CN112725524A - 一组检测小麦近缘物种通用标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组检测小麦近缘物种的通用标记及其应用，属于作物分子生物学与遗传育种领域。建立的分子标记可以对小麦中是否含有外源染色体进行有效检测。本发明获得的特异分子标记不仅可用于小麦近缘物种的筛选、鉴定，还可以应用于辅助选育抗病小麦新品系/品种，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业化价值。

Description

一组检测小麦近缘物种通用标记及其应用
技术领域
本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及一组检测小麦近缘物种通用标记及其应用。
背景技术
小麦近缘物种中含有丰富的抗病、抗逆和抗虫等优异基因，是改良小麦抗病、抗逆等性状的珍贵基因库。随着小麦远缘杂交和染色体工程研究的深入开展，含抗病、抗逆等优异基因的外源染色体或染色体片段被导入小麦，创制出了一大批优良的中间材料，为丰富普通小麦的遗传基础和性状改良提供了重要的物质基础。
刘旭等（2000）利用RAPD引物对高大山羊草及对照进行分析，建立了可以用于检测小麦背景中高大山羊草染色体的RAPD标记。王春梅等（2007）利用STS引物对中国春、黑麦、普通小麦－黑麦1R－7R二体异附加系进行分析，建立了黑麦1R染色体特异STS标记。Zhang等（2012）根据小麦EST序列设计引物对小麦、簇毛麦以及小麦-簇毛麦渐渗系进行扩增，建立了簇毛麦5VS特异EST标记。Mattera等（2015）利用EST引物对智利大麦和小麦等材料进行扩增，建立了智利大麦7Hch染色体EST标记。Liu等（2016）利用一套小麦-拟斯卑尔脱山羊草附加系和代换系为材料，开发了拟斯卑尔脱山羊草S基因组染色体特异EST标记和SSR标记。
上述标记要么是建立了某一小麦近缘物种特异标记，要么是建立了小麦近缘物种某一条染色体（臂）特异分子标记。然而，目前可用于同时区分不同小麦近缘物种的分子标记，以及可同时用于检测小麦背景中不同近缘物种的通用标记还未见报道。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测小麦近缘物种通用标记缺乏的问题，本发明提供了一套能够快捷、有效、简便地检测小麦近缘物种的分子标记。
本专利通过筛选小麦A、B和D染色体共线性基因某一内含子三个亚基因组间长度差异超过10bp的区域，在该内含子上下游的外显子保守序列处设计引物，利用小麦为对照，小麦的近缘物种、小麦-近缘物种杂交种质等为材料，进行PCR扩增验证，建立了能检测小麦近缘物种的通用标记，对筛选鉴定小麦外缘材料、小麦-近缘物种杂交种质、分离群体以及选育含近缘物种血缘的小麦品系/品种均具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过自主筛选小麦A、B和D染色体共线性基因某一内含子三个亚基因组间长度差异超过10bp的区域，在该内含子上下游的外显子保守序列处设计引物，对小麦族黑麦属、簇毛麦属、大麦属、偃麦草属、山羊草属等物种进行PCR扩增验证，建立了能检测小麦近缘物种的通用标记。
本发明提供了一组检测小麦近缘物种的通用标记，其特征在于：为下列25对引物序列中的一对以上的组合，其碱基序列如下：
Figure 483999DEST_PATH_IMAGE001
Figure 144787DEST_PATH_IMAGE002
本发明提供一组检测小麦近缘物种的通用标记，可以在检测小麦近缘物种染色体、基因中应用。
所述的应用，其特征在于，所述的检测的步骤如下：
（1）以待测的普通小麦、小麦近缘物种和小麦-近缘物种杂交种质的基因组总DNA为模板，分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用PAGE凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与对照不同的特异多态性条带，则说明待测物种还有小麦外源染色体。
优选的，步骤（2）中所述的对照为中国春小麦。
优选的步骤（1）中所述的引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μLDNATaq聚合酶0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg2+的10×PCR缓冲液3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；
所述的PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。
优选的， 其特征在于步骤（1）中使用6% PAGE凝胶电泳进行检测。
以中国春、硬粒小麦－簇毛麦双二倍体、小麦－长穗偃麦草双二倍体、小麦－中间偃麦草部分双二倍体、小麦－多年生簇毛麦附加系、小麦－非洲黑麦双二倍体、小麦－中间偃麦草部分双二倍体、中国春－智利大麦双二倍体、圆锥小麦－顶芒山羊草双二倍体、圆锥小麦－单芒山羊草双二倍体、小麦－偏凸山羊草部分双二倍体、乌拉尔图小麦－沙融山羊草双二倍体、栽培一粒小麦－二角山羊草、小麦－无芒山羊草双二倍体、中国春－希尔斯山羊草双二倍体和小麦－尾状山羊草双二倍体为研究材料进行PCR扩增，结果发现，25对引物都可以在供试材料间扩增出明显多态性。不同引物在不同小麦远缘杂交种质中扩增出的多态性不完全相同，因此，这些多态性标记能应用于检测小麦背景的外源染色质。引物Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增结果如图3所示。
之前研究报道主要是利用RAPD、SSR、EST和PLUG标记鉴定小麦近缘物种染色体，要么是建立了某一小麦近缘物种特异标记，要么是建立了其某一条染色体或染色体臂分子标记，建立分子标记的比例从2.44%-32.86%不等（Said和Cabrera，2009；Liu等，2011；Zhao等，2013；刘晓明等，2016；Gong等，2017）。然而，可用于同时区分不同小麦近缘物种的分子标记，以及可同时用于检测小麦背景中不同近缘物种的通用标记还未见报道。本专利通过筛选小麦A、B和D染色体共线性基因某一内含子三个亚基因组间长度差异超过10bp的区域，在该内含子上下游的外显子保守序列处设计引物，进行PCR扩增验证，建立了能检测小麦近缘物种的通用标记，建立标记的比例为69.44%（25/36），远高于上述文献报道的获得标记的比例，并且建立的标记的应用范围更加广泛，不仅能筛选鉴定小麦外缘材料，还能鉴定小麦-近缘物种杂交种质，此外，对选育含近缘物种血缘的小麦品系/品种也具有重要意义。
有益效果：
本发明建立了用于检测小麦近缘物种的通用标记，提供了使用新标记检测小麦是否含有外源染色体的新方法。因为小麦近缘物种含有一些优异的抗病、抗逆基因，因此，本发明获得的特异分子标记对筛选鉴定小麦外缘材料、杂交分离群体以及选育抗病小麦品系/品种均具有重要意义。
附图说明
图1是引物Triad_24（A）、Triad_82（B）、Triad_199（C）、Triad_220（D）、Triad_291（E）和Triad_352（F）在普通小麦中扩增产物的PAGE电泳检测图。图A-F分别为引物Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增产物在6% PAGE凝胶电泳的检测结果。泳道M为Marker（DL2000），泳道1-7分别代表中国春（1）、济麦21（2）、济麦22（3）、济麦23（4）、济麦44（5）、济麦229（6）和济麦262（7）。
图2是引物Triad_24（A）、Triad_82（B）、Triad_199（C）、Triad_220（D）、Triad_291（E）和Triad_352（F）在小麦近缘物种中扩增产物的PAGE电泳检测图。图A-F分别为引物Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增产物在6% PAGE凝胶电泳的检测结果。泳道M为Marker（DL2000），泳道1-24分别代表中国春（1）、野生一粒小麦（2-4）、乌拉尔图小麦（5-7）、黑麦（8-10）、拟斯卑尔脱山羊草（11-13）、沙融山羊草（14-16）、高大山羊草（17-18）、小伞山羊草（19-20）、簇毛麦（21-22）以及智利大麦（23-24）。
图3是引物Triad_24（A）、Triad_82（B）、Triad_199（C）、Triad_220（D）、Triad_291（E）和Triad_352（F）在小麦远缘杂交种质中扩增产物的PAGE电泳检测图。图A-F分别为引物Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增产物在6% PAGE凝胶电泳的检测结果。泳道M为Marker（DL2000），泳道1-31分别代表硬粒小麦－簇毛麦双二倍体（1-3）、小麦－长穗偃麦草双二倍体（4-5）、小麦－中间偃麦草部分双二倍体（6-7）、小麦－多年生簇毛麦附加系（8-9）、小麦－非洲黑麦双二倍体（10-11）、小麦－中间偃麦草部分双二倍体（12-13）、中国春－智利大麦双二倍体（14-15）、圆锥小麦－顶芒山羊草双二倍体（16）、圆锥小麦－单芒山羊草双二倍体（17-18）、小麦－偏凸山羊草部分双二倍体（19-20）、乌拉尔图小麦－沙融山羊草双二倍体（21-22）、栽培一粒小麦－二角山羊草（23-24）、小麦－无芒山羊草双二倍体（25-26）、中国春－希尔斯山羊草双二倍体（27-28）、小麦－尾状山羊草双二倍体（29-30）和中国春（31）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所用的植物材料（表1）和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、材料
材料的种质库编号及其染色体组等信息列于表1。
表1 试验材料表
序号 编号 材料 染色体组
1 CS 中国春 AABBDD
2 JM21 济麦21 AABBDD
3 JM22 济麦22 AABBDD
4 JM23 济麦23 AABBDD
5 JM44 济麦44 AABBDD
6 JM229 济麦229 AABBDD
7 JM262 济麦262 AABBDD
8 PI 277123 野生一粒小麦 A<sup>b</sup>A<sup>b</sup>
9 PI 352502 野生一粒小麦 A<sup>b</sup>A<sup>b</sup>
10 PI 355522 野生一粒小麦 A<sup>b</sup>A<sup>b</sup>
11 PI 428182 乌拉尔图小麦 A<sup>u</sup>A<sup>u</sup>
12 PI 428253 乌拉尔图小麦 A<sup>u</sup>A<sup>u</sup>
13 PI 428254 乌拉尔图小麦 A<sup>u</sup>A<sup>u</sup>
14 PI 542470 黑麦 RR
15 PI 535196 黑麦 RR
16 PI 525207 黑麦 RR
17 PI 542243 拟斯卑尔脱山羊草 SS
18 PI 542258 拟斯卑尔脱山羊草 SS
19 PI 554305 拟斯卑尔脱山羊草 SS
20 PI 584382 沙融山羊草 S<sup>sh</sup>S<sup>sh</sup>
21 PI 584385 沙融山羊草 S<sup>sh</sup>S<sup>sh</sup>
22 PI 584391 沙融山羊草 S<sup>sh</sup>S<sup>sh</sup>
23 AE 133 高大山羊草 S<sup>l</sup>S<sup>l</sup>
24 AE 135 高大山羊草 S<sup>l</sup>S<sup>l</sup>
25 PI 560771 小伞山羊草 UU
26 AE 1070 小伞山羊草 UU
27 PI 639750 簇毛麦 VV
28 PI 368884 簇毛麦 VV
29 NGB90118 智利大麦 H<sup>ch</sup>H<sup>ch</sup>
30 NGB90119 智利大麦 H<sup>ch</sup>H<sup>ch</sup>
31 XX030 中国春－智利大麦双二倍体 AABBDDH<sup>ch</sup>H<sup>ch</sup>
32 N-5349 硬粒小麦－簇毛麦双二倍体 AABBVV
33 A6-4 小麦－多年生簇毛麦附加系 AABBDD+1对V<sup>b</sup>
34 N-5350 小麦－长穗偃麦草双二倍体 AABBDDEE
35 7047 小麦－中间偃麦草部分双二倍体 －
36 15n-21 小麦－中间偃麦草部分双二倍体 －
37 N-5396 小麦－非洲黑麦双二倍体 AABBDDR<sup>a</sup>R<sup>a</sup>
38 TA3402 圆锥小麦－顶芒山羊草双二倍体 AABBMM
39 TA3401 圆锥小麦－单芒山羊草双二倍体 AABBNN
40 TA3404 小麦－偏凸山羊草部分双二倍体 －
41 TA3398 乌拉尔图小麦－沙融山羊草双二倍体 A<sup>u</sup>A<sup>u</sup>S<sup>sh</sup>S<sup>sh</sup>
42 TA3430 栽培一粒小麦－二角山羊草 A<sup>m</sup>A<sup>m</sup>S<sup>b</sup>S<sup>b</sup>
43 TA8024 小麦－无芒山羊草双二倍体 AABBDDTT
44 TA3371 中国春－希尔斯山羊草双二倍体 AABBDDS<sup>s</sup>S<sup>s</sup>
45 TA3368 小麦－尾状山羊草双二倍体 AABBCCDD
注：－表示染色体组暂未获得准确信息。
2、序列分析与选择
利用BLASTN对中国春小麦参考基因组及其注释信息IWGSC RefSeq Annotationv1.0中的A:B:D=1:1:1同源基因信息进行分析并保留微观共线性良好并且均来自相同同源群的基因（参数设置e-value≤1e-10），只保留含有内含子并且A、B和D亚基因组之间相对应内含子大小差别均超过10bp的基因。在上一步筛选出的内含子信息基础上，分别获取每个内含子上下游的外显子序列，长度小于50bp外显子序列将被去除。
3、引物设计与合成
利用Primer3（https://github.com/primer3-org/primer3）分别在上下游外显子序列中设计正向和反向PCR引物，PCR引物的长度范围20-23bp。分别对每组内含子中A、B和D三个亚基因组的正向或反向引物去重，然后以组为单位分别统计正向或反向引物重复出现的次数，只保留重复次数为3, 即在A、B和D三个亚基因组中均完全匹配的引物。利用BLASTN对上述引物进行整个基因组水平的特异性检测，数据库为中国春参考基因组TGAC v1.39，E-value设置为10，输出格式设置为6；保留BLASTN输出中100%匹配（匹配长度与引物长度相同）的结果，并统计每条引物匹配到基因组上的位置数目；只保留匹配位置数目为3的引物，即在每个亚基因组上有且只有唯一匹配的引物。利用BLASTN对上述引物在基因组上的位置进行检索，去除未知染色体（ChrUn）以及不能成对的引物（即只有正向或只有反向引物）。利用A基因组的序列信息，选取每个基因中PCR产物最小或正反向引物相距最近的组合。将设计的引物序列递交给由青岛擎科天成生物技术有限公司合成。
4、DNA提取及PCR扩增
基因组DNA的提取方法参照Liu等（2017），用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取液的完整性和浓度。30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNApolymerase 0.3μL，200μM的dNTPs0.3μL，含Mg2+的10×PCR buffer 3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL。PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。
5、PCR产物电泳及检测
PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶（ polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）电泳检测。PAGE胶每100mL的配置包括30%丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide，Acr-Bis，29:1）20mL，5×TBE缓冲液20mL，10%过硫酸铵溶液（Ammonium persulphate，AP）1mL，四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED）40μl，最后用无菌双蒸馏水补充至100mL。电泳完后，PAGE胶在1μg/mL的溴化乙锭溶液中染色30min，最后在GDS-Gel Dol2000紫外凝胶成像系统下扫描照相。
6、检测小麦近缘物种的通用标记的建立
通过生物信息学筛选，共获得符合要求的引物2189对，随机选取并合成其中的36对用于引物筛选验证和标记开发。以济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229和济麦262为材料，对合成的36对引物扩增效果进行筛选验证。结果发现，36对引物均能在供试小麦中扩增出相同的2-3条清晰DNA条带，即这些引物不能在小麦间扩增出多态条带。
为了研究合成36对引物在小麦族物种间是否可以扩增出多态性，以中国春、野生一粒小麦、乌拉尔图小麦、黑麦、拟斯卑尔脱山羊草、沙融山羊草、高大山羊草、小伞山羊草、簇毛麦和智利大麦为研究材料进行PCR扩增，结果发现，36对引物中有25对可以在供试材料间扩增出明显多态性。不同引物在不同物种间扩增出的多态性不完全相同，这些引物不仅可以在同一物种不同亚种间扩增出多态性，还能在不同物种间扩增出多态性，更能在小麦与小麦近缘植物间扩增出多态性，因此，这些多态性标记可能能应用于检测小麦背景的外源染色质。筛选出的25对引物信息如表2所示。引物 Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增结果如图2所示。
表2 标记名称及引物列表
序号 标记名称/上、下游 扩增内含子 引物序列 SEQ ID
1 Triad_3 上游引物序列 内含子_8 CCTTCGCATGCTCTGTCCTT SEQ ID NO.1
2 Triad_3 下游引物序列 内含子_8 TAGCGATTGAGGGCGTCCAA SEQ ID NO.2
3 Triad_17 上游引物序列 内含子_2 TTTGGCGGCTTCCTTTGATAGC SEQ ID NO.3
4 Triad_17 下游引物序列 内含子_2 AGAAGTGCGCAACGTTTCCG SEQ ID NO.4
5 Triad_24 上游引物序列 内含子_3 CCAGCAGAACCCATCGCTGTA SEQ ID NO.5
6 Triad_24 下游引物序列 内含子_3 CACTGCGGTGCAAGGCATG SEQ ID NO.6
7 Triad_74 上游引物序列 内含子_4 TGGTGCTTATGGGGCTCCG SEQ ID NO.7
8 Triad_74 下游引物序列 内含子_4 GTCCCGCACCAAAAGGTAGC SEQ ID NO.8
9 Triad_81 上游引物序列 内含子_5 AGGTCCCCACTCTACGAAGTTAA SEQ ID NO.9
10 Triad_81 下游引物序列 内含子_5 AGGAGAGGTGGACCCAACAC SEQ ID NO.10
11 Triad_82 上游引物序列 内含子_2 CCCAGAGCCAGATCTCAGCAA SEQ ID NO.11
12 Triad_82 下游引物序列 内含子_2 GGAGGACCAGCTTGCATGGA SEQ ID NO.12
13 Triad_114 上游引物序列 内含子_3 GTTCAGGCCTCGTCCTCAGC SEQ ID NO.13
14 Triad_114 下游引物序列 内含子_3 TCTGTCCCCTAGCCTCTCCT SEQ ID NO.14
15 Triad_128 上游引物序列 内含子_13 CGCATAACATGGGGCTTGGGA SEQ ID NO.15
16 Triad_128 下游引物序列 内含子_13 TAAGTGCCGTGCGGAGTCC SEQ ID NO.16
17 Triad_137 上游引物序列 内含子_5 AGGACTTCATGTGCTTGGGC SEQ ID NO.17
18 Triad_137 下游引物序列 内含子_5 AGTCTCTCGAGTTCACGACTTCT SEQ ID NO.18
19 Triad_181 上游引物序列 内含子_6 AGGCACGCCTTTATCGAGGT SEQ ID NO.19
20 Triad_181 下游引物序列 内含子_6 AATATTCCAAGGGCCAGCGC SEQ ID NO.20
21 Triad_188 上游引物序列 内含子_3 CCTCCGTAACATTCTCACGCAT SEQ ID NO.21
22 Triad_188 下游引物序列 内含子_3 CACTTGTCCACGCTGCAACT SEQ ID NO.22
23 Triad_199 上游引物序列 内含子_4 CAAGCGTTGCCACAGTGATTT SEQ ID NO.23
24 Triad_199 下游引物序列 内含子_4 CGCAGGTGTCCACAGGTATACA SEQ ID NO.24
25 Triad_201 上游引物序列 内含子_3 ACACGCCCAATTGAAGCCTCT SEQ ID NO.25
26 Triad_201 下游引物序列 内含子_3 TAGAGACGCGCTTGTTGCAC SEQ ID NO.26
27 Triad_208 上游引物序列 内含子_3 CAGAGGTTGAGGTCGCTCCA SEQ ID NO.27
28 Triad_208 下游引物序列 内含子_3 TGTTCAACACCCACGAGGACC SEQ ID NO.28
29 Triad_220 上游引物序列 内含子_2 TGCGCGGGTTATATACTGAGGAG SEQ ID NO.29
30 Triad_220 下游引物序列 内含子_2 ATGTGCTCAGTGTTTTATGCGGG SEQ ID NO.30
31 Triad_265 上游引物序列 内含子_2 AGCTTGACTTTGTGATTGCCGAT SEQ ID NO.31
32 Triad_265 下游引物序列 内含子_2 CCGGGCAGTTGTGGAAGAAT SEQ ID NO.32
33 Triad_278 上游引物序列 内含子_5 GGCTAAGTGTGCCGAGGAGT SEQ ID NO.33
34 Triad_278 下游引物序列 内含子_5 ACACCCCTATTCTCTGGAACACC SEQ ID NO.34
35 Triad_291 上游引物序列 内含子_3 AGTCATCGACGATCGCCTTGT SEQ ID NO.35
36 Triad_291 下游引物序列 内含子_3 CACCGTGCTTGTTGGCAACT SEQ ID NO.36
37 Triad_293 上游引物序列 内含子_2 TGCTTTCAGGATGGCACTGC SEQ ID NO.37
38 Triad_293 下游引物序列 内含子_2 GCCTCAGGTGAAGGCTTTTCTG SEQ ID NO.38
39 Triad_340 上游引物序列 内含子_12 TGGGAAGCCAGCAACCACAT SEQ ID NO.39
40 Triad_340 下游引物序列 内含子_12 GTACAAGCGAGGCACAGATTCAT SEQ ID NO.40
41 Triad_341 上游引物序列 内含子_2 CGCACCAGGTTTCACGGAAA SEQ ID NO.41
42 Triad_341 下游引物序列 内含子_2 CTGACATTATTGCCACGAGGAGC SEQ ID NO.42
43 Triad_352 上游引物序列 内含子_2 GGCTGGTCAGTCTCTTGCACTA SEQ ID NO.43
44 Triad_352 下游引物序列 内含子_2 CCTGGCATGGTTGGTCTGAT SEQ ID NO.44
45 Triad_379 上游引物序列 内含子_2 GCCTCCGACCTCTCTCGATG SEQ ID NO.45
46 Triad_379 下游引物序列 内含子_2 AGAGTCAGGTCGCATAGCCA SEQ ID NO.46
47 Triad_408 上游引物序列 内含子_2 TACTCCGCCGGGGACTTCTC SEQ ID NO.47
48 Triad_408 下游引物序列 内含子_2 AGAGTGCTAACATCAGGGCAGT SEQ ID NO.48
49 Triad_440 上游引物序列 内含子_3 TCTTGATGTGTTCGGGCAAACG SEQ ID NO.49
50 Triad_440 下游引物序列 内含子_3 GATGGCCCTCTACGAGCAGT SEQ ID NO.50
为了验证筛选出25对引物扩增出多态性标记在检测小麦背景的外源染色质的可行性，以中国春、硬粒小麦－簇毛麦双二倍体、小麦－长穗偃麦草双二倍体、小麦－中间偃麦草部分双二倍体、小麦－多年生簇毛麦附加系、小麦－非洲黑麦双二倍体、小麦－中间偃麦草部分双二倍体、中国春－智利大麦双二倍体、圆锥小麦－顶芒山羊草双二倍体、圆锥小麦－单芒山羊草双二倍体、小麦－偏凸山羊草部分双二倍体、乌拉尔图小麦－沙融山羊草双二倍体、栽培一粒小麦－二角山羊草、小麦－无芒山羊草双二倍体、中国春－希尔斯山羊草双二倍体和小麦－尾状山羊草双二倍体为研究材料进行PCR扩增，结果发现，25对引物都可以在供试材料间扩增出明显多态性。不同引物在不同小麦远缘杂交种质中扩增出的多态性不完全相同，因此，这些多态性标记能应用于检测小麦背景的外源染色质。引物 Triad_24、Triad_82、Triad_199、Triad_220、Triad_291和Triad_352的扩增结果如图3所示。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
序列表
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 一组检测小麦近缘物种通用标记及其应用
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttcgcatg ctctgtcctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagcgattga gggcgtccaa 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttggcggct tcctttgata gc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaagtgcgc aacgtttccg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagcagaac ccatcgctgt a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactgcggtg caaggcatg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtgcttat ggggctccg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcccgcacc aaaaggtagc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggtccccac tctacgaagt taa 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggagaggtg gacccaacac 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccagagcca gatctcagca a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggaggaccag cttgcatgga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttcaggcct cgtcctcagc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tctgtcccct agcctctcct 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcataacat ggggcttggg a 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taagtgccgt gcggagtcc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggacttcat gtgcttgggc 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtctctcga gttcacgact tct 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aggcacgcct ttatcgaggt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aatattccaa gggccagcgc 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctccgtaac attctcacgc at 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacttgtcca cgctgcaact 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caagcgttgc cacagtgatt t 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgcaggtgtc cacaggtata ca 22
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acacgcccaa ttgaagcctc t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tagagacgcg cttgttgcac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cagaggttga ggtcgctcca 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgttcaacac ccacgaggac c 21
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgcgcgggtt atatactgag gag 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgtgctcag tgttttatgc ggg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agcttgactt tgtgattgcc gat 23
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccgggcagtt gtggaagaat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggctaagtgt gccgaggagt 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acacccctat tctctggaac acc 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtcatcgac gatcgccttg t 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caccgtgctt gttggcaact 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgctttcagg atggcactgc 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcctcaggtg aaggcttttc tg 22
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgggaagcca gcaaccacat 20
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtacaagcga ggcacagatt cat 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cgcaccaggt ttcacggaaa 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctgacattat tgccacgagg agc 23
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggctggtcag tctcttgcac ta 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cctggcatgg ttggtctgat 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcctccgacc tctctcgatg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agagtcaggt cgcatagcca 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tactccgccg gggacttctc 20
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
agagtgctaa catcagggca gt 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcttgatgtg ttcgggcaaa cg 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gatggccctc tacgagcagt 20

Claims (6)

1.一组检测小麦近缘物种的通用标记，其特征在于：为下列25对引物序列中的一对以上的组合，其碱基序列如下：
序号 标记名称/上、下游 扩增内含子 引物序列 SEQ ID 1 Triad_3 上游引物序列 内含子_8 CCTTCGCATGCTCTGTCCTT SEQ ID NO.1 2 Triad_3 下游引物序列 内含子_8 TAGCGATTGAGGGCGTCCAA SEQ ID NO.2 3 Triad_17 上游引物序列 内含子_2 TTTGGCGGCTTCCTTTGATAGC SEQ ID NO.3 4 Triad_17 下游引物序列 内含子_2 AGAAGTGCGCAACGTTTCCG SEQ ID NO.4 5 Triad_24 上游引物序列 内含子_3 CCAGCAGAACCCATCGCTGTA SEQ ID NO.5 6 Triad_24 下游引物序列 内含子_3 CACTGCGGTGCAAGGCATG SEQ ID NO.6 7 Triad_74 上游引物序列 内含子_4 TGGTGCTTATGGGGCTCCG SEQ ID NO.7 8 Triad_74 下游引物序列 内含子_4 GTCCCGCACCAAAAGGTAGC SEQ ID NO.8 9 Triad_81 上游引物序列 内含子_5 AGGTCCCCACTCTACGAAGTTAA SEQ ID NO.9 10 Triad_81 下游引物序列 内含子_5 AGGAGAGGTGGACCCAACAC SEQ ID NO.10 11 Triad_82 上游引物序列 内含子_2 CCCAGAGCCAGATCTCAGCAA SEQ ID NO.11 12 Triad_82 下游引物序列 内含子_2 GGAGGACCAGCTTGCATGGA SEQ ID NO.12 13 Triad_114 上游引物序列 内含子_3 GTTCAGGCCTCGTCCTCAGC SEQ ID NO.13 14 Triad_114 下游引物序列 内含子_3 TCTGTCCCCTAGCCTCTCCT SEQ ID NO.14 15 Triad_128 上游引物序列 内含子_13 CGCATAACATGGGGCTTGGGA SEQ ID NO.15 16 Triad_128 下游引物序列 内含子_13 TAAGTGCCGTGCGGAGTCC SEQ ID NO.16 17 Triad_137 上游引物序列 内含子_5 AGGACTTCATGTGCTTGGGC SEQ ID NO.17 18 Triad_137 下游引物序列 内含子_5 AGTCTCTCGAGTTCACGACTTCT SEQ ID NO.18 19 Triad_181 上游引物序列 内含子_6 AGGCACGCCTTTATCGAGGT SEQ ID NO.19 20 Triad_181 下游引物序列 内含子_6 AATATTCCAAGGGCCAGCGC SEQ ID NO.20 21 Triad_188 上游引物序列 内含子_3 CCTCCGTAACATTCTCACGCAT SEQ ID NO.21 22 Triad_188 下游引物序列 内含子_3 CACTTGTCCACGCTGCAACT SEQ ID NO.22 23 Triad_199 上游引物序列 内含子_4 CAAGCGTTGCCACAGTGATTT SEQ ID NO.23 24 Triad_199 下游引物序列 内含子_4 CGCAGGTGTCCACAGGTATACA SEQ ID NO.24 25 Triad_201 上游引物序列 内含子_3 ACACGCCCAATTGAAGCCTCT SEQ ID NO.25 26 Triad_201 下游引物序列 内含子_3 TAGAGACGCGCTTGTTGCAC SEQ ID NO.26 27 Triad_208 上游引物序列 内含子_3 CAGAGGTTGAGGTCGCTCCA SEQ ID NO.27 28 Triad_208 下游引物序列 内含子_3 TGTTCAACACCCACGAGGACC SEQ ID NO.28 29 Triad_220 上游引物序列 内含子_2 TGCGCGGGTTATATACTGAGGAG SEQ ID NO.29 30 Triad_220 下游引物序列 内含子_2 ATGTGCTCAGTGTTTTATGCGGG SEQ ID NO.30 31 Triad_265 上游引物序列 内含子_2 AGCTTGACTTTGTGATTGCCGAT SEQ ID NO.31 32 Triad_265 下游引物序列 内含子_2 CCGGGCAGTTGTGGAAGAAT SEQ ID NO.32 33 Triad_278 上游引物序列 内含子_5 GGCTAAGTGTGCCGAGGAGT SEQ ID NO.33 34 Triad_278 下游引物序列 内含子_5 ACACCCCTATTCTCTGGAACACC SEQ ID NO.34 35 Triad_291 上游引物序列 内含子_3 AGTCATCGACGATCGCCTTGT SEQ ID NO.35 36 Triad_291 下游引物序列 内含子_3 CACCGTGCTTGTTGGCAACT SEQ ID NO.36 37 Triad_293 上游引物序列 内含子_2 TGCTTTCAGGATGGCACTGC SEQ ID NO.37 38 Triad_293 下游引物序列 内含子_2 GCCTCAGGTGAAGGCTTTTCTG SEQ ID NO.38 39 Triad_340 上游引物序列 内含子_12 TGGGAAGCCAGCAACCACAT SEQ ID NO.39 40 Triad_340 下游引物序列 内含子_12 GTACAAGCGAGGCACAGATTCAT SEQ ID NO.40 41 Triad_341 上游引物序列 内含子_2 CGCACCAGGTTTCACGGAAA SEQ ID NO.41 42 Triad_341 下游引物序列 内含子_2 CTGACATTATTGCCACGAGGAGC SEQ ID NO.42 43 Triad_352 上游引物序列 内含子_2 GGCTGGTCAGTCTCTTGCACTA SEQ ID NO.43 44 Triad_352 下游引物序列 内含子_2 CCTGGCATGGTTGGTCTGAT SEQ ID NO.44 45 Triad_379 上游引物序列 内含子_2 GCCTCCGACCTCTCTCGATG SEQ ID NO.45 46 Triad_379 下游引物序列 内含子_2 AGAGTCAGGTCGCATAGCCA SEQ ID NO.46 47 Triad_408 上游引物序列 内含子_2 TACTCCGCCGGGGACTTCTC SEQ ID NO.47 48 Triad_408 下游引物序列 内含子_2 AGAGTGCTAACATCAGGGCAGT SEQ ID NO.48 49 Triad_440 上游引物序列 内含子_3 TCTTGATGTGTTCGGGCAAACG SEQ ID NO.49 50 Triad_440 下游引物序列 内含子_3 GATGGCCCTCTACGAGCAGT SEQ ID NO.50
。
2.根据权利要求1所述的一组检测小麦近缘物种的通用标记的应用，其特征在于：在检测小麦近缘物种染色体、基因中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测的步骤如下：
（1）以待测的普通小麦、小麦近缘物种和小麦-近缘物种杂交种质的基因组总DNA为模板，分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用PAGE凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与对照不同的特异多态性条带，则说明待测物种还有小麦外源染色体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述的对照为中国春小麦。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μLDNATaq聚合酶0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg2+的10×PCR缓冲液3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；
所述的PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1）中使用6% PAGE凝胶电泳进行检测。
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