KR101769874B1

KR101769874B1 - 양파 종내 또는 종간 구분을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101769874B1
Application number: KR1020150143979A
Authority: KR
Inventors: 이정호; 이민지; 박지혜
Original assignee: 주식회사녹색식물연구소
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2017-08-21
Also published as: KR20170044374A

Abstract

본 발명은 양파 종내 또는 종간 구분을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 양파 종자 생산에 사용하는 웅성불임 계통 뿐만 아니라, 양파의 품종 개량을 위하여 사용되어지는 양파 근연종을 구별함으로써, 양파 품종 개발 기간을 앞당기고 다양하고 우수한 품종 개발을 체계적으로 수행하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

양파 종내 또는 종간 구분을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for discriminating Allium cepa intra- or inter-species and uses thereof}

본 발명은 양파 종내 또는 종간 구분을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

양파(Allium cepa)의 종자 생산을 위해서 세포질 웅성불임 계통(Cytoplasmic Male Sterile line, CMS line)을 이용하고 있으며, 정상 계통을 N-타입(N-type)이라고 하며, CMS 계통으로 S-타입(S-type)과 T-타입(T-type)이 일반적으로 사용되고 있다. 이와 더불어 새로운 CMS 계통인 K156929가 유전자원센터에 등록되어 있다. 또한, 양파는 그 활력을 높이거나 새로운 형질 도입을 위하여 양파의 근연종을 교배친으로 사용하는데, 그 대표적인 종으로 알리움 갈란툼(Allium galanthum), 알리움 로이레이(Allium roylei) 및 알리움 바빌로비이(Allium vavilovii)가 있다. 양파의 육종과 종자 생산에 있어서 상기 양파 계통과 양파 근연종으로 이루어진 유전자원의 교배에 의해 이루어지면, 이들의 모계를 추적하는 기술은 효율성에 있어서 매우 중요하다.

그러나 양파는 2년생 작물이기 때문에 자식검정과 표현형에 의해 이들의 세포질 타입을 검정한다면 최소 4 년 이상의 시간이 소비된다. 하지만 분자 마커를 이용한다면 표현형에 의한 검정보다 F1 육종의 시간을 대폭 단축시킬 수 있고, 이것에 의해 많은 비용과 노동력 또한 줄일 수 있다.

한국등록특허 제1338472호에는 '양파의 웅성불임 다형성 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1301867호에는 '양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '양파 종내 또는 종간 구분을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 7종의 양파 계통과 근연종의 엽록체 유전체의 완전 염기서열을 밝히고, 엽록체 유전체에서 나타나는 차이를 이용하여 각 엽록체 일배체형(haplotype)을 구분할 수 있는 프라이머 세트 4쌍을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함하는, 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 양파 종자 생산에 사용하는 웅성불임 계통 뿐만 아니라, 양파의 품종 개량을 위하여 사용되어지는 양파 근연종을 구별함으로써, 양파 품종 개발 기간을 앞당기고 다양하고 우수한 품종 개발을 체계적으로 수행하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 7종의 양파 계통(N, S, T, CMS) 및 근연종(알리움 바빌로비이(Allium vavilovii), 알리움 로이레(Allium roylei), 알리움 갈란툼(Allium galanthum)의 엽록체 유전체 분석에 근거한 계통도를 나타낸다.
도 2는 SM1과 SM2 마커를 이용한 일배체형 분석 결과를 나타낸다. A: 아가로스 젤에서 분리된 SM1과 SM2 PCR 산물. B: 바이오아날라이저(Bioanalyzer)를 이용한 SM1과 SM2 PCR 산물의 혼합물의 정밀 분리도. N-타입(N), T-타입(T), 알리움 바빌로비이(VAV), 알리움 로이레(ROY), S-타입(S), CMS-타입(CMS), 알리움 갈란툼(GAL). 16은 VAV, 15는 ROY, 14는 GAL을 의미한다.
도 3은 바이오아날라이저(Bioanalyzer)에서 분리된 SM1과 SM2 PCR 산물의 혼합물 크로마토그램 결과를 나타낸다. N-타입(N), T-타입(T), 알리움 바빌로비이(VAV), 알리움 로이레(ROY), S-타입(S), CMS-타입(CMS), 알리움 갈란툼(GAL).
도 4는 SM3과 SM4 마커를 이용한 알리움 로이레(ROY), S-타입(S)의 일배체형 분석 결과를 나타낸다. A: 아가로스 젤에서 분리된 SM3과 SM4 PCR 산물. B: 바이오아날라이저(Bioanalyzer)에서 분리된 SM3과 SM4 PCR 산물의 혼합물. 15는 ROY을 의미한다.
도 5는 4종의 SM1 내지 SM4 마커를 이용한 양파 계통과 근연종의 일배체형 분석 결과를 나타낸다. N-타입(N), T-타입(T), 알리움 바빌로비이(VAV), 알리움 로이레(ROY), S-타입(S), CMS-타입(CMS), 알리움 갈란툼(GAL).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 일배체형(haplotype)은 하나의 집단 내에서 발견된 여러 부위의 유전자 다형성(polymorphism)을 통계학적인 개연성에 근거하여 조합한 유전자형으로, 각각의 유전자 다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전 정보를 제공하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 서열 내의 각각 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 분자 마커로 이용된다. 상기 분자 마커를 개발하기 위해, 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종의 엽록체 유전체 완전 염기서열을 밝히고, 엽록체 유전체에서 나타나는 차이를 이용하여 각 엽록체 일배체형(haplotype)을 구분할 수 있는 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 선발하였다.

본 발명의 프라이머 세트에 의해 양파(Allium cepa)의 웅성불임과 웅성가임을 구분할 수 있으며, 웅성불임 유형 중 S-타입, T-타입 및 K156929를 구분할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 양파와 양파(Allium cepa)의 근연종을 구분할 수 있으며, 바람직하게는 근연종 중 알리움 갈란툼(Allium galanthum), 알리움 로이레이(Allium roylei) 및 알리움 바빌로비이(Allium vavilovii)를 구분할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은

양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통 또는 근연종을 구분하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 폴리머라제를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 되며, 이렇게 표지 된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 양파 4계통 및 근연종 3종에 대한 엽록체 염기서열 분석

양파 4계통(N-타입, S-타입, T-타입, CMS 타입(K156929)) 및 근연종 3종(알리움 갈란툼, 알리움 로이레, 알리움 바빌로비이)을 대상으로 엽록체 DNA의 완전 염기서열을 분석하였다. 표 1에 본 발명에 사용한 양파 계통과 근연종의 정보를 명시하였다.

7종의 엽록체 유전체를 비교 분석한 결과 56개의 유전자에서 229개의 SNP가 존재함을 확인하였다. 이들의 유연관계는 Paup ver 10.4에서 MP 계통도로 확인하였다(도 1). 상기 7종의 엽록체 유전체는 4개의 기본 일배체형(haplotype)을 가지는 것으로 나타났다. 그 결과 첫번째는 양파의 N-타입, T-타입, 알리움 바빌로비이 그룹, 두번째 그룹은 CMS-타입과 알리움 갈란툼이, 세번째와 마지막 그룹은 각각 알리움 로이레 및 양파 S-타입으로 나뉘어 총 4 그룹으로 분리됨을 확인하였다.

실시예 2. 엽록체 일배체형을 구분하기 위한 프라이머 제작 및 PCR 분석

실시예 1을 통해 얻은 엽록체 일배체형을 PCR 산물의 크기로 구분할 수 있는 4개의 PCR 프라이머 세트를 제작하였다(표 2).

본 발명에 사용된 마커용 프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열(5'-3')	서열번호
SM1 정방향 프라이머	AATGATATATCCGTTTCTTC	1
SM1 역방향 프라이머	ACATGTAATGATAATAGTC	2
SM2 정방향 프라이머	CGTCCAGTAGCTACAACAGTC	3
SM2 역방향 프라이머	CGGATATTGGACACTCTACAG	4
SM3 정방향 프라이머	TATTTTTTTTATATATGCCC	5
SM3 역방향 프라이머	GTTTATTCATCTCTACAG	6
SM4 정방향 프라이머	TTTATCTCCATTCCAAGTGT	7
SM4 역방향 프라이머	TAAATGTTCAATGTCCCTTG	8

제작된 프라이머는 양파 계통 또는 근연종의 엽록체 일배체형 판별 마커로서의 가능성을 검토하기 위하여 7종의 양파 및 근연종 식물에서 PCR를 실시하였다. SM1과 SM2 마커을 위한 PCR 반응은 96℃ 4분 동안 DNA를 변성시킨 후 96℃에서 30초, 45℃에서 30초(touchdown 0.1℃/초), 72℃에서 1분으로 총 35회 증폭한 다음 72℃에서 10분 동안 신장과정으로 수행하였다. SM3와 SM4 마커을 위한 PCR 반응은 96℃ 4분 동안 DNA를 변성시킨 후 96℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 총 35회 증폭한 다음 72℃에서 10분 동안 신장과정으로 수행하였다. PCR 반응 이후 일차적으로 0.8%(w/v) 아가로스 젤을 이용하여 PCR 산물을 분리하였으며, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, 독일)를 이용하여 PCR 산물을 분리하였으며 Agilent DNA 1000 Kit을 사용하였다.

SM1 마커를 이용하면 N-타입(N), T-타입(T), 알리움 바빌로비이(VAV) 그룹과 양파 S-타입(S), CMS-타입(CMS), 알리움 로이레(ROY), 알리움 갈란툼(GAL)이 속하는 그룹의 총 2개의 그룹으로 분리되었다(도 2A). SM2 마커를 이용하면 두 그룹으로 나뉘며, 첫번째 그룹에는 N-타입, T-타입, S-타입, 알리움 바빌로비이(N/T/VAV) 및 알리움 로이레가 속하며 두번째 그룹에는 CMS-타입 및 알리움 갈란툼이 포함됨을 확인하였다(도 2A). SM1과 SM2 마커를 같이 사용하면 N-타입, T-타입, 알리움 바빌로비이가 속하는 첫번째 그룹, S-타입 및 알리움 로이레가 속하는 두번째 그룹, 마지막으로 CMS-타입 및 알리움 갈란툼이 속하는 세번째 그룹으로 분리되었다(도 2B, 도 3 및 도 5).

양파 S-타입 및 알리움 로이레는 SM3과 SM4 마커를 통하여 분리하였다. SM3과 SM4 마커는 각각 알리움 로이레와 양파 S-타입을 구별할 수 있고, 같이 사용할 수도 있었다(도 4 및 5).

<110> GREENPLANT INSTITUTE <120> Primer set for discriminating Allium cepa intra- or inter-species and uses thereof <130> PN15321 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aatgatatat ccgtttcttc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acatgtaatg ataatagtc 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtccagtag ctacaacagt c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggatattgg acactctaca g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tatttttttt atatatgccc 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtttattcat ctctacag 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tttatctcca ttccaagtgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taaatgttca atgtcccttg 20

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 S-타입, T-타입 및 K156929로 이루어진 군으로부터 선택된 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통; 및 알리움 갈란툼(Allium galanthum), 알리움 로이레이(Allium roylei) 및 알리움 바빌로비이(Allium vavilovii)로 이루어진 군으로부터 선택된 근연종을 구분하기 위한 프라이머 세트.
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양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, S-타입, T-타입 및 K156929로 이루어진 군으로부터 선택된 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통; 및 알리움 갈란툼(Allium galanthum), 알리움 로이레이(Allium roylei) 및 알리움 바빌로비이(Allium vavilovii)로 이루어진 군으로부터 선택된 근연종을 구분하기 위한 방법.
제1항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, S-타입, T-타입 및 K156929로 이루어진 군으로부터 선택된 양파(Allium cepa)의 웅성불임 계통; 및 알리움 갈란툼(Allium galanthum), 알리움 로이레이(Allium roylei) 및 알리움 바빌로비이(Allium vavilovii)로 이루어진 군으로부터 선택된 근연종을 구분하기 위한 키트.
제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충액을 포함하는 것인 키트.