KR101301867B1

KR101301867B1 - 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트

Info

Publication number: KR101301867B1
Application number: KR1020110018754A
Authority: KR
Inventors: 홍지화; 권용삼; 송영환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-03-03
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2013-09-02
Also published as: KR20120100095A

Abstract

본 발명은 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 품종에 대해 다형성을 보이는 초위성체 마커 및 이를 이용한 양파 품종의 식별방법으로, 상기 본 발명에 따른 초위성체 마커는 상기 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 품종을 식별할 수 있어, 양파 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사간의 종자 분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정, F1 순도검정 등과 같은 여러 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트{Microsatellite primer set for identifying onion varieties}

본 발명은 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 품종에 대해 다형성을 보이는 초위성체 마커 및 이를 이용한 양파 품종의 식별방법에 관한 것이다.

분자 표지는 농작물의 내병성 또는 기능성과 관련된 유전자의 지도 작성(mapping) 및 형질 연관 마커의 개발, 형질과 관련된 양적 유전자의 염색체상 위치의 확인(QTL, Quantitative Trait Locus), 분자표지를 이용한 F1 순도검정 등과 같은 여러 가지 분자 육종 분야에 활용되고 있다. 또한 분자표지 연구는 식물 품종 보호분야에서도 활용되고 있다. 국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 DNA 마커를 신품종의 특성조사와 식물 신품종보호권 부여에 활용하기 위한 논의를 진행 중이며 아직까지 유전자 수준에서 단순한 염기서열 차이를 품종의 구별성으로 인정하고 있지는 않으나, 품종식별을 위한 분자표지의 활용 가능성을 제안하고 있다. 구체적으로는 육종가의 권리보호를 위해 분자 표지를 활용함에 있어 과거에 주로 사용하였던 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)나 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA) 분석 기술에 의한 결과는 인정하지 않고 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(Simple Sequence Repeat) or Microsatellite, SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 및 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)방법을 활용하는 것을 제안하고 있다는 점이다.

일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성검정과 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA분석 방법은 표현형에 근거한 식별방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다.

실제로 국내외 품종 식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황을 살펴보면, 우리나라에서는 농촌진흥청에서 벼, 콩 등에 대한 SSR 분자표지를, 딸기에 대한 CAPS 분자표지를 이용한 품종 식별 기술을 보고한 바 있다. 또한, 국립종자원은 SSR 분자표지를 이용하여 고추, 배추, 수박, 토마토, 복숭아 등에 대한 작물의 DNA 프로파일을 데이터베이스화 하였으며, 종자 분쟁 발생 시 이를 중재하기 위한 수단으로서 몇몇 작물의 분자 표지를 직접 이용하고 있으며 최근에는 품종보호 출원 작물에 대한 대조품종 선정에 유전자 분석 결과를 보조 자료로 활용하고 있다. 한편, 품종식별용 SSR 분자표지 중 순도검정용 마커에 대해서는 육종가 지원을 위한 박과작물 F1 순도검정에 활용한바 있다.

국외 국가의 사례를 살펴보면, 스페인에서는 포도 등의 작물에 SSR 분석 기술을 이용하여 각 품종 별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하여 기본유래 품종의 식별, 기존품종의 관리 등에 활용하고 있다. 중국의 경우 옥수수 약 4000품종에 대하여 SSR, SNP 분자표지를 이용한 DNA 프로파일을 데이터베이스화하고 있으며 법원에서도 품종보호 침해사례 판단에 유전자분석 결과를 적극 활용하고 있다. 일본은 복숭아, 배, 사과 등에 SSR 분자표지와, 딸기, 차에 CAPS 분자표지를 활용한 품종 식별 방법을 개발하여 육종가 권리 보호에 활용하고 있다.

한편, 백합과 작물인 양파는 생으로 직접 이용되고 있으며 최근 건강식품에 대한 선호도가 증가되면서 양파 즙 등 가공식품의 재료로 이용도가 증가되고 있다. 국립종자원에 신고 된 양파의 국내 육성 품종 및 생산판매신고 품종 수는 941품종(2010년 12월 31일 기준)으로 종자 시장에서 차지하는 비중이 높다고 할 수 있다. 양파는 재배기간이 상대적으로 길어 육종 시 목표형질 선발에 시간이 소요되기에 분자표지를 이용한 육종 및 DNA 분석 방법에 의한 품종식별의 중요도가 증대되고 있으며, 이에 대한 기술 확립이 시급한 상황이다.

양파에 대한 분자 표지 연구 개발 동향을 살펴보면, 양파(Onion)는 재배되는 식물 중 가장 큰 게놈 사이즈(16,415 Mbp of DNA per 1C nuclus)를 가진 것으로 알려져 있다. 이는 백합과 Allium속 작물 중 파(Bunching onion) 보다 28% 큰 게놈 사이즈 이다. 이에 Allium속 작물에 대한 분자 유전학 연구는‘양파’보다는 연구가 좀 더 용이한‘파’를 중심으로 이루어지고 있다. 현재 일본을 중심으로 연구가 활발하게 진행되고 있으며 일본의 채소작물 DNA 마커 데이터베이스 (http://vegmarks.nivot.affrc.go.jp)에 파의 SSR, AFLP 등의 마커를 공개하고 있다. 또한, 미국에서는 EST(Expressed Sequence Tag)를 활용하여 양파 EST-SSR 분자표지를 개발하여 비교유전체 연구를 수행하고 있다(Kuhl J. C. et al. 2004. The Plant Cell. 16: 114-125).

그러나 국내에서 유통되는 품종을 대상으로 초위성체 마커 세트를 이용하여 양파 품종을 식별할 수 있는 적절한 마커 조합의 선별 및 관련 세부적인 기술은 아직까지 국내적으로 확립되지 못한 상태이다. 이는 양파가 중요한 채소 작물임에도 불구하고 분자 생물학 연구 및 분자유전학적인 기초 자료가 가지과(고추, 토마토 등), 박과(수박, 오이 등) 등의 작물에 비해 부족하고, 큰 게놈 사이즈로 인해 품종간 다형성을 나타내는 마커 선별이 매우 어렵기 때문인 것으로 파악된다.

한편, SSR 마커는 유전적인 연관관계가 먼 종간일지라도 마커의 통용성(transferability)이 인정되는 장점이 있다.

이에 본 발명자들은 양파 게놈에서 직접 genomic library를 제작하여 SSR 마커를 개발하는 방법에 비해 시간 및 비용을 크게 절약 할 수 있고, 공개된 양파 마커만으로 품종식별이 어려운 점을 극복할 수 있는 양파 품종식별 방법에 대한 연구를 지속해오던 중, 양파의 품종식별에 있어 아직 활용된 바 없는 Allium속 작물인 ‘파’의 SSR 분자표지를 양파의 마커와 함께 적용함으로써 양파 품종 진위성에 대한 과학적 검증 등에 실용적으로 활용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 국내에서 최초로 양파 79개 유통품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커 및 이를 이용한 양파 품종의 식별방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 양파 품종 식별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 양파 품종의 진위성 규명, 양파 품종보호 출원품종의 대조 품종 선정 또는 F1 순도검정을 위한 양파의 품종을 식별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 유통품종에 대해 다형성을 나타내는 양파 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 양파 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 양파 품종의 진위성 규명, 양파 품종보호 출원품종의 대조 품종 선정 또는 F1 순도검정을 위한 양파의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

서열번호 1과 2의 염기서열로 이루어지는 ACE039 프라이머 세트;

서열번호 3과 4의 염기서열로 이루어지는 ACM024 프라이머 세트;

서열번호 5와 6의 염기서열로 이루어지는 AFS111 프라이머 세트;

서열번호 7과 8의 염기서열로 이루어지는 ACE020 프라이머 세트;

서열번호 9와 10의 염기서열로 이루어지는 AFA08G10 프라이머 세트;

서열번호 11과 12의 염기서열로 이루어지는 ACM071 프라이머 세트;

서열번호 13과 14의 염기서열로 이루어지는 ACM154 프라이머 세트;

서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 AFAT05D09 프라이머 세트;

서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 AFA23C12 프라이머 세트;

서열번호 19와 20의 염기서열로 이루어지는 AFS015 프라이머 세트;

서열번호 21과 22의 염기서열로 이루어지는 AFAT09E05 프라이머 세트;

및

서열번호 23과 24의 염기서열로 이루어지는 AFA11C12 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 양파 품종 식별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따른 양파 품종 식별용 프라이머 세트는 ‘파’의 SSR 분자표지를 양파의 마커와 함께 양파에 적용함으로써 국내 유통되는 양파 품종에 대한 높은 다형성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 양파 품종 식별용 프라이머 세트는 상기‘파’의 SSR 분자표지 및 양파의 마커를 동시에 적용함으로써 양파 게놈에서 직접 genomic library를 제작하여 SSR 마커를 개발하는 방법에 비해 시간 및 비용을 크게 절약 할 수 있고, 공개된 양파 마커만으로 품종식별이 어려운 점을 극복할 수 있는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 양파 품종 식별에 적절한 프라이머 조합의 선별에 있어 상기 ‘파’ 및 ‘양파’의 SSR 분자표지를 프라이머 세트로 이용하여 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 품종의 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 대립 유전자의 PIC(Polymorphic Information Content) 값을 살펴보았을 때 상기 선별된 양파 품종 식별용 프라이머 세트가 양파 품종 식별 방법에 적합함을 확인하였다.

본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 VIC, NED, FAM 또는 PET 이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5‘-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명은 상기 양파 품종 식별용 프라이머 세트(서열번호 1 내지 24); 및

PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)에 필요한 시약;

을 포함하는, 양파 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 적당량의 DNA 중합 효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물, KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유한 PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 RT-PCR 에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은

a) 양파로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 양파 품종 식별용 프라이머 세트(서열번호 1 내지 24)를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;

를 포함하는, 양파의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 게놈 DNA는 양파의 종자, 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물로부터 분리될 수 있다. 보다 상세하게는 양파 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎 또는 줄기로부터 게놈 DNA를 분리하기도 하지만, 본 발명에서는 양파 종자로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 종자에서 직접 게놈 DNA를 분리하면 식물체를 키우지 않아도 되기에, 분석 시 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 양파 품종 식별용 프라이머 세트는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22 및 서열번호 23과 24의 세트로부터 선택되는 1종 이상인 프라이머 세트를 포함한다.

이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다.

겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 증폭된 산물로부터 양파 품종을 식별하는 단계는 자동 염기서열분석장치를 이용하여 대립 유전자(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인한 다음, 각각의 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로는, 각각의 양파 품종에 대하여 본 발명의 양파 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고, 상기 증폭된 산물과의 비교 분석을 통해 양파 품종을 식별할 수 있다. 하기 도 1은 각각의 양파 품종에 대해 각 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성한 것이다. 구체적으로 도 1은 양파 79개 품종을 대상으로 본 발명의 12개의 양파 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 각각 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.

따라서, 품종을 식별하고자 하는 양파로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 마커를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 1의 결과를 비교 분석함으로써 양파 품종을 식별할 수 있다.

본 발명에 따른 양파 품종 식별용 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 양파 79개 품종을 식별할 수 있어, 양파 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사 간의 종자 분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정, F1 순도검정 등과 같은 여러 분야에 양파 품종 식별용 초위성체 마커로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 양파 79개 품종을 대상으로 본 발명에 따른 양파 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 양파 품종 식별용 프라이머 세트에 의해 분석된 각 양파 품종을 코드화하고, NTSYS pc 컴퓨터 프로그램을 활용하여 양파 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예] 양파 품종 식별 방법

(1) 양파 시료

본 발명에서는 하기 표 1에 기재된 양파 79개 품종을 양파 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 양파 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.

(2) 양파 게놈 DNA 의 분리

상기 표 1에 기재된 공시 양파 품종의 종자 15 내지 20 립을 2 ㎖ Eppendorf 튜브에 텅스텐 구슬 2개를 넣고 분쇄기(FRITSCH, Germany)에 돌려 종자를 고르게 마쇄하였다. 이어 2 ㎖ 튜브에 NucleoSpinPlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250)키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 세포 용해 버퍼(lysis buffer)는 PL2를 사용하였다. 추출된 게놈 DNA는 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 PCR 분석을 위해 냉동고(-20℃)에서 보관하였다.

(3) 프라이머 세트의 제작

본 발명의 프라이머 세트를 위한 후보 물질로는 양파(Allium cepa L.)뿐만 아니라 Allium속(파속) 작물 의 하나인 파(Allium fistulosum L.)의 프라이머도 함께 이용하였다.

일본의 채소작물 DNA 마커 데이터베이스 (http://vegmarks.nivot.affrc.go.jp)에 공개된 파 및 양파의 SSR 마커 중 총 219개(파 204개, 양파 15개) 프라이머 세트를 이용하였다. 국내 유통품종을 구분할 수 있는 마커를 선발하기 위하여 레드프라임, 파워볼, 로망, 레드썬, 한터505, 팝, 한터410, 마루시노310, 마루시노330, 뉴마르스, 장춘2호, 조생소닉 품종의 DNA를 분리하여 219개의 프라이머 세트를 이용하여 유전자 증폭한 다음 반복간 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗하면서 다형성 정도가 높은 마커를 15개 선발하였다.

상기 선발된 15개 마커의 분자 표지에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀 분석을 추진하기 위하여, 정방향 프라이머가 형광 발생 물질 VIC, NED, FAM 및 PET 중 하나의 형광인자로 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다. 그리고 이 15개 마커를 이용하여 국내에서 유통되고 있는 양파 79품종에 확대하여 적용하였을 때 품종 식별 능력이 높은 최종 12개의 마커를 선정하였다. 공시 양파 품종에 다형성을 보이는 프라이머 세트의 염기 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

(4) PCR 증폭 및 전기영동

상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 양파 게놈 DNA 20 ng, 10 pmol의 상기 프라이머 세트로 이루어진 마커, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq DNA polymerase 1U(GeNet bio, Korea), 2.5 ㎕의 10×PCR Buffer(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl₂)에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다.

PCR(Biometra, Germany) 증폭은 94℃에서 4분 동안 양파 게놈 DNA를 충분히 변성(denaturation)시킨 다음, 94℃에서 변성 30초, 55℃에서 결합(annealing) 30초, 72℃에서 신장(extension) 30초를 35회 반복 수행한 후 PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 신장 5분을 수행하였다. PCR이 완료된 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동 하여 증폭 여부를 확인하였다.

상기 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 초순수 150 ㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 3 내지5 ㎕(증폭량에 따라 조절)의 PCR 산물을 탈이온 된 포름아마이드(deionized formamide) 10 ㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(Size marker)(LIZ500 size standard) 0.25 ㎕를 잘 혼합하여 섞은 다음 94℃에서 2분간 변성시켰다.

상기 변성시킨 유전자 증폭 산물은 자동염기서열 분석장치(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기 영동한 다음 GeneMapper 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 SSR 분자 표지별 대립 유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.

(5) 본 발명에 따른 마커의 양파 품종 식별 가능성 검정

상기에서 자동염기서열 분석장치로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 양파 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다.

하기 식 1에서 K는 각 대립유전자의 총 밴드수이며 P_i는 마커의 밴드 중에서 i 번째 공통 밴드패턴의 빈도수이다(Anderson et al. 1993).

그 결과, 각 마커에 따른 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 ACE039 마커는 0.448의 가장 낮은 PIC 값을 나타내었고, ACE020 마커는 0.745의 가장 높은 PIC 값을 나타내었다. 마커의 평균 PIC값은 0.575로 다소 높게 나타났다.

이는, 본 발명의 마커가 양파 품종을 충분히 식별 가능하게 할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.

또한, 본 발명에 따른 마커에 대해 대립유전자(밴드) 크기의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수“1”로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 “0”으로 코드화하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 품종을 식별하고자 하는 양파로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 1의 결과를 비교 분석함으로써 양파 품종을 식별할 수 있는 자료로 사용될 수 있다.

상기 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal, 1973)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서도 확인할 수 있듯이 ‘레드프라임’ 과 ‘다까다마’, ‘마루시노310’ 과 ‘야무진’, ‘뉴마르스’ 와 ‘무쏘’, ‘따봉황’ 과 ‘DB-301’, ‘퍼펙트’ 와 ‘천주황’, ‘고꾸와세320’ 과 ‘자이언트’, ‘라피도300’ 과 ‘보라조생황’, ‘마이볼’ 과 ‘에스앤피1’, ‘슈퍼하이볼’ 과 ‘천주중고’, ‘미래황’ 과 ‘메이킹’, ‘팝’ 과 ‘왕중왕’, ‘파라오’ 와 ‘슈퍼볼황’, ‘대지황’ 과 ‘쯔리마루’, ‘카스’ 와 ‘대풍’ 은 유전적 유사도가 매우 큰 품종인 것을 확인할 수 있었고, 상기의 결과로부터 본 발명의 프라이머 세트는 모든 품종의 구별을 가능하게 함을 확인할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1과 2의 염기서열로 이루어지는 ACE039 프라이머 세트;
서열번호 3과 4의 염기서열로 이루어지는 ACM024 프라이머 세트;
서열번호 5와 6의 염기서열로 이루어지는 AFS111 프라이머 세트;
서열번호 7과 8의 염기서열로 이루어지는 ACE020 프라이머 세트;
서열번호 9와 10의 염기서열로 이루어지는 AFA08G10 프라이머 세트;
서열번호 11과 12의 염기서열로 이루어지는 ACM071 프라이머 세트;
서열번호 13과 14의 염기서열로 이루어지는 ACM154 프라이머 세트;
서열번호 15와 16의 염기서열로 이루어지는 AFAT05D09 프라이머 세트;
서열번호 17과 18의 염기서열로 이루어지는 AFA23C12 프라이머 세트;
서열번호 19와 20의 염기서열로 이루어지는 AFS015 프라이머 세트;
서열번호 21과 22의 염기서열로 이루어지는 AFAT09E05 프라이머 세트;
및
서열번호 23과 24의 염기서열로 이루어지는 AFA11C12 프라이머 세트;로 이루어진 군의 모든 프라이머 세트를 포함하는, 표1의 양파 품종으로 구성된 군으로부터 선택되는 양파 품종 식별용 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 양파 품종 식별용 프라이머 세트.
제 1항 또는 제 2항에 따른 프라이머 세트; 및
PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)에 필요한 시약;
을 포함하는, 양파 품종 식별용 키트.
a) 양파로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제 1항 또는 제 2항에 따른 양파 품종 식별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 게놈 DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는, 표1의 양파 품종으로 구성된 군으로부터 선택되는 양파의 품종을 식별하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 게놈 DNA는 양파의 종자, 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 양파의 품종을 식별하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 양파의 품종의 식별방법은 겔 전기영동, DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 양파의 품종을 식별하는 방법.