KR101301863B1 - 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법 - Google Patents

초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내에서 유통되고 있는 상추 90개 품종에 대해 다형성을 보이는 상추 품종식별용 초위성체 프라이머 세트 선별 및 이를 이용한 상추 품종의 식별방법으로, 상기 본 발명에 따른 프라이머 세트를 상기 국내에서 유통되고 있는 상추 90개 품종을 식별할 수 있는 상추 품종 식별용 초위성체 마커로 사용함으로써 상추 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사 간의 종자 분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 여러 분야에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법{A method for identifying lettuce varieties using microsatellite primer set}
본 발명은 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내에서 유통되고 있는 상추 90개 품종에 대해 다형성을 보이는 상추 품종식별용 초위성체 프라이머 세트 선별 및 이를 이용한 상추 품종의 식별방법에 관한 것이다.
분자 표지는 농작물의 내병성 또는 기능성과 관련된 유전자의 지도 작성(mapping) 및 형질 연관 마커의 개발, 형질과 관련된 양적 유전자의 염색체상 위치의 확인(QTL, Quantitative Trait Locus), 분자표지를 이용한 F1 순도검정 등과 같은 여러 가지 분자 육종 분야에 활용되고 있다. 또한 분자표지 연구는 식물 품종 보호분야에서도 활용되고 있다. 국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 DNA 마커를 신품종의 특성조사와 식물 신품종보호권 부여에 활용하기 위한 논의를 진행 중이며 아직까지 유전자 수준에서 단순한 염기서열 차이를 품종의 구별성으로 인정하고 있지는 않으나, 품종식별을 위한 분자표지의 활용 가능성을 제안하고 있다. 구체적으로는 육종가의 권리보호를 위해 분자 표지를 활용함에 있어 과거에 주로 사용하였던 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)나 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA) 분석 기술에 의한 결과는 인정하지 않고 품종간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(Simple Sequence Repeat) or Microsatellite, SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 및 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)방법을 활용하는 것을 제안하고 있다는 점이다.
일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성검정과 품종간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA분석 방법은 표현형에 근거한 식별방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다.
실제로 국내외 품종 식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황을 살펴보면, 우리나라에서는 농촌진흥청에서 벼, 콩 등에 대한 SSR 분자표지를, 딸기에 대한 CAPS 분자표지를 이용한 품종 식별 기술을 보고한 바 있다. 또한, 국립종자원은 SSR 분자표지를 이용하여 고추, 배추, 수박, 토마토, 복숭아, 장미, 양파 등에 대한 작물의 DNA 프로파일을 데이터베이스화 하였으며, 종자 분쟁 발생 시 이를 중재하기 위한 수단으로서 몇몇 작물의 분자 표지를 직접 이용하고 있으며 최근에는 품종보호 출원 작물에 대한 대조품종 선정에 유전자 분석 결과를 보조 자료로 활용하고 있다. 한편, 품종식별용 SSR 분자표지 중 순도검정용 마커에 대해서는 육종가 지원을 위한 박과작물 F1 순도검정에 활용한바 있다.
국외 국가의 사례를 살펴보면, 스페인에서는 포도 등의 작물에 SSR 분석 기술을 이용하여 각 품종 별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하여 기본유래 품종의 식별, 기존품종의 관리 등에 활용하고 있다. 중국의 경우 옥수수 약 4000품종에 대하여 SSR, SNP 분자표지를 이용한 DNA 프로파일을 데이터베이스화하고 있으며 법원에서도 품종보호 침해사례 판단에 유전자분석 결과를 적극 활용하고 있다. 일본은 복숭아, 배, 사과 등에 SSR 분자표지와, 딸기, 차에 CAPS 분자표지를 활용한 품종 식별 방법을 개발하여 육종가 권리 보호에 활용하고 있다.
한편, 국화과 작물인 상추는 생으로 직접 이용되고 있으며 쌈용 채소 중 가장 소비가 많고 인기가 많은 채소이다. 국립종자원에 신고 된 상추의 국내 육성 품종 및 생산판매신고 품종 수는 666품종(2010년 4월 30일 기준)으로 종자 시장에서 차지하는 비중이 높다고 할 수 있다. 상추는 재배시험 시 재배 환경의 영향을 받고, 품종 육종 시 목표형질 선발에 시간이 소요되기에 분자표지를 이용한 육종 및 DNA 분석 방법에 의한 품종식별의 중요도가 증대되고 있으며, 이에 대한 기술 확립이 시급한 상황이다.
상추에 대한 분자 표지 연구 개발 동향을 살펴보면, 국외에서는 미국을 중심으로 연구가 활발하게 진행되고 있으며 Simko(2008)은 EST(Expressed Sequence Tag)로부터 유래된 SSR 마커를 개발하여 상추 품종 타입별로 유전적 유연관계를 연구하였고, Jeuken(2008)은 병저항성 관련 양적형질 유전자좌 탐색을 위한 연구를 수행하였으며, 이러한 상추 연구의 대부분은 상추 품종 식별보다는 상추 유전자 지도 작성 및 병저항성 연관 마커 개발 등이 대부분을 차지하였다.
국내에서는 Yang(2010)은 RAPD, Inter-SSR, AFLP 마커를 이용하여 상추 품종별 유전적인 유연관계를 연구하였다. 그러나, 국내에서 유통되는 품종을 대상으로 초위성체 마커 세트를 이용하여 상추 품종을 식별할 수 있는 적절한 마커 조합의 선별 및 자동염기서열분석기를 이용한 정밀한 genotyping 기술은 아직까지 국내적으로 확립되지 못한 상태이다. 이는 상추가 중요한 채소 작물임에도 불구하고 분자 생물학 연구 및 분자유전학적인 기초 자료가 가지과(고추, 토마토 등), 박과(수박, 오이 등) 등의 작물에 비해 부족하고, 분자유전학적인 기초연구가 미흡하기 때문인 것으로 파악된다.
한편 EST 유래 SSR 마커는 발현된 염기서열을 기반으로 한 마커로서 genomic library 유래 SSR 마커에 비해 식물의 표현형에 직접 영향을 끼친다. 하지만, EST 유래 마커의 경우, genomic SSR 마커에 비해 품종 간 다형성을 나타내는 마커 선별이 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 이는 발현된 염기서열을 기반으로 하기에 종간 보존적인 부분(Conserved region)이 존재하여 genomic 유래 마커보다 다형성을 찾기 힘들기 때문이다.
그러나 EST 유래 마커가 품종 간 다형성을 뚜렷이 나타낸다면 표현형의 발현과 관계가 없는 genomic SSR 마커에 비해 품종식별 효율이 증대될 것이다. 특히 상추와 같이 genomic SSR 마커의 개발이 부진하고, 분자표지를 이용한 품종식별 연구가 되어 있지 않은 작물의 경우 품종식별에 효과적인 EST 유래 마커 세트를 우선 선별한다면 마커(유전자형)와 표현형과의 상관관계를 높이는데도 기여할 수 있을 거라 판단된다.
: IVAN SIMKO, Journal of Heredity, 2008.09,15 : Tae-Jin Yang et al., RESEARCH ARTICLES J. Crop Sci. Biotech. 10: 29~34
본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위한 방법으로 상추 게놈에서 직접 genomic library를 제작하여 SSR 마커를 개발하는 방법에 비해 시간 및 비용을 크게 절약 할 수 있는 상추 품종식별 방법에 대한 연구를 지속해오던 중, 상추 유전자의 지도 작성 또는 병 저항성 유전자좌 탐색에 이용된 EST 유래 SSR 마커로부터 국내에서 최초로 상추 90개 유통품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 선발하고, 이들 초위성체 마커를 프라이머로 이용하여 국내 상추 품종의 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 상추 품종 진위성에 대한 과학적 검증 등에 실용적으로 활용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 국내에서 최초로 상추 90개 유통품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커로, 상추 품종 식별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 상추 품종의 식별방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 상추 품종 식별용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 상추 품종의 진위성 규명, 상추 품종보호 출원품종의 대조 품종 선정을 위한 상추의 품종을 식별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 국내에서 유통되고 있는 상추 90개 유통품종에 대해 다형성을 나타내는 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 상추 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 상추 품종의 진위성 규명, 상추 품종보호 출원품종의 대조 품종 선정을 위한 상추의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
서열번호 1과 2의 염기서열로 이루어지는 SML-001 프라이머 세트;
서열번호 3과 4의 염기서열로 이루어지는 SML-002 프라이머 세트;
서열번호 5와 6의 염기서열로 이루어지는 SML-003 프라이머 세트;
서열번호 7과 8의 염기서열로 이루어지는 SML-007 프라이머 세트;
서열번호 9와 10의 염기서열로 이루어지는 SML-015 프라이머 세트;
서열번호 11과 12의 염기서열로 이루어지는 SML-019 프라이머 세트;
서열번호 13과 14의 염기서열로 이루어지는 SML-038 프라이머 세트;
서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 SML-039 프라이머 세트;
서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 SML-042 프라이머 세트;
서열번호 19와 20의 염기서열로 이루어지는 SML-043 프라이머 세트;
서열번호 21과 22의 염기서열로 이루어지는 SML-045 프라이머 세트;
서열번호 23과 24의 염기서열로 이루어지는 SML-048 프라이머 세트;
서열번호 25와 26의 염기서열로 이루어지는 SML-051 프라이머 세트;
서열번호 27과 28의 염기서열로 이루어지는 SML-054 프라이머 세트;
서열번호 29와 30의 염기서열로 이루어지는 SML-055 프라이머 세트;
서열번호 31과 32의 염기서열로 이루어지는 SML-056 프라이머 세트;
서열번호 33과 34의 염기서열로 이루어지는 SML-057 프라이머 세트;
서열번호 35와 36의 염기서열로 이루어지는 SML-061 프라이머 세트;
서열번호 37과 38의 염기서열로 이루어지는 SML-021 프라이머 세트;
서열번호 39와 40의 염기서열로 이루어지는 SML-022 프라이머 세트;
서열번호 41과 42의 염기서열로 이루어지는 SML-026 프라이머 세트;
서열번호 43과 44의 염기서열로 이루어지는 SML-028 프라이머 세트;
서열번호 45와 46의 염기서열로 이루어지는 SML-032 프라이머 세트; 및
서열번호 47과 48의 염기서열로 이루어지는 SML-037 프라이머 세트;
로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.
보다 상세하게는 상추 EST 유래 SSR 마커, 유전자의 지도 작성 또는 병 저항성 연관 마커로부터 국내 유통되고 있는 상추 90개 유통품종의 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 생성된 증폭 산물의 크기를 이용한 상추 품종 식별 가능성이 높은 프라이머의 조합을 선별하였다. 상기 선별된 프라이머의 조합으로부터 대립 유전자의 PIC(Polymorphic Information Content) 값이 우수한 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 선별할 수 있었고, 상기 선별된 상추 품종 식별용 프라이머 세트가 상추 품종 식별방법에 적합함을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 90개의 유통 품종 중 특히, 강풍적치마, 모스트청쌈, 삼성그린, 에스에스33, 적단, 하이그린, 탑레드, 선풍포찹적축면, 갈레라, 자바흑치마, 및 개량담배로부터 선택되는 1종 이상의 유통품종에 대해 우수한 상추 품종에 대한 다형성을 보이는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트는 특히, 서열번호 1과 2, 서열번호 7과 8, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 27과 28, 서열번호 33과 34, 서열번호 37과 38, 서열번호 39와 40, 서열번호 41과 42, 서열번호 43과 44에서 0.45 이상의 우수한 PIC 값을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 VIC, NED, FAM 또는 PET 이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5‘-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명은 상기 상추 품종 식별용 프라이머 세트(서열번호 1 내지 48); 및 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)에 필요한 시약; 을 포함하는, 상추 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 적당량의 DNA 중합 효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물, KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유한 PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 RT-PCR 에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은
a) 상추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 상추 품종 식별용 프라이머 세트(서열번호 1 내지 48)를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는, 상추의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상추의 종자, 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물로부터 분리될 수 있다. 보다 상세하게는 상추 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎 또는 줄기로부터 게놈 DNA를 분리하기도 하지만, 본 발명에서는 상추 종자로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 종자에서 직접 게놈 DNA를 분리하면 식물체를 키우지 않아도 되기에, 분석 시 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 상추 품종 식별용 프라이머 세트는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34, 서열번호 35와 36, 서열번호 37과 38, 서열번호 39와 40, 서열번호 41과 42, 서열번호 43과 44, 서열번호 45와 46 및 서열번호 47과 48로 이루어지는 프라이머 세트로부터 선택되는 1종 이상인 프라이머 세트를 포함한다.
이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다.
겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 증폭된 산물로부터 상추 품종을 식별하는 단계는 자동염기서열분석기를 이용하여 대립 유전자(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인한 다음, 각각의 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로는, 각각의 상추 품종에 대하여 본 발명의 상추 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고, 상기 증폭된 산물과의 비교 분석을 통해 상추 품종을 식별할 수 있다. 하기 도 1은 각각의 상추 품종에 대해 각 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성한 것이다. 구체적으로 도 1은 상추 90개 품종을 대상으로 본 발명의 90개의 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 각각 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
따라서, 품종을 식별하고자 하는 상추로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 마커를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 1의 결과를 비교 분석함으로써 상추 품종을 식별할 수 있다.
본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 상추 90개 품종에 대한 식별능이 우수하여, 상추 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사 간의 종자 분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 여러 분야에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 상추 90개 품종을 대상으로 본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트에 의해 분석된 각 상추 품종을 코드화하고, NTSYS pc 컴퓨터 프로그램을 활용하여 상추 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예] 상추 품종 식별방법
(1) 상추 시료
본 발명에서는 하기 표 1에 기재된 상추 90개 품종을 상추 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 상추 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
Figure 112011054876950-pat00001
Figure 112011054876950-pat00002
(2) 상추 게놈 DNA의 분리
상기 표 1에 기재된 공시 상추 품종의 종자 15~20 립을 2ml Eppendorf 튜브에 텅스텐 구슬 2개를 넣고 분쇄기(FRITSCH, Germany)에 돌려 종자를 고르게 마쇄하였다. 이어 2 ㎖ 튜브에 NucleoSpinPlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250)키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 세포 용해 버퍼(lysis buffer)는 PL2를 사용하였다. 추출된 게놈 DNA는 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 PCR 분석을 위해 냉동고(-20℃)에서 보관하였다.
(3) 프라이머 세트의 제작
본 발명의 프라이머 세트를 위한 후보 시퀀서 데이터베이스(sequence database)로는 상추(Lactucasativa L.)에서 개발되어 공개된 EST(Expressed Sequence Tag)로부터 유래된 SSR 마커(Simko et al. 2008) 및 병저항성 관련 양적형질 유전자좌 탐색을 위한 EST 마커(Jeuken et al. 2008)의 염기서열을 기반으로 한 총 81개 프라이머 세트를 이용하였다.
국내 유통품종을 구분할 수 있는 마커를 선발하기 위하여 강풍적치마, 모스트청쌈, 삼성그린, 에스에스33, 적단, 하이그린, 탑레드, 선풍포찹적축면, 갈레라, 자바흑치마 및 개량담배 품종으로부터 DNA를 분리하여 상기 81개의 프라이머 세트를 이용하여 유전자 증폭한 다음 반복간 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗하면서 다형성 정도가 높은 마커를 30개 선발하였다. 이들 30개 마커의 분자 표지에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀분석을 추진하기 위하여, 정방향 프라이머에 형광 발생 물질 VIC, NED, FAM 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다. 그리고 이 30개 마커를 이용하여 국내에서 유통되고 있는 상추 90품종에 확대하여 적용하였을 때 품종 식별 능력이 높은 최종 24개의 마커를 선정하였다. 공시 상추 품종에 다형성을 보이는 프라이머 세트의 염기 서열을 상기 표 2에 나타내었다.
Figure 112011054876950-pat00003
Figure 112011054876950-pat00004
(4) PCR 증폭 및 전기영동
상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 상추 게놈 DNA 20 ng, 10 pmol의 상기 마커, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq DNA polymerase 1U(GeNet bio, Korea), 2.5 ㎕의 10 ×PCR Buffer(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다.
PCR(Biometra, Germany) 증폭은 94℃에서 4분 동안 상추 게놈 DNA를 충분히 변성(denaturation)시킨 다음, 94℃에서 변성 30초, 55℃에서 결합(annealing) 30초, 72℃에서 신장(extension) 45초를 40회 반복 수행한 후 PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 신장 10분을 수행하였다. PCR이 완료된 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동 하여 증폭 여부를 확인하였다.
증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 4℃ 냉장고에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 멸균된 증류수 150 ㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 1 내지 3 ㎕(증폭량에 따라 조절)의 PCR산물을 탈이온 된 포름아마이드(deionized formamide) 10 ㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(Size marker)(LIZ500 size standard) 0.25 ㎕를 잘 혼합하여 섞은 다음 94℃에서 2분간 변성시켰다.
상기 변성시킨 유전자 증폭 산물은 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기 영동한 다음 GeneMapper 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 SSR 분자 표지별 대립 유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 상추 품종 식별 가능성 검정
상기에서 자동염기서열분석기로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 상추 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다.
하기 식1에서 K는 각 대립유전자의 총 밴드수이며 Pi는 마커의 밴드 중에서 i 번째 공통 밴드패턴의 빈도수이다(Anderson et al. 1993).
Figure 112011054876950-pat00005
그 결과, 각 마커에 따른 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112011054876950-pat00006
Figure 112011054876950-pat00007
상기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트 중 서열번호 1과 2(마커 명: SML-001), 서열번호 7과 8(마커 명: SML-007), 서열번호 17과 18(마커 명: SML-042), 서열번호 19와 20(마커 명: SML-043), 서열번호 27과 28(마커 명: SML-054), 서열번호 33과 34(마커 명: SML-057), 서열번호 37과 38(마커 명: SML-021), 서열번호 39와 40(마커 명: SML-022), 서열번호 41과 42(마커 명: SML-026) 및 서열번호 43과 44(마커 명: SML-028)에서 0.45이상의 우수한 PIC 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 서열번호 25와 26의 프라이머 세트에서 0.310의 가장 낮은 PIC 값을 나타내었고, 서열번호 1과 2의 프라이머 세트에서 0.598의 가장 높은 PIC 값을 나타내었다. 각 마커의 평균 PIC값은 0.432로, 이는 본 발명의 마커가 상추 품종을 충분히 식별 가능하게 할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
또한, 본 발명에 따른 마커에 대해 대립유전자(밴드) 크기의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수“1”로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 “0”으로 코드화하였고, 공시품종 1번부터 90번까지 총 90품종에 대하여 24개의 초위성체 마커에 대한 밴드의 유무 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 품종을 식별하고자 하는 상추로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 1의 결과를 비교 분석함으로써 상추 품종을 식별할 수 있는 자료로 사용될 수 있다.
구체적으로 살펴보면, 61번 부띠끄 품종과 63번 유레이크 품종은 SML-022마커 2번째 allele에서 부띠끄 품종은 밴드가 존재하여 “1”로 코드화하였고, 유레이크 품종은 밴드가 존재하지 않아 “0”으로 코드화하였다. 품종식별용 초위성체 마커 중 SML-022마커를 제외한 23개 초위성체 마커에 대한 밴드의 유무는 부띠끄와 유레이크 품종간 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
상기 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal, 1973)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서도 확인할 수 있듯이, ‘여름참맛적치마’ 와 ‘하트적치마’, ‘홍풍치마’ 와 ‘아시아진빨치마’, ‘부띠끄’ 와 ‘유레이크’, ‘생그린’ 과 ‘골드그린’ 은 유전적 유사도가 매우 높은 품종인 것을 확인할 수 있었고, 상기의 결과로부터 본 발명의 프라이머 세트는 모든 품종의 구별을 가능하게 함을 확인할 수 있었다.
또한, 실제 경남 합천군 상추 재배 농민과 육묘장과의 상추 종자 분쟁이 발생되어, 국립종자원에 센세이션 농가 재배품종에 대한 품종 진위여부에 대한 분쟁종자대비시험이 접수되어, 본 발명의 상추 품종 식별용 프라이머 세트 24개를 이용하여 분석하였다.
그 결과 24개의 프라이머 세트 중 3개의 프라이머 세트(마커 명: SML-045, SML-022, SML-026)에서 센세이션 품종과 대립유전자의 크기가 다른 품종을 식별을 할 수가 있었고, 또한 본 발명의 프라이머 세트를 통해 상추 품종을 재배해서 특성을 조사해야 하는 노력과 시간을 절감할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1과 2의 염기서열로 이루어지는 SML-001 프라이머 세트;
    서열번호 3과 4의 염기서열로 이루어지는 SML-002 프라이머 세트;
    서열번호 5와 6의 염기서열로 이루어지는 SML-003 프라이머 세트;
    서열번호 7과 8의 염기서열로 이루어지는 SML-007 프라이머 세트;
    서열번호 9와 10의 염기서열로 이루어지는 SML-015 프라이머 세트;
    서열번호 11과 12의 염기서열로 이루어지는 SML-019 프라이머 세트;
    서열번호 13과 14의 염기서열로 이루어지는 SML-038 프라이머 세트;
    서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 SML-039 프라이머 세트;
    서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 SML-042 프라이머 세트;
    서열번호 19와 20의 염기서열로 이루어지는 SML-043 프라이머 세트;
    서열번호 21과 22의 염기서열로 이루어지는 SML-045 프라이머 세트;
    서열번호 23과 24의 염기서열로 이루어지는 SML-048 프라이머 세트;
    서열번호 25와 26의 염기서열로 이루어지는 SML-051 프라이머 세트;
    서열번호 27과 28의 염기서열로 이루어지는 SML-054 프라이머 세트;
    서열번호 29와 30의 염기서열로 이루어지는 SML-055 프라이머 세트;
    서열번호 31과 32의 염기서열로 이루어지는 SML-056 프라이머 세트;
    서열번호 33과 34의 염기서열로 이루어지는 SML-057 프라이머 세트;
    서열번호 35와 36의 염기서열로 이루어지는 SML-061 프라이머 세트;
    서열번호 37과 38의 염기서열로 이루어지는 SML-021 프라이머 세트;
    서열번호 39와 40의 염기서열로 이루어지는 SML-022 프라이머 세트;
    서열번호 41과 42의 염기서열로 이루어지는 SML-026 프라이머 세트;
    서열번호 43과 44의 염기서열로 이루어지는 SML-028 프라이머 세트;
    서열번호 45와 46의 염기서열로 이루어지는 SML-032 프라이머 세트; 및
    서열번호 47과 48의 염기서열로 이루어지는 SML-037 프라이머 세트;로 구성된 군의 모든 프라이머 세트를 포함하는 하기 표1의 상추 품종으로 구성된 군으로부터 선택되는 상추품종 식별용 프라이머 세트. 연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사 1 조아라 권농종묘 46 생그랑쌈 삼성종묘 2 핫레드 권농종묘 47 만홍포찹 삼성종묘 3 청정흑치마 권농종묘 48 건강적오크 동원농산종묘㈜ 4 대풍적치마 권농종묘 49 건강청오크 동원농산종묘㈜ 5 온그린 권농종묘 50 진풍적축면 동원농산종묘㈜ 6 선풍2호 권농종묘 51 시저스레드 동원농산종묘㈜ 7 삼복먹치마 권농종묘 52 하트적치마 그린하트바이오 8 만풍자치마 권농종묘 53 레드스타 한국다끼이㈜ 9 권농포찹이 권농종묘 54 만추레드스타 한국다끼이㈜ 10 홍쌈 권농종묘 55 윈터그린 한국다끼이㈜ 11 새로나흑치마 권농종묘 56 뚝섬청축면 현대종묘㈜ 12 청포찹축면 권농종묘 57 열강적치마 현대종묘㈜ 13 퍼스트결구 권농종묘 58 로즈퀸적축면 대농종묘㈜ 14 베스트결구 권농종묘 59 생그린 씨덱스㈜ 15 빨간오크립 권농종묘 60 루벨라2호 씨덱스㈜ 16 적삼각채 권농종묘 61 부띠끄 ㈜동부한농 17 온풍적치마 권농종묘 62 로얄적오크 경신종묘㈜ 18 오페라적축면 권농종묘 63 유레이크 평화종묘㈜ 19 미풍포찹적축면 권농종묘 64 적사계 농촌진흥청 20 청쌈로메인 권농종묘 65 풍성 농촌진흥청 21 홍풍치마 권농종묘 66 만상 농촌진흥청 22 장풍적축면 권농종묘 67 천상 농촌진흥청 23 청풍치마 권농종묘 68 적하계 농촌진흥청 24 청풍여름치마 권농종묘 69 청하계 농촌진흥청 25 홍풍여름치마 권농종묘 70 아담 농촌진흥청 26 열풍적치마 권농종묘 71 센세이션 한국다끼이㈜ 27 먹치마 권농종묘 72 강풍적치마 권농종묘 28 태풍여름적축면 권농종묘 73 모스트청쌈 권농종묘 29 화풍적포기 권농종묘 74 삼성그린 삼성종묘 30 제일여름흑 제일종묘농산 75 아이스레드 권농종묘 31 제일알로에 제일종묘농산 76 에보니블랙 권농종묘 32 아시아진빨치마 아시아종묘㈜ 77 에스에스33 삼성종묘 33 만추흑적오크 아시아종묘㈜ 78 적단 농촌진흥청 34 진빨롤라 아시아종묘㈜ 79 하이그린 삼성종묘 35 삼각추 아시아종묘㈜ 80 골드그린 권농종묘 36 적삼각추 아시아종묘㈜ 81 탑그린 권농종묘 37 천풍 농우바이오 82 탑레드 권농종묘 38 참존 농우바이오 83 선풍포찹적축면 권농종묘 39 오향적치마 농우바이오 84 갈레라 누넴스비브이 40 보배적치마 농우바이오 85 선풍3호 권농종묘 41 연산홍적축면 농우바이오 86 자바흑치마 권농종묘 42 홍화적축면 농우바이오 87 레드원 권농종묘 43 다발적축면 농우바이오 88 에이스 권농종묘 44 여름참맛적치마 미래종묘 89 여름생채 제일종묘 45 선조흑치마 미래종묘 90 개량담배 제일종묘
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상추 품종 식별용 프라이머 세트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 따른 프라이머 세트; 및
    PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)에 필요한 시약;
    을 포함하는, 상추 품종 식별용 키트.
  4. a) 상추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제 1항 또는 제 2항에 따른 상추 품종 식별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는, 상기 표1의 상추 품종으로 구성된 군으로부터 선택되는 상추의 품종을 식별하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 게놈 DNA는 상추의 종자, 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 상추의 품종을 식별하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 상추의 품종의 식별방법은 겔 전기영동, DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 상추의 품종을 식별하는 방법.
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