CN111961752B - 一种鉴定中国樱桃种质的ssr标记、应用及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定中国樱桃种质的SSR标记、应用及鉴定方法，属于植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域。本发明以SSR标记78A9‑1作为分子标记，提取中国樱桃种质及近缘物种的基因组DNA，利用一对SSR标记引物进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，读取图谱条带，统计分析，本发明克服现有技术中无法准确鉴定中国樱桃种质的缺点，提供了一种快速、准确鉴定中国樱桃种质的SSR标记。本发明具有快速、准确鉴定出中国樱桃种质等优点。

Description

一种鉴定中国樱桃种质的SSR标记、应用及鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域，具体涉及一种鉴定中国樱桃种质的SSR标记、应用及鉴定方法。

背景技术

中国樱桃是蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)的多年生木本果树，已有3000年的栽培历史，其果实风味浓郁，外观鲜艳，具有极高营养、保健和经济价值。然而中国樱桃是多倍体物种，基因组杂合度高，童期长，与樱属其他近缘物种间存在同名异物，同物异名的现象，并且樱属物种间易发生种间杂交，杂交种质的遗传组成难以明确。

植物物种鉴定分为田间性状鉴定与分子鉴定两种方法，田间鉴定对于童期长的果树物种而言，需要很长的周期，并且鉴定的结果中包含了环境的影响，不能够完全反应品种遗传的因素。分子标记鉴定技术可以克服田间鉴定的不足，具有快速且不受环境影响的优势，被广泛用于植物种质鉴定。SSR标记为共显性标记、多态性高、重复性好，通用性高，能在DNA水平上鉴别不同物种是否存在差异.从而科学、准确地判断物种的特异性、一致性和稳定性，为保护育种、鉴定和检测果树苗木真实性提供客观、科学和准确的技术保障。

关于中国樱桃的鉴定，此前未有报道相关的鉴定方法，因此迫切需要一种能特异性鉴定中国樱桃种质的方法，以为中国樱桃的种质资源保护和发掘利用提供便利。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术中无法准确鉴定中国樱桃种质的缺点，提供一种用于鉴定中国樱桃种质的特异性SSR标记及方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种鉴定中国樱桃种质的SSR标记，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：CGAACCTAAGACTACTGATCTA。

所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：CTTGCTGCTTGTGGTAGAG。

所述SSR标记引物编号为78A9-1。

所述SSR标记在鉴定中国樱桃种质中的应用。

一种中国樱桃种质的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)基因组DNA提取：提取待测样本的基因组DNA；

(2)PCR扩增：用权利要求1所述的引物对步骤1得到的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；

(3)凝胶电泳及银染检测：将所述PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测；

(4)数据统计：比对计算出目的条带的大小，对电泳条带按条带大小进行统计。

本发明优选的中国樱桃种质的鉴定方法，包括如下具体步骤：

(1)基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取中国樱桃栽培种质、中国樱桃野生种质、中国樱桃与甜樱桃杂交产生的三倍体杂交后代以及近缘物种样本的基因组DNA，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，采用核酸蛋白定量测定仪检测基因组DNA的纯度和浓度；

(2)PCR扩增：用权利要求1的引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行PCR扩增；

PCR反应体系：10μL 2×Taq mix；7μLddH₂O；1μL正向引物；1μL反向引物；1μLDNA模板；

PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，33个循环；72℃再延伸8min；

(3)凝胶电泳及银染检测：PCR扩增物在聚丙烯酰胺凝胶上恒定功率20W下电泳1.5h，用0.1％的AgNO₃溶液中银染12min，再将聚丙烯酰胺凝胶浸于显色液中显色6min，最后在凝胶成像系统上拍照记录；

(4)数据统计分析：利用Quantity One软件通过与DL500 DNA maker比对计算出目的条带的大小(bp)，对电泳条带按条带大小进行统计，能产生260bp电泳条带的样本判断为中国樱桃，不能产生260bp电泳条带的样本判断为非中国樱桃。

本发明具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明首次开发出能在物种水平上鉴定中国樱桃的方法，是利用本课题组前期开发的中国樱桃全基因组信息筛选出一对中国樱桃特异性SSR标记，操作方法简单、准确度高、成本低、重现性好，是目前在物种水平上鉴别中国樱桃种质最简便，最快速，最准确的方法。

(2)本发明筛选获得中国樱桃特有的SSR标记78A9-1，目前能在中国樱桃、欧洲甜樱桃、欧洲甜樱桃与中国樱桃杂的杂种后代、圆叶樱桃、欧洲酸樱桃、欧洲酸樱桃和灰毛叶樱桃的杂种后代、日本晚樱、东京樱花、钟花樱桃、高盆樱桃、欧李、麦李、郁李、毛樱桃、桃、梅、榆叶梅等17个物种中快速检测出中国樱桃种质，准确率达到100％。

(3)本发明标记引物78A9-1扩增出的目的片段是中国樱桃物种特有的核苷酸序列(260bp)，在基因组高度杂合的多年生木本果树中意义重大，为中国樱桃的种质资源保护和发掘利用提供极大便利，同时对樱属物种的系统发育研究也具有潜在的利用价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明SSR标记78A9-1在不同样本的PCR扩增产物电泳结果。

其中，M为DL500 DNA maker,(TAKARA，大连)，1-92号样本是中国樱桃栽培种质，93-94号样本是中国樱桃野生种质，99号样本是‘兰丁2号’，为中国樱桃(四倍体)与甜樱桃(二倍体)杂交产生的三倍体杂交后代，95-97号样本为樱属近缘桃属和杏属的材料，98及100-114号为中国樱桃近缘物种的樱属其他材料。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明提供一种中国樱桃种质的SSR标记引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：CGAACCTAAGACTACTGATCTA。

所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：CTTGCTGCTTGTGGTAGAG。

鉴定中国樱桃种质的分子标记及方法，采用以下中国樱桃种质以及近缘物种为例。

1、材料与方法

1.1、试验材料：

本实施例一共选取了114份材料，用于挖掘中国樱桃特异性SSR标记，包括：

(1)本实施例采用了94份来自我国8个省(直辖市)的40个县市的地理分布不同，表型差异大的中国樱桃，如表1所示，其中，1-92号为中国樱桃栽培种质，93-94号2份为中国樱桃野生种质。

(2)本实施例还采用了其它物种的样本，如表2所示，包括桃属、杏属及樱属等16个近缘物种20份材料，其中包括99号样本，‘兰丁2号’，为中国樱桃(四倍体)与甜樱桃(二倍体)杂交产生的三倍体杂交后代。

表1中国樱桃试验材料

表2其他近缘物种试验材料

1.2、试验方法：

1.2.1、中国樱桃特异性SSR标记的开发

利用MISA脚本软件对本课题组前期测序的中国樱桃全基因组进行SSR位点扫描，总共检测获得181513个SSR，随机挑选64个位点，应用Primer6软件设计SSR引物，通过中国樱桃及其近缘物种对引物进行PCR扩增验证筛选特异性SSR标记。引物设计原则：引物长度为18～27bp，扩增产物大小在100～400bp，为避免形成“引物二聚体”，退火温度控制在50℃～60℃之间，正反应物Tm值的差异小于5℃，引物末端应无回文结构，引物中(G+C)含量40％～65％，引物委托成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.2.2、DNA的提取及检测

采用改良的CTAB法提取中国樱桃及其近缘物种材料的DNA：

配置去糖缓冲液：1mol/L NaCl；0.1mlo/L Tris-HCl；0.4mlo/L葡萄糖；2％PVP；PH＝8.0。配置DNA提取液(3％CTAB)：1.5mol/L NaCl；0.1mol/L Tris-HCl；0.02mol/L EDTA；2％PVP；3％CTAB；pH＝8.0。

(1)取硅胶干燥的幼嫩叶片1-2g于研钵中，加入少许PVP，再加入液氮，迅速研磨成粉。

(2)将研磨后的粉末(大约0.2g)迅速装入2mL离心管内，再加入1mL去糖缓冲液和10μLβ-巯基乙醇，充分混匀，在常温下5000r离心2min。

(3)倒除上清液，在沉淀中加入1mL 65℃预热的DNA提取液和10μLβ-巯基乙醇，65℃水浴1h，期间每隔5min颠倒离心管使液体充分混匀，在常温下12600r离心10min。

(4)取上清液转置于2ml离心管内，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)混合均匀，在4℃下12600r离心10min。

(5)重复步骤(4)。

(6)取450μL上清液转置于1.5ml离心管内，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)和50μL的3mol/L的醋酸钠，上清液呈深黄色可多加10-50μL醋酸钠，轻轻颠倒混匀，置于-20℃冰箱中静置1h。

(7)在4℃下12600r离心10min，倒除上清液，收集沉淀。

(8)在DNA沉淀中加入75％乙醇800μL，轻摇后静置1min，倒除上清液。如此清洗DNA沉淀两次，然后再用无水乙醇清洗一次，置于通风处风干。

(9)加入50μL ddH2O溶解风干的DNA沉淀。

(10)取2μL DNA采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

(11)取1μL DNA使用核酸蛋白定量测定仪(Eppendorf Biophotomete)检测基因组DNA的纯度和浓度。

(12)将质量合格的DNA加ddH₂O稀释至50ng/μL存储于-20℃冰箱保存。

1.2.3SSR-PCR反应体系及程序：

本发明采用引物20μL SSR-PCR反应体系：10μL 2×Taq mix(成都擎科梓熙生物技术有限公司)；7μLddH₂O；1μL正向引物；1μL反向引物；1μLDNA模板。

PCR反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性50s，53℃-60℃退火1min，72℃延伸1.5min，设置30-34个循环程序；72℃再延伸8min。不同引物依据其扩增效率调整循环程序数及退火温度。

1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测

(1)玻璃板前处理：首先用无水乙醇擦拭有凹槽和无凹槽玻璃板各一块，晾干后用夹子将两块玻璃板固定在一起。

(2)凝胶的配置：将50mL6％聚丙烯酰胺母液、200μL10％过硫酸铵和20μL TEMED(N,N,N,N四甲基乙二胺)均匀混合。然后，沿玻璃板的凹槽处灌入凝胶，排除玻璃板之间的气泡，插入梳子，静置30min晾干。

(3)预电泳：将凝胶玻璃板安装在垂直电泳槽中，拔出鲨鱼齿，用滴管吹洗点样孔，以除去杂质，然后加入0.5×TBE，恒定功率20W预电泳20min。

(4)电泳：用移液枪吸取1μL的PCR产物点样，在恒定功率20W下电泳1.5h。

(5)染色：电泳结束后，用双蒸水冲洗聚丙烯酰胺凝胶表面，随后将其浸于0.1％的AgNO₃溶液中银染12分钟。

(6)显色：染色结束后，用双蒸水冲洗凝胶表面，去除染液。冲洗完毕后将聚丙烯酰胺凝胶浸于显色液(1.5％NaOH，0.25％甲醛)中显色6min，待出现条带时取出，用双蒸水清洗后放于灯箱上用相机拍照。

1.2.5、统计分析

利用Quantity One软件通过与DL500 DNA maker(TAKARA，大连)比对计算出目的条带的大小(bp)，电泳条带按条带大小进行统计。

2、试验结果

提取中国樱桃及其他物种114份材料的基因组DNA，分别使用64对引物进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示78A9-1引物(表3所示)能够特异性鉴定所检测样品是否为中国樱桃种质。筛选出引物78A9-1的最佳PCR反应程序如下：94℃预变性进行4min；94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，33个循环；72℃再延伸8min。

如图1所示，SSR引物78A9-1总共在95份试验材料中成功扩增，在1-92、93-94及100号材料扩增的泳道中全部出现条带，大小约为260bp，其中1-92是中国樱桃栽培种质，93-94是中国樱桃野生种质，99是‘兰丁2号’，为中国樱桃(四倍体)与甜樱桃(二倍体)杂交产生的三倍体杂交后代，由此可见SSR引物78A9-1能在所有中国樱桃种质的试验材料中扩增出260bp的特异性条带。除此以外，SSR引物78A9-1未能在任何非中国樱桃种质的试验材料中扩增成功，其中95-97号为桃属和杏属试验材料，98及100-114号为樱属其他物种的试验材料。

表3SSR标记引物78A9-1的序列信息

在本发明中，SSR标记78A9-1仅能在中国樱桃种质中特异性扩增，鉴别中国樱桃种质的准确率达到100％。

这表明SSR引物78A9-1扩增出的目的片段是中国樱桃物种特有的核苷酸序列，在其他近缘物种中均未检测到相同序列，也意味着可用单一SSR标记78A9-1来鉴定中国樱桃种质，若能扩增出260bp的片段，标志着是中国樱桃种质，反之则不是中国樱桃种质。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种鉴定中国樱桃种质的SSR标记、应用及鉴定方法

<140> 2020109680364

<141> 2020-09-15

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(1)

<400> 1

cgaacctaag actactgatc ta 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向引物(2)

<400> 2

cttgctgctt gtggtagag 19

Claims (4)

1.一种鉴定中国樱桃种质的SSR引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的SSR引物在鉴定中国樱桃种质中的应用，其特征在于，中国樱桃采用所述引物可扩增出260bp的电泳条带。

3.中国樱桃种质的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基因组DNA提取：提取待测样本的基因组DNA；

（2）PCR扩增：用权利要求1的引物对所述步骤（1）得到的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；

（3）凝胶电泳及银染检测：将所述PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测；

（4）数据统计分析：比对计算出目的条带的大小，对电泳条带按条带大小进行统计，能产生260bp电泳条带的样本判断为中国樱桃，不能产生260bp电泳条带的样本判断为非中国樱桃。

4.根据权利要求3所述的中国樱桃种质的鉴定方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

（1）基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取所有样本的基因组DNA，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，采用核酸蛋白定量测定仪检测基因组DNA的纯度和浓度；

（2）PCR扩增：用权利要求1的引物对步骤（1）得到的基因组DNA进行PCR扩增；

PCR反应体系：10μL 2×Taq mix；7μL ddH₂O；1μL正向引物；1μL反向引物；1μL DNA模板；

PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，33个循环；72℃再延伸8min；

（3）凝胶电泳及银染检测：PCR扩增物在聚丙烯酰胺凝胶上恒定功率20W下电泳1.5h，用0.1%的AgNO₃溶液中银染12min，再将聚丙烯酰胺凝胶浸于显色液中显色6min，最后在凝胶成像系统上拍照记录；

（4）数据统计分析：利用Quantity One软件通过与DL500 DNA maker比对计算出目的条带的大小，对电泳条带按条带大小进行统计，所述条带大小的单位为bp。

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