KR102010279B1 - 더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 엽록체 서열 기반의 InDel 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 더덕(Codonopsis lanceolata) 종의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라 더덕 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating Codonopsis lanceolata among genus Codonopsis and uses thereof}

본 발명은 더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커, 상기 분자마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르기 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

식물의 경우는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 게놈 등 3개의 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전정보의 대다수는 핵 게놈에 존재하지만 게놈의 크기가 크고, 많은 인트론(intron)과 엑손(exon)으로 구성되어 있어, 특정 유전자의 염기 서열을 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 분석하여 식물종의 보존이나 식별에 이용하는데는 제한적이며, 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 특정 인트론 부위 등이 이용된다. 식물 미토콘드리아 게놈의 경우 보통 400kb∼4,000kb 크기로, 동물 미토콘드리아와는 달리 크기가 크고 구조적으로 매우 불안정하며 염기서열이 매우 보존적이기 때문에 속, 종 수준 또는 그 이하의 분류군의 계통관계나 식별에 이용하는 것은 거의 의미가 없다.

반면에 식물 엽록체는 기원(origin)이나 진화(evolution)와 같은 엽록체 자체 연구뿐만 아니라, 유전학적인 연구에서도 매우 중요시되어왔다. 엽록체 게놈의 크기는 160Kb 내외이고 구조적으로 안정하며, 염기서열의 변이가 큰 비암호와 영역(non coding region)은 고유종의 식별, 아종 및 변종의 식별, 유전적 변이의 비교 분석에도 유용성이 보고되고 있다. 엽록체 게놈에 존재하는 120여개의 유전자 중 84개의 유전자가 단백질로 전사되는데 유전자에 따라서 진화속도가 크게 다르다. 어떤 보존적인 유전자는 고등 분류군의 계통에만 이용될 수 있으나 빨리 진화하는 유전자의 염기서열은 근연속이나 속내의 뚜렷한 종간의 유연관계를 논의하는데도 이용될 수 있다. 따라서 한국 특산속 식물의 타당성, 식별, 보존 전략을 세우는데 엽록체 게놈의 염기서열은 광범위하게 활용이 가능하다.

한편, 더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 식물로 약 40~50가지의 종이 파키스탄과 히말라야, 중국 및 일본에 이르기까지 아시아 전역에 널리 분포한다. 특히 더덕은 한국과 중국, 일본 등 동아시아 국가에서 오래전 효능 및 안전성이 검증이 된 이후 민간에서 식용 및 의학의 용도로 널리 사용되었다. 더덕은 사포닌(saponin)을 함유하고 있어 기침을 멎게 하고 가래를 억제하는 효과가 있으며 기관지염, 편도선염, 인후염 등 호흡기질환에 좋은 약재로 알려져 있다. 국내 자생하는 더덕 속 식물에는 더덕(Codonopsis lanceolata), 소경불알(Codonopsis ussuriensis), 만삼(Codonopsis pilosula), 애기더덕(Codonopsis minima) 등이 있으며, 최근 국제적으로 FTA가 체결됨에 따라 국외의 자원들이 국내로 많이 반입되어 오고 있다. 특히, 생체가 아닌 말린 형태로 주로 사용되는 약용작물의 특성상 작물을 구분하기는 쉽지 않다.

한편, 한국등록특허 제1752658호에는 '더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0010226호에는 '엽록체 특이적 INDEL 마커를 활용한 근연야생종 감자 및 재배종 감자의 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 더덕 개체들 간의 엽록체 게놈 염기서열을 비교하여 rpoA와 rps2의 유전자간 영역에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 더덕 속 시료를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 더덕 속 식물 내에서 더덕(C odonopsis lanceolata) 종을 특이적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 더덕 속 식물에서 더덕(Codonopsis lanceolata) 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 더덕 속 식물에서 더덕 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 더덕 속 식물에서 더덕 종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 더덕 속 식물에서 더덕 종을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 한약재로 가공되어 유통되는 과정에서 더덕을 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 국내에서 수집된 더덕 개체들의 엽록체 염기서열들을 분석하고, 이들 서열간 InDel 다형성이 나타난 8개의 InDel 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 각각 이용하여 더덕 속 10종의 식물들을 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. C.A, 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea); C.B, 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea ); C.C 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis); C.D, 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora); C.E, 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora); C.F, 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii); C.G, 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata); C.H, 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey); C.I, 코도놉시스 필로술라(nopsis pilosula); 및 C.L, 코도놉시스 란세오라타(Codonopsis lanceolata, 더덕).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 더덕 속 식물로부터 더덕 종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 및 3의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 더덕 속(genus) 식물은 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea), 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea), 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis), 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora), 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora), 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii), 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata), 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey), 코도놉시스 필로술라(nopsis pilosula) 및 코도놉시스 란세오라타(Codonopsis lanceolata, 더덕)일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 더덕 개체 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 영역을 증폭시키기 위해 제작된 것으로, 상기 InDel 다형성을 보이는 서열은 서열번호 1로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 1은 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 4에 나타내었으며, 본 발명에 따른 InDel 다형성은 더덕 종의 엽록체 염기서열에서 rpoA~rps2 사이에 위치하는 것으로 확인되었다.

본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 더덕 속 식물에서 더덕 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

더덕 속(Genus) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕 속 식물에서 더덕 종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 더덕 속(genus) 식물은 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea), 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea), 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis), 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora), 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora), 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii), 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata), 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey), 코도놉시스 필로술라(nopsis pilosula) 및 코도놉시스 란세오라타(Codonopsis lanceolata, 더덕)일 수 있다.

본 발명의 방법은 더덕 속 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 더덕 속 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 더덕 속 식물에서 더덕 종을 구별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 더덕 속 식물의 DNA 추출

총 10종의 더덕 속 식물을 수집한 후 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 수집자원들의 종자에서 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 TE 완충액에 용해시킨 후 보관하였다. 본 발명에서 사용된 더덕 속 식물의 종류는 하기 표 1과 같다.

본 발명에 사용된 더덕 속 식물의 종류

번호	더덕 속 식물	약어
1	Codonopsis convolvulacea	C.A
2	Codonopsis clematidea	C.B
3	Codonopsis mollis	C.C
4	Codonopsis vinciflora	C.D
5	Codonopsis viridiflora	C.E
6	Codonopsis forrestii	C.F
7	Codonopsis ovata	C.G
8	Codonopsis grey	C.H
9	Codonopsis pilosula	C.I
10	더덕(Codonopsis lanceolata)	C.L

2. 중합효소연쇄반응( PCR )

5 ng/㎕ 농도로 희석된 더덕 속 식물의 DNA 각각 2 ㎕(DNA 10 ng), InDel F 및 R 프라이머 각각 1 ㎕, Taq mixture 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 혼합하여 최종 20 ㎕가 되도록 PCR 반응 혼합물을 제조하여 PCR을 수행한 후 증폭 산물을 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. PCR 조건은 하기 표 2와 같다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	94	5분
변성	94	30초
결합	49~55	30초
신장	72	1분
변성 단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종 신장	72	10분
보관	4	∞

실시예 1. 더덕의 엽록체 염기서열 비교 분석

더덕(Codonopsis lanceolata)의 엽록체 염기서열에서 InDel 다형성이 나타난 유전자좌위를 확인하기 위해 국내에서 수집된 더덕 6개체(표 3)의 엽록체 게놈 서열을 각각 정렬(alignment)하고 비교하여 더덕의 엽록체 염기서열에서 총 8개의 InDel 영역을 확인하였다.

더덕 6개체 정보

번호	국내 지역	위도/경도
1	강원 철원군	38°11'07.3"N 127°23'03.3"E
2	전남 장흥군 (천태산)	34°49'25.6"N 126°50'16.0"E
3	경기도 용인시	37°06'31.8"N 127°07'10.4"E
4	강원 횡성군	37°29'01.9"N 127°59'36.3"E
5	충북 청주	36°39'29.6"N 127°27'01.0"E
6	경기 용인시	37°14'27.7"N 127°12'31.8"E

실시예 2. InDel 마커를 이용한 더덕 종 구별

상기 8개의 InDel 마커를 증폭시키기 위한 각각의 프라이머 세트를 제작하여더덕 속 10종의 식물체를 대상으로 PCR 분석을 수행하였다. 10종의 더덕 속 식물체는 각 4개체씩 사용하였으며, 자동모세관 겔 전기영동(Fragment Analyza^TM Automated CE system; Advanced Analytical Technologies, Inc., 미국)으로 분석하였다.

그 결과, 8개의 InDel 마커 중 InDel 마커 1~7에서는 더덕 속 식물 10종 모두에서 밴드가 나타났으나, InDel 마커 8에서는 더덕 속 10종의 식물체 중에서 더덕 종(Codonopsis lanceolata; C.L)에서만 특이적으로 밴드가 나타났으며, 나머지 더덕 속 식물에서는 밴드가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 1).

상기 InDel 마커 8은 더덕 엽록체 게놈의 rpoA와 rps2의 유전자간 부위에 존재하는 4 bp의 염기서열이 결실된 것으로 확인되었고(표 4), InDel 마커 8을 증폭하기 위한 프라이머 세트 정보는 하기 표 5와 같다.

더덕의 InDel 다형성 염기서열 정보

InDel marker 8 - (서열번호 1)

CGGTTCGGGACATAAAAAA AATCACCGGTTTTTAAGGAAACTTAACCGGTTTTTGTATCCGC----AGTTTTGTATAATTGATTNTATATNAATTATATATTAAAATATACATACGTTTCTATATTAAAGTAAATAGCGTATGCATAATAAAAAAATATTGTGCCAAGAGCCCTCTTGACGGACTGGGGCACTCGTGGCCATAAACGAGGCCGATTCCTAAT CCGTTTATACTTCGACCTC

굵은 글씨체 및 밑줄 : 프라이머 위치.

점선 : 염기서열이 결실된 위치.

프라이머 서열 정보

명칭	염기서열 (5'→3') (서열번호)	Tm(℃)	크기	위치
InDel marker 8	F : CGGTTCGGGACATAAAAAA (2)	50.9	237 bp	rpoA ~ rps2
	R : GAGGTCGAAGTATAAACGG (3)	50.5

따라서, 상기 결과를 통해, 더덕 속 식물의 엽록체 게놈 서열에서 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 본 발명의 분자마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 더덕 속 식물에서 더덕 종을 효과적으로 판별하기 위해 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating Codonopsis lanceolata among genus Codonopsis and uses thereof <130> PN18427 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 237 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Codonopsis lanceolata <400> 1 cggttcggga cataaaaaaa atcaccggtt tttaaggaaa cttaaccggt ttttgtatcc 60 gcagttttgt ataattgatt ntatatnaat tatatattaa aatatacata cgtttctata 120 ttaaagtaaa tagcgtatgc ataataaaaa aatattgtgc caagagccct cttgacggac 180 tggggcactc gtggccataa acgaggccga ttcctaatcc gtttatactt cgacctc 237 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cggttcggga cataaaaaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaggtcgaag tataaacgg 19

Claims (6)

1. 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea), 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea), 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis), 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora), 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora), 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii), 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata), 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey) 및 코도놉시스 필로술라(Codonopsis pilosula)로부터 더덕(Codonopsis lanceolata) 종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
2. 삭제
3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea), 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea), 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis), 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora), 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora), 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii), 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata), 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey) 및 코도놉시스 필로술라(Codonopsis pilosula)로부터 더덕(Codonopsis lanceolata) 종을 구별하기 위한 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
5. 더덕 속(Genus) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 코도놉시스 콘볼부라세아(Codonopsis convolvulacea), 코도놉시스 클레마티데아(Codonopsis clematidea), 코도놉시스 몰리스(Codonopsis mollis), 코도놉시스 빈시플로라(Codonopsis vinciflora), 코도놉시스 비리디플로라(Codonopsis viridiflora), 코도놉시스 포레스티이(Codonopsis forrestii), 코도놉시스 오바타(Codonopsis ovata), 코도놉시스 그레이(Codonopsis grey) 및 코도놉시스 필로술라(Codonopsis pilosula)로부터 더덕(Codonopsis lanceolata) 종을 구별하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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