KR101177787B1 - 기장의 재래종 판별용 ｓｓｒ 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기장(Panicum miliaceum L.)에서 분리한 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기장의 재래종 판별용 SSR 마커, 상기 SSR 마커 증폭용 SSR 프라이머쌍을 포함하는 기장의 재래종 식물의 DNA 다형성 검출용 키트, 및 상기 SSR 프라이머쌍을 이용한 기장의 재래종 판별 방법에 관한 것이다.

유전자풀, 유전적 다양성, Proso millet, Panicum miliaceum L., 개체군 구조, SSR 마커

Description

기장의 재래종 판별용 ＳＳＲ 마커 및 이의 용도{SSR markers for discriminating of proso millet landraces and use thereof}

본 발명은 기장에서 분리한 SSR 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 기장의 재래종 판별용 SSR 마커, 상기 SSR 마커 증폭용 SSR 프라이머쌍을 포함하는 기장의 재래종 식물의 DNA 다형성 검출용 키트, 및 상기 SSR 마커 증폭용 SSR 프라이머쌍을 이용한 기장의 재래종 판별 방법에 관한 것이다.

패니쿰(Panicum) 속은 400여 종을 포함하는 화본과에 속하는 큰 속(genera) 중 하나이며, 전세계에 걸쳐 주로 열대 및 아열대기후지역 (Cavers and Bough 1985, Academic Press, pp 143~155)과 건조지역 및 반건조지역에 분포되어 있다 (M'Ribu & Hilu 1994, Theor Appl Genet 88: 412~416). 흔히 Proso millet, Common millet, Broomcorn millet, White millet, Hershey millet, Yellow millet, 또는 Hog millet 등의 영문명으로 불리는 기장(Panicum miliaceum L.)은 경제적으로 중요한 1년생 난지형 초본이다 (Lagler et al. 2005, Euphytica 146: 77~85). 미국에서 기장의 종자는 조류와 가축의 사료로 사용되고 있으나, 기장을 재배하는 다른 나라에서는 식량으로 쓰이기도 한다. 일반적으로 기장의 재배는 중앙아시아 및 동 아시아로부터 기원하여, 인도, 러시아, 중동 및 유럽 등지로 전파된 것으로 알려져 있으며, 상기 지역에서 지금까지도 광범위하게 재배되고 있다 (Harlan 1992, Am Soc Agron Crop Sci Soci Am Madison, Wis., USA).

기장의 재래종은 내건성, 내병성 그리고 역병저항성이 강하여 상기 내건성, 내병성, 또는 역병저항성 작물 육종의 재료로 유용하다. 한국의 농촌진흥청 농업유전자원센터에서는 최근 지리적으로 다양한 지역으로부터 기장 재래종을 수집, 보존하려는 노력을 기울이고 있으나, 작물육종 재료로서 기장의 이용 및 기장 유전자원에 대한 유전적 다양성 및 동정에 관한 연구는 제한된 실정이다.

SSR(Simple Sequence Repeat)과 같은 분자 마커는 대립인자 특이적이고 공우성이다. 상기 분자 마커는 대립인자 다형성이 유의하게 잘 나타나므로 유전적 다양성 연구 및 생물체들 간의 연관성 연구에 매우 유용하다 (Ishii et al. 2001, Genenome 44: 658~666). 벼의 유전적 다양성 분석에서 다수의 형광염료로 표지된 SSR 마커의 이용 시, 마커의 다중 패널(multiplex panel)을 이용한 효과적인 유전인자형 분석이 가능하였다 (Blair et al. 2002, Theor Appl Genet 105: 449~457). 따라서, 유전수집자원(germplasm collection)의 유전적 다양성과 개체군 구조 분석의 연구결과는 작물의 개량에 있어서 중요한 기초자료이고 작물의 보존과 육종전략을 세우는데 큰 역할을 한다 (Thomson et al. 2007, Theor Appl Genet 114: 559~568).

SSR과 같은 DNA 마커를 이용하여 보리 (Malysheva-otto et al. 2006, BMC Genetics 7: 6), 손가락조 (Dida et al. 2008, Tropical Plant Biol 1: 131~141), 들깨 (Park et al. 2008, Genet Resour Crop Evol 55: 523~535), 및 벼 (Garris et al 2005, Genetics 169: 1631~1638) 등 여러 작물에서 유전적 다양성, 계통발생학적 연관성, 및 개체군 구조분석 결과들이 보고된 바 있다. 그러나, 기장에서는 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 기법을 이용하여 생물형(biotype)의 다양성을 평가한 연구 (Karam et al. 2004, Planta Daninha, 22: 167~174)가 유일하다. 상기 마커의 광범위한 이용에는, DNA 라이브러리 제작, 염기서열분석, SSR을 포함한 클론의 동정, 및 SSR 모티프 인접구간의 염기서열을 이용한 프라이머 디자인 등으로 인한 시간적 및 경제적인 문제로 인해 제약이 있었다. 최근 라이브러리 enrichment 기법과 자동 염기서열 분석기의 발달로 인해 상기 분자 마커의 개발이 비교적 간편하며 신속해지고 경제적인 면에서도 효율적이 되었다 (Zane et al. 2002, Mol Ecol 11: 1~16).

최근, Panicum 속에서 AFLP (Karam et al. 2004, Planta Daninha, 22: 167~174), RAPD (M'Ribu & Hilu 1994, Theor Appl Genet 88: 412~416), ISSR (Lagler et al. 2005, Euphytica 146: 77~85), 및 SSR (미발표)과 같은 다양한 DNA 마커가 개발되고 있으나, 기장 게놈으로부터의 SSR 염기서열의 분리, 및 SSR를 기초로 한 마커 개발에 관한 정보는 아직 부족한 실정이다. 기장 육종에 관한 노력의 부족으로, 몇 가지 유전인자형은 한국의 몇 개 지역의 밭에서 재래종의 상태로 있다 (Park et al. 2005, J Agrn Crop Sci 191: 401~410).

기장의 지리적 기원에 관해서는 오랜 기간 논란이 되어왔고, 기원과 순화지역에 관해서도 형태적, 고고학적, 분자유전학적 증거 등에 근거를 둔 여러 다른 가 설이 제시되어왔으나, 아직도 정확한 것은 밝혀지지 않고 있다. 기장은 중앙아시아 및 동아시아에서 순화되었을 것으로 여겨지고 있으나, 약 7000년 전 중국과 코카서스 지역에서 최초로 출현하였다. 또한 동시대에 유럽에서도 나타났으나, 그 유의성이 명확하지 않다 (Hunt et al. 2008, Veget Hist Archaeobot 17(Suppl 1): S5~S18)는 것은 기장 작물이 각 지역에서 독립적으로 순화되었음을 제시한다. 기장은 중국, 인도 그리고 러시아 등 동아시아에서 수 천년 전부터 알려져 있었다. 기장의 재배는 중앙아시아 및 동아시아에서 시작하여 인도, 러시아, 중동과 유럽 등지로 전파 (Roshevits 1980, Indian National Scientific Doc Center, New Delhi)된 것으로 여겨지긴 하나, 아직 확실한 기장 야생원종은 밝혀진 바가 없다. Daniel 및 Hopf (2000, Domestication of plants in the Old World, 3rd edition, Oxford University Press, p. 83)는 중앙아시아 (카스피 해에서 신장 및 몽고에 걸친 광범위한 지역)에서 기장의 야생형을 찾았다고 보고한 바 있으며, 상기 반건조 지역을 "진정한 야생 miliaceum 형"의 보금자리로 제안했다. Yoon (2001, History of food culture in Korea. Shin-Kwang publishing, Korea)은, 한국의 신석기 유적지 (황해도 봉산군 지답리 집단주거지 2번)에서 발견된 빗살무늬토기 안에서 발견된 기장 종자의 탄소연대측정을 통하여 (Kim 2007, Nutritional Research & Practice 1: 8~13),신석기시대 이후 한국의 다수 지역에서 기장이 재배되어왔다고 보고한 바 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 기장의 유전자원 및 작물육종 연구에 대한 기초 자료를 제공하고자 기장 게놈 DNA를 사용하여 구축된 SSR-enriched 라이브러리로부터 16 개의 다형성 SSR 마커를 발굴하였다. 상기 마커를 이용하여 전세계에서 수집된 기장 재래종 수집자원의 유전적 다양성 및 유전적 연관성을 분석하였으며, 상기 정보는 기장 생식질(germplasm) 연구 및 육종에 이용될 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기장의 재래종 판별용 SSR 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 증폭용 프라이머쌍을 포함하는 기장의 재래종 식물의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 기장의 재래종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 SSR 마커는 기장의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 기장 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 육종에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 SSR 마커를 이용하여 기장의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 이를 통하여 기장의 품종을 판별할 수 있다. 본 발명의 다른 효과는 국내 및 국외품종을 동정할 수 있는 마커 조합 개발과 그들 조합을 키트(kit)로 제작 시 기장 연구기관 및 농산물 품질관리원 및 유통업체 등에서 유통기장의 품종판별, 생산보급, 품종보호권 등과 관련한 문제점을 해결하는 데 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기장의 재래종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커를 제공한다.

바람직하게는, 상기 기장의 재래종 판별용 SSR 마커는 기장(Panicum miliaceum L.)의 게놈 DNA를 사용하여 구축된 SSR-enriched 라이브러리로부터 얻을 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 기장의 재래종 판별용 SSR 마커는 도 5에 기재된 GB-PMM-004, B-PMM-014, GB-PMM-023, GB-PMM-025, GB-PMM-029, GB-PMM-061, GB-PMM-085, GB-PMM-094, GB-PMM-098, GB-PMM-106, GB-PMM-115, GB-PMM-117, GB-PMM-121, GB-PMM-126, GB-PMM-134 및 GB-PMM-145으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 빈번히 사용된 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자지도상 의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.

본 발명은 또한, 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 증폭용 프라이머쌍; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 기장의 재래종 판별용 SSR 마커를 동정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 프라이머쌍은 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 증폭용 프라이머쌍이며, 상기 프라이머쌍은 SSR 마커를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머쌍은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

기장에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 증폭용 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기장의 재래종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 기장에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있 다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 가장 바람직하게는, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.

표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍은 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 증폭용 프라이머쌍이다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서,모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있 다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 식물재료

농촌진흥청 국립유전자원센터에서 선발된 기장 217 점의 수집자원 (도 2a, 2b)을 본 발명에 사용하였다. 실험에 사용된 기장 수집자원은 아제르바이잔 (1 점), 볼리비아 (2 점), 몽고 (8 점), 우크라이나 (5 점), 헝가리 (1 점), 카자흐스탄 (1점), 구 체코슬로바키아 (1 점), 북한 (6 점), 인도 (13 점), 네팔 (2 점), 태국 (4 점), 러시아 (25 점), 중국 (3 점), 프랑스 (1 점), 우즈베키스탄 (2 점), 타지키스탄 (1 점), 한국 (141 점) 등 총 17 개국에서 수집된 것이다.

2. DNA 추출 및 SSR 유전인자형 분석

품종별로 5 립의 종자를 파종하여 온실에서 15일 키운 후 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 순도와 농도는 NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc.)를 이용하여 확인하였고, 최종 DNA 농도는 20 ng/μL로 만들었다. 25 개의 다형성 SSR 마커 (미발표)는 SSR 인접서열에 근거하여 디자인하였고, Dixit (2005, Mol Ecol Notes 5: 736~738)의 방법을 이용하여 조(Italian millet) 10 개의 수집자원을 대상으로 다형성을 평가하였다. 상기 마커의 반복 모티프, 어닐링(annealing) 온도, 및 특성은 도 3에 제시되어 있다. 다형 성 PCR(polymerase chain reaction) 산물의 크기는 Schuelke (2000, Nature Biotech 18: 233~234)가 고안한 M13 tail PCR 방법을 이용하여 측정하였다. PCR 반응을 위해서 주형 DNA 40ng, 1×PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 U Taq DNA 중합효소, 8 pmol 역방향 프라이머와 8 pmol 형광염료로 표지된 M13(-21) 프라이머, 그리고 2 pmol M13(-21) tail 정방향 프라이머를 사용하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 3분, 1 단계 (94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분)를 30 회 반복, 2 단계 (94℃에서 30초, 53℃에서 45초, 72℃에서 1분)를 10 회 반복하고, 최종 72℃에서 10분)간 연장반응을 수행하였다. SSR 대립인자 분석은 ABI-PRISM 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였고, 분석 프로그램으로는 GENESCAN 3.7와 GENOTYPER 3.7 software (Applied Biosystems)를 사용하였다.

3. 유전적 다양성 분석

기장 수집자원 241 점의 SSR 마커에 대한 총 대립인자의 수(total number of alleles), 대립인자의 빈도(allele frequency), 수집자원-특이적 대립인자(accession-specific alleles), 유전자 다양성(gene diversity), 및 다형성 정보 함량(polymorphism information content: PIC)을 포함한 다양성 측도에 대해 PowerMarker version V3.0 genetic analysis package program (Liu & Muse 2005, Bioinformatics 21: 2128~2129)을 이용하여 기본적인 통계분석을 수행하였다. 이형 접합성(heterozygosity) 관찰치( Ho ) 및 이형접합성 기대치( H _E )를 포함한 다양성 분석은 POPGENE V1.31 genetic analysis package program을 이용하여 측정하였다 (Yeh et al. 1999, POPGENE Version 1.32. Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis. Computer program and documentation distributed by University of Alberta and Centre for International Forestry Research, Alberta, Canada).

각 쌍의 수집자원간 유전적 거리는 PowerMarker V3.0 프로그램을 이용하여 계산하였다 (Liu & Muse 2005, Bioinformatics 21: 2128~2129). UPGMA (unweighted pair group method using the arithmetic averages)는 PowerMarker 프로그램 내에 있는 MEGA4 소프트웨어를 이용하였다 (Tamura et al. 2007, Mol Biol Evol 24: 1596~1599). 각 개체군의 유전적 다형성은 PowerMarker V3.0 프로그램을 이용하여 좌위 당 관찰된 대립인자(A), 다형성 좌위의 비율(P), 그리고 유전적 다양성 또는 기대된 이형접합성( H _E )의 평균값으로 평가하였다 (Liu & Muse 2005, Bioinformatics 21: 2128~2129).

실시예 1: 대립인자의 다양성, 빈도 분포, 및 유전적 다양성

25 개의 SSR 좌위가 다형성이었으며 (미발표), 217 점의 기장 수집자원에서 총 185 개의 대립인자가 검출되었다 (도 3). 검출된 대립인자의 수는(N_A)는 2(GB-PMM_031) 내지 19(GB-PMM-106) 개로, 좌위당 평균 7.4 개의 대립인자가 나타났다. 25 개의 다형성 좌위 중 20 개의 좌위는 완벽한 반복을 갖는 2-뉴클레오티드 SSR과 3-뉴클레오티드 SSR, 4 개의 좌위는 비반복성 서열에 의해 중단되어 불완전한 반복을 갖는 SSR로 구성되어 있다. 한 개의 좌위(GB-PMM-060)는 완전한 4-뉴클레오티드 SSR로 구성되어 있다. 4 개의 좌위 (GM-PMM-073, GB-PMM-094, GB-PMM-111, GB-PMM-133)는 다수 반복서열(multiple repeats, 즉 한 개 이상의 SSR)로 구성되어 있고, 3 개의 좌위 (GB-PMM-004, GB-PMM-121, GB-PMM-126)는 서로 다른 반복 모티프로 구성된 복합 반복서열(compound repeats, 즉 서로 다른 반복 모티프로 구성된)로 구성되어 있다 (도 3). 유전자 다양성에 대한 H _E 값은 0.03(GB-PMM-117) 내지 0.72(GB-PMM-134)로서, 조사된 모든 좌위에 대해 평균 0.36으로 나타났다. 근친계수(f)는 -0.89 내지 1.00으로 조사된 모든 좌위에서 평균 0.71을 보였고, 22 개의 좌위에서 초과 이형접합성을 보였으며 3 개의 좌위에서 초과 동형접합성을 나타냈다. 상기 모든 좌위는 유의적 임계수준 (P < 0.05)에서 HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium)을 벗어났다. 기대이형접합성(H _E ) 값과 대립인자(NA) 또는 반복 단위의 수 간에 명확한 상관관계를 보이지 않았다 (자료 미제시, 도 3).

25 개의 SSR이 다양한 국가로부터의 수집된 217 개의 수집자원에 대해 생식질(germplasm)의 다양성, 계통적 유연관계 및 개체군 유전적 구조를 평가하는데 사용되었다. SSR 마커는 높은 다형성을 보였고, 총 185 개의 대립인자가 나타났으며 좌위 당 평균 7.4 개의 대립인자가 나타났다. 또한 모든 좌위에서 기대이형접합성(H _E )의 평균 수치가 0.36으로 나타났다. 22 개의 좌위에서 초과 이형접합성 개체 가 보였다. 식물에서는 초과 이형접합성이 일반적이긴 하나, 기장은 자가수분 작물이기 때문에 상기 초과 이형접합성이 초래된 원인이 불명확하다. 기장의 생물형(biotype) 간에는 적어도 10%의 타가수분이 발생하기 때문에 초과 이형접합성을 보이기도 한다 (Popov 1947, Plant Breeding Abst 17: 453). 초과 이형접합성은 수확량과 품질을 위해 농부들에 의해서 선발되거나, 개체군들이 혼합하면서 발생하는 것으로 여겨진다 (Lopes et al. 1999, Theor Appl Genet 99: 733~739).

185 개 대립인자의 빈도 분포양상을 살펴보면, 28 개의 대립인자(15.14%)는 5~50% 사이의 빈도로 일반적인 대립인자(common allele)인 것으로, 24 개의 대립인자(12.97%)는 50% 보다 큰 빈도로 풍부한 대립인자(abundant allele)인 것으로, 133 개의 대립인자(71.89%)는 5% 미만의 빈도로 희귀 대립인자(rare allele)인 것으로 나타났다 (도 4). 흥미롭게도 모든 좌위에서 적어도 한 개의 희귀 대립인자가 발견되었다. GB-PMM-106 좌위 (19 개 중 17 개의 대립인자)에서 가장 많은 수의 희귀 대립인자가 발견되었고, 다음 순으로 GB-PMM-126 및 GB-PMM-134 (16 개 중 13 개의 대립인자)에서 13 개의 대립인자가 발견되었다. 총 133 개의 희귀 대립인자 중 16 개의 다른 좌위의 41 개(30.8%)의 희귀 대립인자는 수집자원-특이적 대립인자(즉, 하나의 수집자원에서만 나타나는)로 나타났다. 8 개국에서 수집된 25 점의 수집자원은 적어도 한 개의 유일 대립인자를 가지는 것으로 나타났으며, 이들 중 9 점의 수집자원은 원산지가 한국, 5 점은 인도, 3 점은 몽고, 3 점은 러시아였고, 중국, 우크라이나, 네팔, 및 헝가리의 수집자원에서 각각 1 점씩 수집자원-특이적 대립인자가 나타났다 (도 5). 16 개의 좌위 중 10 개의 좌위에서 한 개 이상의 수 집자원-특이적 대립인자가 나타났다. GB-PMM-106 좌위에서 가장 많은 7 개의 수집자원-특이적 대립인자가 발견되었고, 두 개의 다른 좌위, GB-PMM-085 및 GB-PMM-126에서 다음으로 많은 각각 5 개씩의 수집자원-특이적 대립인자가 발견되었다. 5 개의 대립인자는 몽고가 원산지인 수집자원 #14와 #234에 특이적이었으며, 3 개의 대립인자는 러시아가 원산지인 #9에 특이적인 것이었다. 4개의 수집자원 (중국의 #239, 헝가리의 #6, 그리고 인도의 #143과 #147)에서 각각 2 개씩의 대립인자가 특이적인 것으로 나타났다.

기장의 재래종에서 희귀 대립인자(71.9%)의 예외적인 높은 빈도의 발생이 기장 수집자원의 전체적인 유전적 다양성에 크게 영향을 미쳤으며 (Roussel et al. 2004, Theor Appl Genet 108: 920-930), 또한 작물육종에 있어 신규 대립인자의 저장소로서 원시자연성 및 잠재성을 나타낸다. 따라서, 유전자은행에서 수집자원의 유전적 변이를 최대화하고, 육종 프로그램에서 희귀 대립인자를 포함한 대립인자를 활용하는 것은 매우 유용하다 (Yifru et al. 2006, Plant Breeding 125: 125~130).

모든 좌위에서 적어도 한 개 이상의 희귀 대립인자 및 16 개의 서로 다른 좌위에서 수집자원-특이적 대립인자 (희귀 대립인자의 30.8%)의 존재는 본 발명의 SSR 마커가 고도의 정보를 함유하고 있음을 나타낸다 (도 5). 유전자형-특이적 대립인자는 특정 유전자형 또는 특이적 유전자형의 특정 분포지역을 진단하는데 이용할 수 있으므로 매우 유용하다. 이런 관점에서, GB-PMM-106은 17 개의 희귀 대립인자 및 7 개의 재래종(수집자원)-특이적 대립인자를 포함하여 19 개의 전체 대립인자를 보이기 때문에 가장 정보함량이 많은 좌위이다.

실시예 2: 기장 재래종 수집자원 간의 유연관계

한 국가에서 수집된 모든 수집자원을 하나의 개체군이라 가정하여, 연관성의 정도를 추정하기 위해 각 개체군 쌍 간에 공유된 대립인자 빈도에 근거하여 유전적 거리를 계산하였다. 유전적 거리는 0.17 (우크라이나와 러시아 간) ~ 0.90 (헝가리와 인도 간)이었고, 상기 유전적 거리는 여러 국가에서 수집된 개체군 간의 유전적 연관관계를 나타내는 UPGMA 분지도를 작성하는데 이용되었다 (도 1). 헝가리 유래의 개체군(HUN)에는 하나의 수집자원만이 있었지만, 분지도 (도 1) 상에서 다른 국가들 유래의 개체군들과는 상당한 유전적 거리가 있는 것으로 나타났고, 또한 인도와 아제르바이잔 유래의 개체군들도 다른 국가의 개체군들과 유전적으로 거리가 멀었으며, out-group으로 구분되었다.

유전적 거리 0.19에서 14 개 국가로부터 수집된 기장 개체군들이 여러 작은 아집단으로 구성된 하나의 큰 집단으로 묶였다. 한국(KOR), 북한(PRK) 및 중국(CHN) 유래의 개체군들은 유전적으로 가까운 하나의 집단으로 묶였다. 몽고(MNG), 러시아(RUS) 및 우크라이나(UKR) 유래의 개체군들도 하나의 집단으로 묶였다. 카자흐스탄(KAZ), 네팔(NPL) 및 태국(THA) 유래의 개체군들이 한 집단을 이루고, 체코슬로바키아(CSK), 프랑스(FRA), 볼리비아(BOL), 타지키스탄(TJK) 및 우즈베키스탄(UZB) 유래의 개체군들이 또 다른 하나의 집단을 형성하였다. 유전적 다양성이 가장 높은 개체군은 인도 개체군(0.50)이었고, 다음 순으로 북한(0.43), 몽고(0.40), 그리고 러시아(0.38) 순이었다 (도 6). 비록 한국 개체군이 한국 내 여 러 지역에서 수집된 가장 많은 수의 수집자원 (141 점)으로 구성되어 있으며, 평균 대립인자수에서는 가장 높은 수치(4.16)를 나타내었음에도 불구하고 유전적 다양성은 상대적으로 낮은 수치(0.22)를 보였다.

25 개의 SSR 마커를 이용하여, 한국의 여러 지역 및 여러 국가에서 수집된 217 점의 기장 수집자원에 대한 유집분석(cluster analysis) 결과, 지리적 기원이 다른 수집자원의 대부분은 하나의 큰 집단으로 묶였다. 한국의 수집자원은 중앙아시아 여러 국가 유래의 수집자원 및 유럽의 일부 수집자원으로부터 0.21의 짧은 유전적 거리에서 분리되며, 대다수의 인도 수집자원이 0.25의 유전적 거리에서 별도의 아집단으로 묶이는 것은 중앙아시아(러시아 및 몽고), 동아시아(한국 및 중국) 및 아시아 남부(인도)의 3 개 지역에서의 다수 순화 가설을 제시한다.

도 1은 여러 국가 유래 기장 집단 간의 유전적 유연관계를 보여주는 UPGMA 분지도이다.

도 2a는 217 개의 기장 수집자원을 나타낸다.

도 2b는 217 개의 기장 수집자원을 나타낸다.

도 3은 217 개의 기장 수집자원으로부터 개발된 25 개 다형성 마커의 특성을 보여준다.

도 4는 217 개의 기장 수집자원 간에 25 개 SSR 마커에서의 대립인자 빈도분포를 보여준다.

도 5는 217 개의 기장 수집자원 간에 16 개 SSR 좌위에서 동정된 유전인자형 특이적 대립인자를 보여준다.

도 6은 17 개국 유래의 기장 집단 간에 25 개 SSR 좌위에서의 유전적 매개변수를 보여준다.

도 7은 6-모델에 근거하여 아집단 간 유전적 거리(대각선의 상면) 및 F _ST (대각선의 하면)를 보여준다 (P < 0.001).

<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> SSR markers for discriminating of proso millet landraces and use thereof <130> PN09212 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-004 F primer <400> 1 gcaagagcgt gtgtgtga 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-004 R primer <400> 2 tggtgtcagg aacattaagg a 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-013 F primer <400> 3 aggggtaggg ctgatgaa 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-013 R primer <400> 4 atagtgatcg cgaccgtg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-014 F primer <400> 5 gggagacgca gtgtggta 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-014 R primer <400> 6 tacaggtcct gcgtgagg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-023 F primer <400> 7 gctagcttgt tgttgccg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-023 R primer <400> 8 gatgcgtacc gcttgtgt 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-025 F primer <400> 9 cttgtgctgg gctaggtg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-025 R primer <400> 10 aatgtggttg gcattgga 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-029 F primer <400> 11 agctcctggc tcagctct 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-029 R primer <400> 12 cttgctgtcg tcgtcctc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-031 F primer <400> 13 aaacgggatc ggtgtagc 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-031 R primer <400> 14 aatgaggcac tgacagcc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-060 F primer <400> 15 tcgtgacaga gcgtcctt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-060 R primer <400> 16 tcgatctcgg tctgctgt 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-061 F primer <400> 17 ctccgcagca agacattt 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-061 R primer <400> 18 tttcgatccg aggaggat 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-066 F primer <400> 19 taatgccaaa ccaagcgt 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-066 R primer <400> 20 ggtacaagta caagcccgc 19 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-073 F primer <400> 21 gctctcaccg tctgatcg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-073 R primer <400> 22 cgcattctct tccccttt 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-085 F primer <400> 23 cagcccatca cactcgat 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-085 R primer <400> 24 cttcttcgtc gtccctcc 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-094 F primer <400> 25 aagagcgagg gctagcat 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-094 R primer <400> 26 cggcagcaac tcatcaat 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-096 F primer <400> 27 ggcctatggg ctttttgt 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-096 R primer <400> 28 gcgttcggaa caactgaa 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-098 F primer <400> 29 tgccaggcac tacaccat 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-098 R primer <400> 30 catctcttcg ctgtccca 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-106 F primer <400> 31 agcgagagga aacagcgt 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-106 R primer <400> 32 ataggcgtcg gagatggt 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-107 F promer <400> 33 ctcagctcgc cccttatt 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-107 R primer <400> 34 gcaccggaat atgcaaga 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-111 F primer <400> 35 gttcgaggct gatgcaag 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-111 R primer <400> 36 cgcatcacac gtcacatc 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-115 F primer <400> 37 gcacgtcaca ctcacacg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-115 R primer <400> 38 tgggtgtatc agggcttg 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-117 F primer <400> 39 gtgagggtga tcacgagg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-117 R primer <400> 40 ccacgccaaa ctcaaatc 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-121 F primer <400> 41 ggacatacgc atggtggt 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-121 R primer <400> 42 acgatcgaat gagcgaga 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-126 F primer <400> 43 cttccatagg gtgcctcc 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-126 R primer <400> 44 catcgcaatt gggaaaga 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-133 F primer <400> 45 tctcagtgct ttacgccg 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-133 R primer <400> 46 aggaaccgga accaccta 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-134 F primer <400> 47 caggctctgg caaagatg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-134 R primer <400> 48 caaggtcagg ggaaccat 18 <210> 49 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-145 F primer <400> 49 tccaagagca gcacgg 16 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GB-PMM-145 R primer <400> 50 agacgtcgtg ccaagaga 18

Claims (6)

1. 도 5에 기재된 GB-PMM-004, B-PMM-014, GB-PMM-023, GB-PMM-025, GB-PMM-029, GB-PMM-061, GB-PMM-085, GB-PMM-094, GB-PMM-098, GB-PMM-106, GB-PMM-115, GB-PMM-117, GB-PMM-121, GB-PMM-126, GB-PMM-134 및 GB-PMM-145 마커를 포함하는, 기장의 재래종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커 세트 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 기장의 재래종 판별용 SSR 마커는 기장(Panicum miliaceum L.)의 게놈 DNA를 사용하여 구축된 SSR-enriched 라이브러리로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 SSR 마커 세트 조성물.
3. 제1항에 따른 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 세트 증폭용 프라이머쌍; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 기장의 재래종 식물의 DNA 다형성 검출용 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
5. 기장에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 기장의 재래종 판별용 SSR 마커 세트 증폭용 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기장의 재래종 판별 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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