KR101660951B1 - 수박 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수박 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 SNP 마커는 분자표지로서 형태적 지표로만 품종을 구별하는 것에 비해 객관적이며 환경의 영향을 받지 않으므로, 보다 일정한 품종판별을 할 수 있다. 이러한 방법은 품종간 유사성 측정 및 신품종 평가에 활용할 수 있을 뿐 아니라 농가와 종자회사간, 종자회사와 종자회사간의 종자분쟁을 해결하는 데 사용할 수 있다. SSR(Simple Sequence Repeat) 마커도 품종판별에 사용할 수 있으나 SNP(Single nucleotide polymorphism)는 많은 수의 샘플을 처리하는데 보다 유리하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 수박 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트 및 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트; 및 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 수박 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
박과 식물(Cucurbitaceae) 중 수박속(Citrullus) 식물은 남아프리카가 원산인 시트루루스 라나투스(Citrullus lanatus), 북아프리카와 중동 원산인 시트루루스 콜로신디스(Citrullus colocynthis), 서남 아프리카 원산인 시트루루스 에시어호서스(Citrullus ecirrhosus) 및 시트루루스 나우디니아누스(Citrullus naudinianus), 인도 원산인 시트루루스 피스투로서스(Citrullus fistulosus) 5종으로 분류된다. 우리가 식용으로 먹는 수박은 시트루루스 라나투스 var. 라나투스(Citrullus lanatus var. lanatus)에 포함되는 것으로 알려져 있다. 또한, 수박은 과형에 따라 타원형계 및 원형계, 생장형에 따라 왜성형 및 포복형으로 구분하고 있다.
한국 수박의 재배면적은 대략 34,000ha에 이르며 메론, 오이, 호박이 속해 있는 박과 작물 중 가장 넓은 지역에서 재배되고 있다. 수박은 한국 전체의 채소 재배면적의 10%에서 재배되고 있으며 이는 고추, 배추, 무에 이어 4위를 차지하고 있다(2001년).
한편, 현재 품종 구별은 전통적인 멘델의 법칙을 적용한 표현형 위주의 형태학적 형질 및 효소나 단백질 변이와 같은 생화학적 특성에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 이와 같은 방식은 변이의 빈도가 낮고 전 작물에 대한 적용에 한계가 있으며, 생산자의 재배 조건에 따라 다른 결과를 초래할 수 있어서 정확한 품종 판별이 곤란하기 때문에 분자 수준에서의 품종 구별 방법이 활발하게 연구되고 있다. 예를 들면, 네덜란드에서는 장미 및 토마토에 대해 각 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하였고, 일본은 벼 등의 작물에 대한 품종 식별용 분자 마커를 개발하여 품종 보호에 활용하고 있다.
분자표지는 DNA 염기서열의 차이를 대상으로 모든 조직에서 탐지할 수 있으며, 환경적인 영향과 유전자 간의 다면 발현에 의한 영향을 받지 않는다는 장점을 가지고 있다. 현재 주요 작물에 대한 게놈 유전자 지도 작성이 활발하게 진행되고 있고, 분자표지는 육종의 선발 과정에 실제로 활용되고 있다. 식물의 육종 연구에 이용할 수 있는 분자표지가 다양하게 개발되어 왔으며 개발된 분자표지를 대량으로 검증하고 판별할 수 있는 기술과 실험 기자재도 매우 빠르게 개발되고 있다. 시간이 많이 소요되는 기술보다는 PCR을 이용한 RAPD(Random Amplified polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), SSR(Simple Sequence Repeat) 및 SNP(Single nucleotide polymorphism) 분석 등 다양한 분자표지 기술이 폭넓게 이용되고 있다. 분자표지 중 공우성 표지(codominant marker)를 이용하면 유전자의 동형접합(homozygous) 여부를 판별할 수 있으며, 형질이 발현되기 전에 조사가 가능하여 품종 육성에 있어서 빠른 판별이 가능하다는 장점이 있다.
SNP(Single nucleotide polymorphism)는 개체 간의 DNA에 나타나는 하나의 염기 차이로, 매우 다양한 종의 게놈에 걸쳐서 존재한다. 식물체 게놈에 나타나는 빈번한 SNP는 유전자 지도제작(mapping), 분자표지 보조 육종(marker assisted breeding) 및 유전자지도 기반 클로닝(map-based cloning)을 가능하게 한다. SNP는 게놈 유전자 표지 중 가장 많으며, 이러한 SNP를 검출하기 위해서 실험의 용이성 및 비용을 고려한 다양한 SNP 검출 방법과 실험장비가 개발되고 있다.
HRM(high resolution melting) 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 RT-PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 dsDNA에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다.
한국등록특허 제0823692호에는 '국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 DNA 마커'에 대해 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1014238호에는 '수박 F1 종자 순도 검정 방법'에 대해 개시되어 있다. 하지만, 본 발명의 수박 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 대해 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 수박 품종을 판별할 수 있는 SNP(Single nucleotide polymorphism) 분자마커를 개발하여 품종을 조기에 구분하고, 보다 일정한 품종판별을 하고자 한다. 따라서, 수박 시료에서 DNA를 추출하고 프라이머를 제작하여 10개 수박 공시 품종에서 22개의 SNP 마커를 선별하였다. 이에 대해 HRM(high resolution melt) 분석을 실시한 결과, 최종적으로 7개의 SNP 마커에서 품종간 다형성을 확인하였으며, 이를 이용하여 공시 품종을 전부 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트 및 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 수박 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커는 분자표지로서 형태적 지표로만 품종을 구별하는 것에 비해 객관적이며 환경의 영향을 받지 않으므로, 보다 일정한 품종판별을 할 수 있다. 이러한 방법은 품종간 유사성 측정 및 신품종 평가에 활용할 수 있을 뿐 아니라, 농가와 종자회사간, 종자회사와 종자회사간의 종자분쟁을 해결하는 데 사용할 수 있다. SSR(Simple Sequence Repeat) 마커도 품종판별에 사용할 수 있으나 SNP는 많은 수의 샘플을 처리하는데 보다 유리하게 사용될 수 있다.
도 1은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM02 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1, No.2 및 No.3은 본 발명의 7개(NHWM02, NHWM08, NHWM12, NHWM13, NHWM15, NHWM16, NHWM21) SNP 마커로 얻을 수 있는 패턴을 나타낸 것으로, No.1은 드레곤, 스피드꿀, 환상꿀, 씨제로, 달고나, 조생흑미; No.2는 슈퍼꿀, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호; No.3은 흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 2는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM08 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 달고나, 조생흑미; No.2는 스피드꿀, 환상꿀, 씨제로, 리코후레쉬1호, 리코후레쉬1호, 흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 3은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM12 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 달고나, 스피드꿀, 환상꿀, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미; No.2는 씨제로 품종을 나타낸 곡선이다.
도 4는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM13 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 씨제로, 리코후레쉬1호; No.2는 스피드꿀, 환상꿀, 달고나, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 5는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM15 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 씨제로, 조생흑미; No.2는 드레곤, 스피드꿀, 환상꿀, 달고나, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 6은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM16 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 환상꿀, 씨제로; No.2는 드레곤, 스피드꿀, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미; No.3은 달고나 품종을 나타낸 곡선이다.
도 7은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM21 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 스피드꿀, 환상꿀, 씨제로, 흑미, 조생흑미; No.2는 달고나, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호 품종을 나타낸 곡선이다.
도 2는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM08 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 달고나, 조생흑미; No.2는 스피드꿀, 환상꿀, 씨제로, 리코후레쉬1호, 리코후레쉬1호, 흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 3은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM12 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 달고나, 스피드꿀, 환상꿀, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미; No.2는 씨제로 품종을 나타낸 곡선이다.
도 4는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM13 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 씨제로, 리코후레쉬1호; No.2는 스피드꿀, 환상꿀, 달고나, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 5는 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM15 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 씨제로, 조생흑미; No.2는 드레곤, 스피드꿀, 환상꿀, 달고나, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미 품종을 나타낸 곡선이다.
도 6은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM16 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 환상꿀, 씨제로; No.2는 드레곤, 스피드꿀, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미; No.3은 달고나 품종을 나타낸 곡선이다.
도 7은 10개 수박 공시 품종에 대해 NHWM21 마커로 HRM 분석한 결과이다. No.1은 슈퍼꿀, 드레곤, 스피드꿀, 환상꿀, 씨제로, 흑미, 조생흑미; No.2는 달고나, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호 품종을 나타낸 곡선이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 7개의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트 및 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머" 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 3, 4, 15, 16, 23, 24, 25, 26, 29, 30, 31, 32, 41 및 42로 나타낸 염기서열은 본 발명의 바람직한 실시예로서 제시되는 수박 품종 판별용 마커의 염기서열을 나타낸다. 홀수 서열은 모두 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 짝수서열은 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
상기 7개의 프라이머 세트가 모두 조합되어 수박 품종을 판별하는 마커로서 사용되며, 상기 프라이머들을 이용하여 얻어지는 PCR 산물의 크기는 약 100~120bp로 설계되어져 있다. 상기 수박 품종은 슈퍼꿀, 드레곤, 씨제로, 달고나, 리코후레쉬1호, 리코스위트1호, 흑미, 조생흑미, 스피트꿀 및 환상꿀로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 7개의 프라이머 세트로 얻을 수 있는 SNP 패턴이 이론적으로는 288개이므로 현재 판매되는 주요 수박 품종은 대부분 구별할 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및 상기 각 증폭된 산물을 HRM(high resolution melt) 분석을 통해 수박 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예
1. 수박 F1 종자 품종 구별
(1) 핵산 시료 추출
수박 종자의 가운데 부분을 펀처(puncher, 지름 3mm)로 뚫어서 샘플을 준비하고 스테인레스(Stainless) 구슬 1개를 넣고, 비드 비터(bead beater)로 2분간 작동시켜 종자를 파쇄하였다. 재현성 확인을 위하여, 각 품종당 2개체씩 핵산을 추출하였다. 본 실시예에 사용한 공시품종은 하기 표 1과 같다.
| 연번 | 품종명 | 회사명 | 연번 | 품종명 | 회사명 |
| 1 | 슈퍼꿀 | 농협종묘 | 6 | 리코스위트1호 | 파트너종묘 |
| 2 | 드레곤 | 농협종묘 | 7 | 흑미 | 삼성종묘 |
| 3 | 씨제로 | 신젠타 | 8 | 조생흑미 | 삼성종묘 |
| 4 | 달고나 | 신젠타 | 9 | 스피트꿀 | 농우바이오 |
| 5 | 리코후레쉬1호 | 파트너종묘 | 10 | 환상꿀 | 농우바이오 |
파쇄된 종자에 추출버퍼(extraction buffer)를 넣고 섞은 후 원심분리하여 고형분은 제거하였다. 상층액과 동일 부피의 세포용해 버퍼(cell lysis buffer)를 첨가한 후 65℃에서 30분간 처리하였다. 이어 다시 원심분리한 후 단백질 침전 버퍼를 첨가하고 원심분리하여 침전물을 제거하였으며, 그 상층액에 이소프로필알콜을 섞어주었다. 원심분리하여 핵산을 침전시키고 상층액은 제거한 뒤 70% 에탄올로 씻어 준 다음, 에탄올을 날려 보낸 뒤 물에 녹여 하기 실시예에 사용하였다.
(2)
SNP
(
Single
nucleotide
polymorphism
) 판별 및
프라이머
제작
수박 8개 계통에서 전체 염기서열을 확보한 뒤 약 5만 개의 SNP를 확보하였다. 이들 중 계통간 차이가 많이 나는 SNP를 판별하고 각 염색체별로 약 2개씩 총 22개의 SNP를 최종적으로 판별하였다. SNP 확인을 위한 프라이머는 SNP를 중심으로 약 50~60bp 떨어진 위치에서 디자인하여 최종 PCR 산물이 100~120bp가 되도록 제작하였다.
| 프라이머 이름 | 염색체 및 위치 |
염기서열 | 사이즈 (bp) |
|
| 정방향(서열번호) | 역방향(서열번호) | |||
| NHWM01 | Chr1_933889 | TGCAAAGTACATACCAGGCA(서열번호 1) | CAAAAGCCCCTCAACCACAT(서열번호 2) | 105 |
| NHWM02 | Chr1_6293684 | AGTTTCTTTTGCAACAACCAGA(서열번호 3) | TCTCAGCGATTCTCCAGAGTC(서열번호 4) | 102 |
| NHWM03 | Chr2_61775 | ACCTTCTTGAAATTCGACACGT(서열번호 5) | TGGGATTTGAGAAGGGGAGT(서열번호 6) | 101 |
| NHWM04 | Chr2_34403192 | CTCCACGAGTCCCTAATGCA(서열번호 7) | CGCATAGCCTGATATAGTCCAT(서열번호 8) | 113 |
| NHWM05 | Chr3_624752 | AAATTCCACTGACCCAAGCC(서열번호 9) | GCATCCCACGTTTCCTCATC(서열번호 10) | 102 |
| NHWM06 | Chr3_27710244 | ACACATCACTACAACATTCGACC(서열번호 11) | CACACTTGATTGCTCTAAGGTGT(서열번호 12) | 102 |
| NHWM07 | Chr4_150715 | GAGACTTGGAAAAGAGGAGAAGA(서열번호 13) | CCAAACGAACCTCTAACTTTGAT(서열번호 14) | 115 |
| NHWM08 | Chr4_23282899 | CAATCAAAATTTGTCACATGGCA(서열번호 15) | AGTCATACTTGGGTGCATCC(서열번호 16) | 102 |
| NHWM09 | Chr5_340755 | TCATGCTGCCTTCCCAATTG(서열번호 17) | AGATCGTATCAAGCACTCGGT(서열번호 18) | 100 |
| NHWM10 | Chr5_33456683 | AGACACTGGTTTCAATGACGT(서열번호 19) | GTGTAATTGCAACAACCACCA(서열번호 20) | 109 |
| NHWM11 | Chr6_1167844 | GGAAATAGTGATGAGATGGTCGG(서열번호 21) | TCACTCCTCATTTGTCCACTGT(서열번호 22) | 100 |
| NHWM12 | Chr6_25774625 | GTGTTCAACCCGTCGGAATA(서열번호 23) | CGCTGATTTCAAATTGTATGGCA(서열번호 24) | 101 |
| NHWM13 | Chr7_147265 | AGAAAATTCGAAGGGTTGGCC(서열번호 25) | GCTGCCTTAATTTATCTCACACA(서열번호 26) | 107 |
| NHWM14 | Chr7_31118355 | TGCGAGGAGAGTGTCAAACA(서열번호 27) | GCATGTGGTGGAAGAATCAAAG(서열번호 28) | 110 |
| NHWM15 | Chr8_31016 | TCACGTTCTAAATCCTGATCGA(서열번호 29) | TGCTTATGTCATCCCCAAACC(서열번호 30) | 100 |
| NHWM16 | Chr8_26137596 | TGACAGGCAGCTGGATTCA(서열번호 31) | GCTGGGATTTCTTTGTACCATTG(서열번호 32) | 100 |
| NHWM17 | Chr9_177779 | AGCTTATGGTCAAGGATGGTTT(서열번호 33) | CGTGACATATGACTGTTTGAGGG(서열번호 34) | 103 |
| NHWM18 | Chr9_34350107 | AATGACAGGAATCCTTGGTTCAC(서열번호 35) | AAGAAAGAGAGAATCCCGAGTCA(서열번호 36) | 100 |
| NHWM19 | Chr10_2306030 | AGGGGCTAAATTAGGATATGCC(서열번호 37) | TCCATCAAACTGAGCCTGCT(서열번호 38) | 106 |
| NHWM20 | Chr10_477453 | GACATCTCCCTCGCAGTTCA(서열번호 39) | CCGCTGATGTTCCGATTGAA(서열번호 40) | 107 |
| NHWM21 | Chr11_1642997 | ACCTGGCTTCGTGAAAATGG(서열번호 41) | GACCCAATTGTTGAGCGTCT(서열번호 42) | 110 |
| NHWM22 | Chr11_23893496 | CCCCAAGCAGTTCTCATGAT(서열번호 43) | GAAGGGACCGAATGCAGTTC(서열번호 44) | 100 |
(3)
HRM
(
high
resolution
melt
) 분석
상기 실시예에 따라 추출한 DNA 및 프라이머 세트를 이용하여 HRM을 수행하였다. HRM 반응을 수행하기 위한 반응액 조성은 다음과 같다. DNA 5㎕, dNTP 혼합물 2㎕, 10X 버퍼 2㎕, 프라이머 0.1㎕, Taq polymerse 0.1㎕, CytoNine 0.5㎕, 물 8.4㎕. 반응조건은 처음 94℃에서 4분간 처리한 후 95℃에서 10초, 57℃에서 20초, 72℃에서 30초로 37회 반복하였다. 반응 완료후 90℃에서 60℃로 점차 내리면서 형광세기를 측정하였다. 10개 수박 공시 품종에서 22개 SNP에 대해 HRM 분석을 실시한 결과, 도 1 내지 7에 개시된 바와 같이 7개 SNP(NHWM02, NHWM08, NHWM12, NHWM13, NHWM15, NHWM16 및 NHWM21)에서 품종간 다형성을 확인할 수 있었다. NHWM02 및 NHWM16에서는 3가지 다형성을 볼 수 있었으며 나머지 SNP 마커에서는 2가지 서로 다른 SNP가 관찰되었다. 3가지가 관찰되는 경우 두 개는 동형 접합(homozygous), 나머지 하나는 이형 접합(heterozygous) 상태로 추정이 된다.
또한, 도 1 내지 7에 개시된 바와 같이 각 패턴별로 값을 지정하였다. 두 개의 패턴이 관찰되면 No.1 및 No.2, 세 개가 관찰되면 No.1, No.2 및 No.3으로 값을 정하였다. 공시한 품종별로 각 SNP 마커에 따른 값을 표 3과 같이 정리해 보면 7개의 SNP 마커로 공시 품종을 전부 구별할 수 있음을 확인할 수 있다. 최종적으로, 7개의 SNP 마커로 얻을 수 있는 SNP 패턴이 이론적으로는 288개이므로 현재 판매되는 주요 품종은 대부분 구별할 수 있을 것으로 사료된다.
| 품종 | NHWM02 | NHWM08 | NHWM12 | NHWM13 | NHWM15 | NHWM16 | NHWM21 |
| 슈퍼꿀 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 드레곤 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 1 |
| 씨제로 | 1 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 달고나 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 2 |
| 리코후레쉬1호 | 2 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 |
| 리코스위트1호 | 2 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 흑미 | 3 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1 |
| 조생흑미 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 스피트꿀 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1 |
| 환상꿀 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 1 | 1 |
<110> NH Seed Co., Ltd.
<120> Single nucleotide polymophism maker for selecting watermelon
clutivar and uses thereof
<130> PN15171
<160> 44
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
tgcaaagtac ataccaggca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
caaaagcccc tcaaccacat 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
agtttctttt gcaacaacca ga 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tctcagcgat tctccagagt c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
accttcttga aattcgacac gt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
tgggatttga gaaggggagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
ctccacgagt ccctaatgca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
cgcatagcct gatatagtcc at 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
aaattccact gacccaagcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gcatcccacg tttcctcatc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
acacatcact acaacattcg acc 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
cacacttgat tgctctaagg tgt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
gagacttgga aaagaggaga aga 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ccaaacgaac ctctaacttt gat 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
caatcaaaat ttgtcacatg gca 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
agtcatactt gggtgcatcc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
tcatgctgcc ttcccaattg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
agatcgtatc aagcactcgg t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
agacactggt ttcaatgacg t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
gtgtaattgc aacaaccacc a 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
ggaaatagtg atgagatggt cgg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
tcactcctca tttgtccact gt 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
gtgttcaacc cgtcggaata 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
cgctgatttc aaattgtatg gca 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
agaaaattcg aagggttggc c 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
gctgccttaa tttatctcac aca 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
tgcgaggaga gtgtcaaaca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
gcatgtggtg gaagaatcaa ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
tcacgttcta aatcctgatc ga 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
tgcttatgtc atccccaaac c 21
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
tgacaggcag ctggattca 19
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
gctgggattt ctttgtacca ttg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
agcttatggt caaggatggt tt 22
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
cgtgacatat gactgtttga ggg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
aatgacagga atccttggtt cac 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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aagaaagaga gaatcccgag tca 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
aggggctaaa ttaggatatg cc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
tccatcaaac tgagcctgct 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 39
gacatctccc tcgcagttca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
ccgctgatgt tccgattgaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
acctggcttc gtgaaaatgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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gacccaattg ttgagcgtct 20
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 43
ccccaagcag ttctcatgat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 44
gaagggaccg aatgcagttc 20
Claims (4)
- 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트 및 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 프라이머 세트; 및 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
- 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및
상기 각 증폭된 산물을 HRM(high resolution melt) 분석을 통해 수박 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 판별하기 위한 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150112335A KR101660951B1 (ko) | 2015-08-10 | 2015-08-10 | 수박 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020150112335A KR101660951B1 (ko) | 2015-08-10 | 2015-08-10 | 수박 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도 |
Publications (1)
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ID=57101286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101660951B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707692A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-10-26 | 武汉市农业科学院 | 一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物 |
| KR101923647B1 (ko) | 2016-12-29 | 2018-11-29 | 부산대학교 산학협력단 | 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커 |
| KR20190117238A (ko) | 2018-04-06 | 2019-10-16 | 부산대학교 산학협력단 | 프로라이코펜 고함량 수박 개체 선발용 분자마커 및 이의 용도 |
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- 2015-08-10 KR KR1020150112335A patent/KR101660951B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |