KR101795937B1 - 호접란 품종 식별을 위한 kslg-cp001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 호접란 품종의 식별을 위한 KSLG-CP001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 호접란의 다양한 품종에서 P. KS Little Gem 품종을 식별할 수 있는 KSLG-CP001 프라이머 세트와 이를 포함한 마커용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 엽록체 유전체 분석 결과 발견된 길이다형성을 포함하는 유전자 rpl16 의 인트론 부분을 증폭하는 것으로, 이를 이용하여 분석하고자하는 다양한 호접란 품종 시료의 DNA를 증폭한 후 아가로오스 겔 전기영동을 통해 증폭 산물의 길이 다형성을 분석하는 과정을 통해 호접란 품종을 효과적으로 구분할 할 수 있다. 또한 본 발명은 엽록체상의 유전자를 표적으로 하고 있기 때문에 호접란의 모계 기원을 추정할 수 있는 근거가 될 수 있다.

Description

호접란 품종 식별을 위한 KSLG-CP001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물{Primer set KSLG-CP001 for identification of Phalaenopsis and composition of marker comprising the same}
본 발명은 호접란 품종의 식별을 위한 KSLG-CP001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 호접란의 다양한 품종에서 P. KS Little Gem 품종을 식별할 수 있는 KSLG-CP001 프라이머 세트와 이를 포함한 마커용 조성물에 관한 것이다.
호접란은 세계적으로 인기가 많은 화훼작물로, 주로 꽃의 형태와 색 또는 향기 등의 표현형적 특성으로 품종을 구분한다.
애기장대, 벼, 옥수수, 콩 등에서는 차세대 염기서열 분석 방법을 이용하여 제작된 유전체 서열 정보를 이용하여 유전형이 다른 식물체의 구별에 관한 연구가 잘 되어 있다. 그러나 호접란에서는 유전체 서열에 관한 연구가 초기 단계이기 때문에 품종식별 마커에 관한 연구는 잘 이루어지지 않았다.
현재까지 유전체 염기서열이 완전히 분석된 호접란은 P. equestris 의 한 종류 뿐이며 이 서열만을 이용하여 품종 구분 마커를 개발하는 것에는 한계가 있다.
호접란은 개화 이전의 영양생장 단계에서 외형만으로 품종 구분이 어려운 경우가 많으며, 종자로부터 개화하기 까지는 3년가량이 소요되기 때문에 표현형적 특성으로 품종을 구분하는 것은 비효율적인 측면이 있다. 또한, 호접란 품종은 조직배양을 통하여 대량생산되므로 품종을 무단으로 복사하는 등의 행위가 발생할 경우 이를 표현형적 특성만으로 동일 품종 여부를 판단하는 것은 거의 불가능하다.
이에 본 발명자들은 유전체 서열에 관한 연구가 초기 단계에 위치하여 기존 품종식별 마커에 대해 알려져 있지 않던 호접란의 종 및 품종 구분이 가능한 프라이머 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2012-0001457호
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-CP001 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 목적은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 엽록체 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 호접란 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-CP001 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 호접란 품종은 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu -cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 엽록체 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 호접란 품종 식별 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 호접란 품종은 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu -cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 엽록체 유전체 분석 결과 발견된 길이다형성을 포함하는 유전자 rpl16 의 인트론 부분을 증폭하는 것으로, 이를 이용하여 분석하고자하는 다양한 호접란 품종 시료의 DNA를 증폭한 후 아가로오스 겔 전기영동을 통해 증폭 산물의 길이 다형성을 분석하는 과정을 통해 호접란 품종을 효과적으로 구분할 할 수 있다. 또한 본 발명은 엽록체상의 유전자를 표적으로 하고 있기 때문에 호접란의 모계 기원을 추정할 수 있는 근거가 될 수 있다.
도 1은 호접란 P. KS Little Gem의 엽록체 유전체의 유전자 분포를 나타낸 것으로 삽입/결실 영역을 화살표와 번호로 표기하였다.
도 2는 호접란 엽록체 유전체 서열 다형성을 나타낸 것이다.
도 3은 난초과 식물 P. KS Little Gem, P. aphrodite (NCBI accession no. NC_007499.1), P. equestris (NCBI accession no. NC_017609.1) 을 비롯한 난초과식물 Oncidium Gower Ramsey (NCBI accession no. NC_014056.1), Cymbidium sinense (NCBI accession no. NC_021430.1), Cymbidium tortisepalum (NCBI accession no. NC_021431.1, KC876128.1, KC876125.1), Cymbidium tracyanum (NCBI accession no. NC_021432.1), Cymbidium aloifolium (NCBI accession no. NC_021429.1), Cymbidium mannii (NCBI accession no. NC_021433.1, KC876126.1) 의 rpl16 서열을 정렬한 것이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물을 전기영동 한 결과이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 호접란 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 호접란 품종을 식별하기 위한 분자표지를 개발하기 위해, 먼저 P. KS Little Gem의 엽록체 서열과 더불어 P. aphrodite, P. equestris의 엽록체 서열 정보를 다운로드 받은 후 다형성을 보이는 부위를 탐색하기 위해 alignment 분석과 mVISTA 분석을 수행한 결과, 도 1과 2와 같이 다형성이 나타나는 부위가 있는 것을 발견할 수 있었고, 도 1에 길이 다형성을 나타내는 6곳을 표기하였다.
또한, 6 종의 유전자 후보에서 각 삽입/결실 부위를 증폭하는 프라이머 세트를 구성한 뒤 PCR을 수행하고 아가로오스 겔에서 결과를 분석한 결과, rpl16 유전자의 인트론 부분을 증폭하였을 때 길이 다형성이 나타나 P. Little Gem과 다른 품종을 효과적으로 구분할 수 있음을 확인하고, rpl16 유전자의 다형성이 높은 인트론 부분을 선택하여 프라이머 세트를 디자인하였다.
따라서, 본 발명은 KSLG-CP001 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 호접란 품종은 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu - cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 가장 바람직하게는 다양한 호접란 품종에서 P. KS Little Gem를 식별하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머 세트"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 DNA 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 난초과 식물의 엽록체 염기서열이 보존된 유전자를 증폭할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다.
본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 가지는 프라이머 세트를 가지는 프라이머 세트를 사용하였다.
상기 서열번호 1의 프라이머는 편의상 KSLG-CP001-F로 표시하며, 상기 서열번호 2의 프라이머는 편의상 KSLG-CP001-R로 표시한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호접란 품종 식별용 마커 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 엽록체 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 호접란 품종 식별 방법을 제공한다.
상기에서 시료는 호접란의 어느 부분이라도 가능한데, 예를 들면, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등이 있다.
상기에서 엽록체 DNA 증폭은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplificatoin), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 통상적인 조건을 취할 수 있으며, 본 발명의 일구체예에서는, 초기 변성(pre-denaturation)을 95℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃에서 5분)을 실시하는 조건을 취할 수 있다. 또한, 이러한 PCR 방법은 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 상기에서, 증폭된 산물을 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기의 증폭된 산물 검출은 겔 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기(size) 분석을 통해 이루어질 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
호접란과 근연종에서 엽록체유전체 다형성 위치 탐색 및 증폭 가능 위치 선별
<1-1> 엽록체 서열 비교분석을 통한 다형성 부위 발견
엽록체 서열 내의 다형성을 나타내는 부위를 탐색하기 위해, 본 발명자의 연구팀에서 조립한 P. KS Little Gem의 엽록체 서열과 더불어 P. aphrodite, P. equestris의 엽록체 서열 정보를 다운로드 받은 후 다형성을 보이는 부위를 탐색하기 위해 alignment 분석과 mVISTA 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1과 같이 다형성이 나타나는 부위가 있는 것을 발견할 수 있었고, 도 1에 길이 다형성을 나타내는 6곳을 표기하였다. 본 발명에서 발견한 다형성을 나타내는 부위는 다음과 같다(하기 표 1 참조).
Figure 112016054394310-pat00001
<1-2> 분자마커 선별
6 종의 유전자 후보에서 각 삽입/결실 부위를 증폭하는 프라이머 세트를 구성한 뒤 PCR을 수행하고 아가로오스 겔에서 결과를 분석하였다. 증폭 산물 생성이 정상적으로 이루어지지 않은 경우는 제외하였다.
그 결과, rpl16 유전자의 인트론 부분을 증폭하였을 때 길이 다형성이 나타나 P. Little Gem과 다른 품종을 효과적으로 구분할 수 있는 것으로 나타났다.
< 실시예 2>
호접란과 품종 식별용 프라이머 세트 제작
상기 실시예 1에서 발견한 rpl16 유전자의 다형성이 높은 인트론 부분을 표적하기 위해, 다형성이 높은 영역 주위의 잘 보존된 영역에 프라이머 세트를 제작하였다(하기 표 2 참조).
BioEdit 프로그램을 이용해 rpl16 유전자 부위를 정렬한 뒤 품종간 또는 종간 다형성이 비교적 적은 부분에 프라이머 세트를 제작하고(도 3 참조), 이를 in silico PCR과 아가로오스 겔 분석을 통해 최종적으로 프라이머 세트를 선정하였다.
Figure 112016054394310-pat00002
< 실시예 3>
엽록체 서열 정보가 있는 난초과 식물의 rpl16 구조와 비교분석
호접란 P. KS Little Gem, P. aphrodite (NCBI accession no. NC_007499.1), P. equestris (NCBI accession no. NC_017609.1) 을 비롯한 난초과식물 Oncidium Gower Ramsey (NCBI accession no. NC_014056.1), Cymbidium sinense (NCBI accession no. NC_021430.1), Cymbidium tortisepalum (NCBI accession no. NC_021431.1, KC876128.1, KC876125.1), Cymbidium tracyanum (NCBI accession no. NC_021432.1), Cymbidium aloifolium (NCBI accession no. NC_021429.1), Cymbidium mannii (NCBI accession no. NC_021433.1, KC876126.1)에서 엽록체 유전자 rpl16의 구조를 파악하기 위해 BioEdit 프로그램에서 alignment 분석을 수행한 결과, 도 3 에서 보이는 바와 같이 유전자의 방향은 - strand 이며 2개의 엑손으로 이루어져있고 인트론 부위는 다형성이 높은 것으로 나타났다.
rpl16은 엽록체 유전체 내에 존재하며 50S large ribosomal subunit을 구성하는 리보솜 단백질 L16을 암호화하고 있는 유전자로 밝혀져 있다.
< 실시예 4>
호접란의 게놈 DNA 분리 및 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR 다형성 분석
본 발명에서 제작한 프라이머 세트를 실제 품종에 적용해 보기 위해 샘플 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, D. pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu - cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P. amabilis 에서 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 CTAB 완충용액을 이용한 방식으로 추출하였다.
이후 추출한 DNA를 주형으로, 프라이머 세트(상기 표 2 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 5 분간 pre-denature 한 뒤, 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분 조건을 34회 반복한 다음, 마지막으로 72 ℃ 에서 5 분간 최종 신장(post-elongation)을 수행하였다. 반응 산물을 0.5X TBE 완충용액과 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 분석하였다.
프라이머 세트를 호접란 샘플 19종에 적용해 본 결과 도 4 에서 나타낸 바와 같이 P. Little Gem과 다른 호접란에서 단일 밴드가 증폭된 것을 확인할 수 있었고, 다형성이 존재하는 것을 확인할 수 있어 본 발명의 분자 표지는 호접란의 품종 구분에 유용하다고 할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set KSLG-CP001 for identification of Phalaenopsis and composition of marker comprising the same <130> PN1605-184 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-CP001 forward sequence <400> 1 gaatttcttc tcatccagct cctc 24 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSLG-CP001 reverse sequence <400> 2 ggcgtgattc aatagaggta aagaaaa 27

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 KSLG-CP001 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem을 식별하기 위한 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 P. KS Little Gem 호접란 품종 식별용 마커 조성물.
  4. 호접란 품종 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 엽록체 DNA를 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 P. KS Little Gem, P. equestris, P. Sogo Vivien, Doritis pulcherrima, P. javanica, P. bellina, P. fuscata, P. philippinensis, P. cornu-cervi, P. sumatrana, P. hieroglyphica, P. pulchra, P. mannii, P. schilleriana, P. modesta, P. sanderana, P. pantherina, P. speciosa var. tetraspis, P.amabilis으로 이루어진 호접란 품종으로부터 P. KS Little Gem 호접란 품종의 식별 방법.
  5. 삭제
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