KR20230033245A - 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 분자마커 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별을 위한 고효율 대량분석 분자마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 분자마커는 표적 부위인 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 특이 분자마커 세트를 활용하여 대조군, 결여 품종/개체 및 이형접합자 품종/개체의 유전자형 분류가 가능한 바, 식물체 소실 없이 초기 생육단계에서의 빠른 선발 및 대량 판별이 가능하여 계통 선별이 용이하고 육종 연한 단축에 기여도가 높은 바, 품종 개발시 효율성을 높일 수 있다.
본 발명의 분자마커는 표적 부위인 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 특이 분자마커 세트를 활용하여 대조군, 결여 품종/개체 및 이형접합자 품종/개체의 유전자형 분류가 가능한 바, 식물체 소실 없이 초기 생육단계에서의 빠른 선발 및 대량 판별이 가능하여 계통 선별이 용이하고 육종 연한 단축에 기여도가 높은 바, 품종 개발시 효율성을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별을 위한 고효율 대량분석 분자마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
단백질 등 풍부한 영양성분을 포함하고 있는 두유는 소비자에게 친숙하고 기호도가 높은 콩 가공식품 중 하나이다. 두유 제조 과정에서 생콩이 가지고 있는 비린내, 알러지 유발, 소화의 어려움 등과 같은 식미저해인자를 제거하기 위해 열처리를 수행하게 되나, 열처리 시 유용한 영양성분도 동시에 변형 및 소실되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 문제점을 개선하고자 육종적 방법으로 식미저해인자 중 하나인 비린내를 제거한 콩 품종을 개발하는 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 현재까지 개발된 비린내를 제거한 콩 품종에 대한 분자마커 세트 및 유전형 분류 방법은 계통 선발 유효성이 낮고 판별 속도가 느려 대량 판별에 적용하기에 어려움이 있어 왔다. 이에, 효율적인 콩 품종 연구개발을 위해 새로운 분자마커 세트 및 유전형 판별 방법의 개발이 요구되어 왔다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 비린내를 제거한 콩 품종에 대한 계통 선발 유효성이 높고 신속 대량 판별이 가능한 분자마커 세트를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 콩의 비린내 제거 판별 집단의 게놈 DNA를 이용하는 방법으로 식물체 소실 없이 초기 생육단계에서 빠르게 선발하고 대량 판별이 가능한 SNP 분자마커 세트 및 이를 이용한 유전자형 판별 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드; 중 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "콩 식미저해인자"는 콩 또는 이를 가공하여 만든 식품의 기호도를 감소시키는 인자를 의미하며, 일예로 비린내, 알러지 유발 및 소화의 어려움 등이 있다. 본 발명에 있어서, 상기 콩 식미저해인자는 콩 비린내 제거에 관여하는 유전자 또는 유전형을 의미한다.
상기 콩 비린내 제거에 관여하는 유전자는 리폭시게나아제(Lipoxygenase)를 코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 리폭시게나아제를 코딩하는 유전자는 콩 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자일 수 있다.
콩을 가공하여 만드는 식품, 예컨대, 두유 등의 제조 과정에서는 생콩이 가지고 있는 비린내, 알러지 유발, 소화의 어려움 등과 같은 식미저해인자를 제거하기 위해 열처리를 수행하게 되나, 열처리 시 유용한 영양성분도 동시에 변형 및 소실되는 문제가 발생하는 바, 이러한 문제점을 개선하기 위해 육종적 방법으로 식미저해인자 중 하나인 비린내를 제거한 콩 품종을 개발하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 비린내를 제거한 콩 품종에 대한 분자마커 세트 및 유전형 분류 방법은 계통 선발 유효성이 낮고 판별 속도가 느려 대량 판별에 적용하기 어려운 실정이다.
이에, 본 발명은 계통 선발 유효성이 높고 판별 속도가 향상되어 비린내를 제거한 콩 품종 또는 계통 선별이 용이한 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 특이 분자마커, 즉 프라이머 세트를 최초로 발굴한 것에 의의가 있다.
본 발명에서 용어, "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 3의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 3쌍의 프라이머 세트로 구성될 수 있다.
일예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트;로 구성될 수 있다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트는 TaqMan 기반 프라이머 세트일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 기반 프라이머 세트일 수 있다.
한편, 전술한 프라이머 세트와 동일한 영역을 증폭할 수 있고 동일한 기능을 하는 프라이머라면, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 구성되는 3쌍의 프라이머 세트 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 콩 비린내 제거 유전형인 lx1, lx2 및/또는 lx3을 포함하는 계통 또는 품종의 판별을 위한 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 유전자의 염기서열 증폭을 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 콩 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및 Lx3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있으며, 보다 구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트는 Lx1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트는 Lx2, 또는 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트는 Lx3 유전자를 각각 검출 또는 증폭시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 분자마커"는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 치환되거나, 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 마커는 야생형 또는 대조군과 판별 대상의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 야생형 또는 대조군의 유전체에서 치환, 삽입 또는 결실된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머 형태로 제작될 수 있다.
상기 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
상기 용어, "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.
상기 용어, "대조군"은 본 발명의 품종 판별에 있어 기준이 되는 작물의 품종 또는 개체를 의미한다.
본 발명의 프라이머 세트는 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 유전자를 보유하지 않는, 즉, 콩 비린내 제거 유전형으로서 lx1, lx2 및/또는 lx3 유전형을 나타내는 계통 또는 품종을 판별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 Williams82(Lx1Lx2Lx3, 대조군) 및 미소(lx1lx2lx3), 진양(lx1lx2lx3), 단미2호(lx1lx2), 진품콩(lx2lx3) 및 진품콩2호(lx1lx2lx3) 등 비린내 관련 콩 5 품종과 함께 비린내 정보가 없는 국내외 콩 26 품종을 대상으로 Lx1, Lx2, Lx3의 유전형을 분석한 결과, 콩 27품종 중 Nattosoryu, 일품검정콩, Kosuzu에서 Lx1 결여(lx1)를 새롭게 확인하여(표 4 내지 표 7 참고) 비린내 결여 품종일 가능성을 제시하였다. 또한, Williams82(Lx1Lx2Lx3, 대조군) 및 비린내 관련 콩 5 품종에서는 Lipoxygenase가 발현되지 않거나 대조군 대비 발현양이 극히 적어 콩 비린내가 나지 않음을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 미소(lx1lx2lx3)/PI200485(Lx1Lx2Lx3) F2 분리세대의 24개체(표 8 내지 표 9 참고)를 대상으로 유전자형을 분석한 결과, 24개체 중 대조군 타입 Lx1Lx2 8개체, 결여 품종 타입 lx1lx2 9개체, 이형접합자 7개체가 확인되고(표 8 내지 표 9, 도 4), 대조군 타입 Lx3 8개체, 결여 품종 타입 lx3 6개체, 이형접합자 10개체가 확인되어(도 5), 해당 개체에서 콩 비린내 제거 유전형이 발현되지 않거나 대조군 대비 발현량이 극히 적어 콩 비린내가 나지 않음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 프라이머 세트는 판별 대상 콩 품종 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및 Lx3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 검출 또는 증폭시켜 판별 대상 품종이 콩 비린내 유발 유전형인 Lx1, Lx2 및 Lx3와 콩 비린내 제거 유전형인 lx1, lx2 및 lx3을 나타내는지를 알 수 있으며, 그 결과 해당 품종에서 콩 비린내 유발 유전형이 발현되지 않거나 대조군 대비 발현량이 극히 적은 경우, 콩 비린내 제거 유전형을 나타내어 콩 비린내가 나지 않는 품종인 것으로 판별할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별 방법을 제공한다.
상기 방법은 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 프라이머 세트 또는 본 발명의 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머 세트 또는 본 발명의 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 조성물은 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 콩 식물 개체 또는 종자로부터 분리된 시료를 이용하여 게놈 DNA를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로, 종자, 분리된 조직 또는 분리된 세포일 수 있다.
상기 (a) 단계는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
또한, 상기 (a) 단계의 PCR 수행 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 주형으로 사용되는 DNA는 각각의 개별 콩 식물 또는 종자로부터 분리된 DNA일 수 있고, 2 이상의 콩 식물 또는 종자를 포함하는 혼합 물질로부터 분리된 DNA일 수도 있다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 것일 수 있다.
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, (a) 단계에 의하여 증폭된 DNA 마커의 서열을 결정하여, 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 방법으로서 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 랩 온어 칩(lab-on-a-chip) 전기영동을 수행할 수 있다. 또한, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광물질 등으로 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 이때, 사용되는 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NEDTM, Cy-5 또는 Cy-3 등을 사용할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 이에 제한되는 것은 아니나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하여 콩 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 염기서열을 증폭하여 확인함으로써, 콩 비린내 제거 유전형인 lx1, lx2 및/또는 lx3을 포함하는 계통 또는 품종을 판별 또는 구별하는데 사용될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, PCR 키트는, 이전 양태에서 전술한 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분자마커는 표적 부위인 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 특이 분자마커 세트를 활용하여 대조군, 결여 품종/개체 및 이형접합자 품종/개체의 유전자형 분류가 가능한 바, 물체 소실 없이 초기 생육단계에서의 빠른 선발 및 대량 판별이 가능하여 계통 선별이 용이하고 육종 연한 단축에 기여도가 높은 바, 품종 개발시 효율성을 높일 수 있다.
도 1은 콩 품종별 Lx1 및 Lx2 분자마커를 이용한 대립 유전자 변별 플롯을 나타낸 도이다.
도 2는 콩 품종별 Lx3 분자마커를 이용한 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 콩 품종별 SDS-PAGE를 이용한 리폭시게나아제 발현양에 따른 결여 여부를 확인한 결과이다. Lx1, Lx2, Lx3의 단백질 예상 크기는 각각 94.4, 97.1, 96.8 kDa으로 화살표로 표시되었으며, 각 품종의 리폭시게나아제 유전자형 분석 결과와 일치하는 결과를 나타내었다.
도 4는 F2 분리 계통의 Lx1 및 Lx2 분자마커를 이용한 대립 유전자 변별 플롯을 나타낸 도이다.
도 5는 F2 분리 계통별 Lx3 분자마커를 이용한 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 콩 품종별 Lx3 분자마커를 이용한 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 콩 품종별 SDS-PAGE를 이용한 리폭시게나아제 발현양에 따른 결여 여부를 확인한 결과이다. Lx1, Lx2, Lx3의 단백질 예상 크기는 각각 94.4, 97.1, 96.8 kDa으로 화살표로 표시되었으며, 각 품종의 리폭시게나아제 유전자형 분석 결과와 일치하는 결과를 나타내었다.
도 4는 F2 분리 계통의 Lx1 및 Lx2 분자마커를 이용한 대립 유전자 변별 플롯을 나타낸 도이다.
도 5는 F2 분리 계통별 Lx3 분자마커를 이용한 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 분자마커 개발
콩의 비린내와 관련된 Lx1, Lx2 및 Lx3 유전자 서열을 기반으로 분자마커를 선별하였다.
구체적으로, 비린내 결여 품종인 미소의 전장유전체 분석을 통하여 대조군 Williams82 대비 Lx1, Lx2 또는 Lx3 유전자 염기서열 변이를 확인하였다. 그 중, 유전자 기능에 중요한 영향을 미치는 exon 위의 변이만을 타겟으로 하여 각 분자마커를 제작하였다.
Lx1은 Gm13G347600 유전자 게놈 염기서열 중 567번째 (Williams82 품종 기준 5'UTR 서열 포함) C가 미소 품종에서 A로 치환된 2번째 exon 부위를 타겟으로 하였고, Lx2는 Gm13G347500 유전자 게놈 염기서열 중 2938번째 T가 미소 품종에서 A로 치환된 8번째 exon 부위를 타겟으로 하였다. 형광표지(allele1은 VIC dye, allele2는 FAM dye)가 포함된 Lx1과 Lx2 형광표지 SNP 마커는 ThermoFisher사의 Taqman SNP genotyping assay를 통하여 주문제작하였다.
Lx3는 Gm15G026300 유전자 게놈 염기서열 중 149~153번째 T가 미소 품종에서 1bp 결실된 1번째 exon 부위를 타겟으로 하여, EciI 제한효소를 활용한 dCAPS 분자마커를 제작하였다. 설계한 분자마커를 이용한 PCR 산물을 EciI 제한효소 처리를 하면 대조군은 PCR 산물의 절편이 생성되나 미소 품종은 생성되지 않으므로 Lx3 결여 품종(lx3)을 판별할 수 있다. 구체적으로는 아래와 같다.
실시예 1-1.
Lx
1 및
Lx
2 형광표지 SNP 분자마커 선별 결과
선별된 Lx1 및 Lx2 형광표지 SNP 분자마커는 하기 표 1과 같다.
|
유전자
이름 |
마커
타입 |
표적부위 (대조군/결여 품종) |
Forward primer
(5’-3’) |
Reverse primer
(5’-3’) |
Reporter 1
(VIC) |
Reporter 2
(FAM) |
| Lx1 | 형광표지 SNP | 2nd Exon (C/A) |
ACTTACTCGGTACGTACGTAACATAGTAT(서열번호 1) | CCTTCCAAGAACGTATCCTTTCCAA(서열번호 2) | TTTTCCTTTTCCATGTGCTAC(서열번호 7) | TTTCCTTTTCCATTTGCTAC(서열번호 8) |
| Lx2 | 형광표지 SNP | 8th Exon(T/A) | ACAATTCAATTCAATCTCCATCTATGATGTATGT(서열번호 3) | GTCGGTTTGTTGCTATGATGAATGG(서열번호 4) | CAATCACCGCATGAGTAT(서열번호 9) | CAATCACCGCTTGAGTAT(서열번호 10) |
실시예 1-2.
Lx
3 dCAPS-EciI 마커 선별 결과
선별된 Lx3 dCAPS-EciI 마커는 하기 표 2와 같다.
|
유전자
이름 |
마커
타입 |
표적부위 (대조군/결여 품종) |
Forward primer
(5’-3’) |
Reverse primer
(5’-3’) |
산물 크기(bp) | |
| 대조군 | 결여 품종 | |||||
| Lx3 | dCAPS (EciI) | 1st Exon (G/*) |
GACGTGAATAGCGTAACCAGCGTTGGCG(서열번호 5) | CATCAGCTTTGGTAGCACTA(서열번호 6) | 40/96 (Cutted) | 135 (Uncutted) |
실시예 1-3.
Lx
1,
Lx
2 및
Lx
3 분자마커 분석 유전형 분류
상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 선별된 각 분자마커의 표적 부위를 유전형으로 나타낸 결과, 하기 표 3과 같이 Lx1는 야생형(Lx1)에서 CC형, 이형접합자(Heterozygous) 품종에서 CA형, Lx1 결여 품종(lx1)에서 AA형이고, Lx2는 야생형(Lx2)에서 TT형, 이형접합자 품종에서 TA형, Lx2 결여 품종(lx2)에서 AA형이고, Lx3는 야생형(Lx3)에서 GG형, 이형접합자 품종에서 GD형, Lx3 결여 품종(lx3)에서 DD형임을 확인하였다.
| 유전자 이름 | 유전자 내 표적부위 | 염기서열 변이 (대조군/결여 품종) |
Wild-type
(W) |
Heterozygous
(H) |
Mutant
(M) |
| Lx1 | 2nd Exon | C/A | CC | CA | AA |
| Lx2 | 8th Exon | T/A | TT | TA | AA |
| Lx3 | 1st Exon | G/**, 1bp deletion | GG | GD | DD |
실시예 2. 분자마커를 이용한 국내외 콩 품종 대상 비린내 제거 유전자형 분석
실시예 2-1.
Lx
1 및
Lx
2 형광표지 SNP 분자마커를 이용한 유전자형 분석
Williams82(Lx1Lx2Lx3, 대조군) 및 미소(lx1lx2lx3), 진양(lx1lx2lx3), 단미2호(lx1lx2), 진품콩(lx2lx3) 및 진품콩2호(lx1lx2lx3) 등 비린내 관련 콩 5 품종과 함께 비린내 정보가 없는 국내외 콩 26 품종(총 32품종, 표 4 내지 표 5 참고)을 대상으로 각 개체의 게놈 DNA(gDNA)를 각각 추출하여 상기 실시예 1-1에서 선별된 Lx1 및 Lx2 형광표지 SNP 분자마커를 이용 real-time PCR 기기에서 TaqMan SNP 유전자형 분석을 수행하였다.
구체적으로, gDNA 10 ng, 1Х TaqMan Universal Master Mix II, 1Х marker(총 부피 10 ㎕ reaction/1 well)을 혼합하고, PCR을 다음 조건으로 수행하였다: 60℃, 30sec; 95℃, 10min; 95℃, 15sec; 60℃, 1min; 60℃, 30sec; 40cycle.
상기 분석 결과를 대립 유전자 변별 플롯으로 나타낸 결과는 도 1에 나타내었으며, 품종별 유전자형 분석 결과는 하기 표 4 내지 표 5에 나타내었다.
하기 표 4 내지 표 5와 같이, 콩 32품종 중 미소, 진양, 단미2호, 진품콩 및 진품콩2호(4품종)에서 Lx1Lx2 결여(lx1lx2), Nattosoryu, 일품검정콩 및 Kosuzu(3 품종)에서 Lx1 결여(lx1)를 확인하였다.
| # | 품종명 | Lx 1 | Lx 2 | ||||||
| Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | ||
| 1 | Williams82 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.508 | 0.115 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.288 | 0.428 |
| 2 | 미소 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.246 | 4.582 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.236 | 4.069 |
| 3 | 진양 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.244 | 4.426 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.259 | 3.938 |
| 4 | 단미2호 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.253 | 4.410 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.199 | 3.859 |
| 5 | 진품콩 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.254 | 4.624 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.262 | 4.060 |
| 6 | 진품콩2호 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.258 | 4.476 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.258 | 3.890 |
| 7 | 대원콩 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.631 | 0.086 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.448 | 0.108 |
| 8 | PI196168 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.722 | 0.050 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.479 | 0.226 |
| 9 | PI200485 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.655 | 0.124 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.193 | 0.222 |
| 10 | PI567476 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.636 | 0.137 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.474 | 0.317 |
| 11 | PI408105A | Homozygous C/C | 98.384 | 2.647 | 0.172 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.439 | 0.304 |
| 12 | 선풍 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.511 | 0.153 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.685 | 0.216 |
| 13 | Heihe43 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.547 | 0.123 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.509 | 0.282 |
| 14 | 풍산나물 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.555 | 0.119 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.543 | 0.290 |
| 15 | Nattosoryu | Homozygous A/A | 98.384 | 0.257 | 4.551 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.825 | 0.271 |
| 16 | 소원콩 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.582 | 0.150 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.721 | 0.141 |
| # | 품종명 | Lx 1 | Lx 2 | ||||||
| Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | ||
| 17 | 황금콩 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.551 | 0.174 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.645 | 0.399 |
| 18 | 태광콩 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.562 | 0.128 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.484 | 0.218 |
| 19 | 대풍 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.577 | 0.138 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.687 | 0.270 |
| 20 | 광교 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.554 | 0.128 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.533 | 0.296 |
| 21 | 일품검정 | Homozygous A/A | 98.384 | 0.260 | 4.538 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.615 | 0.333 |
| 22 | PI96983 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.502 | 0.145 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.462 | 0.258 |
| 23 | V94-5152 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.444 | 0.135 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.506 | 0.290 |
| 24 | Kosuzu | Homozygous A/A | 98.384 | 0.220 | 4.545 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.534 | 0.335 |
| 25 | Marshall | Homozygous C/C | 98.384 | 2.568 | 0.151 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.552 | 0.109 |
| 26 | Haman | Homozygous C/C | 98.384 | 2.602 | 0.120 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.553 | 0.159 |
| 27 | York | Homozygous C/C | 98.384 | 2.594 | 0.126 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.555 | -0.044 |
| 28 | L29 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.457 | 0.144 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.426 | 0.128 |
| 29 | SS2-2 | Homozygous C/C | 98.384 | 2.553 | 0.025 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.438 | 0.035 |
| 30 | Arksoy | Homozygous C/C | 98.384 | 2.562 | 0.051 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.281 | 0.160 |
| 31 | Ogden | Homozygous C/C | 98.384 | 2.528 | 0.073 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.445 | 0.194 |
| 32 | Columbus | Homozygous C/C | 98.384 | 2.521 | 0.071 | Homozygous T/T | 98.384 | 2.274 | 0.170 |
실시예 2-2.
Lx
3 dCAPS 분자마커를 이용한 유전자형 분석
상기 실시예 2-1의 콩 32품종을 대상으로 각 개체의 gDNA를 각각 추출한 후, 상기 실시예 1-2에서 선별된 Lx3 dCAPS 분자마커를 이용한 PCR을 통해 유전자형 분석을 수행하였다.
구체적으로, PCR을 다음 조건으로 수행하였다: 94℃, 2min; 95℃, 30sec; 55℃, 30sec; 72℃, 20sec; 72℃, 5min; 35cycle. 수득한 각 PCR 산물 5 ㎕에 EciI 제한효소를 처리하기 위해 1Х buffer; EciI 0.5 units를 첨가하고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 2와 같이 콩 32품종 중 미소(lane 2), 진양(lane 3), 진품콩(lane 5) 및 진품콩2호(lane 6) (4품종)에서 Lx3 결여(lx3)를 확인하였다.
실시예 2-3. 비린내 관련 유전자형 분류
상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2에서 분석된 콩의 비린내와 관련된 유전자형 분류 결과를 하기 표 6 내지 표 7에 나타내었다.
구체적으로는 다음과 같다.
- CCTTGG형 (Lx1Lx2Lx3): Williams82, 대원콩, PI196168, PI200485, PI567476, PI408105A, 선풍, Heihe43, 풍산나물, 소원콩, 황금콩, 태광콩, 대풍, 광교, PI96983, V94-5152, Marshall, Haman, York, L29, SS2-2, Arksoy, Ogden, Columbus (총 24품종)
- AATTGG형 (lx1Lx2Lx3): Nattosoryu, 일품검정, Kosuzu (3품종)
- AAAAGG형 (lx1lx2Lx3): 단미2호 (1품종)
- AAAADD형 (lx1lx2lx3): 미소, 진양, 진품콩, 진품콩2호 (4품종)
| # | 품종명 | Lx 1 | Lx 2 | Lx 3 | 유전형 분류 | Lipoxygenase genotype |
| 1 | Williams82 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 2 | 미소 | M | M | M | AAAADD | lx1lx2lx3 |
| 3 | 진양 | M | M | M | AAAADD | lx1lx2lx3 |
| 4 | 단미2호 | M | M | W | AAAAGG | lx1lx2Lx3 |
| 5 | 진품콩 | M | M | M | AAAADD | lx1lx2lx3 |
| 6 | 진품콩2호 | M | M | M | AAAADD | lx1lx2lx3 |
| 7 | 대원콩 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 8 | PI196168 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 9 | PI200485 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 10 | PI567476 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 11 | PI408105A | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 12 | 선풍 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 13 | Heihe43 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 14 | 풍산나물 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 15 | Nattosoryu | M | W | W | AATTGG | lx1Lx2Lx3 |
| 16 | 소원콩 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
W(Wild-type), 대조군 / M(Mutant), 결여 품종 / H, Heterozygous
| # | 품종명 | Lx 1 | Lx 2 | Lx 3 | 유전형 분류 | Lipoxygenase genotype |
| 17 | 황금콩 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 18 | 태광콩 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 19 | 대풍 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 20 | 광교 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 21 | 일품검정 | M | W | W | AATTGG | lx1Lx2Lx3 |
| 22 | PI96983 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 23 | V94-5152 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 24 | Kosuzu | M | W | W | AATTGG | lx1Lx2Lx3 |
| 25 | Marshall | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 26 | Haman | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 27 | York | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 28 | L29 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 29 | SS2-2 | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 30 | Arksoy | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 31 | Ogden | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
| 32 | Columbus | W | W | W | CCTTGG | Lx1Lx2Lx3 |
W(Wild-type), 대조군 / M(Mutant), 결여 품종 / H, Heterozygous
실시예 3. 리폭시게나아제(lipoxygenase) 발현 분석
Williams82(대조군), 미소(lx1lx2lx3), 진품콩(lx2lx3), 진양(lx1lx2lx3), 단미2호(lx1lx2) 및 진품콩2호(lx1lx2lx3) 등 콩 6품종의 각 종자로부터 단백질을 추출한 후, 7% 아크릴아마이드 겔에서 SDS-PAGE(전기영동 조건: 80V 30분, 100V 90분)를 수행하고 쿠마씨 브릴리언트 블루 용액으로 겔을 염색하여 Lx1, Lx2 및 Lx3로부터 발현되는 단백질인 리폭시게나아제의 발현양을 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같이, Lx1, Lx2 및 Lx3의 단백질 예상 크기인 94.4, 97.1 및 96.8 kDa(화살표 표시) 위치에서 대조군인 Williams82에 비해 미소, 진품콩, 진양, 단미2호 및 진품콩2호의 리폭시게나아제 발현이 현저히 감소하였다.
실시예 4. F
2
분리세대에서 분자마커를 이용한 콩 비린내 제거 유전자형 분석
실시예 4-1. F
2
분리세대에서
Lx
1 및
Lx
2 형광표지 SNP 분자마커를 이용한 유전자형 분석
미소(lx1lx2lx3)/PI200485(Lx1Lx2Lx3) F2 분리세대 24개체(표 8 내지 표 9 참고)를 대상으로 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 각 개체의 gDNA를 각각 추출하여 상기 실시예 1-1에서 선별된 Lx1 및 Lx2 형광표지 SNP 분자마커를 이용한 real-time PCR 기기를 사용하여 TaqMan SNP 유전자형 분석을 수행하였다.
상기 분석 결과를 대립 유전자 변별 플롯으로 나타낸 결과는 도 4에 나타내었으며, 품종별 유전자형 분석 결과는 하기 표 8 내지 표 9에 나타내었다.
하기 표 8 내지 표 9와 같이, F2 분리 계통 24개체 중 대조군 타입 Lx1Lx2 8개체, 결여 품종 타입 lx1lx2 9개체, 이형접합자 7개체가 확인되었다.
| # | 개체번호 | Lx 1 | Lx 2 | ||||||
| Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | ||
| 1 | SS19402-1-1001 | FAM/FAM | 0.99 | 0.183 | 4.007 | FAM/FAM | 0.99 | 0.145 | 3.838 |
| 2 | SS19402-1-1011 | VIC/VIC | 0.99 | 2.232 | 0.139 | VIC/VIC | 0.99 | 2.371 | 0.286 |
| 3 | SS19402-1-1015 | VIC/VIC | 0.99 | 2.197 | 0.132 | VIC/VIC | 0.99 | 2.249 | 0.266 |
| 4 | SS19402-1-1017 | VIC/VIC | 0.99 | 2.204 | 0.14 | VIC/VIC | 0.99 | 2.417 | 0.297 |
| 5 | SS19402-1-1038 | VIC/VIC | 0.99 | 2.279 | 0.153 | VIC/VIC | 0.99 | 2.468 | 0.31 |
| 6 | SS19402-1-1048 | VIC/VIC | 0.99 | 2.194 | 0.335 | VIC/VIC | 0.99 | 2.377 | 0.397 |
| 7 | SS19402-1-1056 | FAM/FAM | 0.99 | 0.186 | 4.02 | FAM/FAM | 0.99 | 0.171 | 3.729 |
| 8 | SS19402-1-1064 | FAM/FAM | 0.99 | 0.176 | 4.084 | FAM/FAM | 0.99 | 0.148 | 3.896 |
| 9 | SS19402-1-1074 | FAM/FAM | 0.99 | 0.209 | 4.005 | FAM/FAM | 0.99 | 0.177 | 4.091 |
| 10 | SS19402-1-1078 | FAM/FAM | 0.99 | 0.216 | 4.176 | FAM/FAM | 0.99 | 0.176 | 4.321 |
| 11 | SS19402-1-1091 | VIC/FAM | 0.99 | 2.153 | 3.728 | VIC/FAM | 0.99 | 1.64 | 3.084 |
| 12 | SS19402-2-1107 | FAM/FAM | 0.99 | 0.177 | 4.026 | FAM/FAM | 0.99 | 0.161 | 4.076 |
| # | 개체번호 | Lx 1 | Lx 2 | ||||||
| Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | Call | Quality | VIC (βRn) | FAM (βRn) | ||
| 13 | SS19402-2-1113 | VIC/VIC | 0.99 | 2.294 | 0.158 | VIC/VIC | 0.99 | 2.578 | 0.351 |
| 14 | SS19406-1-1323 | VIC/FAM | 0.99 | 2.154 | 3.561 | VIC/FAM | 0.99 | 1.221 | 2.3 |
| 15 | SS19406-1-1344 | VIC/FAM | 0.99 | 2.32 | 3.843 | VIC/FAM | 0.99 | 1.181 | 2.263 |
| 16 | SS19402-2-1132 | FAM/FAM | 0.99 | 0.199 | 4.034 | FAM/FAM | 0.99 | 0.176 | 4.341 |
| 17 | SS19402-2-1201 | FAM/FAM | 0.99 | 0.196 | 4.118 | FAM/FAM | 0.99 | 0.165 | 4.301 |
| 18 | SS19406-1-1242 | VIC/VIC | 0.99 | 2.282 | 0.158 | VIC/VIC | 0.99 | 2.484 | 0.328 |
| 19 | SS19406-1-1266 | VIC/FAM | 0.99 | 1.075 | 1.872 | VIC/FAM | 0.99 | 0.768 | 1.456 |
| 20 | SS19406-1-1273 | FAM/FAM | 0.99 | 0.131 | 3.877 | FAM/FAM | 0.99 | 0.127 | 3.167 |
| 21 | SS19406-1-1316 | VIC/FAM | 0.99 | 1.977 | 3.125 | VIC/FAM | 0.99 | 1.042 | 1.988 |
| 22 | SS19406-1-1351 | FAM/FAM | 0.99 | 0.175 | 4.403 | FAM/FAM | 0.99 | 0.179 | 3.341 |
| 23 | SS19406-1-1434 | VIC/FAM | 0.99 | 2.217 | 3.553 | VIC/FAM | 0.99 | 1.174 | 2.23 |
| 24 | SS19406-1-1436 | VIC/VIC | 0.99 | 2.655 | 0.215 | VIC/VIC | 0.99 | 2.323 | 0.33 |
실시예 4-2. F
2
분리세대에서
Lx
3 dCAPS 분자마커를 이용한 유전자형 분석
상기 실시예 4-1의 F2 분리세대 24개체를 대상으로 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 각 개체의 gDNA를 각각 추출한 후, 상기 실시예 1-2에서 선별된 Lx3 dCAPS 분자마커를 이용한 PCR 및 제한효소 처리를 통해 유전자형 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5와 같이 F2 분리 계통 24개체 중 대조군 타입 Lx3 8개체, 결여 품종 타입 lx3 6개체, 이형접합자 10개체가 확인되었다.
실시예 4-3. F
2
분리세대에서 비린내 관련 유전자형 분류
상기 실시예 4-1 및 실시예 4-2에서 분석된 F2 분리세대의 비린내와 관련된 유전자형 분류 결과를 하기 표 10 내지 표 11에 나타내었다.
구체적으로는 다음과 같다.
- CCTTGG형 (Lx1Lx2Lx3): SS19402-1-1011 외 2개체
- CCTTDD형 (Lx1Lx2lx3): SS19402-1-1015 외 2개체
- AAAAGG형 (lx1lx2Lx3): SS19402-1-1056 외 1개체
- AAAADD형 (lx1lx2lx3): SS19402-1-1001 외 1개체(표 10 내지 표 11 내 볼드체 표시)
- Heterozygous AAAAGD형, CATAGG형, CATAGD형, CATADD형, CATTGG형, CCTTGD형: SS19402-1-1048 외 13개체
| # | 개체번호 | Lx 1 | Lx 2 | Lx 3 | 유전형 분류 |
| 1 | SS19402-1-1001 | M | M | M | AAAADD |
| 2 | SS19402-1-1011 | W | W | W | CCTTGG |
| 3 | SS19402-1-1015 | W | W | M | CCTTDD |
| 4 | SS19402-1-1017 | W | W | W | CCTTGG |
| 5 | SS19402-1-1038 | W | W | M | CCTTDD |
| 6 | SS19402-1-1048 | W | W | H | CCTTGD |
| 7 | SS19402-1-1056 | M | M | W | AAAAGG |
| 8 | SS19402-1-1064 | M | M | H | AAAAGD |
| 9 | SS19402-1-1074 | W | W | M | CCTTDD |
| 10 | SS19402-1-1078 | M | M | W | AAAAGG |
| 11 | SS19402-1-1091 | H | H | M | CATADD |
| 12 | SS19402-2-1107 | M | M | H | AAAAGD |
W(Wild-type), 대조군 / M(Mutant), 결여 계통 / H, Heterozygous
| # | 개체번호 | Lx 1 | Lx 2 | Lx 3 | 유전형 분류 |
| 13 | SS19402-2-1113 | W | W | W | CCTTGG |
| 14 | SS19406-1-1323 | H | H | H | CATAGD |
| 15 | SS19406-1-1344 | H | H | W | CATAGG |
| 16 | SS19402-2-1132 | M | M | H | AAAAGD |
| 17 | SS19402-2-1201 | M | M | M | AAAADD |
| 18 | SS19406-1-1242 | H | W | W | CATTGG |
| 19 | SS19406-1-1266 | H | H | W | CATAGG |
| 20 | SS19406-1-1273 | M | M | H | AAAAGD |
| 21 | SS19406-1-1316 | H | H | H | CATAGD |
| 22 | SS19406-1-1351 | M | M | H | AAAAGD |
| 23 | SS19406-1-1434 | H | H | H | CATAGD |
| 24 | SS19406-1-1436 | W | W | H | CCTTGD |
W(Wild-type), 대조군 / M(Mutant), 결여 계통 / H, Heterozygous
상기 실시예의 결과로부터 본 발명의 분자마커는 표적 부위인 Lx1, Lx2 및/또는 Lx3 특이 분자마커 세트를 활용하여 대조군, 결여 품종/개체 및 이형접합자 품종/개체의 유전자형 분류가 가능한 바, 식물체 소실 없이 초기 생육단계에서의 빠른 선발 및 대량 판별이 가능하여 계통 선별이 용이하고 육종 연한 단축에 기여도가 높은 바, 품종 개발시 효율성을 높일 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Molecular marker set for line or breed identification including
soybean fishy smell removal genotypes and uses thereof
<130> KPA211290-KR
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx1_F
<400> 1
acttactcgg tacgtacgta acatagtat 29
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx1_R
<400> 2
ccttccaaga acgtatcctt tccaa 25
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx2_F
<400> 3
acaattcaat tcaatctcca tctatgatgt atgt 34
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx2_R
<400> 4
gtcggtttgt tgctatgatg aatgg 25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx3_F
<400> 5
gacgtgaata gcgtaaccag cgttggcg 28
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx3_R
<400> 6
catcagcttt ggtagcacta 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx1_Reporter 1
<400> 7
ttttcctttt ccatgtgcta c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx1_Reporter 2
<400> 8
tttccttttc catttgctac 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx2_Reporter 1
<400> 9
caatcaccgc atgagtat 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lx2_Reporter 2
<400> 10
caatcaccgc ttgagtat 18
Claims (9)
- 서열번호 1 내지 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 3의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 3쌍의 프라이머 세트로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트;로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 콩 비린내 제거 유전형은 콩 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및 Lx3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 콩 게놈 DNA의 Lx1, Lx2 및 Lx3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 검출 또는 증폭시킬 수 있는 것인, 프라이머 세트.
- 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 조성물.
- (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물의 분석은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020210115575A KR102641019B1 (ko) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 분자마커 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210115575A KR102641019B1 (ko) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 콩 비린내 제거 유전형을 포함하는 계통 또는 품종 판별용 분자마커 세트 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230033245A true KR20230033245A (ko) | 2023-03-08 |
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ID=85508330
Family Applications (1)
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007030429A2 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Monsanto Technology Llc | Agronomically elite soybeans with high beta-conglycinin content |
| KR20160105145A (ko) * | 2015-02-27 | 2016-09-06 | 한국원자력연구원 | 비린내 제거 돌연변이 콩 |
-
2021
- 2021-08-31 KR KR1020210115575A patent/KR102641019B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007030429A2 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Monsanto Technology Llc | Agronomically elite soybeans with high beta-conglycinin content |
| KR20160105145A (ko) * | 2015-02-27 | 2016-09-06 | 한국원자력연구원 | 비린내 제거 돌연변이 콩 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Julian M. Lenis et al., Theor. Appl. Genet., 120, p.1139-1149, 2010. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102641019B1 (ko) | 2024-03-04 |
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