KR102332688B1 - 인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 InDel 분자마커는 다양한 국내인삼 품종 중에서 '선향' 품종만을 신속·정확하게 구별할 수 있으므로, 인삼 품종의 육종 및 개발과 한약재로 가공되어 유통되는 과정에서 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질 관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating Panax ginseng 'SeonHyang' cultivar and uses thereof}

본 발명은 인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

고려인삼 (Panax ginseng)은 아시아 극동지방에서 자생하는 대표적 약용식물로, 자생지 분포 형태가 우리나라의 삼국시대에 고구려의 영토 및 한반도와 일치하며, 고대의 많은 문헌 기록에서 볼 수 있듯 그 전통이 깊고 역사적으로 명성이 높으며, 전통적으로 국제 인삼 시장에서 고려인삼의 가치와 품질이 고가로 인정되는 바, 한국이 인삼의 종주국이라고 할 수 있다. 인삼의 육종은 채종까지 3년, 생육상과 뿌리의 형질 등을 조사하여 우량개체를 선발하는데 5~6년의 기간이 소요되는 등의 특수성으로 인해 우수 품종의 육성까지 수십 년이 걸리는 어려움이 있다.

이러한 난관 속에서도 한국인삼연초연구원으로부터 순계 분리 육종을 통해 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선 등의 다양한 품종이 개발되어 등록되어 있으나, 생육과 증식속도가 느리고 종자의 증식량이 낮은 인삼의 생식 특성으로 인해 종자 생산체계가 제대로 확립되지 못하여 우수 품종이 실제 농가에 보급되는 비율은 미미한 실정이다. 또한 육성된 우수 품종들 간의 식별 방법과 기존의 재래 혼계종과의 식별 방법은 생육과정 중에 경험적인 형태적 관찰을 통해서만 이루어지고 있기 때문에 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되는 실정이다.

형태적으로 구분하는 방법에 있어서도, 파종 후 많은 시간이 지나서야 식별이 가능하기 때문에 이를 악용하여 재래 혼계종의 종자를 개발된 품종의 종자로 둔갑하여 비싼 값에 판매하는 행위가 일어나고 있으며, 이로 인한 농가의 피해가 증가하리라 예상되고 있다. 개발된 품종들에 있어서도 품종 간 식별이 어려운 단점 및 증식 과정의 비의도적 오염과 혼입 등에 의해 품종의 균일도가 현저히 낮아 명품 인삼을 생산하는데 장애 요인으로 지적되고 있다. 또한, 6년에 걸쳐 생산한 생산품은 뿌리 부위만 유통이 되기 때문에 우수한 품종의 생산품과 우수하지 않은 품종 및 재래 혼계종의 식별이 생육 단계가 아닌 생산품에서 가능하여야 하는데 이에 대한 기반 기술은 거의 없는 상태이며 이를 위한 최선의 방법은 품종을 DNA 수준에서 식별할 수 있는 마커의 활용이다.

최근 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위해 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 근래에 발달한 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고, 이를 활용한 분자마커 개발은 인삼 품종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.

본 발명에서는 육안으로 식별이 어려운 14개의 인삼 품종(K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍 및 선향) 중 타품종에 비해 향이 우수한 '선향' 품종을 구별하기 위한 인삼 핵 게놈 서열에 기반한 InDel 마커를 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제1607562호에 '단일염기다형성을 이용한 고려인삼 G-1 품종 선별방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1481723호에 K-1 품종에 특이적인 SNP에 기반한 '고려인삼 K-1 품종 선별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 K-1 품종 선별방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 14개의 인삼 품종의 핵 게놈 서열을 비교하여 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 14개의 인삼 품종을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍 및 선향' 품종으로부터 '선향' 품종을 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '선향' 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 다양한 국내인삼 품종 중에서 '선향' 품종만을 신속·정확하게 구별할 수 있으므로, 인삼 품종의 육종 및 개발과 한약재로 가공되어 유통되는 과정에서 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질 관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 Pg-NC-InDel31 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 14개의 인삼 품종의 PCR 증폭산물을 겔 전기영동한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 및 2의 서열 내의 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(17개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는, 서열번호 1 및 2의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 인삼의 핵 게놈 상에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 인삼 품종 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍 및 선향' 중에서 '선향'을 다른 인삼 품종으로부터 구별할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '선향' 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 인삼 '선향' 품종을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 인삼 '선향' 품종을 구별하는 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 인삼 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 경우, 248 bp 및 274 bp 크기의 밴드가 검출되면 '선향' 품종으로 판별할 수 있고, 274 bp 크기의 밴드가 검출되면 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 또는 천풍' 품종으로 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 인삼의 자원수집 및 게놈 DNA 추출

실험에 사용된 총 14개의 인삼 품종 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 선향, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍'은 농촌진흥청에서 잎 형태로 제공받았으며, -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. DNA 추출은 액체질소로 어린 잎 시료를 급속 냉각하고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 Biomedic사의 plant gDNA Extraction kit를 사용하여 추출하였다.

2. InDel 마커 개발

상기 추출된 14개의 인삼 품종의 게놈 DNA를 대상으로 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 실시하여 인삼 품종들의 DNA 염기서열 정보를 획득한 후 상기 인삼 품종들의 염기서열을 CLC genomics workbench 프로그램(version 8.0.1)을 통해 비교·분석을 수행하여, 'K-1, 금진, 선운 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍' 품종과 '선향' 품종 간의 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)의 차이를 보이는 InDel 다형성 영역을 탐색하였고, 상기 InDel 다형성 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(표 1). 프라이머 세트는 최대 길이, 최소 길이, 증폭 산물의 크기, 온도, GC 비율 등의 조건을 조절하여 제작되었다.

본 발명의 InDel 마커는 선향 품종의 핵 게놈 서열에서 26 bp 염기가 삽입된 다형성 영역에 기반하여 제작된 것이다(표 2).

본 발명의 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	서열(5'→3') (서열번호)
Pg-NC-InDel31_F	TTCCGCTTCATCGTCTCT (1)
Pg-NC-InDel31-R	CGGGTGCCTAACTCTACT (2)

선향 품종의 InDel 다형성 염기서열 정보

선향 품종의 InDel 다형성 염기서열 정보(26bp 염기서열 삽입) (서열번호 3)

TTCCGCTTCATCGTCTCTAATGTTCACAAATACATCATACAAATTCTCTGGAAAAGGGCACGTCAAAATAAGCAAGTA TAAGTGAATAACTTCTATTAGAATGA TTTGGTTGTGTTAGGGCTATAAAAAACGGAGTCTAGTTGAATTTTTGGCTTGCCAAAACTTGAGTTCGACTAATATAGTAATATTTAAACTAGTTGAGTCAAGTTTTAAAGAGCCTAAACCTGGTGTTACAAACTGGCTCATTTAATAAACCAGTAGAGTTAGGCACCCG

밑줄 : 프라이머 위치

굵은 글씨 및 밑줄 : 염기서열이 삽입된 위치

3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭

상기 추출된 인삼 품종별 게놈 DNA를 10 ng/㎕로 희석하여 DNA 2 ㎕(DNA 10 ng), InDel marker 2 ㎕(forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕), Taq mixture 10 ㎕, 증류수 6 ㎕을 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 52℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

실시예 1. 본 발명의 InDel 마커를 이용한 인삼 '선향' 품종의 구별

인삼 품종 간의 InDel 다형성에 기반하여 제작된 Pg-NC-InDel31 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 다양한 인삼 품종들의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 Pg-NC-InDel31 프라이머 세트의 다형성 패턴 분석을 수행하였다.

그 결과, 인삼 '선향' 품종에서는 248 bp 및 274 bp의 밴드가 확인되었고, 나머지 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍' 품종에서는 274 bp의 밴드가 확인되어, 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍 및 선향'을 포함하는 인삼 품종으로부터 '선향' 품종을 특이적으로 구별하는 것이 가능함을 확인하였다(도 1).

상기 결과에서 '선향' 품종에서 double 밴드가 검출된 이유는, 핵은 헤테로(hetero) 상태로, 모계에서 온 염색체와 부계에서 온 염색체의 크기가 다른 경우가 존재하기 때문에 이러한 차이로 인해 double 밴드로 검출된 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating Panax ginseng 'SeonHyang' cultivar and uses thereof <130> PN21295 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttccgcttca tcgtctct 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgggtgccta actctact 18 <210> 3 <211> 274 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 3 ttccgcttca tcgtctctaa tgttcacaaa tacatcatac aaattctctg gaaaagggca 60 cgtcaaaata agcaagtata agtgaataac ttctattaga atgatttggt tgtgttaggg 120 ctataaaaaa cggagtctag ttgaattttt ggcttgccaa aacttgagtt cgactaatat 180 agtaatattt aaactagttg agtcaagttt taaagagcct aaacctggtg ttacaaactg 240 gctcatttaa taaaccagta gagttaggca cccg 274

Claims (4)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 프라이머 세트.
2. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '선향' 품종 구별용 키트.
3. 인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '선향' 품종을 구별하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 인삼 '선향' 품종을 구별하는 방법.

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