CN116949209B - 一种检测顶芒山羊草5m染色体的分子标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物及其应用，属于分子遗传学领域，该分子标记引物包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑14所示的7对引物对。本发明利用SLAF‑seq技术对顶芒山羊草、中国春及普通小麦‑顶芒山羊草5M单体附加系进行测序，通过序列比对分析获得了5M染色体的特异序列，以此为基础，设计出了顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记引物共7对。这些标记可用来检测小麦背景中的5M染色体，快速筛选具有5M染色体的植株，进而方便进行具有顶芒山羊草血缘或优异性状小麦的分子辅助育种，提高小麦背景中顶芒山羊草5M染色体外源遗传物质的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物及其应用。
背景技术
小麦是重要的粮食作物，养活了世界上大约1/3的人口。然而，目前小麦面临育种亲本单一，遗传基础狭窄，新品种遗传背景趋于同质化等问题，种内遗传变异已很难满足突破性新品种选育的需求。小麦近缘植物富含优异基因，是改良小麦天然的基因源。顶芒山羊草(Aegilops comosa Sm.In Sibth.Et Sm.,2n＝2x＝14,MM)与普通小麦亲缘关系较近，是山羊草属重要的二倍体物种之一，含有丰富的抗麦类病害、耐逆境及品质改良的优异基因，可通过有性杂交向普通小麦转移这些优异基因或性状实现小麦遗传改良。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上由于转换、颠换、插入、缺失等变化引起的DNA序列多态性。高通量测序技术可以在没有参考基因组的情况下实现SNPs密集覆盖。基于高通量测序研发的特异性位点扩增片段测序技术(Specific Length Amplified Fragment Sequencing,SLAF-seq)，具有低成本、高通量特点，是一套简化基因组测序技术。在水稻、小麦、油菜等作物中得到广泛应用。
开发可以检测和追踪外源遗传物质的分子标记在小麦育种中至关重要。目前用于开发标记的常规方法费时昂贵且精确度不高，如使用了200个RAPD引物才筛选到3个华山新麦草基因组特异性重复序列等。目前SLAF-seq技术已经成功运用于高效开发各种小麦野生近缘种的分子标记，如长穗偃麦草、冰草、华山新麦草等。然而，还未用于顶芒山羊草5M染色体特异分子标记的开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了7对顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记引物，这些标记可用来检测小麦背景中的5M染色体，快速筛选具有5M染色体的植株，进而方便进行具有顶芒山羊草血缘或优异性状小麦的分子辅助育种，提高小麦背景中顶芒山羊草5M染色体外源遗传物质的检测效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1-14所示的7对引物对。
本发明还提供一种检测顶芒山羊草5M染色体的试剂盒，包含所述的分子标记引物。
本发明还提供一种检测含有顶芒山羊草5M染色体的小麦渗入系的方法，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1-14所示的一对或多对引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的有无判断待测样品是否含有顶芒山羊草5M染色体。
进一步地，若出现电泳条带，且条带大小为500bp，则待测样品含有顶芒山羊草5M染色体；若无电泳条带，则待测样品不含有顶芒山羊草5M染色体。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系包括：2×Taq Master Mix10μL、ddH2O 7μL、前引物1μL、后引物1μL和DNA 1μL。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性3min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸25s，35个循环；72℃维持延伸3min，12℃保温。
本发明还提供一种所述的分子标记引物或所述的试剂盒在鉴定小麦是否含有顶芒山羊草5M染色体中的应用。
本发明还提供一种所述的分子标记引物或所述的试剂盒在小麦野生资源利用、小麦遗传改良或小麦分子育种中的应用。
本发明还提供一种所述的分子标记引物或所述的试剂盒在顶芒山羊草资源利用或顶芒山羊草遗传物质检测中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用SLAF-seq技术对顶芒山羊草、中国春及普通小麦-顶芒山羊草5M单体附加系进行测序，通过序列比对分析获得了5M染色体的特异序列，以此为基础，设计出了顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记引物共7对。这些标记可用来检测小麦背景中的5M染色体，快速筛选具有5M染色体的植株，进而方便进行具有顶芒山羊草血缘或优异性状小麦的分子辅助育种，提高小麦背景中顶芒山羊草5M染色体外源遗传物质的检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为5M染色体特异分子标记5M-SF-14在各种材料中的扩增条带结果；1：顶芒山羊草PI551070；2：四倍体小麦-顶芒山羊草人工合成双二倍体STM(Langdon/PI 551070)；3：NAL-40(普通小麦-顶芒山羊草5M单体附加系)；4：NAL-41(普通小麦-顶芒山羊草5M二体附加系)；5：Langdon；6：CSph2a；7：BZ1313；8：SM 1605；
图2为11个分子标记在4份不同顶芒山羊草居群中的PCR条带；M1：PI 551070；M2：PI551059；M3：PI551061；M4：PI551062；
图3为不同普通小麦-顶芒山羊草异染色体系及不同基因组的山羊草材料的11个分子标记分析；a中1M：含顶芒山羊草1M的异染色体系NAL-35；2M：含顶芒山羊草2M的异染色体系NAL-38；3M：含顶芒山羊草3M的异染色体系NAL-39；5M：含顶芒山羊草5M的异染色体系NAL-40；7M：含顶芒山羊草7M的异染色体系NAL-33；b中M：含M基因组的二倍体顶芒山羊草PI554419；U：含U基因组的二倍体小伞山羊草CIae29；D：含D基因组的二倍体节节麦AS60；C：含C基因组的二倍体尾状山羊草PI551139；
图4为62个5M单体附加系F2自交群体分子标记分析及使用FISH探针pSc119.2/pTa535、pTa71/(CTT)12验证结果；a：5M-SF-31分子标记分析结果；b-d，e1，f1和g1：FISH探针pSc119.2/pTa535分析结果；e2，f2和g2：FISH探针pTa71/(CTT)12分析结果；其中，a：D1-D62；b：D9；c：D15；d：D38；e1-e2：D5；f1-f2：D31；g1-g2：D57。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下述实施例中所使用的普通小麦-顶芒山羊草异染色体系部分材料在文献“Zuoetal.(2022)Identification and characterization of wheat-Aegilops comosa7M(7A)disomic substitution lines with stripe rust and powdery mildewresistance.Plant Disease.106：2663-2671”和“Zuo et al.(2023)Disomic 1M(1B)Triticum aestivum-Aegilops comosa substitution line with favorable proteinproperties.Journal of Agricultural and Food Chemistry.71:7258-7267”中公开过，其他材料可从四川农业大学小麦研究所获得。其中，5M单体附加系NAL-40的系谱来源为Langdon/PI 551070//CSph2a///BZ 1313////SM 1605。PI 551070为顶芒山羊草，Langdon为四倍体小麦，CSph2a、BZ 1313和SM 1605为六倍体小麦。该单体附加系由顶芒山羊草与四倍体小麦杂交染色体自然加倍后，再与三个六倍体小麦杂交获得复合杂交F1，最终在其自交F4代利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术鉴定得到，共43条染色体，包含42条来自小麦的染色体和1条顶芒山羊草的5M染色体。不同顶芒山羊草材料包括PI 551059、PI 551061和PI 551062，不同基因组的山羊草包括含C基因组的尾状山羊草PI 551139、U基因组的小伞山羊草CIae 29和D基因组的节节麦AS 60，不同的普通小麦-顶芒山羊草异染色体系包括含顶芒山羊草1M、2M、3M、5M和7M的不同材料，自交分离群体为5M染色体单体附加系NAL-40自交的F2代。
本发明前期研究发现，顶芒山羊草5M染色体可能含抗条锈病新基因，可提高小麦的条锈病抗性。但目前缺乏在小麦背景中检测顶芒山羊草5M染色体的技术手段。为此开展下述研究：
实施例1顶芒山羊草5M染色体特异分子标记开发
1、基因组DNA的提取和纯化
利用CTAB法分别提取顶芒山羊草、普通小麦-顶芒山羊草5M单体附加系及中国春的基因组DNA，具体操作步骤如下：
(1)用消毒过的剪刀将幼嫩叶片剪成小段，置于含有1颗钢珠的2ml EP管中；
(2)随后将其在液氮中冷冻10min，用高通量植物组织研磨器研磨1min，频率约为21Hz；
(3)样品磨好后，在EP管中加入600μL预热至65℃的2×CTAB提取液，快速震荡混匀，再置于65℃水浴1-2h，每隔10-15min轻摇一次使其充分反应；
(4)取出样品冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒混匀，直至上清液呈牛奶状；
(5)使用离心机12,000rpm离心10min，取500μL上清液置于1.5ml EP管中，加入500μL-20℃预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，在-20℃冰箱中放置1-2h，用牙签挑出析出的DNA，用70％和100％酒精各清洗1次，至DNA呈现白色，在通风橱中风干；
(6)待酒精全部挥发完毕后，在EP管中加入适量pH 8.0的1×TE，用Nanodrop DNA浓度检测仪测定DNA浓度，并用1％琼脂糖电泳检测DNA质量。
2、基于SLAF-seq技术获得特异序列标签
用SLAF-seq方法对顶芒山羊草PI551070、普通小麦-顶芒山羊草5M单体附加系NAL-40及中国春的基因组DNA进行测序(由北京百迈客生物科技有限公司完成)，得到各样品的序列标签。将PI551070和NAL-40测序后的SLAFs分别与中国春聚类，聚不到一起的序列再进行BLAST，留下序列相似度超过90％的SLAFs。再与中国春参考基因组、其他物种的核酸和蛋白质序列比较，留下相似度为0的序列。最终获得5M染色体的特异序列标签为65个。
3、顶芒山羊草5M染色体特异分子标记的开发
通过对不同材料获得的SLAF-seq序列进行聚类和对比分析，获得5M特异的候选SLAFs序列标签65个，进一步利用NCBI网站的在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计引物，设计成功41对。在擎科生物工程股份有限公司合成引物，用HAP(High affinity purification)方式纯化。将引物在二倍体顶芒山羊草、四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体、四倍体和六倍体小麦亲本及含5M染色体的普通小麦-顶芒山羊草渗入系中进行PCR扩增(扩增体系和程序见表1和表2)，获得11对引物在顶芒山羊草二倍体、四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体及普通小麦-顶芒山羊草5M染色体渗入系中有目标条带，在四倍体及六倍体小麦亲本中均无目标条带的，作为5M染色体特异的候选分子标记，其中图1为5M染色体特异分子标记5M-SF-14在顶芒山羊草及含顶芒山羊草5M的异染色体系中PCR条带，其中，1：顶芒山羊草PI551070；2：四倍体小麦-顶芒山羊草人工合成双二倍体STM(Langdon/PI551070)；3：NAL-40(普通小麦-顶芒山羊草5M单体附加系)；4：NAL-41(普通小麦-顶芒山羊草5M二体附加系)；5：Langdon；6：CSph2a；7：BZ1313；8：SM1605。在不同顶芒山羊草材料中扩增，结果表明11对引物均有一致条带(图2)。进一步在含不同M染色体(1M、2M、3M、5M和7M)的普通小麦-顶芒山羊草渗入系和含不同基因组的山羊草中进行PCR扩增，获得只在含5M染色体的普通小麦-顶芒山羊草渗入系和顶芒山羊草中有目标条带的7对引物(表3)作为5M染色体特异的分子标记(图3)。从7个标记中随机选取一个，在5M单体代换系NAL-40自交产生的F2群体进行PCR扩增，随机各选取3个含目标条带和无目标条带的单株进行FISH分析，验证分子标记的稳定性。如图4所示，随机选取标记5M-SF-31对5M单体附加系NAL-40自交的F2群体进行PCR扩增，共鉴定62个单株(D1-D62)，随机各选取3个无目标条带的单株D9、D15和D38以及3个有目标条带的单株D5、D31和D57使用FISH探针pSc119.2/pTa535(图4中b-d、e1、f1和g1)，pTa71/(CTT)12(图4中e2、f2和g2)进行FISH分析，结果表明D9、D15和D38不含5M染色体，D5、D31和D57含5M染色体，说明本发明设计的分子标记引物鉴定准确，具有稳定性。
4、PCR反应
以含5M染色体的普通小麦-顶芒山羊草异染色体系、亲本顶芒山羊草、四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体、四倍体和六倍体小麦为DNA模板，根据测序获得的顶芒山羊草染色体特异序列设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系和程序如表1和表2所示。
表1.PCR反应体系
| PCR反应组分 | 体积(μL) |
| 2×Taq Master Mix(诺唯赞) | 10 |
| ddH2O | 7 |
| 引物F(10μM) | 1 |
| 引物R(10μM) | 1 |
| DNA(150ng/μL) | 1 |
| 总计 | 20 |
表2.PCR反应程序
5、琼脂糖凝胶电泳及PCR反应产物分析
PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶，120V恒压下电泳20-30min，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，观察结果。若含5M染色体的普通小麦-顶芒山羊草异染色体系、顶芒山羊草和四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体有扩增条带，而四倍体和六倍体小麦无扩增条带，则认为此标记为候选的顶芒山羊草染色体特异分子标记。之后在不同的顶芒山羊草材料、含不同M染色体的普通小麦-顶芒山羊草异染色体系，不同基因组的山羊草和5M染色体的分离群体中验证标记的重复性、特异性及稳定性，获得顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记。本发明的7个5M染色体特异分子标记均具有良好的准确性、可靠性和特异性。7对顶芒山羊草5M染色体特异的分子标记引物如表3所示。图1为分子标记5M-SF-14的扩增结果，可以看出在普通小麦-顶芒山羊草5M相关的异染色体系、顶芒山羊草及四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体中均能扩增得到大小为500bp的条带，而在四倍体和六倍体小麦中无扩增条带。
表3. 7个顶芒山羊草5M染色体特异分子标记
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种检测顶芒山羊草5M染色体的分子标记引物，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQID NO：1-14所示的7对引物对。
2.一种检测顶芒山羊草5M染色体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的分子标记引物。
3.一种检测含有顶芒山羊草5M染色体的小麦渗入系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1-14所示的一对或多对引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的有无判断待测样品是否含有顶芒山羊草5M染色体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，若出现电泳条带，且条带大小为500bp，则待测样品含有顶芒山羊草5M染色体；若无电泳条带，则待测样品不含有顶芒山羊草5M染色体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：2×TaqMaster Mix 10μL、ddH2O 7μL、前引物1μL、后引物1μL和DNA 1μL。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性3min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸25s，35个循环；72℃维持延伸3min，12℃保温。
7.一种如权利要求1所述的分子标记引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定小麦是否含有顶芒山羊草5M染色体中的应用。
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| 利用RFLP分子标记鉴定小麦-顶芒山羊草异代换系;翁跃进，贾继增，董玉琛;遗传学报(03);全文 * |
| 小麦-顶芒山羊草2M染色体系的鉴定与评价;宫文萍;张伟;李豪圣;李光蓉;张玉梅;杨足君;刘成;刘建军;;核农学报(10);全文 * |
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