼흰잎마름병의 발생시 그 원인이 되는 병원균의 종류를 신속하게 판별하는 것이 이후의 방제 등의 대책 수립에 중요한 자료가 된다.
같은 식물병원균 내에서의 분화형 또는 변종 중에서 기준 품종에 대한 기생성이 다른 것을 레이스(race)라고 하며, 레이스를 판별할 때에는 그들을 구분하는 기준품종을 선정할 필요가 있는데 이를 판별품종(differential variety)이라고 한다.
현재, 우리나라에서는 일본판별품종을 우리나라 판별품종(밀양42호, 한강찰벼, 풍산벼, 청청벼, 밀양23호)으로 대체하여 레이스를 검정하고 있으며 그 결과 5개의 레이스 (K1, K2, K3, K4, K5)가 있음이 보고되었으며, 2005년 전국 레이스를 조사한 결과 K1(37%), K2(29%), K3(29%), K4(2%), K5(2%)로 나타났다.
하지만, 레이스의 판별은 병원균을 5개의 판별품종에 접종하여 나타나는 병징에 따라 감수성 또는 저항성으로 판정하여 구분하기 때문에 많은 시간과 노력이 소요되며 또한 형태적, 생리적, 생화학적인 특징이 나타나지 않기도 하여 발생 병원균의 신속한 판정이 어려운 실정이다.
따라서, 본 발명자들은 최근의 분자생물학적 기법의 발전에 의하여 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 이용하여 벼흰잎마름병원균의 레이스를 판별하고자 하였다.
일반적으로, 유전자 수준에서 생물종을 식별하는 방법으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 방법은 핵산지문법(DNA fingerprinting)이다. 이 방법은 다시, 제한효소단편장다형(RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법, 라이보좀 구성 핵산 염기서열의 차이를 이용한 방법, 특정 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법 등으로 구분된다.
PCR법은 10~20mer로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후, 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드젤(acrylamidegel)에 전기영동하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다.
현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 진단법은 인체나 동물의 세균성 질병을 진단하는데 이용되고 있는데, 식중독 관련 병원성 세균인 대장균, 콜레라균 등의 검출용 PCR 진단키트들이 개발되어 있다. 또한 외국의 경우는 식물 병원균에 대해서도 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 비롯한 다양한 병원균에 대한 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다.
또한, PCR 진단에 소요되는 시간은 다른 진단방법에 비해 매우 짧아 6시간 이내에 완료되고, 진단에 소요되는 비용 또한 저렴할 뿐 아니라 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이므로, 본 발명에서도 핵산지문법 중 PCR 공정을 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 레이스를 신속, 정확하게 판별하고자 하였다.
이에, 본 발명은 종래에 수행되었던 벼흰잎마름병원균의 레이스를 판별하는데 따른 고비용 및 저효율의 단점을 극복하고, 국내 우점으로 확인된 벼흰잎마름병원균 K3 및 K5 레이스를 특이적으로 판별하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 제1항의 유전자를 포함하는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 또는 K5 레이스 판별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2 의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)을 분리하여 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; PCR 증폭결과 벼흰잎마름병원균( Xanthomonas oryzae pv . oryzae ) K3 및 K5 레이스의 특이 유전자(서열번호 1)의 전부 또는 일부가 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5레이스의 판별방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스 판별용 PCR키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별을 신속하고 정확하게 수행하여 해당 레이스에 대한 저항성 품종의 재배를 유도하여 벼흰잎마름병원균의 재발생을 방지할 수 있다.
도 1은 80 균주의 벼흰잎마름병원균을 제작된 판별 특이 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행한 결과 사진이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다. 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 또는 K5 레이스 판별용 조성물에 포함되어 사용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 및 K5 레이스 이외에서는 검출되지 않기 때문에, 이는 K3 또는 K5 레이스의 판별을 위한 유전자 마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 국내 우점으로 확인된 벼흰잎마름병원균 K3 및 K5 레이스를 특이적으로 판별하기 위해 AFLP(amplified fragment length polymorphism)분석을 수행하고 벼흰잎마름병원균 K3 및 K5에 특이적인 증폭산물 클로닝, 염기서열분석을 수행하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 최종 1종의 상기 유전자 마커를 선정하였고, 이에 대한 특이적 프라이머를 개발하여 이를 이용한 PCR 분석을 통한 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스의 판별 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 또한 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열에 기초하여 제작할 수 있으며, PCR을 용이하게 실시하기 위하여 통상적인 최적의 프라이머의 제조방법에 따라 컴퓨터 프로그램(Primer Designer V. 1.01, Scientific and educational software(IBM사))을 이용하여 제작할 수 있다. 바람직하게는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 판별용 프라이머는 15 내지 25mer를 포함하고, 프라이머 내의 G, C 함량이 50% 이상인 것이 적당하다. 보다 구체적으로는 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)을 분리하여 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; PCR 증폭결과 벼흰잎마름병원균( Xanthomonas oryzae pv . oryzae ) K3 및 K5 레이스의 특이 유전자(서열번호 1)의 전부 또는 일부가 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스의 판별방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스 판별용 PCR키트를 제공한다.
본 발명의 PCR을 이용한 벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5 레이스 판별은 프라이머를 이용하여 이루어지며, PCR 조건은 통상의 조건이 바람직하고, 프라이머의 특성에 따라 적절히 조절하여 실시가능하다.
상기 프라이머 세트는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스에 대해서만 약 1000bp의 단일밴드를 형성(즉, 증폭)하며 다른 레이스에 대해서는 밴드를 전혀 형성하지 않는다. 이러한 증폭여부 확인은 6시간 정도면 충분히 할 수 있기 때문에, DNA 수준에서 신속, 정확히 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스를 판별할 수 있다. 이하의 실시예에서는 특정 크기의 특정 프라이머 세트(서열번호 2 및 서열번호 3)를 사용하였으나, 상기 유전자(서열번호 1)의 전부 또는 일부를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 어떤 크기와 서열의 프라이머 세트를 이용하더라도 역시 동일하게 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스를 판별할 수 있음은 당업자에게 당연한 것이다.
상기 '유전자(서열번호 1)의 전부 또는 일부를 증폭시킬 수 있다'는 것은 상기 서열 전체만을 증폭시키거나, 상기 서열 일부만을 증폭시키거나, 상기 서열 전체를 포함하여 주변부까지 증폭시키거나, 상기 서열 일부를 포함하여 주변부까지 증폭시킬 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 한편, 하기의 실시예에서 특별히 언급되지 아니한 분자생물학적 실험기법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989)을 참조하였다.
< 실시예 1> 벼흰잎마름병원균의 배양
수집된 다양한 레이스의 벼흰잎마름병원균을 영양 브로쓰(Nutrient broth) (0.3% 소고기 추출물(beef extract), 0.5 % 펩톤) 액체 배지에 접종하여 28℃ 인큐베이터에서 2일간 정치 배양하였다. PCR 분석에 사용된 균주는 표 1에 정리하였다.
번호 균주 레이스 번호 균주 레이스 번호 균주 레이스
1 KACC10331 (K1) 31 HB 03029 (K3) 61 HB 04022 (K3)
2 HB 01013 (K1) 32 HB 03034 (K3) 62 HB 04023 (K3)
3 HB 02010 (K1) 33 HB 03035 (K3) 63 HB 04024 (K3)
4 HB 02022 (K1) 34 HB 03042 (K3) 64 HB 04030 (K3)
5 HB 02027 (K1) 35 HB 03045 (K3) 65 HB 04031 (K3)
6 HB 02033 (K1) 36 HB 03046 (K3) 66 HB 04050 (K3)
7 HB 02045 (K1) 37 HB 03047 (K3) 67 HB 04052 (K3)
8 HB 03011 (K1) 38 HB 03050 (K3) 68 HB 0102 (K3a)
9 HB 03087 (K1) 39 HB 03054 (K3) 69 HB 0109 (K3a)
10 HB 04027 (K1) 40 HB 03055 (K3) 70 HB 03032 (K3a)
11 HB 04068 (K1) 41 HB 03058 (K3) 71 HB 04045 (K4)
12 HB 02030 (K2) 42 HB 03059 (K3) 72 HB 04034 (K5)
13 HB 03026 (K2) 43 HB 03060 (K3) 73 HB 04037 (K5)
14 HB 03028 (K2) 44 HB 03061 (K3) 74 HB 04039 (K5)
15 HB 04046 (K2) 45 HB 03067 (K3) 75 HB 04040 (K5)
16 HB 04059 (K2) 46 HB 03071 (K3) 76 HB 04044 (K5)
17 HB 01001 (K3) 47 HB 03072 (K3) 77 HB 04047 (K5)
18 HB 01002 (K3) 48 HB 03074 (K3) 78 HB 04054 (K5)
19 HB 01003 (K3) 49 HB 03076 (K3) 79 HB 04058 (K5)
20 HB 01005 (K3) 50 HB 03077 (K3) 80 HB 04071 (K5)
21 HB 02003 (K3) 51 HB 03079 (K3)
22 HB 02019 (K3) 52 HB 03084 (K3)
23 HB 02024 (K3) 53 HB 03086 (K3)
24 HB 02038 (K3) 54 HB 03091 (K3)
25 HB 02041 (K3) 55 HB 04000 (K3)
26 HB 03002 (K3) 56 HB 04002 (K3)
27 HB 03009 (K3) 57 HB 04007 (K3)
28 HB 03010 (K3) 58 HB 04009 (K3)
29 HB 03013 (K3) 59 HB 04012 (K3)
30 HB 03014 (K3) 60 HB 04015 (K3)
< 실시예 2> 벼흰잎마름병원균 검출 및 판별을 위한 특이적 프라이머 제작
벼흰잎마름병원균의 K3 또는 K5 레이스 판별을 위한 PCR 분석용 특이 프라이머 제작을 위해 AFLP (amplified fragment length polymorphism) 분석을 통하여 특이 증폭 단편을 클로닝 하였다. 이는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) K3 또는 K5 레이스 판별용 유전자 마커이며 이의 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
서열번호 1의 염기서열을 바탕으로 PCR을 위한 특이적 프라이머 1쌍을 제작하였고, 이의 서열은 다음과 같다.
XOOK3-5F : 5'-TGAACCACTGCTTCTGCTGG-3'(서열번호 2)
XOOK3-5R : 5'-AGTCACTGCGGGTTCCCGAA-3' (서열번호 3)
< 실시예 3> 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스 판별용 프라이머를 이용한 PCR
실시예 1에서 배양된 80 균주의 벼흰잎마름병원균과 실시예 2에서 제작된 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 판별용 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭반응은 MyCycler 써멀사이클러(thermalcycler) (BioRad, USA)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 프로-핫 스타트(Pro-Hot Start) PCR 마스터 믹스(Master Mix) (TNT research, Korea)에 10 pmole의 XOOK3-5F, XOOK3-5R 프라이머와 각각의 배양된 세포 1㎕를 첨가하여 총량이 20㎕가 되게 하여 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 15 초, 60℃ 15초, 72℃ 30초로 25회 반응하였다. 반응 후 PCR 증폭산물을 1.2% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV 상에서 확인하였다.
결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, K3 또는 K5 레이스 판별용 프라이머 세트를 사용하여 80 균주의 벼흰잎마름병원균에 대한 PCR 분석을 수행한 결과 벼흰잎마름병원균( Xanthomonas oryzae pv . oryzae ) K3 및 K5 레이스의 특이 유전자(서열번호 1)인 1,000bp의 증폭 산물은 벼흰잎마름병원균 중 K3 및 K5에서만 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
K1, K2, K3, K4, K5 : 국내 벼흰잎마름병원균의 레이스
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자.
  2. 제1항의 유전자를 포함하는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) K3 또는 K5 레이스 판별용 조성물.
  3. 서열번호 2 의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어진 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 판별용 프라이머 세트.
  4. 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)을 분리하여 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출된 DNA를 제 3 항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
    PCR 증폭결과 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) K3 및 K5 레이스의 특이 유전자(서열번호 1)의 전부 또는 일부가 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5레이스의 판별방법.
  5. 제 3 항에 의한 프라이머 세트를 포함하는 벼흰잎마름병원균 K3 또는 K5 레이스 판별용 PCR키트.
KR1020100111484A 2010-11-10 2010-11-10 벼흰잎마름병원균의 ｋ3 또는 ｋ5 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별 방법 KR101166786B1 (ko)

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