CN111876515A - 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法 - Google Patents

火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111876515A
CN111876515A CN202010750345.4A CN202010750345A CN111876515A CN 111876515 A CN111876515 A CN 111876515A CN 202010750345 A CN202010750345 A CN 202010750345A CN 111876515 A CN111876515 A CN 111876515A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ssr
dragon fruit
est
sample
variety
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010750345.4A
Other languages
English (en)
Inventor
武志江
邓海燕
黄黎芳
梁桂东
陆贵锋
黄凤珠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences filed Critical Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010750345.4A priority Critical patent/CN111876515A/zh
Publication of CN111876515A publication Critical patent/CN111876515A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于火龙果种质资源鉴定技术领域，公开了一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，包括：分别提取火龙果RNA、建立cDNA文库并测序定位SSR标记；EST‑SSR引物设计与筛选；优化PCR反应体系，并结合经设计与筛选得到的EST‑SSR引物进行EST‑SSR多态性分析；依次进行SSR标记测序验证和SSR‑PCR扩增；依次进行毛细血管电泳检测、火龙果指纹图谱的构建和火龙果种质鉴定技术体系的制定。本发明根据每对引物扩增的等位基因片段大小以及0/1代码转化，构建了每份种质的指纹图谱；集成相关试验技术研究结果，建立了火龙果EST‑SSR分子标记种质鉴定技术体系。

Description

火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法
技术领域
本发明属于火龙果种质资源鉴定技术领域，尤其涉及一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法。
背景技术
目前，据2019年最新数据统计，全国火龙果种植面积已发展到5.33万hm2余，主要集中在南方地区，包括广西、广东、海南、贵州、云南、福建、台湾等热带南亚热带地区。然而，由于品种鉴定体系标准和市场监管的缺失，火龙果种苗流通中存在品种混乱、随意命名、同物异名或异物同名等现象，严重侵犯了育种者和生产者的合法权益，对火龙果产业的健康发展不利，因此，能否有效鉴定和区分不同品种是维护品种权亟待解决的基本问题。量天尺属(火龙果)已于2019年4月1日列入第十一批植物新品种保护名录，而火龙果的品种鉴定及品种权利保护尚未建立相对统一的方法体系。由此可见，构建火龙果品种鉴定技术体系标准和分子身份证数据库势在必行
通过全国标准信息公共服务平台检索，目前现行的品种鉴定技术标准主要包括DUS测试和分子标记法。而DUS测试在品种鉴定的使用上存在成本高、周期长且受环境或人为因素影响等诸多问题。至截稿前，火龙果DUS测试指南的行业标准仍未颁布。DNA分子标记中，早期RAPD、ISSR、RFLP、AFLP等标记因其具有分型不稳定、基因型过多无法分辨、非共显性等缺陷，没有纳入品种鉴定标准。国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMP测试指南草案中，将SSR和SNP分子标记纳入适合构建品种分子标记数据库的两项技术，其中SSR标记鉴定技术较成熟，成为品种建库的首选标记。荧光标记SSR毛细管电泳检测技术因其测序精准高效、重复性好、结果可靠等优点，尤其适用于大批量品种的检测分析，被广泛应用于各类作物的品种鉴定、分子身份证构建及品种权保护等研究。目前有关火龙果SSR标记开发的文献报道较少，主要用于遗传多样性和亲缘关系分析上，且不同的研究者所保存的种质资源在数量和种类上存在较大差异。另外，利用SSR分子标记构建火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的研究迄今未见相关报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)DNA分子标记中，早期RAPD、ISSR、RFLP、AFLP等标记因其具有分型不稳定、基因型过多无法分辨、非共显性等缺陷。
(2)目前有关火龙果SSR标记开发的文献报道较少，主要用于遗传多样性和亲缘关系分析上，且不同的研究者所保存的种质资源在数量和种类上存在较大差异。
(3)用SSR分子标记构建火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的研究迄今未见相关报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：提高基因分型的灵敏度和精准度，是解决现有技术问题及缺陷的难度。
解决以上问题及缺陷的意义为：利用荧光标记结合毛细管电泳技术实现分子标记的共显性、高分辨度和重复性，以区分基因类型及辨别精准性和重复性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法。
本发明是这样实现的，一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，所述火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，分别提取火龙果RNA、建立cDNA文库并测序定位SSR标记。
步骤二，EST-SSR引物设计：选取SSR位点侧翼序列长度大于50bp的Unigenes序列，使用primer 3.0设计EST-SSR引物。
步骤三，EST-SSR引物筛选：根据引物筛选标准选取EST-SSR引物，取3个形态显著不同的种质通过2％琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛，选择8个的火龙果品种通过2％琼脂糖凝胶电泳进行复筛。
步骤四，优化PCR反应体系，并结合经设计与筛选得到的EST-SSR引物进行EST-SSR多态性分析。
步骤五，依次进行SSR标记测序验证和SSR-PCR扩增。
步骤六，依次进行毛细血管电泳检测、火龙果指纹图谱的构建和火龙果种质鉴定技术体系制定。
进一步，步骤六中，所述火龙果种质鉴定技术体系的建立方法，包括：
(1)取样：采集为扦插苗、实生苗等嫩茎作为检测样品。
(2)样品保存：选取适量的样品，装入EP管，液氮速冻，置于-80℃的冰箱中保存待测。
(3)提取DNA，构建PCR反应体系并设置PCR反应程序。
(4)分别进行毛细管电泳检测、数据分析及结果判定。
进一步，步骤(3)中，所述提取DNA的方法为：
1)每个火龙果嫩茎样品取0.1～0.2g，放置2mL EP管中，剪碎，加入1mL含1％巯基乙醇的CTAB裂解液。组织研磨仪研磨2min。
2)研磨后的样品放入65℃水浴裂解60min，其间振荡混匀2～3次。
3)12000rpm离心5min，吸取800μL上清转入新的2mL离心管中，每管样品加入200μL20％PVP40，混合均匀。分别加入300μLTris饱和酚，300μL氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min。
4)12000rpm离心10min，吸取上清。
5)重复步骤3.1、步骤3.4两次。
6)上清加入按照1:1加入氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min。
7)12000rpm离心10min，吸取上清。加入1/103M NaAC和0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA。
8)12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干。200～500μL含有RNase的TE溶解DNA。
进一步，步骤(4)中，所述毛细血管电泳检测的方法，包括：
(I)将高度去离子甲酰胺HIDI溶液与LIZ500分子量内标以100：1的体积比混匀；
(II)取9μL加入96孔板中，再加入1μL稀释10倍的PCR扩增产物；
(III)使用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，得到毛细管原始数据，即FASTA文件。
进一步，步骤(4)中，所述对数据进行分析的方法为：
a)利用GeneMarker对原始数据进行分析，根据各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置比较分析，确定待测样品的片段大小。
b)根据每对引物扩增出的等位基因片段大小，按“有”对应电泳峰记为“1”，“无”记为“0”的方法，最终由一系列0/1数字表示，形成一个0/1代码的SSR指纹图谱。
进一步，步骤(4)中，所述对结果进行判定的方法为：
将待测样品与对照样品的SSR指纹比对结果分析，若待测品种与对照品种有等位基因不同的位点，则根据位点及其等位基因的不同，判定两者为不同品种；若待测品种与对照品种全部位点等位基因均相同，则判定两者为SSR指纹完全相同的品种。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述构建方法构建的火龙果种质资源SSR指纹数据库。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述构建方法构建的火龙果种质资源SSR指纹鉴定体系。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，基于转录组测序技术开发了20对核心EST-SSR引物，进而对105个火龙果种质进行了毛细管电泳检测，共检测到111个等位基因变异，每对引物平均扩增5.5个等位变异，扩增片段大小在131～286bp。根据每对引物扩增的等位基因片段大小以及0/1代码转化，构建了每份种质的指纹图谱；集成相关试验技术研究结果，建立了火龙果EST-SSR分子标记种质鉴定技术体系。
本发明对14个样品组织进行转录组测序，共获得8.81Gb Clean Data，Q30碱基百分比在95.32％及以上。组装后共获得58,839条Unigene。其中长度在1kb以上的Unigene有13,403条。基于Unigene库的基因结构分析，共获得4,985个SSR标记。SSR类型丰富，鉴定出6种类型的SSR，包括单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复SSR。EST-SSR以单碱基和双碱基重复单元为主要类型，其出现频率最高，分别占总SSR的43.13％和33.00％；三碱基重复出现频率为16.89％；而四碱基、五碱基和六碱基重复出现频率较低，三者总和仅为1.06％。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法原理图。
图3是本发明实施例提供的Unigene长度分布图。
图4是本发明实施例提供的SSR密度分布图。
图5是本发明实施例提供的初筛电泳图片示意图。
图6是本发明实施例提供的复筛电泳图片示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法包括以下步骤：
S101，分别进行火龙果RNA的提取、cDNA文库的建立及测序定位SSR标记。
S102，EST-SSR引物设计：选取SSR位点侧翼序列长度大于50bp的Unigenes序列，使用primer 3.0设计EST-SSR引物。
S103，EST-SSR引物筛选：根据引物筛选标准选取EST-SSR引物，取3个形态显著不同的种质通过2％琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛，选择8个的火龙果品种通过2％琼脂糖凝胶电泳进行复筛。
S104，优化PCR反应体系，并结合经设计与筛选得到的EST-SSR引物进行EST-SSR多态性分析。
S105，依次进行SSR标记测序验证和SSR-PCR扩增。
S106，依次进行毛细血管电泳检测、火龙果指纹图谱的构建和火龙果种质鉴定技术体系制定。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
一、研究工作总结摘要
本项目旨在构建火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系。本项目基于转录组测序技术开发了20对核心EST-SSR引物，进而对105个火龙果种质进行了毛细管电泳检测，共检测到111个等位基因变异，每对引物平均扩增5.5个等位变异，扩增片段大小在131～286bp。根据每对引物扩增的等位基因片段大小以及0/1代码转化，构建了每份种质的指纹图谱；集成相关试验技术研究结果，建立了火龙果EST-SSR分子标记种质鉴定技术体系。
二、项目工作总结
2.1任务来源
本项目属基础应用研究领域的自选课题，其选题来源于火龙果产业发展的实际问题，包括品种混乱，来源记载不详，同名异种或同种异名等问题，旨在构建火龙果种质资源的SSR指纹数据库及鉴定体系，为火龙果的品种鉴定与溯源提供准确可靠的证据，以规范火龙果种子种苗的市场流通，同时为我国火龙果新品种的知识产权鉴定提供一定的理论基础和科学依据。
2.2研究成果
2.2.1火龙果转录组测序及EST-SSR的识别分析
对14个样品组织进行转录组测序，共获得8.81Gb Clean Data，Q30碱基百分比在95.32％及以上。组装后共获得58,839条Unigene。其中长度在1kb以上的Unigene有13,403条。基于Unigene库的基因结构分析，共获得4,985个SSR标记。SSR类型丰富，鉴定出6种类型的SSR，包括单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复SSR。EST-SSR以单碱基和双碱基重复单元为主要类型，其出现频率最高，分别占总SSR的43.13％和33.00％；三碱基重复出现频率为16.89％；而四碱基、五碱基和六碱基重复出现频率较低，三者总和仅为1.06％。
Unigene长度分布图如图3所示，SSR密度分布图如图4所示。
2.2.2 EST-SSR引物设计与筛选
选取SSR位点侧翼序列长度大于50bp的Unigenes序列，使用primer 3.0共设计了3442对EST-SSR引物。根据引物筛选标准选取200对EST-SSR引物。选取3个形态显著不同的种质通过2％琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛(图5)，获得106对SSR引物。选择8个的火龙果品种通过2％琼脂糖凝胶电泳进行复筛(图6)，获得20对SSR核心引物(表1)。SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20分别对应表1中的引物1-引物20。
表1 20对火龙果SSR核心引物
Figure BDA0002609805460000081
2.2.3火龙果SSR指纹数据库的构建
利用20对核心SSR引物对105份火龙果品种构建指纹图谱(表2)。20对引物共扩增出111个等位基因变异，每对引物平均扩增5.5个等位变异，扩增片段大小在131～286bp，其中多态位点不小于5个的引物有11个，c36039等位变异数最多，为10个，这套引物有较好的鉴别能力。
表2 SSR引物的等位基因多态性
Figure BDA0002609805460000091
2.2.4火龙果种质鉴定技术体系的建立
基于本发明结果，建立火龙果种质鉴定技术体系，以便于普及推广和应用。
1、供试材料
1.1取样
采集为扦插苗、实生苗等嫩茎作为检测样品。
1.2样品保存
选取适量的样品，装入EP管，液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存待测。
2、DNA的提取
2.1每个火龙果嫩茎样品取0.1～0.2g，放置2mL EP管中，剪碎，加入1mL含1％巯基乙醇的CTAB裂解液。组织研磨仪研磨2min。
2.2研磨后的样品放入65℃水浴裂解60min，其间振荡混匀2～3次。
2.3 12000rpm离心5min，吸取800μL上清转入新的2mL离心管中，每管样品加入200μL 20％PVP40，混合均匀。分别加入300μLTris饱和酚，300μL氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min。
2.4 12000rpm离心10min，吸取上清。
2.5重复步骤3、步骤4两次。
2.6上清加入按照1∶1加入氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min。
2.7 12000rpm离心10min，吸取上清。加入1/103M NaAC和0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA。
2.8 12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干。200～500μL含有RNase的TE溶解DNA。
3、PCR反应
3.1 PCR反应体系(见表3)
表3 PCR反应体系
componcnt Volumc/rcaction Final conccntr atoon
2×Drcm Taq mix 10μl 1×
ISSR Primcr(10uM) 1μl 0.5μM
RNasc-frcc watcr 8μl
Tcmplatc gDNA 1μl 20ng
Total rcaction volumc 20μl
3.2 PCR反应程序(见表4)
表4 PCR反应程序
Figure BDA0002609805460000111
4、毛细管电泳检测
将高度去离子甲酰胺(HIDI)溶液与LIZ500分子量内标以100：1的体积比混匀后，取9μL加入96孔板中，再加入1μL稀释10倍的PCR扩增产物，然后使用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，得到毛细管原始数据，即FASTA文件。
5、数据分析
利用GeneMarker对原始数据进行分析，根据各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置比较分析，确定待测样品的片段大小。根据每对引物扩增出的等位基因片段大小，按“有”对应电泳峰记为“1”，“无”记为“0”的方法，最终由一系列0/1数字表示，形成一个0/1代码的SSR指纹图谱。
6、结果判定
将待测样品与对照样品的SSR指纹比对结果分析，若待测品种与对照品种有等位基因不同的位点，则根据位点及其等位基因的不同，判定两者为不同品种；若待测品种与对照品种全部位点等位基因均相同，则判定两者为SSR指纹完全相同的品种。
105个火龙果品种EST-SSR指纹数据库如表5所示。
表5 105个火龙果品种EST-SSR指纹数据库
Figure BDA0002609805460000121
Figure BDA0002609805460000131
三、技术总结
3.1技术路线(如图2所示)
3.2研究方案
(1)转录组测序及EST-SSR位点识别
1)选择火龙果不同生育期的组织样品分别提取RNA，制成混合样品；
2)建立cDNA文库及测序；
3)使用SSR识别工具软件对EST序列进行SSR位点搜索定位。
(2)EST-SSR标记引物的设计和评价
1)用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计；
2)采用优化的SSR-PCR反应体系，以火龙果DNA样品为模板进行SSR-PCR扩增，分析EST-SSR标记的多态性，从中筛选重复性高、条带清晰、多态性好的引物；
3)选择条带单一且扩增效率高的扩增产物进行测序验证。
(3)火龙果SSR指纹数据库及鉴定体系的构建
1)利用筛选的多样性指数高、特异性强的引物对所有供试种质DNA进行SSR-PCR扩增；
2)应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电或毛细管电泳对PCR扩增产物进行检测，建立火龙果种质资源的SSR指纹数据库；
3)制定火龙果种质鉴定技术规程。
3.3项目取得的成果
1)建立火龙果种质资源的SSR指纹数据库(如表5所示)；
2)制定火龙果种质鉴定技术体系(如2.2.4)；
3)开发了20对核心SSR引物(如表1所示)；
4)开发了一种从火龙果茎尖中快速提取高质量基因组DNA的方法(如2.2.4)；
5)优化了火龙果PCR的扩增体系和程序(如2.2.4)。
3.4技术的创新点。
1)创新开发了一种火龙果DNA的提取方法。
2)首次使用毛细管电泳技术进行基因分型。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggtgtctc agcttcctca tccatgggac ttagattggc 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catggctttt tcccattttg tggcctattc aagggtatgc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtcatgca aacatggagg aggagagcag gtggtccttt 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggctttcat ggggttttag cattgcaaag aggggtcatt 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttggatg gctgtccttc gccaattagt gtttggcgat 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atacccgttg cacttgcttc taccgagccc aacaataagc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtctcctcc tttctccgac agcttgctct gaagacgctc 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgagatga tgaggttccg gagtcaaact ccaactcgcc 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaccacgcta gcacactcct tggcttcctc cttttcttca 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgatcaggt ggagcaggag acctcaacct cagaggggat 40
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaggagtggc agaagacgaa tcaaatttcc ttcctcactc ac 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcatccatgc acgacattct aatgagtgtt ccctgccatc 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agggcagtag gtgcagaaga tgtcacccac aatcaagcat 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgattcactg ttaccggtcg ttcaagaaat gggcaaatcc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acccatgatt tttgacgcat ttgtctgctg ctgtttttgg 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccttcttct caccatcagc gtagccggag tgcgtaaaaa 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttcagaaatg gaaaggaccg accagcagct aaggtgcatt 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccaaggacg tctggtctta tcaaaatgag cccaaaaacc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
catgctgcgt atctatgcgt aatcaagaac gaaaatggcg 40
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cacgatccag tctgccctat ttctaagtgg atctgtctgt cactg 45

Claims (8)

1.一种火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，所述火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，分别提取火龙果RNA、建立cDNA文库并测序定位SSR标记；
步骤二，EST-SSR引物设计：选取SSR位点侧翼序列长度大于50bp的Unigenes序列，使用primer 3.0设计EST-SSR引物；
步骤三，EST-SSR引物筛选：根据引物筛选标准选取EST-SSR引物，取3个形态显著不同的种质通过2％琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛；选择8个的火龙果品种通过2％琼脂糖凝胶电泳进行复筛；
步骤四，优化PCR反应体系，并结合经设计与筛选得到的EST-SSR引物进行EST-SSR多态性分析；
步骤五，依次进行SSR标记测序验证和SSR-PCR扩增；
步骤六，依次进行毛细血管电泳检测、火龙果指纹图谱的构建和火龙果种质鉴定技术体系制定。
2.如权利要求1所述的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，步骤六中，所述火龙果种质鉴定技术体系的建立方法，包括：
(1)取样：采集为扦插苗、实生苗等嫩茎作为检测样品；
(2)样品保存：选取适量的样品，装入EP管，液氮速冻，置于-80℃的冰箱中保存待测；
(3)提取DNA，构建PCR反应体系并设置PCR反应程序；
(4)分别进行毛细管电泳检测、数据分析及结果判定。
3.如权利要求2所述的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述提取DNA的方法为：
1)每个火龙果嫩茎样品取0.1～0.2g，放置2mL EP管中，剪碎，加入1mL含1％巯基乙醇的CTAB裂解液；组织研磨仪研磨2min；
2)研磨后的样品放入65℃水浴裂解60min，其间振荡混匀2～3次；
3)12000rpm离心5min，吸取800μL上清转入新的2mL离心管中，每管样品加入200μL20％PVP40，混合均匀；分别加入300μLTris饱和酚，300μL氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min；
4)12000rpm离心10min，吸取上清；
5)重复步骤3.1、步骤3.4两次；
6)上清加入按照1:1加入氯仿剧烈震荡混匀，室温放置10min；
7)12000rpm离心10min，吸取上清；加入1/103M NaAC和0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA；
8)12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干；200～500μL含有RNase的TE溶解DNA。
4.如权利要求2所述的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述毛细血管电泳检测的方法，包括：
(I)将高度去离子甲酰胺HIDI溶液与LIZ500分子量内标以100：1的体积比混匀；
(II)取9μL加入96孔板中，再加入1μL稀释10倍的PCR扩增产物；
(III)使用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，得到毛细管原始数据，即FASTA文件。
5.如权利要求2所述的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述对数据进行分析的方法为：
a)利用GeneMarker对原始数据进行分析，根据各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置比较分析，确定待测样品的片段大小；
b)根据每对引物扩增出的等位基因片段大小，按“有”对应电泳峰记为“1”，“无”记为“0”的方法，最终由一系列0/1数字表示，形成一个0/1代码的SSR指纹图谱。
6.如权利要求2所述的火龙果种质资源SSR指纹数据库及鉴定体系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述对结果进行判定的方法为：
将待测样品与对照样品的SSR指纹比对结果分析；若待测品种与对照品种有等位基因不同的位点，则根据位点及其等位基因的不同，判定两者为不同品种；若待测品种与对照品种全部位点等位基因均相同，则判定两者为SSR指纹完全相同的品种。
7.一种利用权利要求1-6任意一项构建方法构建的火龙果种质资源SSR指纹数据库。
8.一种利用权利要求1-6任意一项构建方法构建的火龙果种质资源SSR指纹鉴定体系。
CN202010750345.4A 2020-07-30 2020-07-30 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法 Pending CN111876515A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010750345.4A CN111876515A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010750345.4A CN111876515A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111876515A true CN111876515A (zh) 2020-11-03

Family

ID=73205570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010750345.4A Pending CN111876515A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111876515A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107190097A (zh) * 2017-07-26 2017-09-22 贵州大学 利用转录组测序的ssr分子标记鉴定火龙果种质的方法
CN112029763A (zh) * 2020-08-28 2020-12-04 广西壮族自治区农业科学院 一种从火龙果茎尖中快速提取高质量基因组dna的方法
CN113584217A (zh) * 2021-09-06 2021-11-02 上海植物园 一种基于est-ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107190097A (zh) * 2017-07-26 2017-09-22 贵州大学 利用转录组测序的ssr分子标记鉴定火龙果种质的方法
CN112029763A (zh) * 2020-08-28 2020-12-04 广西壮族自治区农业科学院 一种从火龙果茎尖中快速提取高质量基因组dna的方法
CN113584217A (zh) * 2021-09-06 2021-11-02 上海植物园 一种基于est-ssr分子标记的映山红亚属杜鹃花杂交品种鉴定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NASHIMA 等: "SSR Marker Development and Genetic Identification of Pitaya (Hylocereus spp.) Collected in Okinawa Prefecture, Japan", 《THE HORTICULTURE JOURNAL》 *
PAN 等: "Genetic diversity among germplasms of Pitaya based on SSR markers", 《SCIENTIA HORTICULTURAE》 *
武志江 等: "利用荧光标记SSR构建火龙果种质资源分子身份证", 《中国南方果树》 *
王壮 等: "火龙果转录组SSR的信息分析及其分子标记开发", 《贵州农业科学》 *
胡文斌 等: "火龙果主要商业品种SSR指纹图谱构建和遗传多样性分析", 《热带作物学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110724758B (zh) 一种基于snp标记鉴定京农科728玉米杂交种纯度的方法
CN115678979B (zh) 菠萝液相芯片及其应用
CN115198023B (zh) 一种海南黄牛液相育种芯片及其应用
CN113832243B (zh) 基于kasp技术开发的用于茶树品种鉴定的核心snp标记
CN110846429A (zh) 一种玉米全基因组InDel芯片及其应用
CN111088382A (zh) 一种玉米全基因组snp芯片及其应用
CN110872633B (zh) 一种基于snp标记鉴定京科968玉米杂交种纯度的方法
CN110894540A (zh) 用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用
CN111607661B (zh) 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用
CN117965781A (zh) 一种花生40K液相SNP芯片“PeanutGBTS40K”及其应用
CN117133354A (zh) 一种高效鉴定林木关键育种基因模块的方法
CN108416189B (zh) 一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法
CN111876515A (zh) 火龙果种质资源ssr指纹数据库及鉴定体系的构建方法
CN112080497B (zh) 一种鉴定西瓜种质真实性的snp位点引物组合及应用
CN115820923A (zh) 一种用于构建甘蔗dna指纹图谱的分子标记组合及其应用
CN112226433B (zh) 一种鉴定白皮松种质资源的snp位点引物组合及应用
CN111235301B (zh) 一种鉴定苦瓜品种真实性的方法及其专用ssr引物组合
CN111944922B (zh) 基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用
CN111607659A (zh) 与苎麻原麻半纤维素含量关联的snp分子标记及其应用
LU503449B1 (en) Two PARMS-SNP Molecular Markers for Identifying Resistant Gene VrTAF5 of Vigna radiata (Linn.) Wilczek Cercospora Leaf Spot Disease
CN113549616B (zh) 鉴定文心兰品种的caps分子标记、筛选方法与应用
CN117144037B (zh) 一种洋葱核心snp的分子标记集及应用
CN108427866B (zh) 一种基于分子标记技术的农作物自交系类群的鉴定方法
CN117821650A (zh) 一种芋全基因组SNP-Panel及其应用
CN115747370A (zh) 不结球白菜kasp分子标记及其在种质资源鉴定中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination