JP5546165B2 - 非ジャポニカ種ウナギ検出に利用可能なプライマーセット、非ジャポニカ種ウナギ混入の検査方法およびウナギ種同定方法 - Google Patents
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Description
フォワード側プライマー:atccttacaggactattcctagcc(Tm=61.5)
リバース側プライマー:gaatcctagtaggtctttgtaggagaagtat(Tm=63.1)
フォワード側プライマー:atccttacaggactattcctagcc(Tm=61.5)
リバース側プライマー:ggaagcacatatcctacgaatggt(Tm=66.0)
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リバース側プライマー:gggggggggggaatcctagtaggtctttgtacgagaagtat(Tm=69.7)
まず、常法により合成した本実施形態の第1のプライマーセットを用いて、A.anguilla種、およびA.australis australis種由来のDNAの増幅を行った。また、対照として、ジャポニカ種ウナギ(A. japonica)についても、第1のプライマーセットを用いた核酸増幅を試みた。
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第1のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 5.0μl
同時にDNA水溶液の代わりに滅菌水5.0μlを加えたネガティブコントロールを作成した。
実施例1と同様の手順で、ジャポニカ種ウナギ(100個体分)、A.anguillaおよびA.australis australisのDNAを抽出してDNA水溶液とした。また、抽出したDNAから一部を分離し、ジャポニカ種ウナギのDNA100質量部に対し、A.anguillaのDNAが1質量部(10μgに対し100ng)、0.1質量部(10μgに対し10ng)、および0.01質量部(100μgに対し10ng)で含まれるDNA水溶液を調製した。次に、これらDNA水溶液を常法により合成した第3のプライマーセット(20pmol)を用いたPCRに供し、得られたPCR産物を2%アガロースゲルで30分泳動した。
フォワード側:tgatgttaatcaccaacaacccgt(Tm=67.9)
リバース側:tctgtggcgatcagttcctctgagt(Tm=71.1)
核プライマーセット:20pmol
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第3のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
核DNAプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 個々に濃度調整
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第3のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
核DNAプライマーセット(5 pmol/μl) 2.0μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 個々に濃度調整
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第3のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
核DNAプライマーセット(5 pmol/μl) 1.0μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 個々に濃度調整
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第3のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
核DNAプライマーセット(5 pmol/μl) 0.5μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 個々に濃度調整
10×PCR Buffer 10.0μl
1×dNTP mix 8.0μl
第3のプライマーセット(5 pmol/μl) 4.0μl
核DNAプライマーセット(1 pmol/μl) 1.0μl
dH2O 72.5μl
Taq ポリメラーゼ 0.3μl
DNA水溶液 個々に濃度調整
実施例1と同様の手順で、ジャポニカ種ウナギ(100個体分)、A.anguillaのDNAを抽出してDNA水溶液とした。また、実施例2と同様に、抽出したDNAから一部を分離し、ジャポニカ種ウナギのDNA100質量部に対し、A.anguillaのDNAが10質量部(10μgに対し1μg)および1質量部(10μgに対し100ng)で含まれるDNA水溶液を調製した。次に、これらDNA水溶液を第2のプライマーセット(20pmol)を用いて実施例1と同じ条件でPCRに供し、得られたPCR産物を2%アガロースゲルで30分泳動した。
A. marmorata、A. obscura、A. celebensis、A. interioris、A. bicolorpacifica、A. reinhardtii、A. rostrata、A. bengalensislabiata、A. nebulosaneb、A. megastoma、A. mossambica、A. bicolorbic、A. malgumora、A. Anguilla、およびA. australis australisについて実施例1に記載したのと同じ方法でDNAを抽出し、第1のプライマーセットを用いてPCRに供した。
A.anguillaおよびA.australis australisについて、実施例1と同様の手順でDNA水溶液を調製した。
Claims (8)
- 非ジャポニカ種ウナギのシトクロムb遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号1に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるフォワード側プライマーと、
配列番号2に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。 - 非ジャポニカ種ウナギのシトクロムb遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号1に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるフォワード側プライマーと、
配列番号3に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。 - 非ジャポニカ種ウナギのシトクロムb遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号1に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるフォワード側プライマーと、
配列番号4に示される塩基配列(ただし、TはUであってもよい)からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。 - ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギとを含んでなる集団から非ジャポニカ種ウナギの存在を検出する検査方法であって、
前記集団における前記非ジャポニカ種ウナギから抽出した前記非ジャポニカ種ウナギのDNAを、請求項1から3のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅して検出することを特徴とする検査方法。 - 前記集団は、所定数のウナギの頭部により構成されていることを特徴とする請求項4に記載の検査方法。
- 請求項1から3のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅された非ジャポニカ種ウナギのDNAを調べることにより、前記非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。
- 請求項1または3に記載のプライマーセットを用いて増幅された前記非ジャポニカ種ウナギのDNAを、制限酵素HinfIおよび/または制限酵素RsaIで消化し、
消化により得られる制限断片長の比較に基づいて非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする請求項6に記載の非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。 - 請求項1に記載のプライマーセットを用いて増幅された前記非ジャポニカ種ウナギのDNAを、制限酵素HinfIおよび/または制限酵素RsaIで消化し、
消化により得られる制限断片長の比較に基づいて非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする請求項6に記載の非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。
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