KR20200049500A - 국화 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 국화 품종을 구별하는 방법에 대한 것이다.
따라서, 본 발명의 SSR 마커는 기존에 활용되지 못했던 국화의 염기서열을 활용하여 국내 국화 품종의 다형성 평가, 국화 품종을 정확하게 분리 및 효율적으로 관리하기 위한 도구가 될 수 있으며 향후 국화 유전자원의 관리, 핵심집단 구축, 품종 판별 및 가계도 분석 등의 다양한 분야에 활용될 수 있을 것이다.

Description

국화 품종 구별을 위한 SSR 마커 및 이의 용도 {SSR markers for discriminating Chrysanthemum morifolium cultivars and uses thereof}
본 발명은 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 국화 품종을 구별하는 방법에 대한 것이다.
국화(Chrysanthemum morifolium)는 국화속에 속하는 여러해살이 풀로 주로 관상용으로 쓰이며, 꽃을 말려 베개 속에 넣으면 두통에 효과적이며, 이불솜에 넣으면 그윽한 향기를 즐길 수 있으며, 국화술을 담가 먹기도 한다. 국화의 품종 등록을 하려면 한 가지 이상의 대조품종과의 구별이 명확해야 하고(구별성; distinctness), 조사특성이 균일하게 당대에서 발현되어야 하며(균일성; uniformity), 일반적인 방법으로 증식하였을 때 안정하게 유지(안정성; stability)되어야 한다.
국화는 전세계적으로 주요 화훼작물 중 하나이며, 국내 화훼산업의 3대 작물에 속한다. 이러한 국화 산업에 활력을 불어넣기 위해서, 혁신적인 국화 품종 개발을 위한 육종 기술과 국내에서 육성된 품종을 효율적으로 보호하는 품종보호체계가 절실히 필요하다. 그러나 국화는 94GB의 높은 게놈 크기, 고도의 이형 접합성을 가진 타식성 작물이며, 배수체 작물로 대립유전자가 많아 유전자형 분석시 그 해석이 복잡하기 때문에 국화 품종의 체계적인 보호에 난항을 겪고 있다.
전통적인 식물연구는 식물의 형태적 내지 생태적 차이 등을 기초하여 이루어졌으나, 식물의 변이 발생으로 동정이 어렵고 효율성이 낮으며, 유전적 특성이 가까운 근연종간에는 매우 제한적이어서 식물의 다양성을 평가하기에는 무리가 있었다. 이러한 한계점을 보완하기 위해 분자생물학적 분석법이 사용되고 있으며, 이를 통해 작물의 유전적 다양성 내지 유연관계에 대한 분석이 효율적으로 이루어지고 있다. 상기 분자생물학적 분석법에 사용되는 분자표지 마커는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), SSR(simple sequence repeat), SNP(Single nucleotide polymorphism) 또는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 등이 있다.
이상적인 마커는 다형성이 높아야 하고 게놈 전체에 고르게 분산되어 있으며 유전적 차이가 명확해야 한다. 그리고 분석 가격이 낮고 재현성이 높아야 한다. 그러나 RFLP 마커는 재현성이 높으나 다형성 확인이 어렵고, RAPD 마커 및 AFLP 마커는 다형성 확인은 용이하나 재현성이 낮아 분자육종학 연구에는 주로 게놈내 특정 염기서열을 기반으로 개발된 SSR 마커 또는 SNP 마커가 활용되고 있다. 그 중, SSR 마커는 생물 유전체에 전체적으로 분포하면서, 변이가 큰 단순반복 염기서열(1~4bp)의 차이를 이용하여 제작되므로 다형성 내지 유연관계 확인에 용이하다. 따라서 SSR 마커는 공우성(co-dominant)이 있어야 하고, 개발시에 염기서열 정보가 필요하다. SSR마커는 국립종자원 UPOV에서 제안한 유전자 분석 지침서를 기반으로 고추, 멜론, 상추 등의 27개 작물에 보편적으로 사용되고 있다. 그러나 상기 언급한 바와 같이 국화의 경우, 유전체가 복잡하여 국화 품종 구별을 위한 SSR 마커 개발이 용이하지 않은 실정이다.
대한민국 등록특허 제 10-1826732 호 에서는, 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 및 키트를 제공하고 있다. 그러나 높은 유전적 다형성과 재현성을 가지면서 국내에 유통되는 국화의 품종을 구별하기 위한 SSR 마커에 대한 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 작물의 다형성 내지 유연관계를 분석하기에 적합한 SSR 마커를 국화 품종 구별에 사용하기 위하여 예의 노력한 결과, 국내 유통되는 품종인 스탠다드 국화 ‘정운’ 및 ‘세이노이세이’의 RNA를 기반으로 다형성이 높은 SSR 마커를 제작 및 선발하고, 상기 SSR 마커를 이용하는 경우 국화의 품종을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 국화 품종을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 9개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것 일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, i) 국화에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는, 국화 품종을 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 게놈 DNA는 국화의 액아 또는 잎에서 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 SSR 마커는 기존에 활용되지 못했던 국화의 염기서열을 활용하여 국내 국화 품종의 다형성 평가, 국화 품종을 정확하게 분리 및 효율적으로 관리하기 위한 도구가 될 수 있으며 향후 국화 유전자원의 관리, 핵심집단 구축, 품종 판별 및 가계도 분석 등의 다양한 분야에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 스탠다드 국화 품종인 '정운'과 '세이노이세이'를 이용하여 생산된 short read를 이용하여 제작한 유니진(unigene) 내지 콘티드(contigue)를 나타낸다. x축은 콘티그의 길이(base pair)를 나타내며 y축은 개수를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 국화 SSR 마커에 존재하는 다양한 반복 모티프(repeat motifs)들의 빈도를 나타낸다. A는 Di-nucleotide(27.5%)로서, TG(10.1%)+AC(3.4%)+CA(6.7%)+TA(7.3%)을 의미하며; B는 Tri-nucleotide(61.2%)로서, GAT(10.7%)+CAA(2.2%)+CCA(2.8%)+CGT(3.9)+GAG(2.2)+ACA(2.2)+TCA(5.6%) +TGA(5.1%)+ACC(2.8%)+ATA(4.5%)+AGT(2.8%)+CGC3.9%)+ATC(3.9%)+TTG(3.4%)+TGT(2.8%)+AAC(2.2%)를 의미하고; C는 Tetra-nucleotide(11.3%)로서 ATTT(3.5%)+TAAC(2.8%)+TGTT(2.8%)+TTAT(2.2%)을 의미한다.
도 3은 본 발명의 국화 SSR 마커에 존재하는 다양한 반복 모티프(repeat motifs)들의 빈도를 나타낸다. Di-nucleotide 중에서는 AT/TA 유형이, Tri-nucleotide 중에서는 ATG/TGA/GAT가 가장 많이 분포하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 선정된 31개 마커의 다형성 정보(Polymorphic Information Content; PIC)를 나타낸다.
도 5는 선정된 31개 마커의 유전자 정보(Gene Diversity; GD)를 나타낸다.
도 6은 유전분석용으로 선발된 9개의 마커를 이용하여 8개의 국화 품종(왼쪽부터 차례대로, 1: 아르거스, 2: 보라미, 3: 무지개, 4: 예스루비, 5: 백설, 6: 백선, 7: 신마, 8: 수미)의 유전분석 결과를 나타낸다.
도 7은 품종판별용으로 선발된 22개의 마커를 이용하여 8개의 국화 품종(왼쪽부터 차례대로, 1: 아르거스, 2: 보라미, 3: 무지개, 4: 예스루비, 5: 백설, 6: 백선, 7: 신마, 8: 수미)의 품종분석 결과를 나타낸다.
도 8은 유전분석용으로 선발된 9개의 마커로 [표 4] 및 [표 7]에서의 8개의 국화 품종(a1 및 b1: 아르거스, a2 및 b2: 보라미, a3 및 b3: 무지개, a4 및 b4: 예스루비, a5 및 b5: 백설, a6 및 b6: 백선, a7 및 b7: 신마, a8 및 b8: 수미)에 대한 유전분석 결과의 피크점을 나타낸다. 상기 9개의 마커는 재현성이 있는 것을 확인하였다.
도 9는 유전분석용으로 선발된 9개의 마커 중 8개의 마커로 국화 품종 64종 중 56종의 유연관계를 분석한 계통도를 나타낸다. 숫자들은 유전적 비유사성(genetic dissimilarity)를 의미하고, 트리의 길이는 비유사성 지수 값과 같으며 스케일 바는 왼쪽 하단에 위치한다.
도 10은 본 발명의 국화 SSR 마커의 PIC(polymorphism information content) 추정을 나타낸다. (A)는 8 개의 KNOU_SSR 마커 중 국화 8 품종에서 국화 56 품종 간의 PIC 추정의 상관 관계를 나타낸다. 데이터 세트는 선형 또는 다항식 회귀 모형에 적합하며, 선형 및 다항식 모델의 방정식 및 R-제곱 값은 각각 그림의 아래쪽과 위쪽에 표시된다. (B)는 국화 56 품종에서 무작위로 선택된 8, 24 및 40 품종으로 KNOU_CrySSR40의 PIC를 독립적으로 추정한 결과를 나타낸다.
도 11은 유전분석용으로 선발된 마커를 이용하여 56개의 국화 품종의 품종분석 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 국화의 유전체가 복잡하다는 특성상 국화 품종의 체계적인 보호가 어려웠으며 같은 맥락에서 작물의 유전체 정보를 기반으로 제작하는 SSR 마커를 국화 품종 구별에 적용하는데에 어려움이 있었다. 이를 극복하여 작물의 유전적 다형성 내지 유연관계 확인에 용이한 SSR 마커를 국화 품종 구별에 효과적으로 적용한 마커는 아직까지 개시된 바 없다.
본 발명에 따른 국화 품종 구별을 위한 SSR 마커는 유전적 다형성 정보 함유량(Polymorphic Information Content) 등의 수치가 높아 국내에 유통되고 있는 국화의 품종을 높은 효율 내지 정확도로 구별할 수 있어, 국화 품종 구별 용도로서 효과적이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.
상기 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트는 상기 9개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는 6개 이상의 프라이머 세트가 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 8개 이상의 프라이머 세트가 포함되는 것이 바람직하다. 상기 6개 이상의 프라이머 세트가 포함되는 경우, 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 가 모두 포함되는 것이 바람직하다. 8개 이상의 프라이머 세트가 포함되는 경우 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 가 모두 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다.
상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 SSR 프라이머(22개 올리고 뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머; 및 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, '프라이머'는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 의 64품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 블루호프, 골든아이, 신명, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 백설, 백선, 신마 및 수미 의 56품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 블루호프, 골든아이, 신명, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 예스루나, 예스루비, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 백설, 백선, 신마 및 수미 의 54품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것이 바람직하다. 보라미白, 해피엔디, 하이백산 및 핑크베리로 이루어진 군, 백마와 드림옐로우로 이루어진 군, 포드와 그린엔젤로 이루어진 군 및 레오파드와 러빙유로 이루어진 군은 상기 54종의 국화 품종 각각과 구별될 수 있으며, 각각 군으로서 분리될 수 있다(도 9).
본 발명은 또한, 상기 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, i) 국화에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는, 국화 품종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 단계 i)의 게놈 DNA는 국화의 액아 또는 잎에서 분리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 DNA 분리용 키트를 사용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 6-FAM (6-Carboxyfluorescein), NED, VIC, PET 또는 ROX이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 6-FAM, NED, VIC, PET 또는 ROX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한 상기 표지 물질에는 Cy-5 또는 Cy-3가 포함될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 상기 단계 iii)의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 상기 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것이 바람직하다. 상기 국화 품종은 상기 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트에서의 국화 품종과 동일하므로 그 기재로 설명을 대신한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
국화 SSR 마커 제작
<1-1> 국화 SSR 대량 추출
공시재료는 예산 화훼연구소에서 국내 유통되는 품종인 스탠다드 국화 '정운' 과 '세이노이세이' 의 두 개의 품종에서 각각 액아 1개 및 어린 잎 1개를 채취하여 Total RNA Isolation System으로 RNA를 추출(238,635,903 basepair(bp))하였고, 각각 Hiseq2500으로 sequencing을 수행한 후 QC 및 cDNA를 합성하여 Library 제작 및 NGS를 기반으로 short read를 생산하였다. 그 결과, 280,434개의 unigene이 생산되었고, 평균 unigene의 길이는 851bp였다(도 1). 그리고 De novo assembly와 read mapping을 하였다. 상기 샘플 Pooling에서 먼저 SSR sequence filtering을 한 후, polymorphic SSR sequence filtering을 통해 SSR을 대량 추출을 하였다.
<1-2> 프라이머 디자인
상기 실시예 <1-1>에서 생산된 unigene 서열을 기반으로 31,121개 SSR(Simple sequence repeat)을 선발하였고, 정운과 세이노이세이 간 Polymorphic SSR을 찾기 위해 각각의 RNAseq 정보를 기반으로 De novo assembly를 수행하였다. 그 후 각각의 De novo assembly 결과에 대해 선발된 SSR 서열을 pairwise Blast 후 각 SSR loci repeat number에 대한 차를 조사해본 결과, 17,551 SSR loci(약 56%)가 polymorphic 함을 발견하였다. 그리고 그 중에서 다형성이 높으면서 증폭 산물 크기가 200~300bp 범위인 프라이머를 디자인하기 위하여 SSR loci 207개를 선정하고, 이 중 50개를 선정하고 이를 이용하여 프라이머를 디자인하였다.
<1-3> PCR 증폭 및 프라이머 선발
상기 실시예 <1-2>에서 디자인한 50개의 프라이머들을 이용하여 정운 및 세이노이세이 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 그 후 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 DNA를 추출하고, PCR을 통해 증폭된 프라이머만을 선발하였다. 그 결과 하기 [표 1]과 같이 50개의 프라이머 중 31개의 프라이머만이 증폭되어 최종적으로 31개의 SSR 마커를 선발하였다.
검토한
마커의 갯수 		SSR 마커 유형 다형적
마커의 갯수 		증폭된 SSR 마커의 다형성 SSR 마커 출처
50 국화의 유전적(genomic) SSR 31 31/50 본 발명에서 제조
유전분석용 SSR 마커 및 품종판별용 SSR 마커 분류
<2-1> 공시재료
상기 [실시예 1]에서 선발한 마커들을 분류하기 위한 공시재료는 시중에서 유통되는 국화 64품종 중 대체로 잘 알려진 스프레이 국화 아르거스(Argus), 보라미(Borami), 무지개(Mujigae) 및 예스루비(Yes Ruby) 4품종과 스탠다드 국화 백설(Baekseol), 백선(Baekson), 신마(Zinba) 및 수미(Sumi) 4품종 총 8품종을 대표 품종으로 선정하였다(표 2).
NO. 재배 품종명 타입 분류 NO. 재배 품종명 타입 분류
1 아르거스 스프레이 5 백설 스탠다드
2 보라미 스프레이 6 백선 스탠다드
3 무지개 스프레이 7 신마 스탠다드
4 예스루비 스프레이 8 수미 스탠다드
<2-2> DNA 추출 및 PCR 증폭 확인
충청남도 농업기술원 화훼연구소에서 상기 [표 2]의 8품종 국화의 어린잎을 채취해 튜브에 넣었고, -80℃ 디프리져에 보관하였다. 실험에 사용할 국화샘플은 사각용기에 액체질소를 넣고 담아와서 파쇄기(티슈라이져)에서 파쇄한 후 튜브를 액체질소에 담가 두었다.
튜브에 추출 용액(Extraction buffer mix) 30㎖ 및 환원제 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 30㎕ 를 넣고 볼택싱(vortexing)한 후 히팅기에서 2시간 중탕했다. 그 후, 4℃에 보관 중인 PCI용액 700㎕ 를 넣고 15분간 기계를 이용하여 섞어 준 후 12,000, 15분, 4℃ 조건에서 원심분리하였다. 피펫으로 상층액 500㎕를 수득하여 PCI 500㎕을 첨가해 15분간 기계를 이용하여 섞어 준 후 12,000, 15분, 4℃ 조건에서 원심분리하고, 상층액 400㎕를 수득하였다. 이에 DNA를 침전시키기 위해 이소프로판올(Iospropanol) 400㎕ 을 넣고, 남아있는 RNA를 제거하기 위해 RNAse-A 2㎕ 를 넣고 30분간 얼음 위에 방치하였다. 볼택싱 후 12,000, 15분, 4℃ 조건으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 70% 1차 에탄올 700㎕ 를 넣고 15분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 70 % 2차 에탄올 700㎕ 를 넣고 5분간 원심분리 하였다. 에탄올을 버리고 3분동안 원심분리한 후 남아있는 에탄올을 피펫으로 제거했다. 상온에서 15분간 에탄올을 증발시킨 후 3차 증류수 100㎕를 넣어 펠렛을 녹였다. DNA를 추출하고 하기 [표 3]의 PCR Mixture 반응액을 이용하여, 다음과 같은 사이클로 PCR을 진행하였다; 95℃에서 3분간 Inital denturation를 시행 한 후, 95℃에서 1분간 Denturation, 55℃에서 45초 Annealing, 72℃에서 1분간 Extension으로 이 세 단계를 35번 반복하였다. 그리고 72℃에서 10분간 Final Extension을 수행 하였다. 증폭된 DNA를 전기영동하여 갤(gel)의 UV사진으로 증폭결과를 확인했다. 나노드럼에서 DNA를 정량했다.
그 결과는 [표 4] 내지 [표 7]와 같다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
<2-3> 다형성 지수 계산 및 마커 사진 분석
상기 <실시예 1>에서 선발된 31개의 프라이머를 활용하여 다형성 정도를 조사하고자 하였다.
구체적으로, 수원실용화재단에서 모세관전기영동기 ZAG(Zero Agarose Gel)로 다형성을 분석하고 PROSize 2.0으로 피크점 데이터를 정리하였다. PROSize 2.0 프로그램을 사용하여 모세관전기영동 데이터를 PowerMaker V3.25 프로그램으로 PIC(polymorphism information contents) 값을 계산하였다. 그리고 도출된 PIC 값과 마커 사진을 분석하여 유전 분석용 마커와 품종 판별용 마커를 선발하였다.
그 결과, 하기 [표 8] 및 [표 9] 에서 나타나는 바와 같이, 다형성 정도를 나타내는 PIC(Polymorphism information content) 값은 0.051~0.908 범위에 분포하였고, 평균값은 0.779의 값으로 높게 나타났고 유전자 다양성 수치인 GD(Gene diversity)도 평균 0.805으로 높게 나타나 유사한 패턴을 보였다([도 4] 및 [도 5]). 이형접합성 H(Heterozygosity)은 CrySSR_16, CrySSR_17, CrySSR_18, CrySSR_40, CrySSR_49, CrySSR_50은 싱글밴드 양상을 보였고 평균 0.466을 나타내었다. 밴드가 또렷하고 진하며 깨끗한 마커인 knou CrySSR_4, Knou CrySSR_7, knou CrySSR_9, Knou CrySSR_16,knou CrySSR_31, knou CrySSR_40, Knou CrySSR_42, knou CrySSR_45 및 Knou CrySSR_50번의 9개를 유전분석용으로 선발하였으며(도 6, 표 10), 나머지는 품종 판별만 가능한 품종판별용으로 선발하였다(도 7, 표 11).
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
선발된 마커의 재현성 확인
상기 <실시예 2>에서 선발된 9개의 유전분석용 마커의 재현성을 알아보고자 하였다. 구체적으로, 첫 번째 8품종(표 2)과 두 번째 64품종(표 15) 중 동일한 8품종을 9개의 유전분석용 마커로 분석하여 품종의 각각에 해당되는 피크점을 기록하고 비교하였다.
그 결과, 하기 [표 12] 내지 [표 14] 및 [도 8]에서 나타나는 바와 같이 a와 b의 위치가 같은 패턴을 가지고 있는 것을 확인하였다. a와 b의 위치 패턴이 다른 것들은 분석과정의 오차로 사료되었다. 따라서 본 발명의 유전분석용 마커는 재현성이 있는 것을 확인하였다.
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
선발된 마커로 국화 유연관계 분석
<4-1> 공시재료
유연관계 분석을 위한 공시재료는 충청남도농업기술원 예산화훼연구소에서 재배되고 있는 품종 중에 국내에서 유통되는 스프레이 또는 스탠다드 타입 국화로 총 56품종(표 15) 내지 보라미白, 해피엔디, 하이백산, 핑크베리, 백마, 드림옐로우, 포드 및 그린엔젤을 모두 이용하였다. 이에는 실험의 연결성을 위해 1차 실험에서 사용한 8품종(표 2)을 포함하였다. 그리고 상기 <실시예 2>에서 선발한 9개의 유전분석용마커 중 8개의 유전분석용마커를 활용해 공시재료 64품종의 유연관계 분석을 수행하였다.
Figure pat00013
<4-2> DNA 추출 및 PCR 증폭 확인
DNA 추출 및 PCR 증폭 확인은 상기 실시예 <2-2>의 방법과 동일하게 진행하였다. 그 결과는 하기 [표 16] 및 [표 17]와 같으며, KnouCry_4, KnouCry_7, KnouCry_16, KnouCry_31, KnouCry_40 및 KnouCry_42의 프라이머 세트만으로도 국화 55품종 이상을 충분히 유전적으로 구분할 수 있음을 확인하였다.
Figure pat00014
Figure pat00015
<4-3> 다형성 지수 계산 및 계통도 작성
Polymorphism 수원 실용화재단에서 모세관전기영동기 ZAG(Zero Agarose Gel)로 분석하고 PROSize 2.0으로 데이터를 정리하였다. PROSize 2.0 프로그램을 사용하여 모세관전기영동 데이터를 PowerMaker V3.25 프로그램을 사용하여 대립유전자 빈도(MAF:Major. Allele. Frquency), 대립유전자 수(NA:No. of alleles), 유전적 다형성 정보 함유량(PIC:Polymorphic Information Conent), 이형접합(H:Heterozyosity) 등을 측정 하였고, UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetical average) 방법을 이용해 phylogenetic tree를 이용하여 계통도를 작성하였다.
Figure pat00016
그 결과, 상기 [표 18]은 유전분석용 마커에 대한 서열정보 및 이를 이용하여 8품종(표 2) 내지 64품종 중 상기 56품종(표 15)의 다형성 지수를 나타낸다. 이때, [도 10]에서 나타나는 바와 같이 PIC 기준 약 58%의 데이터 셋만이 선형회귀로 설명되는 반면, 2차함수로 설정된 곡선회귀가 적용이 되었을 때 약 81%의 데이터 셋이 관련 회기분석으로 설명이 되는 것을 알 수 있었다. 특히 다형성이 높은 KNOU_CrySSR4 등과 같은 SSR loci군은 샘플의 숫자가 늘어남에 따라 다형성 정도가 크게 변화가 없지만, 상대적으로 다형성 정도가 낮게 평가된 KNOU_CrySSR40 등과 같은 SSR loci군들은 중간 정도의 SSR군들은 다형성 정도가 뚜렷이 증가가 되었다. KNOU_CrySSR40 등과 같이 PIC 값 기준 0.75이하인 loci인 경우 집단의 규모가 8품종에 불과할 때, 관련 마커의 다형성예측이 평가절하될 수 있음을 확인하였다. KNOU_CrySSR40에 대해 샘플 규모를 8, 24, 40 품종으로 확대한 결과, PIC 예측에 대한 오차범위가 점차 줄어들었고, 특히 집단 규모가 24품종 이상이 되면 평가절하효과가 완화가 되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명의 국화 SSR마커 다형성 예측시 정확성을 확보하기 위해 적어도 24품종 혹은 자원을 사용해야 할 것으로 판단하였다.
또한, [도 9]의 계통도를 작성할 수 있었다. 본 발명의 유전분석용 마커들은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 블루호프, 골든아이, 신명, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 예스루나, 예스루비, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 백설, 백선, 신마 또는 수미의 56품종을 모두 개별적으로 분리해낼 수 있었다. 추가적으로, 보라미白, 해피엔디, 하이백산 및 핑크베리는 하나의 그룹으로, 백마와 드림옐로우는 하나의 그룹으로, 포드 및 그린엔젤은 하나의 그룹으로, 레오파드 및 러빙유는 하나의 그룹으로 분리해낼 수 있었다.
따라서 본 발명의 9개의 유전분석용 마커는 64품종 모두를 분류해낼 수 있음을 확인하였다.
<4-4> 선발된 마커를 이용한 국화 품종 구별
상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 국화 품종을 유전분석하였다.
그 결과, [도 11]에서 나타나는 바와 같이 본 발명의 유전분석용 마커가 국화 56품종을 명확하게 구별할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Korea National Open University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> SSR markers for discriminating Chrysanthemum morifolium cultivars and uses thereof <130> 1066126 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_4_F <400> 1 acagtacaca cacagccaac ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_4_R <400> 2 gtaatgcttc cgtctgcata gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_7_F <400> 3 aggcccaact ttattcaccc 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_7_R <400> 4 ccaaatccaa tctccggc 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_9_F <400> 5 cattcacact cacctacaca cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_9_R <400> 6 cctccctctc ttacaatgtc ac 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_16_F <400> 7 acaagtagta ggaggaggag ga 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_16_R <400> 8 cagtgtagcc ggtacagaag a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_31_F <400> 9 ggaagcaagt gtgtggtttc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_31_R <400> 10 acctccccat agaatcttga gc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_40_F <400> 11 gacggatttt gagcttggag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_40_R <400> 12 gaaccaataa tcccgacacc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_42_F <400> 13 caaagtacta ccaaacgcgg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_42_R <400> 14 gtaacattga gggtgtagca gc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_45_F <400> 15 aaacagcctg acccaatctc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_45_R <400> 16 gtcatcatcc aaccaccaac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_50_F <400> 17 gatggtgaga cattgcgtct 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_50_R <400> 18 gctcaaggat tatggacact gg 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_1_F <400> 19 gagttcttcg gagtaagatc cg 22 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_1_R <400> 20 tggcgtgtac aagtttcg 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_5_F <400> 21 accataacca ccaccactgt 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_5_R <400> 22 gaggtaggtt tggtggtcg 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_6_F <400> 23 ggaggctcgg aatttgtt 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_6_R <400> 24 ccatcgacga aactaacgag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_8_F <400> 25 ctcgacattc gtcaaagtcc 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_8_R <400> 26 gaatcccatt ctgcttcg 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_10_F <400> 27 gaacatgcaa tggatggg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_10_R <400> 28 ccaccacact ccgtcattat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_11_F <400> 29 cccatctcaa tccttcactc 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_11_R <400> 30 gtaacaccaa ccctaccttc ct 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_14_F <400> 31 gaagggaagg gtatggaaga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_14_R <400> 32 tagcataagc ttgggctctc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_15_F <400> 33 gacttcaaac cctgacaacg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_15_R <400> 34 gggacatgtt tttgtgacgg 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_17_F <400> 35 gttcggatcg cttcatca 18 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_17_R <400> 36 taaccgcggt gatagttcg 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_18_F <400> 37 cgcgtatgct aatgaaggac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_18_R <400> 38 ccttcaaacc caaaccctac 20 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_20_F <400> 39 ggctctgatc acccatttct ac 22 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_20_R <400> 40 accaaacact accaccgtga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_22_F <400> 41 gatccatagc ccaaatggtg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_22_R <400> 42 gccgagagct aacaagatca 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_23_F <400> 43 gtgataagga gcaagtccga g 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_23_R <400> 44 cggcattaca actctcccta gt 22 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_25_F <400> 45 gttcgaatac ctcgtttggc 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_25_R <400> 46 gaaacacctc tagttcacgc tc 22 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_27_F <400> 47 cgtacactcc aacaccactt c 21 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_27_R <400> 48 caacaagacc cgaatcctc 19 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_29_F <400> 49 ctctctcaag tgaagttgtg gc 22 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_29_R <400> 50 agaaagggtc ggcttgat 18 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_30_F <400> 51 caactacctg atcaacctcc tc 22 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_30_R <400> 52 ggagtcgtga aagtggtcat 20 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_35_F <400> 53 gtgaggagac cttttacagc ag 22 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_35_R <400> 54 atccagtggt gggaggtaac 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_37_F <400> 55 cacttctcgt tatcctcaca cc 22 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_37_R <400> 56 ctgtgtctac gattggcatc 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_38_F <400> 57 tattgccaca tgcacacc 18 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_38_R <400> 58 gtatatcact aacccccatc cc 22 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_48_F <400> 59 ctccatccat ccatgtgagt 20 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_48_R <400> 60 accacagcac tggcacat 18 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_49_F <400> 61 ctttgctagt gctgatactg gc 22 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Knou CrySSR_49_R <400> 62 ataatccgcc agctagggt 19

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것을 특징으로 하는 국화 품종 구별을 위한 SSR 프라이머 세트.
  3. 제1항의 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 국화 품종 구별을 위한 키트.
  4. 제3항에 있어, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼인 것을 특징으로 하는, 국화 품종 구별을 위한 키트.
  5. i) 국화에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)의 증폭 산물을 검출하는 단계;
    를 포함하는, 국화 품종을 구별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 i)의 게놈 DNA는 국화의 액아 또는 잎에서 분리하는 것을 특징으로 하는, 국화 품종을 구별하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단계 iii)의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 국화 품종을 구별하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 국화의 품종은 예스누리, 예스코러스, 옐로우팡팡, 드림프린스, 카스텔리, 맨트리, 예스투게더, 예스나우, 예스스타, 그린위치, 핑크프라이드, 퍼플콘, 프로기, 블랙마블, 레오파드, 아르거스, 보라미, 무지개, 휘파람, 예스모닝, 매직, 옐로우캡, 체리블럿섬, 시크릿핑크, 오렌지엔디, 브라이트엔디, SP13-154-01, 조이핑크, 핑크베리, 블루호프, 골든아이, 신명, 포드, 델리아크림, 일월, 파워엔디, 파이어핑크, 드림라운드, 드림옐로우, 필드그린, 옐로우마블, 엔젤, 예스홀릭, 버블엔디, 해피엔디, 스윗캔디, 옐로우키드, 러브마인, 조이크림, 매직스타, 러빙유, 예스루나, 예스루비, 그린엔젤, 피치엔디, 예스송, 예스엘사, 보라미白, 하이백산, 백설, 백선, 신마, 수미 및 백마 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종인 것을 특징으로 하는, 국화 품종을 구별하는 방법.
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