CN107190097B - 利用转录组测序的ssr分子标记鉴定火龙果种质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，该方法设计序列表所示的EST‑SSR标记引物并包括以下步骤：S1，取火龙果幼嫩茎尖，用于提取基因组DNA；S2，基于火龙果转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；S3，PCR采用10μl反应体系：包含10‑50ng模板DNA 1‑2μl，正、反向引物各0.2‑0.5μl，5μl Mix及适量ddH2O；S4，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃反应30s，54‑63℃反应30s，72℃反应30s，进行35个循环；72℃延伸8min；4℃最终保存；S5，PCR扩增产物先进行引物初步筛选，然后再进行多态性筛选，根据谱带的有无和大小来判定结果。本发明需要解决的关键技术是EST‑SSR标记引物的获得和筛选，以及PCR扩增体系的优化。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及基于火龙果转录组测序序列而开发的SSR引物、PCR扩增及其应用。基于转录组序列开发的多对SSR标记引物，专用于从DNA水平对火龙果种质的快速鉴定及亲缘关系分析。
背景技术
火龙果(Hylocereusspp.)属于仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereus)和蛇鞭柱属(Seleniereus)，是近年来被广泛关注的一种新兴热带、亚热带水果。火龙果适宜种植范围广、抗病虫害能力强、产量高、效益好和市场风险小，因此火龙果种植被视为一个有良好市场前景和经济效益的农业开发项目。火龙果种质的准确、高效鉴定和亲缘关系分析，对种质的知识产权保护、开发和利用具有重要现实意义。
目前，火龙果遗传背景并不清晰，这给火龙果种质鉴定、杂交育种、新种质挖掘等带来了很大困难，随着分子生物学技术的发展，RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子标记技术已被用于火龙果种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，但这些多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且这些分子标记覆盖火龙果基因组比例较小，标记密度较低。
SSR分子标记广泛应用于评价种质资源、分析遗传多态性和构建遗传图谱研究，具有共显性、多态性丰富、重复性和稳定性好等优点，EST-SSR分子标记基于基因编码区开发，可直接反映基因的表达信息，并具有较高的保守性和通用性。
发明内容
为了克服火龙果现有分子标记多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且覆盖火龙果基因组比例较小，标记密度较低等缺点，本发明旨在提供多态性检出率高、分辨率更好、共显性、稳定可靠、简单高效的分子标记鉴定方法。该方法可直接用于火龙果种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，为种质知识产权保护和遗传改良提供更好的分析工具。本发明需要解决的关键技术是EST-SSR标记引物的获得，以及PCR扩增体系的优化。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明的EST-SSR标记引物为如下表的1对或任意几对：
本发明的方法包括如下步骤：
1.取新采集的或-80℃下保存的幼嫩茎尖，利用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒提取基因组DNA；
2.根据火龙果转录组测序的序列，设计合成125对EST-SSR引物，并进行PCR扩增体系优化：
1)PCR反应体系为(10μl体系)：10-50ng的模板DNA 2μl，正、反向引物(10μM)0.25μl，5μl Mix及适量ddH2O(2.5μl)。其中，Mix含0.1U/μl Taq polymerase，500μM dNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mM KCl，3mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂，这里的其它稳定剂和增强剂采用现有的常规技术的稳定剂和增强剂即可。
PCR反应程序为：
2)随机选用几个代表性种质的DNA，先进行PCR反应，再通过2％琼脂糖凝胶电泳，对设计引物进行EST-SSR位点数的初筛，筛选出谱带清晰的引物。
3)将初筛获得的引物，对8个代表性种质的DNA进行PCR扩增，然后进行10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，复选出谱带清晰、多态性丰富的引物。
4)用初筛、复筛获得的多态性较好引物，对所有供试种质进行SSR分子标记分析，根据扩增产物的有无和大小来判定结果。
本发明采用的火龙果SSR标记引物，来自于本发明基于火龙果转录组测序结果开发的EST-SSR引物。转录组测序样本采自贵州省果树科学研究所资源圃紫红龙幼嫩茎尖，液氮速冻后送百迈克公司(北京)进行转录组测序，总获108127条unigenes。然后使用MISA程序进行SSR位点搜索，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重复次数为10、6、5、5、5、和5。接着用primer 3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点侧翼序列长度大于50bp。引物设计主要参数为：(1)退火温度(Tm)在55-63℃之间。(2)PCR产物大小在100-300bp；引物长度在18-24bp之间；尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配、引物二聚体的出现。对批量设计的SSR引物对在Unigen库中进行SSR引物的Blast验证。最后随机选取125对EST-SSR引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成。
本发明方法适用于火龙果种质快速可靠的分子检测和鉴定，具有重要的实用价值，与其它方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1、操作简便快速：本发明利用基于火龙果转录组测序的序列设计SSR引物，对样本进行PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳后即可判断结果，无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切。
2、PCR体系已优化且聚丙烯酰胺变性凝胶的制作技术成熟：在本发明中，优化的PCR体系更适合于火龙果EST-SSR标记的扩增。而聚丙烯酰胺变性凝胶的制作技术成熟，已形成一套完整的体系，效果较好。
3、检测结果灵敏度高：对待检样品仅需提供模板10-50ng，即可准确鉴定其所属种质；
4、结果高度准确、可靠、重复性好：本发明已经对火龙果不同种质DNA样本进行了检测，经过多次重复检测，检测准确率100％，为检测结果提供了高度的可靠性；
5、本发明中开发的EST-SSR引物获得的分子标记，在火龙果基因组中分布均匀、多态性丰富、共显性、清晰稳定、分辨率高，可有效用于火龙果的种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等工作，在知识产权保护和遗传育种上具有重要实际意义；
6、取材方便：火龙果茎的采集不受季节、地点的限制。
附图说明
图1是2对EST-SSR引物扩增后2％琼脂糖凝胶电泳初筛检测图，图中：(1-4分别表示种质R3、R4、R5、R7；5-8分别表示种质B6、F18、红4、B5；M为DNAMarker)；
图2是2对EST-SSR引物扩增后10％变性PAGE凝胶电泳复筛检测图，图中：(1-8分别表示种质R3、R4、R5、R7、B6、F18、红4、B5；M为DNAMarker)；
图3是引物C30929对红肉、白肉、黄肉共70个火龙果种质检测图，图中：(M为D2000Marker，图中泳道编号与表2供试种质编号对应)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
以本发明中的EST-SSR引物，鉴定70份火龙果种质，包括50份红皮红肉型、10份红皮白肉型和10份红皮粉红肉型，以引物对C30929为例，可区分供试材料。
1.EST-SSR引物的设计及合成
首先对测序得到的序列进行前处理，得到高质量无冗余的EST序列，利用MISA软件在转录数据中搜索SSR位点，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5，接着用Primer3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点序列长度在18-24bp之间。其中，引物设计的主要参数为：退火温度(Tm)在54-63℃之间，60℃最佳；PCR产物大小为100-300bp；GC含量在40％-60％之间，50％最佳。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。设计合成的C30929正、反向引物相关信息如表1所示。
表1引物C30929相关信息
2.火龙果种质及其基因组DNA提取
以70份火龙果种质为供试材料，见表2所示。
采用天根DNAsecure Plant Kit(DP320)试剂盒提取基因组DNA，利用2％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测其质量和浓度，并用TE缓冲液将其稀释至约20mg.L-1。
表2 70份火龙果供试种质的名称及主要性状
3.PCR扩增
优化反应体系为(10μl)：40ng的模板DNA，各0.25μl正、反向引物(10μM)，5μl Mix及适量ddH2O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase，500μMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。
优化的PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸8min，4℃保存。
4.EST-SSR引物初筛
将PCR反应产物在含有GoldViewⅠ的2％琼脂糖凝胶中，以5V/cm电压电泳适当时间，然后于凝胶分析仪中观察并拍照保存，筛选出条带清晰的引物，如图1所示。
5.EST-SSR引物多态性位点复筛
使用初筛引物对样本进行PCR扩增，使用10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测扩增产物，观察其多态性，如图2所示。
1)装板：将玻璃板洗净晾干后装入U型硅橡胶框的凹形槽中，有磨砂的玻璃面向内，将玻璃板稍微倾斜置于试验台上。
2)封胶：用1％的琼脂密封胶室下端玻璃板与橡胶框之间的缝隙。
3)灌胶：50ml(可灌两块板)SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配方如表3，将配好的胶倒入三角瓶中，充分混匀，待气泡消失后，沿玻璃板凹口快速均匀地注入胶室中，并插入合适的梳子，将玻璃板平置于试验台上，待胶凝固。
表3 10％聚丙烯酰胺变性凝胶组成成分及添加成分的顺序
4)预电泳：拔出梳子，用注射器加ddH2O多次冲洗加样孔，将凝胶板固定在垂直电泳槽内，向槽内加入1×TBE缓冲液。接上电极，打开电源，调试工作环境为电压90V，预电泳10min左右。
5)变性：预电泳期间10ul PCR扩增产物中加5μl loading buffer，混匀，PCR仪97℃变性10min，4℃保存。
6)点样：用注射器加1×TBE电解液再次冲洗加样孔，边冲洗边点样，PCR产物上样量为1.5μl左右，然后打开电源，调试工作环境为电压150V，电泳3.5小时。
7)电泳结束后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板；小心取下凝胶，放置于有ddH2O的托盘中冲洗一或两次，银染检测。
8)银染检测
(1)固定(10％冰乙酸)：50ml冰乙酸加ddH2O定容至500ml，混匀，倒入装有凝胶的托盘中于摇床上均匀摇动20min，摇床转速设置为45r/min，之后ddH2O漂洗凝胶两次(速度快，约5s)。
(2)染色(0.1％AgNO3)：称取0.5gAgNO3用ddH2O定容至500ml，染色时现加入3ml37％的甲醛，混匀，倒入装有凝胶的托盘中于摇床上避光均匀摇动约15min，摇床转速设置为45r/min，然后ddH2O漂洗2次，时间不超过5s。
(3)显色：称取10g NaOH，ddH2O定容至500ml，染色时加入2ml 37％甲醛，混匀，倒入装有凝胶的托盘中于摇床上均匀摇动显影，摇床转速设置为45r/min，等到谱带清晰时停止。
(4)ddH2O漂洗凝胶1-2次，尽量不超过5s，立即用数码相机拍照记录。
6.供试种质的EST-SSR分析
用复筛出的多态性较好的EST-SSR引物(如C30929)，对供试材料进行PCR扩增及变性PAGE凝胶电泳、银染，结果如图3。凝胶制备和染色方法见步骤5。
7.数据处理及分析
每种EST-SSR引物重复扩增3次，绝大部分带型可重复，极少数不能重复的谱带统计时忽略不计。采用人工读带的方式，对扩增结果进行统计分析，将谱带按“引物号-片段长度”进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。
8.指纹图谱构建
不同引物产生的谱带数及多态性存在差异，根据用最少的引物组合鉴别尽量多种质的原则，建立火龙果种质指纹图谱，且所有供试材料的特异性各不相同，达到种质鉴定的目的。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州大学
<120> 利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法
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Claims (5)
1.一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，其特征在于：EST-SSR标记引物为如下的1对或任意几对：
2.根据权利要求1所述的利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1，取火龙果幼嫩茎尖，用于提取基因组DNA；
S2，基于火龙果转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；
S3，PCR采用10 µl反应体系：包含10-50 ng模板DNA 1-2 µl，正、反向引物各0.2-0.5 µl，5 µl Mix及适量ddH2O；
S4，PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃反应30 s，54-63℃反应30 s，72℃反应30s，进行35个循环；72℃延伸8 min；4℃最终保存；
S5，PCR扩增产物先进行引物初步筛选，然后再进行多态性筛选，根据谱带的有无和大小来判定结果。
3.根据权利要求2所述的利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，其特征在于：S1中所述幼嫩茎尖是指新采集或-80℃下保存的火龙果茎尖。
4.根据权利要求2所述的利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，其特征在于：S3中Mix包括0.1 U/μl Taq polymerase、500 μM dNTP、20 mM Tris-HCl、100 mMKCl、3 mM MgCl2。
5.根据权利要求2所述的利用转录组测序的SSR分子标记鉴定火龙果种质的方法，其特征在于：所述初步筛选是用2%琼脂糖电泳，依据电泳结果进行初步筛选；所述多态性筛选是用10%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳进行。
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