CN113999934B - 水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于作物分子遗传育种领域，涉及水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记及其应用。申请人对Pik基因进行重测序，通过序列多态性分析发现Pik‑1起始密码子下游806位、901位和4210位核苷酸类型组成的身份代码，即3个SNP，可以有效识别Pik、Pike、Pi1、Pikm和Piks。本发明提供的分子标记可对Pik位点等位基因类型快速筛查，且只需要经过PCR和电泳检测即可获得准确结果，具有高通量、低成本的特点。

Description

水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物分子遗传育种领域，涉及水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记及其应用。
背景技术
水稻是我国主要粮食作物之一，其高产稳产对于维护我国粮食安全具有重要意义。水稻生长过程中会遭遇多种病、虫的为害，其中，稻瘟病在水稻生长发育的各个时期均可发生，且具有流行性强、发病面积广的特点。传统防控稻瘟病主要依赖于杀真菌剂，但长期使用药物会使病原菌产生抗药性，同时会造成环境污染不利于可持续发展，育种实践表明利用优异抗性资源及基因培育具有广谱抗病能力的水稻新品种是防治稻瘟病经济、高效且环境友好的方法。
目前通过图位克隆、反向遗传学等方法，从水稻中已经鉴定到了100多个抗稻瘟病基因，其中有30多个基因已经被克隆，这些基因具有成簇分布的特点，在水稻第6、11、12号染色体上各分布着一个基因簇。其中，11号染色体长臂末端的基因簇中存在着一个特殊的抗性位点Pik，该位点已克隆了7个具有广谱抗性的抗稻瘟病基因(Pik、Pike、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)，这些等位基因的抗性均由2个紧密连锁但转录方向相反的CC-NBS-LRR类基因(Pik-1和Pik-2)共同决定。对比抗性品种Kusabue(Pik)、Tsuyuake(Pikm)、K60(Pikp)等Pik位点功能性等位基因序列和感病品种日本晴非功能性等位基因DNA序列发现，Pik位点可被分为K-单元型和N-单元型(Zhai et al.2012,New Phytologist 189:321-334)，目前已经克隆的具有抗病功能的等位基因Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh均属于K-单元型，在K-单元型中进一步存在KM亚单元型(Pik、Pike、Pi1、Pikm和Piks)及KH亚单元型(Pikp和Pikh)的分化。利用来源于我国湖南省、江西省等地的215个单孢进行抗谱分析，发现Pike的抗病频率高达86.1％，Pikm和Pi1的抗病频率也分别达到了50.2％和48.4％(Chenet al.2015,Molecular breeding 35:117)。生产实践也表明，Pik、Pi1等基因对我国很多稻瘟病生理小种均具有较强的抗性，尤其对我国南方稻区。因此，Pik位点抗病基因在水稻抗病育种中具有重要的应用价值。
在水稻的抗病育种中，筛选出含有KM亚单元型功能性等位基因(Pik、Pike、Pikm、Piks或Pi1)的抗原材料，需要采用等位型分析的方法，即利用不同的稻瘟病菌单孢对抗原材料进行进行接种并分析其抗谱差异从而识别不同等位型，但稻瘟病的发生易受到环境因素影响，且遗传背景中其他抗性基因在抗谱上会与Pik、Pike、Pikm、Piks或Pi1有一定的交叉，该方法耗时长，操作繁琐，且不足以准确、真实地反映出基因型。而利用测序技术对现有材料进行测序虽然准确性高，但是要经历PCR扩增、凝胶检测、克隆、测序、序列比对分析等过程，耗时长、成本高、效率低。随着分子标记技术的发展，利用分子标记对基因进行鉴别已成为抗病育种中的常用方法。对于Pik位点，华南农业大学团队曾经开发出了Piks的鉴别标记(201210118460.5)，该套分子标记包含了3个dCAPS标记，通过3个dCAPS标记的检测结果对Piks进行识别，检测过程需经过PCR、酶切、聚丙烯酰胺凝胶检测；武汉大学的科研团队利用Pike中特异性的SNP开发出了检测Pike的dCAPS分子标记d-G1328C和d-A3017T(201410794672.4；Chen et al.2015,Molecular breeding 35:117)，但最近的研究表明，Pikg-1编码区1328位及Pikg-2编码区3017位核苷酸类型与Pike相同(Meng et al.2021,Molecular Genetics and Genomics 296:939-952)，因此该分子标记检测结果需要进一步验证；华南农业大学团队最近公开了一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等位基因家族的技术体系(CN202110644560.0)，该套分子标记通过三级检测能够识别Pik、Pikm、Piks、Pi1、Pikp、Pikh等9个等位基因，但该套标记中针对每个等位基因均需要单独利用等位基因特异性的1-4个dCAPS标记进行检测，该方法要经过PCR、酶切、电泳检测等过程；针对Pik位点上设计的其他相关分子标记(202011566147.9；201810055528.7；张羽etal.2014,四川农业大学学报32:252-259等)均不能对等位基因类型进行识别。在本发明中，申请人提供了一套精准、高效识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1的分子标记，该套标记共包含3个分子标记，且识别过程只需要经过PCR扩增和凝胶检测，该方法简便快捷、成本低廉，可广泛应用于水稻种质资源Pik等位基因鉴定及抗稻瘟病种质筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供了水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记引物组，共包含12条引物，利用该引物组，可以对Pik位点中3个SNP位点上的核苷酸类型进行检测，进而筛选出含有Pik、Pike、Pikm、Piks或Pi1的水稻种质资源。
本发明的另一个目的在于提供了鉴别水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因类型中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
申请人对Pik基因进行重测序，序列多态性分析发现Pik-1起始密码子下游806位、901位和4210位核苷酸类型组成的身份代码，即3个SNP，可以有效识别Pik、Pike、Pi1、Pikm和Piks。在此基础上，申请人设计了能够准确识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1的分子标记引物：
水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记引物组，包括：
T806G-F：ATGGTACCGGTGGATCTCGA
T806G-R：CAAGAGTCTCTGTTAGATTGGGACT
806G-F：TCGCAGGTGACCTAAGAGATGAT
806T-R：CCATCACCGACCACCACTTCC；
T901C-F：GTACCGGTGGATCTCGATTC
T901C-R：ATGGTGTGCTAAGTGTATCAGTTAC
901C-F：GTTGCTGGAGGTCAGCATAGC
901T-R：CTCCTTCACATCTTCCATTA
T4210G-1F：TAATCGATGACATTTGGCATT
T4210G-1R：CCTCAGATAAAGAGGAAGATGG
4210G-R：TGCTATCCTCCAAGACAAGGATCA
4210T-F：GGATCTAGATAATAATGATGCATT。
本发明的保护内容还包括：上述引物组在鉴别水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因类型中的应用，可对含有Pik、Pike、Pikm、Piks或Pi1的水稻种质资源进行鉴定筛选。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、申请人对Pik基因进行重测序，序列多态性分析发现Pik-1起始密码子下游806位、901位和4210位核苷酸类型组成的身份代码，即3个SNP，可以有效识别Pik、Pike、Pi1、Pikm和Piks。在此基础上，申请人设计了能够准确识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1的分子标记，特异性强。
2、本发明在两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改进创新，通过在内引物中引入错配碱基，提升了内引物对SNP位点碱基类型识别的特异性。
3、本发明提供的分子标记可对Pik位点等位基因类型快速筛查，且只需要经过PCR和电泳检测即可获得准确结果，具有高通量、低成本的特点。传统的等位基因识别需要水稻材料种植于特定的环境中，利用多个单孢进行接种鉴定进而分析其抗谱，成本高、周期长；利用测序方法对特定基因进行检测，则需经过PCR扩增、电泳检测、克隆等一系列过程，成本高、效率低；针对SNP设计的dCAPS标记需要经过PCR扩增、酶切、电泳检测等过程，操作繁琐、成本高。
附图说明
图1为分子标记T806G优化及结果验证琼脂糖凝胶电泳图；
其中：a：引物组合T806G-1F/1R、806G-1F和806T-1R梯度PCR扩增Pik(泳道1-12)和Pi1(泳道13-24)的检测电泳图：温度梯度范围为50-70℃；
b：引物组合T806G-F/R、806G-F和806T-R梯度PCR扩增Pik(泳道1-12)和Pi1(泳道13-24)的检测电泳图：温度梯度范围为50-70℃；
c：分子标记T806G引物组合T806G-F/R、806G-F/R识别等位基因的电泳检测结果：M：DL2000(TaKaRa，Janpan)；1：湘早143(Pike)；2：IRBLkm(Pikm)；3：IRBLks-F5(Piks)；4：IRBLk-ka(Pik)；5：IRBL1-CL(Pi1)；6：IRBLkp-K60(Pikp)；7：IRBLkh-K3(Pikh)。
图2为分子标记T901C优化及结果验证琼脂糖凝胶电泳图；
其中：a：引物组合T901C-1F/1R、901C-1F和901T-1R梯度PCR扩增Pik(泳道1-12)和Piks(泳道13-24)的检测电泳图，温度梯度范围为50-70℃；
b：引物组合T901C-F/R、901C-2F和901T-2R梯度PCR扩增Pik(泳道1-12)和Piks(泳道13-24)的检测电泳图，温度梯度范围为50-70℃；
c：T901C-F/R、901C-F和901T-R梯度PCR扩增Pik(泳道1-12)和Piks(泳道13-24)的检测电泳图，温度梯度范围为50-70℃；
d：分子标记T901C引物T901C-F/R、901C-F/R识别等位基因的电泳检测结果，M：DL2000(TaKaRa，Janpan)；1：湘早143(Pike)；2：IRBLks-F5(Piks)；3：IRBLkm(Pikm)；4：IRBLk-ka(Pik)；5：IRBL1-CL(Pi1)；6：IRBLkp-K60(Pikp)；7：IRBLkh-K3(Pikh)。
图3为检测分子标记T4210G设计结果的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：a：引物组合T4210G-F/R、4210T-F和4210G-R梯度PCR扩增Piks(泳道1-12)和Pik(泳道13-24)的检测电泳图，温度梯度范围为50-70℃；
b：分子标记T4210G引物T4210G-1F/R、4210G-R和4210T-F识别等位基因的电泳结果。M：DL2000(TaKaRa，Janpan)；1：湘早143(Pike)；2：IRBLkm(Pikm)；3：IRBLks-F5(Piks)；4：IRBLk-ka(Pik)；5：IRBL1-CL(Pi1)；6：IRBLkp-K60(Pikp)；7：IRBLkh-K3(Pikh)。
图4为本发明筛选出的分子标记识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1抗原的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中所用rTaq酶及dNTP均购置于宝生物工程(大连)有限公司，其余均为常规生化试剂。
实施例1：
SNP位点筛选：
申请人为了从杂交稻骨干亲本中获取含有KM亚单元型功能性等位基因(Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1)的水稻抗原材料，依据K-单元型的基因组序列设计了测序引物(表1)，并分别利用Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh的供体材料DNA对引物特异性进行了验证。
表1本发明中用于Pik-1测序的引物序列信息
引物名称 上游引物序列(5’-3’) 下游引物序列(5’-3’)
K1 tactgttaaccttgctctaattaca aggaagtcttcacagtgctaact
K2 caagattcagaacacgactcc tatcatgtagagttgcggagg
K3 aacagggaaatgcagagctag tcttgggaatggactttctgat
申请人利用CTAB法提取了IR24、R287、特青、IR72等263份来源广泛的水稻种质资源材料的DNA，并利用上述引物进行了PCR，发现只有IR24、R287、Basmatis、嘉814、千辛124、C418和Centauro等108份水稻材料在Pik位点为K-单元型。随后，申请人对上述108份材料中所含的Pik-1等位基因进行了测序，从108份水稻材料中筛选出了含有Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1的抗原材料共计28份(表2)。
表2利用测序技术筛选出的水稻抗原材料
Figure BDA0003411190170000061
为了找寻快速高效筛选携带KM亚单元型功能性等位基因(Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1)水稻抗原材料的方法，申请人将上述108份水稻材料中的Pik-1等位变异体基因组序列与Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh进行了比较分析，在Pik-1中共获取了225个SNP位点及15个插入/缺失位点。由于未发现Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1特异性的SNP位点，申请人对SNP位点进行了排列组合分析，最终发现利用Pik-1起始密码子下游806位、901位和4210位核苷酸类型组成的身份代码可以有效识别Pik、Pike、Pi1、Pikm和Piks，其中Pik在806位、901位和4210位的核苷酸类型为GTT，Pike的核苷酸类型为TTT，Pi1的核苷酸类型为TTG，Pikm的核苷酸类型为GTG，Piks的核苷酸类型为GCG。
实施例2
分子标记T806G的设计与结果验证
依据两对交叉引物设计方法，申请人首先针对806位SNP T/G设计了两侧通用引物T806G-1F/-1R，用于扩增SNP侧翼区片段。随后，申请人针对806位T和G分别设计了引物806G-1F和806T-1R，其中806G-1F序列与Pike及Pi1(806位碱基为G)序列完全匹配，806T-1R与Pik、Pikm和Piks(806位碱基为T)完全匹配(表3)。申请人将上述4条引物等体积混合后作为PCR中的引物，并使用Pi1和Pik的供体材料的基因组DNA作为模板进行了梯度PCR，PCR温度梯度设置为50-70℃，琼脂糖凝胶电泳检测发现上述4条引物的组合不能够区分出Pi1和Pik(图1中a)，且在预期共有片段的下方出现了非预期条带。上述结果表明，直接利用软件设计出的引物806G-1F和806T-1R与DNA模板之间的结合能力太强，导致扩增出的片段不具有特异性。因此，不能直接使用SNP侧翼区序列作为SNP位点特异性的引物。
随后，申请人重新设计了通用引物并命名为T806G-F/R(表3)。并对806G-1F和806T-1R引物序列中SNP位点上游碱基进行了修改，通过不断尝试，最终发现将806G-1F中倒数第4位碱基由C更改为T，806T-1R中倒数第3、第4位碱基由AA更改为TT(修改碱基后的引物分别命名为806G-F和806T-R)后梯度PCR检测能获得特异性的PCR产物(图1中b)，并且利用Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh基因供体水稻材料的基因组DNA对分子标记T806G进行了验证(图1中c)，发现分子标记T806G从湘早143(Pike)和IRBL1-CL(Pi1)基因组DNA中扩增出长度为558bp和339bp的DNA片段(带型赋值为1)，从IRBLkm(Pikm)、IRBLks-F5(Piks)和IRBLk-ka(Pik)中扩增出长度为558bp和262bp的DNA片段(带型赋值为2)，从IRBLkp-K60(Pikp)和IRBLkh-K3(Pikh)中扩增出589bp的DNA片段(带型赋值为3)。
表3分子标记T806G优化过程中使用引物的序列信息
Figure BDA0003411190170000071
注：加粗的核苷酸符号表示引入错配的碱基
实施例3：
分子标记T901C的设计与结果验证
针对SNP 901C/T，申请人首先设计了扩增SNP位点两翼序列的通用引物T901C-1F/-1R，并针对901位点碱基类型T和C分别设计了特异性的引物901T-1F和901C-1R，其中901T-1F序列与Pik、Pi1、Pikm和Pike(901位碱基为T)序列完全匹配，901C-1R与Piks、Pikp和Pikh(901位碱基为C)序列仅有单个碱基差异。将上述4个引物等体积混合后使用Pik和Piks供体材料DNA作物模板进行PCR，琼脂糖凝胶检测发现共有引物未扩增出预期条带，且Pik和Piks带型一致(图2中a)。申请人于是重新设计了通用引物并命名为T901C-F/-R，并将901C-1F序列中倒数第4为碱基由T修改为A，901T-1R中末端碱基A删除，重新合成了SNP位点特异性引物901C-2F和901T-2R，PCR检测结果表明通用引物T901C-F/-R扩增具有特异性，而引物901C-2F与模板结合能力太强，导致在Pik和Piks中均能扩增出只有901位点碱基类型为C才出现的片段(图2中b)。
随后，申请人对SNP位点特异性引物的序列进行了调整，最终发现将901C-2F引物序列中第17、18位的CA更改位AT，并将901T-R中第1位碱基T删除后，新合成的引物901C-F和901T-R与T901C-F/-R配合扩增片段具有特异性(图2中c)，引物序列信息见表4。
利用Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh基因供体水稻材料的基因组DNA对分子标记T901C进行了验证，分子标记T901C从湘早143(Pike)、IRBL1-CL(Pi1)、IRBLkm(Pikm)、和IRBLk-ka(Pik)基因组DNA中扩增出长度为554bp和358bp的DNA片段(带型赋值为1)，从IRBLks-F5(Piks)中扩增出长度为554bp和241bp的DNA片段(带型赋值为2)，从IRBLkp-K60(Pikp)和IRBLkh-K3(Pikh)中扩增出630bp和241bp的DNA片段(带型赋值为3)(图2中d)。
表4分子标记T901C优化过程中使用引物的序列信息
Figure BDA0003411190170000081
注：加粗的核苷酸符号表示引入错配的碱基
实施例4：
分子标记T4210G的设计与结果验证
针对SNP 4210G/T，申请人首先设计了扩增SNP位点侧翼序列的引物T4210G-F/R(表5)。在4210G和其上游23个碱基的核苷酸序列的基础上将倒数第3位核苷酸由T修改为A作为4210G-F的引物序列。对于下游引物，在4210G上游1个碱基和其下游22个碱基的核苷酸序列的基础上修改了3个核苷酸，并将该序列反向互补作为4210T-R的引物序列。上述4个引物等体积混合后扩增使用Pik和Piks供体材料DNA作物模板进行PCR，琼脂糖凝胶检测发现该分子标记能够区分出Pik和Piks(图3中a)。
申请人利用Pik、Pike、Pi1、Pikm、Piks、Pikp和Pikh基因供体水稻材料的基因组DNA对分子标记T901C进行了验证。分子标记T4210G从湘早143(Pike)、IRBLk-ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)和IRBLkh-K3(Pikh)中扩增出467bp和310bp的DNA片段(带型赋值为1)，从IRBLkm(Pikm)、IRBL1-CL(Pi1)和IRBLks-F5(Piks)中扩增出467bp和203bp的DNA片段(带型赋值为2)(图3中b)。
表5分子标记T4210G的引物序列信息
Figure BDA0003411190170000091
注：加粗的核苷酸符号表示引入错配的碱基
上述实例表明，依据分子标记T806G、T901C和T4210G的检测结果可有效识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1，在实际使用时，可以根据需求选择合适的分子标记组合，如若筛选含有Pike、Pi1或Pik的抗原，只需使用分子标记T806G和T4210G；倘若需要筛选含有Pikm或Piks的抗原，则需使用分子标记T806G、T901C和T4210G。分子标记识别Pik、Pike、Pikm、Piks和Pi1抗原的示意图见图4。
实施例5：
分子标记在筛选抗稻瘟病种质资源中的应用
1)生物材料
来源广泛的263份水稻种质资源，如表6所示。
2)水稻DNA提取及引物
利用CTAB法提取上述材料的基因组DNA，分子标记为实施例1中开发的T806G、
T901C和T4210G，引物序列如表3-5所示。
T806G的引物为：
T806G-F：ATGGTACCGGTGGATCTCGA
T806G-R：CAAGAGTCTCTGTTAGATTGGGACT
806G-F：TCGCAGGTGACCTAAGAGATGAT
806T-R：CCATCACCGACCACCACTTCC。
T901C的引物为：
T901C-F：GTACCGGTGGATCTCGATTC
T901C-R：ATGGTGTGCTAAGTGTATCAGTTAC
901C-F：GTTGCTGGAGGTCAGCATAGC
901T-R：CTCCTTCACATCTTCCATTA。
T4210G的引物为：
T4210G-1F：TAATCGATGACATTTGGCATT
T4210G-1R：CCTCAGATAAAGAGGAAGATGG
4210G-R：TGCTATCCTCCAAGACAAGGATCA
4210T-F：GGATCTAGATAATAATGATGCATT。
3)PCR及琼脂糖凝胶检测
PCR反应体系为10μL，标记的退火温度按照表3-5所示，设置30个循环。扩增产物在1.5％～2％的琼脂糖凝胶中检测并记录结果。
4)结果记录及基因型评判
获得263份水稻种质资源在3个分子标记扩增的电泳图后，依据实施例2-4所述记录每份材料在每个分子标记的带型，获得材料的带型数据并评判基因型，排除DNA质量问题仍未扩增的材料带型记录为“-”。材料的带型数据和基因型检测结果见表6。
5)基因型检测结果及分析
通过分子标记检测，申请人从263份水稻种质资源材料中检测到5份(少蘖粳、合江19、R069、鄂粳17和空育131)材料在分子标记T806G、T4210G和T901C的带型为211，表明这5份材料中含有Pik；2份材料(C101LAC和IR38)在3个标记的带型为121，表明这2份材料中含有Pi1；2份材料(早优143和早143/898B)在3个标记的带型为111，表明这2份材料中含有Pike；9份材料(外95-122、DEDALO、成恢178、R433、成恢727、成恢9348、Lemont、TR2和LABELLE)在3个标记的带型为221，表明这9份材料携带Pikm；另有10份材料(巴里拉、CRM360-37-8、IDRA、YR6-100-9、隆科大粒稻、月光、稻花香、辛13、秋光、辛15)带型为222，表明含有Piks。上述结果与实施例1一致。
表6分子标记检测水稻种质资源带型记录及基因型评判表
Figure BDA0003411190170000111
Figure BDA0003411190170000121
Figure BDA0003411190170000131
Figure BDA0003411190170000141
注：湘早143(Pike)、IRBL1-CL(Pi1)、IRBLkm(Pikm)、和IRBLk-ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)和IRBLkh-K3(Pikh)分别为Pike、Pi1、Pikm、Pik、Pikp和Pikh的供体材料
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactgttaac cttgctctaa ttaca 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggaagtctt cacagtgcta act 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caagattcag aacacgactc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatcatgtag agttgcggag g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacagggaaa tgcagagcta g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttgggaat ggactttctg at 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggagcagt gatgcttca 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaattcaca tatggatttc acc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgccggtga cctaagagac gat 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatcaccga ccaccacaac c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggtaccgg tggatctcga 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagagtctc tgttagattg ggact 25
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgcaggtga cctaagagat gat 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccatcaccga ccaccacttc c 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggcgctgc caataaatt 19
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagagtctct gttagattgg gactg 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctccttcac atcttccttt a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgctggagg tcagccaagc a 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gttgctggag gtcagccaag c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tctccttcac atcttccatt a 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtaccggtgg atctcgattc 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggtgtgct aagtgtatca gttac 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttgctggag gtcagcatag c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctccttcaca tcttccatta 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taatcgatga catttggcat t 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctcagataa agaggaagat gg 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgctatcctc caagacaagg atca 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggatctagat aataatgatg catt 24

Claims (3)

1.水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因鉴别分子标记引物组，包括：
T806G-F：ATGGTACCGGTGGATCTCGA
T806G-R：CAAGAGTCTCTGTTAGATTGGGACT
806G-F：TCGCAGGTGACCTAAGAGATGAT
806T-R：CCATCACCGACCACCACTTCC；
T901C-F：GTACCGGTGGATCTCGATTC
T901C-R：ATGGTGTGCTAAGTGTATCAGTTAC
901C-F：GTTGCTGGAGGTCAGCATAGC
901T-R：CTCCTTCACATCTTCCATTA；和
T4210G-1F：TAATCGATGACATTTGGCATT
T4210G-1R：CCTCAGATAAAGAGGAAGATGG
4210G-R：TGCTATCCTCCAAGACAAGGATCA
4210T-F：GGATCTAGATAATAATGATGCATT。
2.权利要求1所述的引物组在鉴别水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因类型中的应用。
3.权利要求1所述的引物组在制备鉴别水稻抗稻瘟病Pik位点等位基因类型试剂盒中的应用。
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229份水稻品种及重要育种材料抗稻瘟病Pik位点基因型鉴定;陈子强等;《福建农业学报》;20160615(第06期);第552-559页 *

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