CN115678979B - 菠萝液相芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及液相芯片技术，尤其涉及菠萝液相芯片及其应用。本发明开发了一套包含40349个SNP位点的液相芯片，对10个菠萝品种进行检测，位点捕获效率均在98％以上，利用探针进行位点捕获最终获得10个菠萝的SNP位点的基因型，计算出不同菠萝品种间的遗传相似度，从而判断出不同菠萝品种间的遗传相似性。本发明采用40K的SNP液相芯片对10个品种进行区分，可极大程度地吻合供试品种的选育背景，准确性高，可有效提升菠萝品种遗传相似性的分析效率、节约试验成本，在菠萝品种类群划分、品种鉴定、品种选育等方面均有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及液相芯片技术，尤其涉及菠萝液相芯片及其应用。
背景技术
菠萝属凤梨科、凤梨属多年生单子叶草本植物，是我国华南四大水果之一，是典型的热带、亚热带作物。由于菠萝栽培品种众多，20世纪80年代后，根据品种的性状及来源等特征，人们将菠萝分为无刺卡因类(Smooth Cayenne)、皇后类(Queen)、西班牙类(Spanish)、伯南布哥类(Pernambuco)、佩罗莱拉类(Perolera)5个类群，另外它们的杂交后代形成了一类杂交类群。菠萝品种的划分主要依据菠萝在果实、叶片、植株性状等方面的差异来进行，然而地区及国际间种质频繁交流而导致的同名异物、同物异名现象存在，造成了菠萝品种名称的混乱，从分子水平上进行区分势在必行，然而现有的一代、二代分子标记手段RFLP， ISSR，SSR，RAPD等存在部分结果与形态学分类不一致的情况，也无从区分，目前以基因组为基础的SNP技术作为三代分子标记，具有高通量、更加精确的特点，正广泛应用动植物中，但菠萝中尚未有开发SNP标记。
因此，为了更准确地划分菠萝类群，急需提供一种更加精准的菠萝品种遗传相似性及品种区分的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种菠萝液相芯片及其应用，可以对10个品种进行区分，可极大程度地吻合供试品种的选育背景，准确性高，可有效提升分析效率、节约试验成本。
本发明通过以下的方案实现：
一种菠萝分子标记的SNP位点组合，所述的SNP位点组合包含以下的40349个SNP位点，其位点信息为如表1中所示。
一种菠萝分子标记的探针，所述的探针能够与菠萝基因组中含有以上所述的40349个SNP位点区域杂交形成双链，为了更好的对靶向位点序列进行捕获，为每个位点设计探针，探针序列其序列如表1中所示。
一种用于区分菠萝品种的液相芯片，包含以上所述的SNP位点组合和所述SNP位点对应的探针。
以上所述的液相芯片在分析菠萝品种间遗传相似性上的应用。
一种分析菠萝品种遗传相似性的方法，包括以下步骤：
(1)所用的10个菠萝品种分别为：巴厘、神湾、台农17号、台农4号、金菠萝、无刺卡因、Pulae、Nenas Arnis、Ripley和Pérola；各位点信息如权利要求1所示；
(2)在每个位点设计覆盖目标SNP的探针，采用生物素(Biotin)标记对目标探针进行标记，构建菠萝40K探针；
(3)提取各个菠萝品种的DNA，构建样品测序文库；在液态中加入利用生物素标记的目标探针，分别与10个菠萝品种通过重测序获得的基因组目标区域杂交形成双链；
(4)利用链霉亲和素包衣的磁珠对携有生物素标记的目标探针进行分子吸附，从而捕获与探针杂交的靶点；
(5)对捕获的靶点序列依次进行靶点序列洗脱、靶点扩增、文库DNA洗脱步骤，构建DNA文库；将构建好的DNA文库用华大MGISEQ2000 测序仪进行测序，测序数据经过质控、与参考基因组比对、SNP鉴定、基因型分型信息提取，形成最终的基因型分型文件，获得10个菠萝的SNP 位点的基因型；
(6)分别计算所述的10个菠萝品种两两间的遗传相似度，计算公式如下：
其中，GS为样本1与样本2的遗传相似度；nij为样本1与样本2中均检出的但基因型无差异的SNP标记位点的数目；Nij为样本1与样本2 中均检出的SNP标记位点的数目；
(7)根据计算获得的遗传相似度，判断不同菠萝品种间的遗传相似性。
以上所述的液相芯片在菠萝品种类群划分中的应用。
以上所述的液相芯片在菠萝品种鉴定中的应用。
一种鉴定菠萝品种的方法，其步骤包括：
按照上述方法获得待测菠萝SNP位点的基因型；分别与上述10个菠萝品种进行比对，若SNP位点的基因型一致，或者遗传相似度达到100％，则可判定待测菠萝品种与比对的菠萝品种相同。
以上所述的液相芯片在菠萝育种中的应用。
进一步，所述的应用中，包括：品种的选育、分子标记辅助育种、检测育种材料、全基因组选择育种、制备全基因组育种芯片。
以上所述的液相芯片的以下任一种应用：
(1)在菠萝全基因组关联分析中的应用；
(2)在菠萝种质资源基因指纹分析中的应用；
(3)在菠萝菠萝聚类分析及亲缘关系鉴定的应用；
(4)在菠萝菠萝基因型分型检测中的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用开发的一套包含40349个SNP位点的液相芯片，对10个菠萝品种进行检测，位点捕获效率均在98％以上，利用探针进行位点捕获最终获得10个菠萝的SNP位点的基因型，10个品种间遗传相似度变化范围为0.7759-0.9950，平均为0.8412。
利用上述获得的菠萝各品种间的遗传相似度，使用R语言的pheatmap包进行的热图绘制(默认参数)，从做出的图聚类划分，可以将10 个菠萝品种划分为2个类群。第Ⅰ类群又可分为两个亚群，亚群Ⅰ-Ⅰ包括3个品种，分别是皇后类的巴厘和神湾，西班牙类的Pulae，亚群Ⅰ- Ⅱ包含3个品种，分别是西班牙类的Nenas Arnis，和杂交类台农17号、台农4号。第二类群包含四个品种，分别是卡因类的金菠萝、无刺卡因，皇后类的Ripley，以及伯南布哥类Pérola。
本发明采用40K的SNP液相芯片对10个品种进行区分，可极大程度地吻合供试品种的选育背景，准确性高，可有效提升菠萝品种遗传相似性的分析效率、节约试验成本。
同时，本发明所述的40K液相芯片，还可以用于菠萝全基因组关联分析，检测菠萝基因型，建立菠萝种质资源基因指纹图谱，还可以在菠萝品种培育中提供遗传关系证据，并且利用SNP位点的基因型对新培育的菠萝品种基因型进行检验，快速确定菠萝品种的基因型，缩短品种培育的周期。
对于无法确定品种的菠萝，也可以采用本发明所述的方法获得相应SNP位点的基因型，分别与本发明中所述的10个菠萝品种两两进行比对，分析其与上述10个菠萝品种的亲缘关系。
附图说明
图1为SNP标记在不同染色体的分布情况，横坐标为染色体ID，左示例Count为位点数/区段数；右示例Length为染色体长度(单位bp)。其中CABGUK020000023.1、CABGUK020000023.1、CABGUK020001179.1、CABGUK020001269.1、CABGUK020002976.1、CABGUK020003088.1，由于每个scaffold序列很短，且位点数较少，所以未放入图中。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一、探针的合成
利用覆盖菠萝25对染色体的40K(40349个位点)SNP芯片；在每个位点设计覆盖目标SNP的探针，采用生物素(Biotin)标记对目标探针进行标记，构建菠萝40K探针。
为了更好的对靶向位点序列进行捕获，探针设计过程中，按照2X设计，其中有些位点设计出1X探针。探针序列如表1所示。
表1中，“：”之前的为位点信息，“-”左侧数据为位点所在的染色体，“-”右侧数据为位点所在染色的位置，“-”右侧数字之后的字母为参考基因组碱基类型；“：”之后为探针序列。若为2X探针，以“/”进行区分不同的序列。
所述的探针设计原则为：a.挑选出可覆盖区域的所有探针长度110bp；b.计算可覆盖目标区域探针的GC含量；c.计算探针的同源性区域个数。所述探针的挑选标准为：a.选取探针含量在30％-70％之间的；b.选取同源性区域个数＜5的；c.选取探针区域不包含SSR、N区域的；d.筛选出最终符合要求的探针序列，进而确认目标位点的覆盖情况。
二、菠萝品种基因组DNA测序文库构建步骤：
1.样品DNA提取
采用CTAB法对样本DNA进行提取。
2.样品DNA质检
将测试样品DNA，用Qubit Fluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对DNA浓度进行测定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。检测合格的样品放入4℃冰箱，保存、备用。
3.样品DNA片段化
取12μL质检合格的DNA放置于0.2μL PCR管中，将管置于超声波破碎仪中对DNA进行随机物理破碎，片段破碎至200～400bp。
4.样品末端修复
向管中加入4μL GenoBaits End Repair Buffer和2.7μL GenoBaits End RepairEnzyme，补水至20μL，放入ABI 9700PCR仪中37℃温育20分钟， 72℃20分钟完成破碎片段的末端修复和加A过程，待上述程序达到4℃时，立即进行接头连接。
5.样品测序接头连接
从PCR仪中取出小管加入2μL GenoBaits Ultra DNA ligase、8μL GenoBaitsUltra DNA Ligase Buffer和2μL GenoBaits Adapter，补水至20μL，振荡混匀，然后放置于ABI 9700PCR仪上22℃反应60分钟，完成测序接头的连接。
6.样品DNA纯化
向连接产物中加入48μL的GenoPrep DNA Clean Beads对连接产物进行纯化，纯化后采用磁珠进行片段筛选，保留插入片段在300～350bp的连接产物。
7.样品文库扩增
向上一步的PCR管中加入5μL带有Barcode序列的测序接头、1μL P5接头、10μLGenoBaits PCR Master Mix，并用纯水补至20μL；用ABI 9700 PCR仪进行扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复2-4步，共8个循环；72℃延伸5min。不同的Barcode用于区分不同的样品。
8.样品文库纯化
向第二轮PCR产物中加入20μL GenoPrep DNA Clean Beads，振荡混匀，将0.2μL的PCR管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用80％乙醇洗涤磁珠一次，用pH值为8.0的Tris-HCl将文库DNA洗脱下来。
9.DNA杂交
取500ng已完成构建的菠萝基因组DNA测序文库，加入5μL GenoBaits Block I和2μL GenoBaits Block II，置于Eppendorf Concentrator plus 真空浓缩仪上，在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μL GenoBaits 2x Hyb Buffer、2.7μL GenoBaitsHyb Buffer Enhancer、2.8μL Nuclease-Free Water，用移液器吸打混匀后放置于ABI9700PCR仪上95℃温育10分钟，然后取出PCR管加入3μL已经合成的菠萝40K探针，旋涡震荡混匀后放置于ABI 9700PCR仪上65℃温育2小时，完成探针杂交反应。
10.DNA捕获
向上一步杂交完成的反应体系中加入100μL GenoBaits DNA Probe Beads，上下吸打10次，放入ABI 9700PCR仪上65℃温育45分钟，使磁珠与探针结合。用100μL GenoBaitsWash Buffer I、150μL GenoBaits Wash BufferII分别对结合探针后的磁珠进行65℃热洗，然后再用100μL GenoBaits Wash Buffer I、150μL GenoBaits Wash Buffer II和150μL GenoBaits Wash Buffer III分别对磁珠进行常温洗涤。洗涤完成的磁珠用20μLNuclease-Free Water进行重悬。此过程为靶点序列洗脱。
取13μL重悬后的DNA(带磁珠)加入到新的0.2mL PCR管中，然后加入15μLGenoBaits PCR Master Mix、2μL GenoBaits Primer Mix配置 post-PCR体系，用ABI9700PCR仪进行文库扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；重复2-4步，共15个循环；72℃延伸5min。此过程为靶点扩增。
向post-PCR产物中加入45μL GenoPrep DNA Clean Beads并用移液器上下吸打均匀，然后将0.2mL PCR管置于磁力架上至溶液澄清，弃去上清并用75％乙醇洗涤磁珠两次，用pH为8.0的Tris-HCl将文库DNA洗脱下来。完成菠萝40K探针的杂交捕获工作。此过程为文库DNA洗脱。
11.DNA杂交捕获文库质检
用Qubit Fluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对文库的DNA浓度进行测定，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在 300～400bp之间。
至此，完成DNA文库构建过程。
三、DNA杂交捕获文库测序
将构建好的DNA文库用华大MGISEQ2000测序仪进行测序。
表1 40349个位点信息及探针序列
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四、菠萝40K探针基因型数据分析
测序数据经过FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上，用GATK(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行SNP鉴定，用自编的Perl脚本对菠萝40K探针捕获测序的基因型分型信息进行提取，获得菠萝基因分型数据，形成最终的基因型分型文件。
利用覆盖菠萝25对染色体的40K(40349个位点)SNP芯片(如图1和表1所示)，检测10个菠萝品种样本，10个样本的位点捕获效率均在 98％以上，10个品种间相似系数变化范围为0.7759-0.9950，平均为0.8412。
遗传相似度计算公式如下：
其中，GS为样本1与样本2的遗传相似度；nij为样本1与样本2中均检出的但基因型无差异的SNP标记位点的数目；Nij为样本1与样本2中均检出的SNP标记位点的数目。
测定的10个菠萝品种的部分基因型数据如表2所示。
表2 10个菠萝品种的部分基因型数据
| 位点信息 | 无刺卡因 | 巴厘 | 金菠萝 | 台农17 | 台农4 | Ripley | Pérola | 神湾 | Nenas Arnis | Pulae |
| CABGUK020000023.1_30154C | CC | CG | CC | CG | CG | GG | CC | CG | CC | CG |
| CABGUK020000023.1_30170C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| CABGUK020000023.1_30186G | GG | GA | GG | GA | GA | AA | GG | GA | GG | GA |
| CABGUK020000023.1_30203C | CC | CG | CC | CG | CG | GG | CC | CG | CC | CG |
| CABGUK020001179.1_4667T | TT | TT | TT | NA | TT | TT | TT | TT | TT | TT |
| CABGUK020001179.1_4673T | TT | TT | TT | NA | TT | TT | TT | TT | TT | TT |
| CABGUK020001179.1_4674C | CC | CC | CC | NA | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| CABGUK020001179.1_4710T | TT | TT | AA | NA | TT | TT | TT | TT | TA | TT |
| CABGUK020001179.1_4713A | AA | AA | CC | NA | AA | AA | AA | AA | AC | AA |
| CABGUK020001269.1_4417T | TT | TT | TT | TT | TT | TT | TT | TT | AA | TT |
| CABGUK020002976.1_619T | TT | TT | NA | TT | TT | TT | NA | TT | TT | TT |
| CABGUK020003088.1_27305T | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA |
| CABGUK020003088.1_38060A | AA | AA | NA | AA | AA | NA | NA | AA | AA | AA |
| LR828281.1_2320A | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA |
| LR828281.1_7336C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_11349A | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA | AA |
| LR828281.1_13978C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_24728T | TT | TT | TA | TT | TT | TT | TT | TT | TT | TT |
| LR828281.1_31042C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_31044C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_31045C | CT | CC | TT | CC | CT | CC | CC | CC | CT | CC |
| LR828281.1_31046C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_31231G | GA | GG | AA | GG | GA | GG | GG | GG | GA | GG |
| LR828281.1_43046G | GG | GG | NA | GG | GG | GG | GG | GG | GG | GG |
| LR828281.1_60821C | CC | CC | NA | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_85277G | GG | GG | NA | GG | GG | GG | GG | GG | NA | GG |
| LR828281.1_87689C | CC | CC | NA | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_98533C | CC | CC | NA | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_137047G | GG | GG | NA | GG | GG | GG | GG | GG | GG | GG |
| LR828281.1_148924C | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC | CC |
| LR828281.1_153418A | AG | AA | GG | AA | AG | AA | AA | AA | AG | AA |
| LR828281.1_155857A | AT | AA | TT | AA | AT | AA | AA | AA | AT | AA |
含有以上所述探针的液相芯片在菠萝品种类群划分中的应用，其具体操作方法为：根据上述计算获得的遗传相似度，将遗传相似度相近的菠萝品种划分为同一类群。
按照上述获得了10个菠萝品种相互之间的遗传相似度数据。如表4所示。
表4 10个菠萝品种相互之间的遗传相似度
| 巴厘 | 神湾 | Pulae | Nenas Arnis | 台农17号 | 台农4号 | 金菠萝 | 无刺卡因 | Ripley | Pérola | |
| 巴厘 | - | 0.994 | 0.995 | 0.8975 | 0.8884 | 0.9023 | 0.8043 | 0.8206 | 0.8642 | 0.7825 |
| 神湾 | - | 0.995 | 0.8977 | 0.8878 | 0.9013 | 0.8034 | 0.8194 | 0.8634 | 0.7822 | |
| Pulae | - | 0.897 | 0.8883 | 0.9017 | 0.8039 | 0.8198 | 0.8635 | 0.7826 | ||
| Nenas Arn | - | 0.8874 | 0.8864 | 0.8212 | 0.8441 | 0.8762 | 0.7766 | |||
| 台农17号 | - | 0.9244 | 0.8270 | 0.8874 | 0.8844 | 0.7759 | ||||
| 台农4号 | - | 0.8184 | 0.8758 | 0.8769 | 0.7768 | |||||
| 金菠萝 | - | 0.8261 | 0.8261 | 0.7902 | ||||||
| 无刺卡因 | - | 0.8791 | 0.7771 | |||||||
| Ripley | - | 0.7882 | ||||||||
| Pérola | - |
使用R语言的pheatmap包进行的热图绘制，10份品种聚为2个类群，如下表所示：
其中，皇后类的巴厘和神湾与未知类的Pulae遗传相似度最接近，两两间分别为0.9944(巴厘-神湾)、0.9948(神湾-Pulae)、0.995(巴厘-Pulae)。与巴厘和神湾同属于皇后类的Ripley，与巴厘的遗传相似度为0.8642、与神湾的遗传相似度为0.8634，均高于十个品种间的遗传相似度0.8412。西班牙类的Nenas Arnis与Pulae聚在了第Ⅰ类群，两者间遗传相似度为0.897。杂交类的台农17号和台农4号聚集在了第Ⅰ类群，两者间遗传相似度为0.9244。卡因类的金菠萝和无刺卡因聚在了第Ⅱ类群，两者间遗传相似度为0.8261。
伯南布哥类Pérola被聚集在了第Ⅱ类群中，表明它与卡因类的亲缘关系较近，与金菠萝的遗传相似度为0.7902，与无刺卡因的遗传相似度为0.7771，与Ripley的遗传相似度为0.7882。而伯南布哥类Pérola与第Ⅰ类群的各品种遗传相似度均较低，分别为0.7825(巴厘),0.7822(神湾)，0.7826 (Pulae)，0.7768(台农4)，0.7759(台农17)，0.7766(NenasArnis)。
实施例2
采用实施例1制得的液相芯片鉴定菠萝品种。其操作方法为：
按照上述方法获得待测菠萝SNP位点的基因型；将待测菠萝品种分别与上述10个菠萝品种两两进行对比，分析待测品种与上述10个品种的亲缘关系。若二者的SNP位点的基因型一致，或者遗传相似度达到100％，则可判定待测菠萝品种与该品种为相同的菠萝品种，若遗传相似度大于或等于99％且小于100％，则可判定为二者极近似菠萝品种；若遗传相似度小于99％，则可判定二者为不同菠萝品种。
以上所述的液相芯片也可以用于菠萝育种，例如，借助获得的SNP位点及具体的基因型，可进行特定位点标记、位点检测、亲缘关系筛选和判定等，可用在品种的选育、分子标记辅助育种、检测育种材料、全基因组选择育种、制备全基因组育种芯片等等。
以上所述的液相芯片的也可以用于以下任意一种应用：
(1)在菠萝遗传多样性分析中的应用，利用液相芯片对不同品种的位点信息进行分析，比较不同品种的遗传信息，总结不同品种在遗传信息上的变异特点或者规律，从分子水平上检测菠萝的遗传多样性。
(2)在菠萝品种鉴定及亲缘关系鉴定的应用，根据不同菠萝品种间遗传相似度的大小关系，确定菠萝菠萝品种，建立菠萝品种亲缘关系图谱，分析各品种之间的亲缘关系。
(3)在菠萝全基因组关联分析以及基因组选择育种中的应用，通过比对获得的基因型，根据遗传相似度的大小，分析菠萝全基因组直接的关联关系。
(4)在菠萝分子遗传图谱构建和基因定位克隆中的应用，利用获得的基因型数据构建各菠萝品种的遗传图谱，利用液相芯片准确定位染色体上不同位点，实现基因定位克隆。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种用于区分菠萝品种的液相芯片，其特征在于，包含 SNP 位点组合对应的探针；所述的 SNP 位点组合包括菠萝基因组版本号为GCA_902162155.2 的 40349 个 SNP 位点，其位点信息为如下：
上述位点信息中，“-”左侧数据为位点所在的染色体，“-”右侧数值为位点所在的染色上的位置；所述的菠萝品种为巴厘、神湾、台农17号、台农4号、金菠萝、无刺卡因、Pulae、Nenas Arnis、Ripley和Pérola。
2.一种菠萝分子标记的探针，其特征在于，所述的探针能够与菠萝基因组中含有权利要求 1所述的液相芯片中所述的 40349 个 SNP 位点区域杂交形成双链，其序列如序列表中 SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.80284 所示。
3.如权利要求 1 所述的液相芯片在分析菠萝品种间遗传相似性上的应用。
4.一种分析菠萝品种遗传相似性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）所用的 10 个菠萝品种分别为：巴厘、神湾、台农 17 号、台农 4 号、金菠萝、无刺卡因、Pulae、Nenas Arnis、Ripley 和 Pérola；
（2）在每个位点设计覆盖目标 SNP 的探针，采用生物素对目标探针进行标记，构建菠萝 40K 探针；
（3）提取各个菠萝品种的 DNA，构建样品测序文库；在液态中加入利用生物素标记的菠萝40K 探针,分别与 10 个菠萝品种通过重测序获得的基因组目标区域杂交形成双链；
（4）利用链霉亲和素包衣的磁珠对携有生物素标记的目标探针进行分子吸附，从而捕获与探针杂交的靶点；
（5）对捕获的靶点序列进行洗脱、靶点扩增、建库和测序，最终获得 10 个菠萝的如权利要求 1 所示 SNP 位点的基因型；
（6）分别计算所述的 10 个菠萝品种两两间的遗传相似度，计算公式如下：
其中，GS 为样本 1 与样本 2 的遗传相似度；nij 为样本 1 与样本 2 中均检出的但基因型无差异的 SNP 标记位点的数目；Nij 为样本 1 与样本 2 中均检出的 SNP 标记位点的数目；
（7）根据计算获得的遗传相似度，判断不同菠萝品种间的遗传相似性。
5.如权利要求 1 所述的液相芯片在菠萝品种类群划分中的应用。
6.如权利要求 1 所述的液相芯片在菠萝品种鉴定中的应用。
7.一种鉴定菠萝品种的方法，其特征在于，其步骤包括：按照权利要求 4 中所述的方法获得待测菠萝不同品种 SNP 位点的基因型；两两比较，或者与权利要求 4 中所述 10个菠萝品种进行比对，若 SNP 位点的基因型遗传相似度等于 100%，则可判定为相同的菠萝品种，若遗传相似度大于或等于 99%且小于 100%，则可判定为极近似菠萝品种；若遗传相似度小于 99%，则可判定为不同菠萝品种。
8.如权利要求1所述的液相芯片在菠萝育种中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的液相芯片用于品种的选育、分子标记辅助育种、检测育种材料、全基因组选择育种或者制备全基因组育种芯片。
10.如权利要求1所述的液相芯片的以下任一种应用：
（1）在菠萝遗传多样性分析中的应用
（2）在菠萝品种鉴定及亲缘关系鉴定的应用；
（3）在菠萝全基因组关联分析以及基因组选择育种中的应用；
（4）在菠萝分子遗传图谱构建和基因定位克隆中的应用。
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