KR20240052163A - 신규 담배 품종 판별용 단일염기다형성 마커 조성물 - Google Patents

신규 담배 품종 판별용 단일염기다형성 마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 담배 품종인 케이에프128 판별용 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명은 상기 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 프라이머를 제공할 수 있으며, 최소한의 유전자 부위를 이용하여 버어리종, 재래종, 오리엔트종, 및 타 황색종 중에서 케이에프128을 신속하게 판별할 수 있다.

Description

신규 담배 품종 판별용 단일염기다형성 마커 조성물{Composition comprising SNP marker for identifying novel tobacco cultivars}
본 발명은 신규 담배 품종 판별용 단일염기다형성 마커 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 신규 담배 품종 판별방법 등에 관한 것이다.
다형성(polymorphism)은 같은 종의 생물이라도 고유한 유전적 특징으로 보유하고 있으며, 그 특징이 다양하게 나타나는 것을 의미한다. 유전자 마커는 유전체 상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편을 의미한다. 유전자 마커는 작물 육종 분야에서 형질과 연관된 마커의 개발과 이를 이용한 MAS(marker assisted selection), 유전자 지도 작성, 양적형질 유전자좌 분석, 순도 검정, 유전적 다양성 분석, 및 품종 식별 등의 분야에 활용되고 있다. 일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정과 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA 분석 방법은 표현형에 근거한 식별 방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다.
유전자 수준에서의 염기서열 차이를 이용하여 품종 식별을 위한 분자 마커로 활용할 수 있다. 구체적으로, 분자 마커 종류 중 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체 상의 분포 정도를 고려할 때 작물의 다형성을 가장 잘 표현할 수 있는 단순 서열 반복(Simple Sequence Repeat, SSR), 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP), 유전자 삽입-결실(Indel) 등이 있다.
이처럼 유전물질을 이용한 개체 간의 차이에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔고, 최근 분자유전학 및 DNA 분석 기술의 발달로 분자생물학적 수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병 관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자 마커의 개발이 활발히 진행되고 있다.
담배는 세계 5대 기호품으로 경제적 가치가 매우 클 뿐 아니라 유전학에서도 중요한 식물모델이다. 담배가 가지는 유전체(게놈, genome)의 크기는 인간 유전체의 1.5배이며, 아직 다른 주요 작물에 비해 유전학적 측면에서 충분한 연구가 이루어지지 않은 상태이다.
본 발명자들은 다양한 담배 품종의 집단유전학적 특성을 규명하여 신규 담배 품종인 케이에프128(KF128)을 선택적으로 판별할 수 있는 케이에프128 판별용 단일염기다형성 마커 조성물을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케이에프128 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 케이에프128 판별용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 케이에프128 판별용 조성물을 이용하여 SNP 마커를 검출하는 단계를 포함하는, 케이에프128 판별 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 포함하는 케이에프128 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드는 NW_015811897의 일부일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1은 NW_015811897의 146,814 ~ 146,833번째 염기일 수 있고, 서열번호 2는 NW_015811897의 146,829 ~ 146,848번째 염기일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 케이에프128 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 제제는 상기 단일염기다형성이 위치하는 유전체 영역에서 상기 단일염기다형성을 포함하는 8~50개의 연속된 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 프라이머는 서열번호 3 또는 서열번호 4이고, 상기 프로브는 서열번호 5 또는 서열번호 6일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프로브는 5' 말단에 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료, 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프로브는 3'말단에 소광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 소광물질은 BHQ (Black Hole Quencher), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 케이에프128 판별용 조성물을 포함하는 케이에프128 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드의 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 케이에프128 판별 방법을 제공한다:
(1) 판별대상의 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
(2) 상기 핵산을 증폭하는 단계; 및
(3) 상기 증폭산물로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 검출하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (2)단계의 증폭은 시퀀싱(sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), 형광 융해 곡선 기법(fluorescence melting curve analysis, FMCA), Taqman 기법, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3)단계의 검출은 DNA칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계에서 검출된 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기 타입이 구아닌(guanine, G)인 경우이거나, 상기 (3) 단계에서 검출된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기 타입이 아데닌(adenine, A)인 경우, 판별대상이 케이에프128 품종에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 핵산이 RNA인 경우, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 케이에프128 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물 등은 표현형에 의한 판별 방법보다 객관적이고 반복 재현성이 높으므로, 혹시 모를 품종 간 혼입이 발생한 경우 상기 SNP 마커 조성물을 이용하여 케이에프128의 혼입 여부를 신속하게 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 케이에프128 판별용 조성물은 상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 프라이머를 포함하며, 상기 프라이머는 최소한의 유전자 부위를 포함하면서 버어리종, 재래종, 오리엔트종, 및 타 황색종 중에서 케이에프128을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 서열번호 1(SEQ ID No.1)의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP)을 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 2(SEQ ID No.2)의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP)을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 차세대 염기서열 분석(NGS)을 통해 생산된 유전체 염기서열을 바탕으로 신규 담배 품종에 대한 단일염기다형성(SNP) 분자 마커를 개발하고, 관련 부위를 프라이머 및 프로브로 제작하여 최소한의 유전자 부위를 이용하여 개체의 조성을 확인하는 방법을 연구하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1(SEQ ID No.1)의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2(SEQ ID No.2)의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 포함하는 케이에프128 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물을 제공한다(표 1).
SEQ ID No. Locus Position(bp) Sequence
1 NW_015811897 146,814 ~ 146,833 GAAAACAAC[A/G]AGAAACATTA (20 mer)
2 NW_015811897 146,829 ~ 146,848 CATTAATAACC[G/A]TAAGAACA (20 mer)
본 발명에서, 용어 “케이에프128”은 황색종의 일종으로 학명은 Nicotiana tabacum L.로써, 국립종자원에서 보관 중인 품종보호출원품종(출원번호: 출원-2018-37)이다. 케이에프128는 2001년 모본 TC499(K326)과 부본 LAFC53을 인공교배하여 2002년 600개체를 선발, 특성평가, 형질고정, 병저항성 및 생산성 검정 등을 거쳐 2017년에 최종 선발하여 품종출원을 완료하였다. 케이에프128이 대조품종 TC499(K326)와 구별되는 특성으로는 대조품종에 비해 잎의 길이가 길고 잎의 폭이 넓다. 잎모양이 대조품종은 좁은 타원형이면서 잎 끝의 모양이 심하게 뾰족하나, 케이에프128은 잎 모양이 넓은 타원형이면서 잎 끝의 모양이 중간이다. 또한, 대조품종에 비해 꽃 길이가 짧고 화관의 크기가 작은 것이 특성이다.
본 발명에서, 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌위(genetic locus)를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다.
본 발명에서, 용어 "다형성(polymorphism)"는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 위치 및 유전자 상에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유전적 다형성(genetic polymorphism)"은 하나의 유전자 좌위 (locus)에 두가지 이상의 대립 유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, DNA에서 한 개의 뉴클레오타이드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.
본 발명에서, 용어 "단일염기다형성(SNP)"은 유전체에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG,AAGT[G/G]AG)처럼 단일 염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단 (population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일 염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 사이토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 '상보적 (complementary)'이라고 한다. 한편, 본 발명에서 '폴리뉴클레오티드'는 다른 언급이 없으면 본 발명의 SNP가 위치하는 유전체 영역에서 상기 SNP를 포함하는 8~100 개의 연속된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서, 용어 '게놈 DNA(유전체 DNA, genomic DNA, gDNA)'는 한 개체의 유전자의 총 염기서열로서, 거의 완전한 유전정보를 포함하고 있는 DNA를 의미한다.
한편, 본 발명의 케이에프128 판별 방법에서 당업계에 염기서열을 분석하고 결정하기 위하여 통상적으로 사용되는 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), 형광 융해 곡선 기법(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA), Taqman, 또는 이들의 조합으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제”란 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 등을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 상기 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성(template-directed DNA synthesis)의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 될 수 있는 뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “생어 시퀀싱”은 1977년 Frederick Sanger가 개발한 가장 오래되고 널리 상용화된 염기서열 분석법 중 하나로, 최근 상용화된 차세대 염기서열 분석법 (Next-Generation Sequencing, NGS)과 대비하여 고전적 염기서열 분석법을 의미한다. PCR 과정에서 DNA 가닥이 합성되지 않는 사슬 종결의 원리와 전기 영동의 원리를 이용하여 염기서열을 확인하는 방법이다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 어떤 구성 요소가 다른 구성요소에 "연결", "결합" 또는 "접속"된다고 기재된 경우, 그 구성 요소는 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되거나 접속될 수 있지만, 각 구성 요소 사이에 또 다른 구성 요소가 "연결", "결합" 또는 "접속"될 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예 1. 담배 품종 시료 수집
케이에프128을 비롯한 황색종 20종, 버어리종 17종, 재래종 19종, 및 오리엔트종 4종을 수집하였으며(표 2), 상기 시료로부터 분석할 DNA를 추출하였다.
No. 품종 비고 No. 품종 비고
1 KF128 황색종 31 MSTC613 버어리종
2 LAFC53 황색종 32 KB113 버어리종
3 K326 황색종 33 KB111 버어리종
4 NC2326-66 황색종 34 MSKB108 버어리종
5 NC82B 황색종 35 TN90 버어리종
6 NC567 황색종 36 HB4151P 버어리종
7 MSNC567 황색종 37 KT204LC 버어리종
8 MSKF117 황색종 38 향초 재래종
9 MSKF0102-37 황색종 39 오십엽초 재래종
10 KF118 황색종 40 벌초 재래종
11 KF122 황색종 41 회초 재래종
12 KF120 황색종 42 목기초 재래종
13 KF114 황색종 43 이초 재래종
14 KF117 황색종 44 가자초 재래종
15 KF109 황색종 45 봉림 재래종
16 KF0007-23 황색종 46 자홍 재래종
17 PVH2310 황색종 47 진야1호 재래종
18 PVH2299 황색종 48 대마시 재래종
19 PVH09 황색종 49 광초 재래종
20 PVH2233 황색종 50 수안초 재래종
21 KF108 황색종 51 목탄 재래종
22 KB113LC 버어리종 52 신장초 재래종
23 MSKB302 버어리종 53 원주 재래종
24 KB1005 버어리종 54 자래홍 재래종
25 KB1007 버어리종 55 우설초 재래종
26 KB1002 버어리종 56 우방초 재래종
27 KB1003 버어리종 57 Samsun 오리엔트종
28 MSKB4305 버어리종 58 Xanthi 오리엔트종
29 MSKB301 버어리종 59 Izmir 오리엔트종
30 KB108LC 버어리종 60 basma 오리엔트종
실시예 2. 핵산 증폭
실시예 1에서 추출한 DNA를 하기 표 3의 프라이머와 프로브를 이용하여 증폭하였다. 이 때, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 SNP의 위치를 볼드체로 표시하였다.
SEQ ID No. Name Sequence (5’->3’) Base seq. length Tm(℃) 비고
3 128-1F ATTTTAACGATTCTTCCCAC 20 50.5 Primer
4 128-1R CTATTCCTTTTCAGGCAGTA 20 51.3 Primer
5 KF128P [FAM]CGAGAAACATTAATAACCATAAG[BHQ1] 23 50.6 Probe
KF128 Positive
6 KF128N [JOE]CAAGAAACATTAATAACCGTAAG[BHQ1] 23 51 Probe
KF128 Negative
PCR 반응물의 시약 조성은 하기 표 4과 같다. Taq polymerase로는 QuantiTect Probe PCR MasterMix(QIAGEN)을 사용했으며, 95℃에서 15분간 1회 반응시키고(stage 1), 95℃에서 15초 후 57℃에서 1분 반응시키는 것을 40회 반복하였다(stage 2).
Type Volme
Taq polymerase (2X) 25 μl
Forward Primer (10pmole) 1 μl
Reverse Primer(10pmole) 1 μl
Probe(10pmole) 1 μl
D.W. 17 μl
DNA 5 μl
Total 50 μl
실시예 3. 유전자형 분석
실시예 2에서 증폭한 핵산을 이용하여 각 품종별 유전자형을 분석하였다(표 5). 실제로 품종별 생어 시퀀싱을 수행한 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
No. 품종 SNP1 SNP2 빈도값 비고
1 KF128 G A 1 황색종
2 LAFC53 A G 1 황색종
3 K326 A G 1 황색종
4 NC2326-66 A G 1 황색종
5 NC82B A G 1 황색종
6 NC567 A G 1 황색종
7 MSNC567 A G 1 황색종
8 MSKF117 A G 1 황색종
9 MSKF0102-37 A G 1 황색종
10 KF118 A G 1 황색종
11 KF122 A G 1 황색종
12 KF120 A G 1 황색종
13 KF114 A G 1 황색종
14 KF117 A G 1 황색종
15 KF109 A G 1 황색종
16 KF0007-23 A G 1 황색종
17 PVH2310 A G 1 황색종
18 PVH2299 A G 1 황색종
19 PVH09 A G 1 황색종
20 PVH2233 A G 1 황색종
21 KF108 A G 1 황색종
22 KB113LC A G 1 버어리종
23 MSKB302 A G 1 버어리종
24 KB1005 A G 1 버어리종
25 KB1007 A G 1 버어리종
26 KB1002 A G 1 버어리종
27 KB1003 A G 1 버어리종
28 MSKB4305 A G 1 버어리종
29 MSKB301 A G 1 버어리종
30 KB108LC A G 1 버어리종
31 MSTC613 A G 1 버어리종
32 KB113 A G 1 버어리종
33 KB111 A G 1 버어리종
34 MSKB108 A G 1 버어리종
35 TN90 A G 1 버어리종
36 HB4151P A G 1 버어리종
37 KT204LC A G 1 버어리종
38 향초 A G 1 재래종
39 오십엽초 A G 1 재래종
40 벌초 A G 1 재래종
41 회초 A G 1 재래종
42 목기초 A G 1 재래종
43 이초 A G 1 재래종
44 가자초 A G 1 재래종
45 봉림 A G 1 재래종
46 자홍 A G 1 재래종
47 진야1호 A G 1 재래종
48 대마시 A G 1 재래종
49 광초 A G 1 재래종
50 수안초 A G 1 재래종
51 목신장초탄 A G 1 재래종
52 묵초 A G 1 재래종
53 원주 A G 1 재래종
54 자래홍 A G 1 재래종
55 우설초 A G 1 재래종
56 우방초 A G 1 재래종
57 Samsun A G 1 오리엔트종
58 Xanthi A G 1 오리엔트종
59 Izmir A G 1 오리엔트종
60 basma A G 1 오리엔트종
케이에프128의 경우, 타 담배 품종과 달리 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기가 아데닌(A)이 아닌 구아닌(G)이고, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기가 구아닌(G)이 아닌 아데닌(A)이며, 대립인자 빈도값이 매우 높으므로, 상기 두 SNP 분자 마커는 케이에프128을 판별하는데 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 포함하는 케이에프128 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물.
  2. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 케이에프128 판별용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 제제는 상기 단일염기다형성이 위치하는 유전체 영역에서 상기 단일염기다형성을 포함하는 8~50개의 연속된 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 3 또는 서열번호 4인 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 프로브는 서열번호 5 또는 서열번호 6인 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프로브는 5' 말단에 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 프로브는 3' 말단에 소광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별용 조성물.
  8. 제2항의 조성물을 포함하는, 케이에프128 판별용 키트.
  9. (1) 판별대상의 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (2) 상기 핵산을 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭산물로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기에 위치한 제1 단일염기다형성(SNP); 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기에 위치한 제2 단일염기다형성(SNP);을 검출하는 단계를 포함하는, 케이에프128 판별 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (2)단계의 증폭은 시퀀싱(sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), 형광 융해 곡선 기법(fluorescence melting curve analysis, FMCA), Taqman 기법, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (3)단계의 검출은 DNA칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 검출된 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 10번째 염기 타입이 구아닌(guanine, G)인 경우, 판별대상이 케이에프128 품종에 해당하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 검출된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드의 12번째 염기 타입이 아데닌(adenine, A)인 경우, 판별대상이 케이에프128 품종에 해당하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 케이에프128 판별 방법.
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