CN111893209A

CN111893209A - 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用

Info

Publication number: CN111893209A
Application number: CN202010876453.6A
Authority: CN
Inventors: 柳洪; 安调过; 李立会; 麻菲菲; 许云峰; 张锦鹏; 张小涛
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111893209B

Abstract

本发明公开了一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用。本发明用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT‑D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质在如下中的应用：鉴定或辅助鉴定小麦千粒重；比较待测小麦千粒重的高低；选育千粒重相对较高/低的小麦单株或株系或品系或品种。利用本发明提供的插入缺失的KASP标记，可用于检测小麦品种或品系中是否含有增加千粒重的位点。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，可加快小麦高产品种的选育进程。

Description

一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域和分子育种领域，尤其涉及一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用。

背景技术

普通小麦(Triticum aestivum L.)是全球最为重要的粮食作物之一，养活了全世界近40％的人口(http://www.fao.org/)。我国是世界上最大的小麦生产和消费国，小麦生产的可持续发展对国家粮食安全和社会稳定起着至关重要的作用(何中虎等(2018) 中国小麦产业发展与科技进步.农学学报,8,99-106.)。因此，在耕地面积有限的情况下，提高小麦单产是我国育种家选育小麦品种的首要目标。小麦单产受亩穗数、穗粒数和千粒重(Thousand kernel weight，TKW)及环境因素共同影响，其中千粒重的遗传力最高、遗传最为稳定，提升潜力最大(Zhang DL et al.(2012)Identifying loci influencing grainnumber by microsatellite screening in bread wheat(Triticum aestivum L.).Planta,236:1507-1517.)。因此，精细定位控制重要产量性状的位点和克隆其基因，开发功能标记，从更深层次认识理解产量形成的遗传和分子基础，对提升我国小麦育种水平，满足对粮食持续增长的需求具有重要意义。

目前，已有大量研究利用重组自交系(RIL)、近等基因系(NIL)和双单倍体群体等遗传作图群体对小麦籽粒相关性状进行初定位。目前，利用RIL和DH等群体开展连锁分析，已获得大量粒重相关性状的QTL，这些QTL几乎分布在全部21条小麦染色体上。在小麦7DS染色体(即7D染色体短臂)上已经定位了一些粒重相关的QTL 位点。利用“W7984(M6)×Prinz”群体在7DS染色体Xgwm295-Xgwm1002区段检测到控制千粒重的位点QTgw.ipk-7D(

MS et al.(2008)Fine mapping of the region on wheat chromosome 7Dcontrolling grain weight.Funct Integr Genomic 8:79-86.)。利用 “Hesheng2hao×Nongda4332”RIL群体在Xcau.7D-2–7D-ID-9区段定位到一个控制千粒重和粒宽的位点QTgw.cau-7D(Chen Z et al.(2019)Dissection of genetic factors underlying grainsize and fine mapping of QTgw.cau-7D in common wheat (Triticumaestivum L.).Theor Appl Genet 133:149-162.)。

TaFT-1，作为拟南芥FT的同源基因，在小麦中作为核心的成花因子调控开花(ChenA et al.(2014)PHYTOCHROME C plays a major role in the acceleration of wheatflowering under long-day photoperiod.Proc Natl Acad Sci USA 111:10037-10044.)。研究发现，TaFT-1在小麦中除了调控开花，同时还可以调控小穗的发育，种子萌发等(Liu H et al.(2019)Beyond heading time:FT-like genes and spikedevelopment in cereals.J Exp Bot 70:1-3.)。小麦功能缺失的TaFT-B1突变体小穗数和分蘖与野生型相比显著增加 (Dixon LE et al.(2018)Developmental responses ofbread wheat to changes in ambient temperature following deletion of a locusthat includes FLOWE-RING LOCUS T1.Plant Cell Environ 12:76-90)。携带TaFT-A1的优异等位基因TaFT-A1(G)的材料小穗数显著高于携带TaFT-A1(C)等位基因材料(Chen Zet al.(2020)Pleiotropic QTL influencing spikelet number and heading date incommon wheat(Triticum aestivum L.).Theor Appl Genet 133:1825–1838.)。但是，到目前为止，还没有发现TaFT-1与千粒重性状相关的优异等位变异。

竞争性等位基因多态性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)及特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。KASP标记与传统的凝胶电泳标记相比，不仅操作简单，同时还具有遗传稳定性好等优点，是一种高通量的分子标记。通过开发重要粒重基因的KASP标记，可以通过分子设计育种加快小麦高产品种的选育进程。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种千粒重相关的InDel位点的高通量检测标记及其在育种中的应用。

第一方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因(TraesCS7D02G111600)的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质在如下任一中的应用：

P1、鉴定或辅助鉴定小麦千粒重；

P2、比较待测小麦千粒重的高低；

P3、选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

P4、选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

P5、制备用于比较待测小麦千粒重的高低；

P6、制备用于选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

P7、制备用于选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

P8、鉴定或辅助鉴定小麦单产(单位面积产量)；

P9、比较待测小麦单产的高低；

P10、选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

P11、选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

P12、制备用于比较待测小麦单产的高低；

P13、制备用于选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

P14、制备用于选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

其中，第840位脱氧核糖核苷酸G不缺失的所述TaFT-D1基因的核苷酸序列如 SEQID No.1所示；第840位脱氧核糖核苷酸G缺失的所述TaFT-D1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

所述用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质可为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒。

进一步地，所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物。

一条所述上游引物可根据SEQ ID No.1所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且其3'末端脱氧核糖核苷酸为SEQ ID No.1所示的DNA 片段的第840位脱氧核糖核苷酸G；另一条所述上游引物可根据SEQ ID No.2所示的 DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且其3'末端脱氧核糖核苷酸为SEQ IDNo.2所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸A；所述下游引物可根据SEQ ID No.2所示的基因片段的第840位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

更进一步地，所述成套引物可为由SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子组成的成套引物。

其中，所述SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物可为SEQ IDNo.3的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A。所述SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物可为SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光标签序列FAM具体为SEQ ID No.3的第 1-21位；所述荧光标签序列HEX具体为SEQ ID No.4的第1-21位。即，所述成套引物为由SEQID No.3所示的单链DNA分子、SEQ ID No.4所示的单链DNA分子和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子组成的成套引物。

在所述试剂或试剂盒中，还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A可为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5'末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A可为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3'末端连接荧光淬灭基团。所述荧光探针B可为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5' 末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B可为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3'末端连接荧光淬灭基团。

本发明中所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和淬灭探针B是存在于KASP 2×Master Mix中，其中所述KASP 2×Master Mix是英国LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002(适用于96孔或384孔PCR板)。

进一步地，所述特异荧光标签序列A可为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B可为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A可为FAM，所述荧光报告基团 B可为HEX；所述荧光淬灭基团可为BHQ。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光标签序列FAM具体为SEQ ID No.3的第 1-21位；所述荧光标签序列HEX具体为SEQ ID No.4的第1-21位。

第二方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的方法，可包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；

(A2)用前文所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，采用基因分型软件BioRad CFX Manager对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第 840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFXManager分析靠近FAM轴(X轴)，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1 基因的第840位脱氧核糖核苷酸G不缺失，基因型记为TaFT-D1(G)(TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸为G纯合型)；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFXManager分析靠近HEX轴(Y轴)，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1 基因的第840位脱氧核糖核苷酸G缺失，基因型记为TaFT-D1(-)(TaFT-D1基因的第 840位脱氧核糖核苷酸G缺失纯合型)。

方法B：一种比较待测小麦千粒重的高低的方法，可包括如下步骤：

(B1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(B2)按照如下确定所述待测小麦千粒重的高低：基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的所述待测小麦的千粒重高于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-) 的所述待测小麦的千粒重。

方法C：一种选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下步骤：

(C1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(C2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中 7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的小麦，最终获得千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种。

方法D：一种选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下步骤：

(D1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(D2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中 7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的小麦，最终获得千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

方法E：一种比较待测小麦单产的高低的方法，可包括如下步骤：

(E1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(E2)按照如下确定所述待测小麦单产的高低：基因组中7DS染色体上TaFT-D1 基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的所述待测小麦的单产高于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-) 的所述待测小麦的单产。

方法F：一种选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下步骤：

(F1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(F2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中7DS 染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的小麦，最终获得单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种。

方法G：一种选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下步骤：

(G1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840 位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(G2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中 7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的小麦，最终获得单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

第三方面，本发明要求保护具有如下(A)-(H)中至少一种功能的物质：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦千粒重；

(B)比较待测小麦千粒重的高低；

(C)选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

(E)鉴定或辅助鉴定小麦单产；

(F)比较待测小麦单产的高低；

(G)选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

(H)选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

所述物质为前文所述的用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质。

第四方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)千粒重相对较高；

(b)千粒重相对较低；

(c)单产相对较高；

(d)单产相对较低。

第五方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。

在本发明中，所述千粒重相对较高是指当所比较的小麦中基因组上其他影响千粒重高低的位点的效应相等时，基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦的千粒重相对于基因组中7DS染色体上 TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦的千粒重更高。所述千粒重相对较低是指当所比较的小麦中基因组上其他影响千粒重高低的位点的效应相等时，基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦的千粒重相对于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦的千粒重更低。所述单产相对较高是指当所比较的小麦中基因组上其他影响单产高低的位点的效应相等时，基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为 TaFT-D1(G)的待测小麦的单产相对于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦的单产更高。所述单产相对较低是指当所比较的小麦中基因组上其他影响单产高低的位点的效应相等时，基因组中7DS 染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦的单产相对于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦的单产更低。

在前文各方面中，所述小麦可为但不限于如下品种中的任一种或任几种：藁8901、3228、藁8901/3228重组近交系群体，以及实施例部分表2中所示的133份小麦品种。

本发明利用藁8901/3228重组近交系群体对千粒重性状进行QTL定位，在7DS 染色体(即7D染色体短臂)上定位到一个QTL，记为QTkw.cas-7D，其加性效应来自藁8901，增加千粒重1.25g。经基因组重测序发现，与藁8901相比，3228的TaFT-D1 基因序列在距上游ATG840bp位置存在一个G碱基的缺失，导致TaFT-D1蛋白出现移码突变。该插入缺失突变存在两种基因型：基因型TaFT-D1(G)和TaFT-D1(-)。利用遗传连锁群体和自然群体表型和基因型的统计分析证明基因型TaFT-D1(G)为高千粒重类型。针对该InDel变异，本发明开发了KASP标记KFT-D1。通过实验证明：利用本发明提供的插入缺失的KASP标记(KFT-D1)，可用于检测小麦品种或品系中是否含有增加千粒重的位点。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，可加快小麦高产品种的选育进程。

附图说明

图1为千粒重位点QTkw.cas-7D在4个环境下的染色体定位。

图2为TaFT-D1在3228和藁8901中的基因和蛋白序列的差异。(a)为基因序列； (b)为蛋白序列。

图3为TaFT-D1 KASP标记基因分型结果。靠近Y轴方形点代表携带TaFT-D1(-) 型等位基因，靠近X轴圆点代表携带纯合TaFT-D1(G)型等位基因。靠近左下角菱形点代表空白对照。

图4为PG-RIL群体中携带TaFT-D1(-)型和TaFT-D1(G)型两种不同等位变异的家系在千粒重上差异。

图5为133份自然群体中携带TaFT-D1(-)型和TaFT-D1(G)型两种不同等位变异的家系在千粒重上差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦种质资源3228：记载在“Wang J,et al.(2011)QTL mapping of yield-related traits in the wheat germplasm 3228.Euphytica 177:277-292.” 一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验实验，不得他用。

实施例1、小麦千粒重相关的InDel位点发掘及KASP标记的开发

一、重组自交系群体的构建

以小麦品种藁8901为母本、3228为父本进行杂交，采用单粒传法获得含有176 个株系的F_6:9代重组近交系(PG-RIL)群体。

二、PG-RIL群体千粒重多年环境下的鉴定

将PG-RIL群体于LC13(2013-2014)、LC14(2014-2015)、LC15(2015-2016)、 LC16(2016-2017)共4个年度种植于中国科学院栾城农业生态系统试验站 (37°53'15″N，114°40'47″E)。每个家系种植2行，行长1.5m，行距0.25m，每行30 粒种子。所有大田试验的水、肥和其他管理都按照当地标准进行。小麦成熟后，每个重复的每个株系随机抽取10株调查千粒重，取平均值。

三、基因型扫描与QTL定位

1、基因组DNA提取

采用CTAB法提取PG-RIL群体的176份后代和双亲植株DNA，使用 NanoDrop2000检测其浓度。

小麦基因组DNA提取步骤具体如下：

①取小麦材料的幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末状，装入2ml EP管。

②加入800μL CTAB提取液，于65℃水浴30分钟，期间多次颠倒混匀。

③加入等体积的氯仿，颠倒混匀15分钟。

④12000rpm离心10min，取500μL上清液至1.5ml的EP管中，加入3倍体积冰无水乙醇，-20℃沉降2h。

⑤12000rpm离心10min，弃上清，加入1ml的70％乙醇洗涤2次。

⑥风干沉淀，加入200μL的ddH₂O溶解。

⑦待DNA充分溶解后，检测浓度与纯度。

2、基于高密度遗传连锁图谱的千粒重位点QTkw.cas-7D的定位

利用PG-RIL遗传作图群体，在中国科学院栾城试验站4年共4个环境条件下开展了产量性状的QTL定位，在7DS染色体区段检测到控制千粒重性状的稳定表达的 QTLQTkw.cas-7D(图1)，LOD(threshold log-of-odds)峰值区间(即LOD值大于3.0 的区间)为AX-111061288–AX-111184541，能够解释5.50-9.22％的千粒重表型变异，加性效应来自藁8901，增加千粒重1.25g(表1)。进一步结合两侧Bin标记(与AX-111061288和AX-111184541遗传距离相同的标记)和边界标记的位置，将其定位于 AX-110826147–AX-111359934区间，对应中国春7DS染色体的65.50-69.32Mb共3.82 Mb物理区间内(图1)。

表1 QTkw.cas-7D区间内千粒重的QTL信息

性状	环境	峰值区间	QTL区间(cM)	LOD值	P-Value	PVE(％)	加性效应
								千粒重	LC13	AX-111061288-AX-111184541	92.76-93.06	4.21	0.021	9.22	-1.250
千粒重	LC14	AX-111061288-AX-111184541	92.76-93.06	4.30	0.032	5.50	-0.895
								千粒重	LC16	AX-111061288-AX-111184541	92.76-93.06	4.91	0.002	8.09	-1.169
千粒重	BLUP	AX-111061288-AX-111184541	92.76-93.06	6.79	0.005	8.82	-1.211

注：BLUP-最佳线性无偏预测值。

3、QTkw.cas-7D区段变异及候选基因的预测

根据PG-RIL的定位结果，本发明初步将QTkw.cas-7D定位于中国春7D染色体短臂65.50-69.32Mb的物理区间内，包含47个候选基因。根据亲本3228和藁8901基因组重测序的结果，发现其中一个候选基因TaFT-D1(TraesCS7D02G111600)在编码区存在一个碱基的缺失。通过利用中国春IWGSC RefSeq v1.0参考基因组，根据TaFT-D1 基因组上下游序列差异，设计TaFT-D1基因组特异引物TaFT-D1-F/R，以亲本3228和藁8901基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增的条带回收、测序。对重测序结果分析发现，与藁8901相比，3228的TaFT-D1基因序列在距上游ATG 840bp位置存在一个G碱基的缺失，导致TaFT-D1蛋白出现移码突变(图2)。

特异引物TaFT-D1-F/R：

TaFT-D1-F：5'–TGAGGGCGTTGTACAAGACC–3'。

TaFT-D1-R：5'–GACCCAGATGCTCCAAGTCC–3'。

以3228和藁8901基因组DNA为模板，利用基因组特异引物TaFT-D1-F/R对模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系：2×pfu PCR Mastermix(北京全式金生物，AP221-12)5μl；dNTP0.24μl；TaFT-D1-F(10μM)0.5μl；TaFT-D1-R(10μM)0.5μl；DNA模板2μl；PCR enhancer(南京诺唯赞，P021-01)5μl；ddH₂O补足25μl。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性20s，60℃退火60s，72℃延伸20s， 36个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖140V电压下电泳20min后，在1.0kb位置存在扩增条带，切下条带后使用天根DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司， BY302)回收PCR产物。再将回收的DNA片段与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物，CB101-02)连接20min，转化大肠杆菌感受态细胞TransT1(北京全式金生物， CD501-02)。过夜培养后挑单克隆，通过PCR鉴定后将单克隆测序，得到TaFT-D1的基因组序列。

使用生物信息分析软件DNAMAN对3228和藁8901序列分析，发现与藁8901 相比，3228TaFT-D1基因在第三个外显子840bp处存在1个G碱基的缺失，产生了 InDel突变，导致了3228TaFT-D1蛋白质的移码突变(图2)。该插入缺失位点记为 TaFT-D1-Ind840。

小麦藁8901基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，其第840位的核苷酸G不缺失，为G纯合型，记为基因型TaFT-D1(G)。

小麦3228基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其第840位的核苷酸G缺失，为G缺失纯合型，记为基因型TaFT-D1(-)。

4、KASP标记的开发

针对TaFT-D1在藁8901和3228之间的InDel变异(TaFT-D1-Ind840)，本发明开发了KASP标记KFT-D1，其中上游引物TaFT-D1-FAM扩增的为TaFT-D1(G)型等位基因，TaFT-D1-HEX引物扩增TaFT-D1(-)型等位基因，TaFT-D1-C为下游通用引物。

KFT-D1上游序列为：

TaFT-D1-FAM：5'–gaaggtgaccaagttcatgctGCACGAAGCGATGGATCCCC–3'(SEQ IDNo.3，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

TaFT-D1-HEX：5'–gaaggtcggagtcaacggattGCACGAAGCGATGGATCCCA–3'(SEQ IDNo.4，小写字母部分为特异荧光标签序列HEX)。

KFT-D1下游序列：

TaFT-D1-C：5’–TATCCCCGGTACAACTGGTGCATCC–3’(SEQ ID No.5)。

上述SEQ ID No.3所示的单链DNA分子与SEQ ID No.5所示的单链DNA分子扩增TaFT-D1基因在第三个外显子840bp处基因型为TaFT-D1(G)的片段。

上述SEQ ID No.4所示的单链DNA分子与SEQ ID No.5所示的单链DNA分子扩增TaFT-D1基因在第三个外显子840bp处基因型为TaFT-D1(-)的片段。

实施例2、利用KASP标记检测插入缺失位点(TaFT-D1-Ind840)基因型方法的建立

以实施例1中的PG-RIL群体家系及其亲本(藁8901和3228)基因组DNA为模板，利用实施例1中的引物KFT-D1进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增体系：DNA模板1.00μL；引物混合液0.08μL；KASP Master Mix(LGC 公司，KBS-1016-002)2.81μL；ddH₂O补足至5.00μL。

其中，所述引物混合液中上游引物TaFT-D1-FAM和TaFT-D1-HEX终浓度均为12 μM，下游引物TaFT-D1-C的终浓度为30μM。

其中，KASP Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成。荧光探针A的核苷酸序列为： 5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，其5'端连接一个FAM荧光基团；荧光探针B 的核苷酸序列为：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，5'末端连接一个HEX荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5'-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3'，其3'端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为： 5'-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3'，其3'端连接一个淬灭基团BHQ。

PCR反应程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火并延伸60s，30个循环。

PCR产物检测使用Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪在37℃进行荧光收集，利用基因分型软件BioRad CFX Manager对PCR产物进行分型，并与已知基因型材料3228 和藁8901进行对照。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

采用基因分型软件BioRad CFX Manager对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFX Manager分析靠近X轴(FAM)，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFX Manager分析靠近Y轴(HEX)，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为 TaFT-D1(-)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

用KFT-D1引物扫描PG-RIL群体时，有108份材料扩增出了等位位点TaFT-D1(-)，有68份材料扩增出了优异等位位点TaFT-D1(G)，如图3所示。图3中靠近X轴(FAM) 呈圆形点的为携带等位位点TaFT-D1(G)材料的分型结果，靠近Y轴(HEX)呈方形点的为携带等位位点TaFT-D1(-)材料的分型结果。

双尾T检验结果表明，在PG-RIL群体中标记KFT-D1与千粒重在LC13 (2013-2014)、LC14(2014-2015)和LC16(2016-2017)这3个年度呈显著或极显著相关，与携带TaFT-D1(-)的材料相比，携带TaFT-D1(G)等位变异的材料在LC13、LC14、 LC15、LC16这4个年度分别提高千粒重1.853g、1.284g、1.134g和2.235g(图4)。

实施例3、KASP分子标记在鉴定、筛选小麦自然群体千粒重中的应用

收集上世纪50年代以来在我国小麦育种工作中发挥重要作用的小麦骨干亲本、不同时期不同生态区的主栽品种及部分小麦微核心种质材料，筛选生育期相对一致且能正常生长的材料共133份品种/品系组成自然群体。

从2013-2014、2014-2015、2015-2016和2016-2017连续4个年度将上述133份材料种植于中国科学院栾城农业生态系统试验站(37°53'15″N，114°40'47″E)，每份材料种3行，行长1.5m，均匀播种30粒，行间距25cm。常规田间管理，生长期间没有发生严重病虫害和倒伏。

对收获的小麦材料进行KASP标记检测，具体方法为：在苗期提取叶片基因组总DNA；以133份材料的基因组DNA为模板，利用实施例1开发的携带不同荧光标记信号的KFT-D1标记引物按照实施例2进行PCR扩增和TaFT-D1基因840bp处核苷酸基因型检测。

用KFT-D1引物扫描133份自然群体时，有19份材料扩增出了等位位点 TaFT-D1(-)，有114份材料扩增出了优异等位位点TaFT-D1(G)，双尾T检验结果表明，在自然群体中标记KFT-D1与千粒重在2013-2014、2014-2015和2015-2016三个年度呈显著或极显著相关，携带TaFT-D1(G)等位变异的材料在2013-2014、2014-2015、 2015-2016和2016-2017 4个年度分别提高千粒重5.220g、5.250g、2.656g和1.680g (图5，表2和表3)。

表2 133份小麦品种千粒重及用KASP标记检测的TaFT-D1基因840bp处核苷酸基因型

表3 133份小麦品种千粒重t检验

本发明的KASP分子标记在PG-RIL遗传群体和133份自然群体同样适用，实验结果与预期一致。说明本发明与千粒重紧密连锁的标记确实具有对千粒重进行辅助选择的作用。由于千粒重是决定小麦单产高低中遗传力最高、遗传最为稳定的因素，因而本发明对于选育单产高的小麦品种具有重要意义。

本发明的KASP分子标记，序列、引物明确，染色体位置清晰，高效、准确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种中。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

<120> 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用

<130> GNCLN202218

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 1

atggccggga gggacagaga cccgctggtg gttggcaggg ttgtggggga cgtgctggac 60

cccttcatcc ggaccaccaa cctcagggtg accttcggga acaggaccgt gtccaacggc 120

tgcgagctca agccgtccat ggtcgcccag cagcccaggg ttgaggtggg cggcaatgag 180

atgaggacct tctacacact cgtacgtaca cagtcactat ctaatgccta tatgtttagc 240

tctgaaagtg ctcgccacac gcacatgatc gatcgagctc tatatatata gtacgtgtgg 300

gaagatgatt ctcgatgctt ctgttcacag aatgtttgtc ttggcaggca catgactaat 360

gctccatctt gcatatggct ctgtgctagc tctctggtgt tgatcatgat tttctatgct 420

tgttttcttt tcttttcggg gaacattgat tttcgatgct tctattcaca tgtttcgttc 480

atgtttgtcc tagcaagcac acgactaatt aaagctcggt cttaaataca tatgcttatt 540

tacggtagta ctctctactt ctctagtatt gatcatgatg tgcacgcgtg tactgcccgc 600

aggtgatggt agacccagat gctccaagtc caagcgatcc caaccttagg gagtatctcc 660

actggtaagt actaaatttg taactcagtt gaataatttc tctgtcccta gatatacaca 720

gtagctcatg tgtgtgtgtc tacatgtgtg tgcaggcttg tgacagatat ccccggtaca 780

actggtgcat ccttcgggca ggaggtgatg tgctacgaga gccctcgtcc gaccatgggg 840

atccatcgct tcgtgctcgt gctcttccag cagctcggcc ggcagaccgt gtacgctccc 900

gggtggcgcc agaacttcaa caccagggac ttcgccgagc tctacaacct cggcccgcct 960

gtcgccgccg tctacttcaa ctgccagcgt gaggccggct ccggcggcag gaggatgtac 1020

aattga 1026

<210> 2

<211> 1025

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 2

atggccggga gggacagaga cccgctggtg gttggcaggg ttgtggggga cgtgctggac 60

cccttcatcc ggaccaccaa cctcagggtg accttcggga acaggaccgt gtccaacggc 120

tgcgagctca agccgtccat ggtcgcccag cagcccaggg ttgaggtggg cggcaatgag 180

atgaggacct tctacacact cgtacgtaca cagtcactat ctaatgccta tatgtttagc 240

tctgaaagtg ctcgccacac gcacatgatc gatcgagctc tatatatata gtacgtgtgg 300

gaagatgatt ctcgatgctt ctgttcacag aatgtttgtc ttggcaggca catgactaat 360

gctccatctt gcatatggct ctgtgctagc tctctggtgt tgatcatgat tttctatgct 420

tgttttcttt tcttttcggg gaacattgat tttcgatgct tctattcaca tgtttcgttc 480

atgtttgtcc tagcaagcac acgactaatt aaagctcggt cttaaataca tatgcttatt 540

tacggtagta ctctctactt ctctagtatt gatcatgatg tgcacgcgtg tactgcccgc 600

aggtgatggt agacccagat gctccaagtc caagcgatcc caaccttagg gagtatctcc 660

actggtaagt actaaatttg taactcagtt gaataatttc tctgtcccta gatatacaca 720

gtagctcatg tgtgtgtgtc tacatgtgtg tgcaggcttg tgacagatat ccccggtaca 780

actggtgcat ccttcgggca ggaggtgatg tgctacgaga gccctcgtcc gaccatggga 840

tccatcgctt cgtgctcgtg ctcttccagc agctcggccg gcagaccgtg tacgctcccg 900

ggtggcgcca gaacttcaac accagggact tcgccgagct ctacaacctc ggcccgcctg 960

tcgccgccgt ctacttcaac tgccagcgtg aggccggctc cggcggcagg aggatgtaca 1020

attga 1025

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tgcacgaagc gatggatccc c 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tgcacgaagc gatggatccc a 41

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tatccccggt acaactggtg catcc 25

Claims

1.用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质在如下任一中的应用：

P1、鉴定或辅助鉴定小麦千粒重；

P2、比较待测小麦千粒重的高低；

P3、选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

P4、选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

P5、制备用于比较待测小麦千粒重的高低；

P8、鉴定或辅助鉴定小麦单产；

P9、比较待测小麦单产的高低；

P10、选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

P11、选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

P12、制备用于比较待测小麦单产的高低；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：第840位脱氧核糖核苷酸G不缺失的所述TaFT-D1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；第840位脱氧核糖核苷酸G缺失的所述TaFT-D1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

进一步地，所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

一条所述上游引物根据SEQ ID No.1所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且其3'末端脱氧核糖核苷酸为SEQ ID No.1所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸G；另一条所述上游引物根据SEQ ID No.2所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且其3'末端脱氧核糖核苷酸为SEQ ID No.2所示的DNA片段的第840位脱氧核糖核苷酸A；所述下游引物根据SEQ ID No.2所示的基因片段的第840位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述成套引物为由SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子组成的成套引物；

进一步地，所述SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；

进一步地，所述SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.4的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述成套引物为由SEQ ID No.3所示的单链DNA分子、SEQ ID No.4所示的单链DNA分子和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子组成的成套引物。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5'末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3'末端连接荧光淬灭基团；

所述荧光探针B为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5'末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3'末端连接荧光淬灭基团；

进一步地，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

7.如下任一方法：

方法A：一种检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；

(A2)用权利要求5所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，采用基因分型软件BioRad CFX Manager对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFX Manager分析靠近FAM轴，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G不缺失，基因型记为TaFT-D1(G)；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件BioRad CFX Manager分析靠近HEX轴，则所述待测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G缺失，基因型记为TaFT-D1(-)；

方法B：一种比较待测小麦千粒重的高低的方法，包括如下步骤：

(B1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(B2)按照如下确定所述待测小麦千粒重的高低：基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的所述待测小麦的千粒重高于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的所述待测小麦的千粒重；

方法C：一种选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(C1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(C2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的小麦，最终获得千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

方法D：一种选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(D1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(D2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的小麦，最终获得千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

方法E：一种比较待测小麦单产的高低的方法，包括如下步骤：

(E1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(E2)按照如下确定所述待测小麦单产的高低：基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的所述待测小麦的单产高于基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的所述待测小麦的单产；

方法F：一种选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(F1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(F2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(G)的小麦，最终获得单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

方法G：一种选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(G1)按照所述方法A检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失；

(G2)选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸的基因型为TaFT-D1(-)的小麦，最终获得单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

8.具有如下(A)-(H)中至少一种功能的物质，为权利要求1-6任一中所述的用于检测小麦基因组中7DS染色体上TaFT-D1基因的第840位脱氧核糖核苷酸G是否缺失的物质；

(A)鉴定或辅助鉴定小麦千粒重；

(B)比较待测小麦千粒重的高低；

(C)选育千粒重相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育千粒重相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；

(E)鉴定或辅助鉴定小麦单产；

(F)比较待测小麦单产的高低；

(G)选育单产相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；

(H)选育单产相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。

9.权利要求7所述的方法或权利要求8所述的物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)千粒重相对较高；

(b)千粒重相对较低；

(c)单产相对较高；

(d)单产相对较低。

10.权利要求7所述的方法或权利要求8所述的物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。