KR100956323B1 - 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 pcr 방법 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 서열번호 1을 포함하는 프라이머, 서열번호 2를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 3을 포함하는 프로브;
(b) 서열번호 4를 포함하는 프라이머, 서열번호 5를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 6을 포함하는 프로브;
(c) 서열번호 7을 포함하는 프라이머, 서열번호 8을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 9를 포함하는 프로브;
(e) 서열번호 13을 포함하는 프라이머, 서열번호 14를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 15를 포함하는 프로브;
(f) 서열번호 16을 포함하는 프라이머, 서열번호 17을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 18을 포함하는 프로브.
구분 | 마커 명칭 | 타입 | 명명 | 서열 | 서열번호 |
a | DK17-1 | SNP | P1(정방향) | atc ccc ata att ctt gac aa | 1 |
P2(역방향) | gga atc cgt ctt gat ttg tg | 2 | |||
프로브1 | tgt cgc gga gaa cata | 3 | |||
b | DK34 | In/Del | P3(정방향) | atg tca tgt ggc ttg tct gg | 4 |
P4(역방향) | aac tca gga acc atg cca ctg | 5 | |||
프로브2 | tga tca acg tca gac tc | 6 | |||
c | DK50 | SNP | P5(정방향) | cgc gaa cta aac aag ccc ga | 7 |
P6(역방향) | aac cct tcc gat atc ctg tc | 8 | |||
프로브3 | ttg gtg tta cat cag atg | 9 | |||
d | DK63 | SNP | P7(정방향) | aca cgc aat gag tgt ggc agt gtg | 10 |
P8(역방향) | cgg cca tgt gtt tac cta ctg | 11 | |||
프로브4 | tgt atg gct ttt gta cc | 12 | |||
e | DK560 | SNP | P9(정방향) | gcc acg tct tct tta aag att | 13 |
P10(역방향) | att agg ctg cat aca tta gtc atc c | 14 | |||
프로브5 | tag aat ccc gac ccc ct | 15 | |||
f | DK1412 | SNP | P11(정방향) | tat tgg gcc gaa tct gat tcg t | 16 |
P12(역방향) | tct ccg aca gtt tag ggc tta ggg | 17 | |||
프로브6 | tcg cag tac cgg ata tct | 18 | |||
g | DK2171 | SNP | P13(정방향) | aca caa aat aat gtc cat att a | 19 |
P14(역방향) | aac tag caa att gcc tat gcg ttg | 20 | |||
프로브7 | ctt tac aag tat gta gtg aag ga | 21 | |||
h | DK2394 | SNP | P15(정방향) | tga tat ctt gga tta gaa gtt aac | 22 |
P16(역방향) | ctg ata cag aaa ctt tcc aac cat tgg | 23 | |||
프로브8 | gaa cca caa cat ttt gcc gc | 24 | |||
i | DK2401 | SNP | P17(정방향) | cac atc atc ttc aat ttc aac caa aat | 25 |
P18(역방향) | tat aca cca ttg att tct cta aat gg | 26 | |||
프로브9 | taa act ttg cgc tga ac | 27 | |||
j | CCS | SNP | P19(정방향) | caa cgc aac gtc ttg tat gg | 28 |
P20(역방향) | tga acc ctg agt tcc tct cg | 29 | |||
프로브10 | ata ttg aac cct gag ttc ctc tc | 30 |
Filter | 여기 파장 | 방사 파장 | 형광물질 |
1 | 490 | 520 | FAM, SYBR Green® |
2 | 520 | 550 | JOE, VIC®, HEXTM, TET* |
3 | 550 | 580 | TAMRA*, CY3TM |
4 | 580 | 610 | Taxas Red®, ROXTM, RED610TM |
5 | 640 | 670 | Y5TM, RED670TM |
본 발명의 일 예로, 형광물질은 통상의 방법으로 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커 세트에 포함된 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5’말단을 형광물질(6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM) 등)로 3’말단을 quencher 물질(6-카복시테트라메틸 로다민(6-carboxytetramethyl rhodamine, TAMRA) 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광물질(6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 6-카복시테트라메틸 로다민(6-carboxytetramethyl rhodamine, TAMRA) 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광물질과 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
마커 | 2394 | 50 | 2401 | 1412 | 17-1 | 34 | 63 | 560 | 2171 | |
1 | 남평 | |||||||||
2 | 대안 | |||||||||
3 | 동안 | |||||||||
4 | 동진1 | |||||||||
5 | 상미 | |||||||||
6 | 새계화 | |||||||||
7 | 새추청 | |||||||||
8 | 수라 | |||||||||
9 | 신동진 | |||||||||
10 | 오대 | |||||||||
11 | 일미 | |||||||||
12 | 일품 | |||||||||
13 | 주남 | |||||||||
14 | 중화 | |||||||||
15 | 추청 | |||||||||
16 | 화봉 | |||||||||
17 | 화성 | |||||||||
18 | 화영 | |||||||||
19 | 대진 | |||||||||
20 | 동진 | |||||||||
21 | 삼천 | |||||||||
22 | 운두 | |||||||||
23 | 태봉 | |||||||||
24 | 화동 | |||||||||
25 | 문장 | |||||||||
26 | Koshihikari | |||||||||
27 | Hitomebore | |||||||||
28 | 삼광벼 | |||||||||
29 | 새상주벼 | |||||||||
30 | 운광벼 | |||||||||
31 | 평안 | |||||||||
32 | 상주벼 | |||||||||
33 | 삼평벼 | |||||||||
34 | 호평 | |||||||||
35 | 중산벼 |
Claims (10)
- 하기 (a), (b), (c), (e), (f)로 이루어진 벼 품종 동진 1호를 식별하기 위한 마커 조합 조성물.(a) 서열번호 1을 포함하는 프라이머, 서열번호 2를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 3을 포함하는 프로브;(b) 서열번호 4를 포함하는 프라이머, 서열번호 5를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 6을 포함하는 프로브;(c) 서열번호 7을 포함하는 프라이머, 서열번호 8을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 9를 포함하는 프로브;(e) 서열번호 13을 포함하는 프라이머, 서열번호 14를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 15를 포함하는 프로브;(f) 서열번호 16을 포함하는 프라이머, 서열번호 17을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 18을 포함하는 프로브.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 마커 조합 조성물은 프로브 종류에 따라 별개의 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 포함하며, 상기 검출가능한 수단은 특이적인 PCR 산물이 증폭된 경우에 검출되는 것을 특징으로 하는 마커 조합 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 검출가능한 수단이 형광물질인 것을 특징으로 하는 마커 조합 조성물.
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- 삭제
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