CN117144037B - 一种洋葱核心snp的分子标记集及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种洋葱核心SNP的分子标记集及应用。本发明提供的洋葱核心SNP分子标记集包含443个SNP标记，该分子标记集具有在洋葱资源或者品种鉴定、洋葱资源或者品种纯度检测、洋葱SNP指纹图库构建、洋葱遗传多样性分析以及分子标记辅助育种中的应用；本发明基于SLAF‑seq高通量测序技术开发的洋葱核心SNP的分子标记集，能够快速、准确的、有效地鉴定评价种子资源，形成每份资源的DNA指纹图谱，可以解决资源中种质混杂、保存管理重复以及知识产权纠纷等问题。
Description
技术领域
本发明属于分析标记辅助育种技术领域，具体涉及一种洋葱核心SNP的分子标记集及在洋葱辅助育种方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着生物测序技术的快速发展，各种DNA分子标记如RFLP、AFLP、SSR、InDel和SNP等，被开发出来用于种质筛选、品种鉴定和产权保护。与上述形态标记相比，其中比较突出和实用的是数量多分布广泛、变异丰富、多态性高、稳定性好、表现型多为共显性且适于规模化选择和鉴定育种材料的新一代DNA序列差异的SNP分子标记，其已经被应用到蔬菜作物如辣椒、黄瓜、瓠瓜的品种鉴定以及种子纯度检测等方面。随着高通量测序技术的发展，基于第二代高通量测序的简化基因组测序SLAF-seq(specific length amplified fragmentsequenceing)诞生，该技术由百迈客公司开发，是基于限制性内切酶切割DNA，对部分基因组进行序列测定，并对酶切片段进行高通量测序，能快速而简化的生成准确的基因分型，具有效率高、稳定性好等特点。基于SLAF-seq高通量测序技术的DNA指纹图谱标记，由全基因组范围内的少数具有较强代表性的标记构成，这些标记组合可以对同种内的不同材料进行区分，结果稳定，鉴定方便，目前已在作物种质资源多样性的研究、品种产权确定和保护、生产种子纯度鉴定等方面广泛应用。
洋葱是两年生草本植物，隶属于百合科葱属，又称圆葱、葱头，是世界上主要蔬菜种类，具有重要园艺和药用价值。其分布广泛，南北各地均有栽培，是国内主栽蔬菜之一，也是出口创汇的主要蔬菜作物。随着我国洋葱种质资源整理保护工作的不断推进，以及洋葱育成品种数量的逐年增多，出现一系列的问题，包括如何判断相似品种、如何对推广品种进行产权确认和保护、如何快速从开放型传粉洋葱种群中分离出纯合基因型和杂合基因型品种；传统对洋葱种质和品种的鉴定评价主要依靠表型，其工作周期长、易受人为因素影响，成为高效利用种质资源的瓶颈之一。
发明内容
针对目前洋葱现有技术中存在的上述问题，本发明基于简化的基因组SLAF-seq技术开发了一组均匀覆盖洋葱基因组、多态信息含量高、适于分型的洋葱核心SNP分子标记集，该分子标记集对于洋葱资源或品种鉴定、纯度检测、洋葱SNP指纹图库构建及洋葱分子标记辅助育种具有重要意义。本发明基于该核心SNP分子标记集进行了洋葱核心种质和品种指纹图库构建，建立了准确、简便、快速的洋葱资源或品种鉴定和纯度检测方法，可准确对瓠瓜种质材料间的遗传结构进行分析。
基于上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：
本发明第一方面，提供一种洋葱核心SNP的分子标记集，所述分子标记集中包括443个SNP标记，所述SNP标记的位点信息如下表所示：
上述表格中SNP标记的物理位置以洋葱双单倍体系DHCU066619的组装基因组(A.cepa v1.2)为参考基因组；本发明验证的实施方式中，上述分子标记集的构建方式如下：
以洋葱双单倍体系DHCU066619的组装基因组为参考基因组，筛选高世代洋葱重要种质进行简化基因组重测序，对通过GATK和samtools两种方法开发得到的SLAF-SNP标记交集作为原始SNP标记数据集；基于SNP标记的材料区分度高、在基因组上分布均匀、特异性强、观测杂合度、Nei多样性指数、多态信息量(PIC)、最小等位基因频(MAF)等原则对该原始SNP标记数据集进行筛选，最终得到上述443个SNP组成的分子标记集。
第二方面，提供第一方面所述洋葱核心SNP的分子标记集在以下任意一个方面的应用：
1)洋葱核心种质的筛选；
2)洋葱的遗传多样性分析；
2)洋葱品种SNP图谱的构建；
4)洋葱品种或纯度鉴定；
5)分子标记辅助育种。
洋葱在我国种植历史短、遗传资源相对匮乏等原因，在杂种一代新品种选育方面还远远落后于其它发达国家，推测有以下两个原因：第一，无论是自交系还是常规品种，其遗传背景都具有相对较高的杂合性，导致即使是不同来源的群体之间，其遗传多样性差异相对匮乏；第二，很多研究表明洋葱品种间遗传背景狭窄，比如长日照和中日照现有大多数品种来源于100余年前引自美国的“Yellow Danvers”品种。因此加强核心种质材料的鉴定与筛选，对促进种质交流、利用、基因库管理以及提升我国洋葱育种水平具有重要的学术和实用意义。
本发明验证的第一个实施方式中，基于上述核心SNP的分子标记集进行洋葱核心种质资源的筛选，筛选方式如下：基于上述分子标记集对现有收集的洋葱材料进行核心SNP分子标记的等位基因覆盖度(CV)评价，筛选出CV值趋于饱和的材料作为洋葱核心种质。
本发明验证的第二个实施方式中，基于上述核心SNP的分子标记集对洋葱品种的指纹图库进行构建，构建方式如下：基于上述分子标记集获取洋葱品种的SNP指纹序列，对所述SNP指纹序列进行2D转化得到该洋葱品种的SNP指纹图谱；所述指纹序列即为上述分子标记集中各SNP位点的碱基集合，由于SNP标记是二等位标记，所以443个SNP标记构成的指纹将会有886个碱基组成；
具体的实例中，如“科威红5号”品种的核心SNP指纹如SEQ ID NO:1所示；利用qrencode(https://github.com/fukuchi/libqrencode)对SNP指纹标记进行2D barcode转化，获得洋葱种质材料SNP指纹二维码。
另外一种实例中，所述洋葱双单倍体材料‘DH-17’的核心SNP指纹如SEQ ID NO:2所示。
上述实施方式中，所述洋葱品种的SNP指纹序列可用于品种纯度鉴定，可行的检测方式如下：依据上述分子标记集中SNP的参考基因位点，检测待测洋葱品种相应的位点获得SNP集合序列，将该SNP集合序列与已知洋葱品种的核心SNP指纹进行比对，即可实现洋葱品种纯度的鉴定。
第三方面，提供SEQ ID NO:1所示序列在洋葱‘科威红5号’品种纯度鉴定中的应用。
第四方面，提供SEQ ID NO:2所示序列在洋葱双单倍体‘DH-17’鉴定中的应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为核心SNP分子标记集的遗传多样性指数图；
图2为种质资源比例梯度覆盖度；
图3为洋葱品种‘DH-17’、‘科威红5号’的SNP指纹二维码。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前针对洋葱种质鉴定的手段主要依赖表型，缺乏基因层面的鉴定手段，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种洋葱核心SNP的分子标记集。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中，对洋葱核心SNP的分子标记集的获得方式进行说明：
1)核心标记的遗传多样性分析
基于洋葱双单倍体系DHCU066619的组装基因组为参考基因组，其版本及网址分别为v1.2和www.oniongenome.wur.nl，选择最适酶切方案，对72份地理来源、表型特性特征等差异较大的高世代洋葱重要种质进行简化基因组重测序。对通过GATK和samtools两种方法开发得到的SLAF-SNP标记交集作为可靠的SNP标记数据集，共2,723,520个群体标记。
对于非遗传群体材料构成的群体开发的SNP，基于标记(组合)的材料区分度高、在基因组上分布均匀、特异性强等原则，以及72份洋葱资源的观测杂合度(Observedheterozygosity)、Nei多样性指数(Nei’s diversity index)、多态信息量(PIC)、最小等位基因频(MAF)等，最终筛选构建出一套含有443个质量高、代表性强的SNP标记作为洋葱核心SNP的分子标记集，其相关详细信息如下表1所示：
表1
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基于72份洋葱资源的核心SNP分子标记集的遗传多样性指数如附图1所示。其平均观察杂合度(Observed heterozygosity)为0.32，Nei多样性指数(Nei’Diversity Index)为0.49；平均多态性信息含量(PIC)为0.37；平均最小等位频率(MAF)为0.42。
实施例2
本实施例中，利用洋葱的443个核心SNP的分子标记集筛选洋葱核心种质，具体实施步骤如下：
1)核心种质的筛选
基于洋葱443个核心SNP的分子标记集，利用Core Hunter II软件对已收集的72份洋葱种质资源，结合加权指数Modified Rogers distance(0.7)和Shannon DiversityIndex(0.3)，按照总的种质资源抽样比例0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9梯度进行筛选，并使用Core Hunter II软件的coreanalyser模块对筛选材料进行等位基因覆盖度(CV)评价。最终得到每个种质资源比例梯度对应的等位基因覆盖度如下表2所示：
表2
基于443个核心SNP标记集对72份洋葱种质资源比例梯度覆盖度所示，需要40％的抽样比例，可以达到99％等位基因覆盖度。因此，选择40％的梯度筛选出的28份材料作为洋葱核心种质。
2)等位基因评估
对上述步骤1)筛出的28份核心种质的A、C、G、T四种等位基因产生的四种纯合和六种杂合共十种基因型的数目进行统计，结果发现几乎所有种质材料的等位基因都出现在核心种质集合中，如下表3和附图2所示，表明筛选的核心种质符合最佳抽样比例。
表3十种基因型的数目及各自比例分布表
实施例3
本实施例是利用洋葱核心SNP标记集构建洋葱品种的种质指纹图库，构建方式如下：
基于上述洋葱核心SNP的分子标记集中各SNP的参考基因位点，分别获得相应位点碱基集合即为SNP指纹，因此，由于每个位点SNP标记是二等位标记，由两个碱基组成，所以443个SNP标记构成的指纹将会有886个碱基组成。
如“科威红5号”，一份红皮商用洋葱，其核心SNP指纹为：
GGATACGTAGGTAAAAGGATCGTTAGAACTCGCCTTATGGTTAANNGGGGTTGGCCAGGGTTCCGGTTCCCCCC
CCGGCCCCTTAAAATTCTGGCTCGAAAGCTCTATGGATCTAAGGGTGGATCTGGCGCCCTGGTTCCGGGGCCTT
GGCTTTGGGGAGGGAATTAACTCTAGAAGGCCTTGGCCCTAAGGGGATGTGGCTTTCCCCGGGGCCCCTTAAC
CAANNTTGTGGCCAAAATTAGCTCCCTCCCCGGAATTTTGGGGTTAANNAAGGAATTCCGGCCAGCTACCTNN
TTGGAAAGGTAACCAATTGGGGCCTTTTGGCTCCAATTTTTTTTTTCCTTCTGGCTCCAACTCTTTAACCGGGGA
ATTGGAAGGGGGTACCCAAGGAACCGGNNAACCAGGGGGATGGAAGGACAGTTAAAGCTAGTTAACCTTTTG
GGGTTCCAACCAAGGAAAACCTTCCCTAAGGCCCCTTAACTCTGGAGTTTTGGCTATCCAACCGGCCGGAAGG
GGAACCCCTTGGCCGGCCTTGGGGGGGGTTCCGGCCTTTTNNNNAAGGAAAAAAGTCTGGCCGGTTATCGAA
CTATCTCTGGGGNNAGCTGTTTAGGGCGACCTACCTGGAGAANNCCCTAAAACTCCGGTTAAGGCTTTGGGGG
GAACCAAGTCTATGGCTGGAATTCTGGTTACACAAACATAAGGACAAAAAAGGGTAATTAACTAACTCTCTGG
AAGGCTATTTGGAGGGCCGGCCGGATGGGGCCCCGGTTACAGGGAAACNNAATTTTAATTAACCTTAATTNNTT
AAGGCCTTTTAAGGGGAAAAAAGGTTGGCCCCNNNNTTAGAAGGAAGGGGAAGGCCGGTTGGGGAATTAAGGGGGGGGTT(SEQ ID NO:1所示)。
洋葱双单倍体‘DH-17’的核心SNP指纹为：
GGAAAATTGGGGGGAAAATTGGCCGGAACCGGCCTTAAGGTTAACCGGGGTTCCCCAAGGAACCGGAATTGG
AATTTTAATTCCGGCCGGTTGGTTGGTTGGCTCTAAGGATTTAAGGGGGGAATTGGCGTTTTGGATCTAGGGCC
TTAGCTTTGGGGGGAAGGATACCTCCGGAAAGTTATGGCCCCGGTTCCAAGGAACCAAAACCAAGGCCGGATG
GCTTTCCCTTTAACTAGAGCTAACTTTTTTTTTAAGGCCCCAACCGGGGGGGGGGAATTCCAATTAATTAACCG
GTTGGGGAATTCCTTGGTTTTAATTCTCTGGCTCCGGGGCCCCCCCCTTAACCAGTTCCAATTTTTTAATTAAAA
CCCTAAAAGGGGGGAACCAAGGGGTTTTGGGGTTGGGGGGAAGGAAGGAAGGCTGGGGCCGGCCGGTTAAC
CAAGGCCCCGGCCAATTCCGGGGCCAATTCCGGCGACCTAACTCTGGAGATCTAGCCAACTATCTAGACGGGG
AAAAAACCTTCCAGACAGCTATAGGGGGGGATCCAATTGGCCGGAGGGGGGGATACGTTTGGCCAATTTTCCG
GCCAACCCCGGGGTTAATTTTCCAGGGCGACCCCCCCAAAGGGCTCTCCTTGGTTCCGGGGGGGGCCTTAAAG
AGAATTAAGTTTATGGCTGTGGTTCTGGCCAACCATACTTGGGGAAGGTTATTTTTAATTAACTGGTTCCTTAATT
AACCTTCCTTGGGGCCGGCCAATTGGGGCCTTAACTACAGGGGGACGTATCTCTCCGGGGTTCTATATTTCCTTG
GCTCTGGAAGGGGTTGGAGTTCCAATTCCTTCCCCGGCCGGGGGGAAAAGGCCGGCCGGTTAATTAAAATTGGAACC(SEQ ID NO:2所示)。
利用qrencode(https://github.com/fukuchi/libqrencode)对SNP指纹标记进行2D barcode转化，分别获得洋葱双单倍体‘DH-17’和商品洋葱‘科威红5号’的SNP图谱的SNP指纹二维码，如附图3所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种洋葱核心SNP的分子标记集在以下任意一个方面的应用：
1)洋葱核心种质的筛选；
2)洋葱的遗传多样性分析；
3)洋葱品种SNP图谱的构建；
4)洋葱品种或纯度鉴定；
5)分子标记辅助育种；
所述分子标记集中包括443个SNP标记，所述SNP标记的位点信息如下表所示：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，表格中SNP标记的物理位置以洋葱双单倍体系DHCU066619的组装基因组为参考基因组。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP标记集的构建方式如下：
以洋葱双单倍体系DHCU066619的组装基因组为参考基因组，筛选高世代洋葱重要种质进行简化基因组重测序，对通过GATK和samtools两种方法开发得到的SLAF-SNP标记交集作为原始SNP标记数据集；基于SNP标记的材料区分度高、在基因组上分布均匀、特异性强、观测杂合度、Nei多样性指数、多态信息量、最小等位基因频原则对该原始SNP标记数据集进行筛选，最终得到上述443个SNP组成的标记集。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述洋葱核心种质的筛选方式如下：基于上述核心分子标记集对洋葱核心种质进行筛选，筛选的标准为：基于权利要求1所述的分子标记集，对已收集的洋葱种质资源进行等位基因覆盖度评价，筛选出CV值趋于饱和的材料作为洋葱核心种质。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述洋葱品种SNP图库的构建方式如下：基于权利要求1所述洋葱核心SNP的分子标记集获取洋葱品种的SNP指纹序列，对所述SNP指纹序列进行2D转化得到该洋葱品种的SNP指纹图谱。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述洋葱品种或纯度鉴定方式如下：依据权利要求1所述洋葱核心SNP的分子标记集的参考基因位点，检测待测洋葱品种相应的位点获得SNP集合序列，将该SNP集合序列与已知洋葱品种的核心SNP指纹进行比对，即可实现洋葱品种纯度的鉴定。
7.SEQ ID NO:1所示序列在洋葱商品种‘科威红5号’品种纯度鉴定中的应用。
8.SEQ ID NO:2所示序列在洋葱双单倍体‘DH-17’材料鉴定中的应用。
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311120532.4A Active CN117144037B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 一种洋葱核心snp的分子标记集及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117144037B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110923357A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-27 | 浙江省农业科学院 | 基于kasp技术开发的瓠瓜核心分子标记集及其应用 |
| KR20230047564A (ko) * | 2021-10-01 | 2023-04-10 | 대한민국(농촌진흥청장) | 중만생 양파 품종판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도 |
| CN116219048A (zh) * | 2021-12-02 | 2023-06-06 | 浙江省农业科学院 | 基于kasp技术开发的豌豆核心snp分子标记集及其应用 |
-
2023
- 2023-08-31 CN CN202311120532.4A patent/CN117144037B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110923357A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-27 | 浙江省农业科学院 | 基于kasp技术开发的瓠瓜核心分子标记集及其应用 |
| KR20230047564A (ko) * | 2021-10-01 | 2023-04-10 | 대한민국(농촌진흥청장) | 중만생 양파 품종판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도 |
| CN116219048A (zh) * | 2021-12-02 | 2023-06-06 | 浙江省农业科学院 | 基于kasp技术开发的豌豆核心snp分子标记集及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117144037A (zh) | 2023-12-01 |
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