CN114480698B - 小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关分子标记及应用 - Google Patents

小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与小麦结实小穗数和/或籽粒硬度值显著相关的分子标记及其应用。利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦4号的1个与结实小穗数和籽粒硬度值显著相关的主效QTL位点Q‑7DS‑YM4(HD/SNS)，其紧密连锁标记是AX‑110194885，并据此开发了1个KASP标记引物组，用以对小麦结实小穗数和/或籽粒硬度值高低进行高效筛选。通过本发明的引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦4号的结实小穗数和籽粒硬度值高的基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用该分子标记进行筛选可以大大提高分子标记辅助选择结实小穗数和/或籽粒硬度值高低的小麦育种工作效率。

Description

小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关分子标记及应用
技术领域
本发明属于小麦结实小穗数和/或籽粒硬度分子标记技术领域，涉及一种小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
小麦品质受基因型、环境以及二者互作效应的共同影响，林作楫等(参考文献：林作楫，雷振生，杨攀，王美芳，中国小麦品质育种进展与问题.河南农业科学,2007,36(2):5-8.)研究认为现有小麦品质评价标准中湿面筋含量和粉质仪稳定时间还不够全面。多数研究表明，籽粒硬度、溶剂保持力(SRC)以及反映蛋白质质量的性状主要受基因型影响，而籽粒或者面粉的蛋白质含量受环境效应影响更大。张晓等(参考文献：张晓,李曼,刘大同,等.扬麦系列品种品质性状分析及育种启示[J].中国农业科学,2020,53(7):1309-1321.)研究表明，籽粒硬度、面筋指数、水SRC、碳酸钠SRC、蔗糖SRC、吸水率、形成时间和弱化度基因型效应大于环境效应明确籽粒硬度、沉淀值、吸水率、水SRC、碳酸钠SRC和蔗糖SRC性状是影响小麦最终加工品质的重要因素，也是小麦品质育种的主要选择指标，而这些品质性状中唯一可以通过小麦脱粒后直接籽粒鉴定的是硬度性状，其他性状都需要磨粉后鉴定，这就会损失小麦种子，而如果要选育出不同硬度性状的小麦种质，在育种早代就应该开始选择相应基因型的种子进一步加代继续选择等。随着小麦基因组学和分子育种技术的迅猛发展，发掘与小麦籽粒硬度性状显著相关的分子标记，揭示它们的分子遗传机理，对选择和培育不同类型优质专用小麦品种具有重要意义。以往研究表明，控制小麦籽粒硬度性状的主效基因Pina和Pinb位于小麦染色体5D短臂的相近物理位置上，陆续也有研究者在第七同源群以及5D长臂上发现控制籽粒硬度性状的基因。研究发现染色体4B和4D上具有控制软质小麦籽粒硬度性状和出粉率的主效位点，并且接近小麦矮秆基因Rht-B1和Rht-D1的位置。其他已报道的控制小麦籽粒硬度性状的微效基因主要位于染色体1A、2A、2D、3B、3A、5A、5B和6D上，但是并没有与这些基因显著相关的分子标记被应用在育种中。
随着人们生活水平的提高，适合制作面包、速冻水饺和高档方便面等食品的优质强筋小麦市场需求日益增加，而长江中下游麦区推广强筋品种极少，早熟强筋品种更是空白。优良磨粉品质要求籽粒硬度高、饱满性好，育种过程中加强籽粒高硬度选择，实现加工品质优良，国家强筋小麦硬度性状的标准是硬度平均值≥60。扬麦23已成为长江中下游麦区推广面积最大的早熟高产强筋小麦品种。扬麦23的硬度值一直稳定在72～76，面包评分82.7～85.5，居供试样品前列(2017～2019年《中国小麦质量报告》；2018农业农村部谷物质量测试中心检测结果；2019中国小麦产业发展暨质量发布年会)。扬麦23具有扬麦4号的遗传背景。扬麦4号硬度值高达71.5～74.8，硬度遗传机理尚不明确，前期通过扬麦4号/偃展1号的遗传群体的硬度值和农艺性状考察表明，群体的硬度值与结实小穗数存在显著的正相关，即平均硬度值较高的家系，平均结实小穗数也较高，这在以往的研究中从未被报道过，这一发现有利于小麦高硬度性状和产量相关性状的协同选择，对强筋高产小麦育种具有重要的意义。因此深入揭示扬麦4号的硬度遗传基础，明确其与结实小穗数的遗传关系，开发紧密连锁的育种可用分子标记，有利于创制硬度值和结实小穗数分型良好的小麦种质，发掘高硬度值并且高结实小穗数的育种材料，为长江中下游强筋高产小麦品种选育奠定理论基础和提供新途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种可供分子标记辅助选择结实小穗数和/或籽粒硬度值高低的小麦育种使用的连锁分子标记。本发明利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦4号的1个同时与结实小穗数和/或籽粒硬度值显著相关的主效QTL位点Q-7DS-YM4(HD/SNS)，且增效基因均来源于扬麦4号，经过比较，与其功能最紧密连锁的标记是AX-110194885，并据此开发了1个KASP标记引物组，用以对结实小穗数和/或籽粒硬度值高低同时进行高效筛选。
本发明第一方面提供了一种检测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度分子标记的物质，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC、TT或CT的成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒。其中，SEQID No.4所示的基因片段为GATACGTTGGAGACATATCAACAGTCGGGAAATCARCGTGGTAAGACCCTAAACGACCAGCACACCAGAAC，第36位碱基R即为SNP位点，为C或T；R表示“[C/T]”，表示该SNP标记的两种多态性单核苷酸C或T，即在实际小麦材料中该位置碱基为C或T。
在某些实施例中，所述成套引物中含有一条上游引物和两条下游引物；所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的上游序列进行设计；
所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其下游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为G，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为A。
在某些实施例中，所述成套引物为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQIDNo.2的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.3的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物和组成的成套引物。
在某些实施例中，所述SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ IDNo.3的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.3的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。
在某些实施例中，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
在某些实施例中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。
第二方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的物质在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
在某些实施例中，所述产品为检测试剂或检测试剂盒。
第三方面，本发明还提供了如下任一方法：
方法A：一种检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)直接测序；
(A2)用本发明第一方面所述的物质对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C或T：
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C和T的杂合体；
方法B：一种比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度的方法，包括如下步骤：
(B1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(B2)按照如下确定所述待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度：基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体则所述待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度高于基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体或者是T和C的杂合体的所述待测小麦；
方法C：一种选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(C1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(C2)选择基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的小麦，最终获得结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
方法D：一种选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(D1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(D2)选择基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的小麦，最终获得结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。
在某些实施例中，所述方法B、所述方法C和所述方法D，所述检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T的方法为所述方法A。
本发明相对于现有技术而言，检测到来源于扬麦4号的1个同时与小麦结实小穗数和籽粒硬度值显著相关的SNP位点Q-7DS-YM4，其紧密连锁标记是AX-110194885，并据此开发了1个KASP标记引物组。以该KASP引物组为引物，以待测小麦基因组为模板进行PCR扩增，若扩增结果显示待测小麦基因分型与扬麦4号相同，则该待测小麦含有等位基因C；反之，则待测小麦含有等位基因T；含有等位基因C的小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值高于含有等位基因T的小麦；该检测方法可快速而直观获得小麦品种结实小穗数和籽粒硬度值高低的结果，适用于大规模育种筛查。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为7D染色体的部分遗传连锁图谱及结实小穗数和籽粒硬度值QTL定位示意图。
图2为实施例1中KASP标记验证部分RIL家系的试验标记扩增检测结果示意图。
图3实施例2中KASP标记应用在小麦鉴定圃的部分小麦品种(系)的试验标记扩增检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1筛选稳定的显著与结实小穗数和籽粒硬度值相关的SNP位点并且设计KASP标记
本实施例以151份来源于“扬麦4号×偃展1号”的重组自交系(F10)为材料，2017年和2018年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区湾头实验基地。采用随机区组设计，每个系种植3行，每行30粒，行长2.0m，行距0.23m，2次重复，按照常规大田管理方式除草和防病防虫。2018年和2019年的5月底待小麦灌浆后期至成熟时调查各家系每穗结实小穗数，每家系随机调查10个单株，每个单株取主茎穗调查每穗结实小穗数，10个单株取平均值为此次重复的每穗结实小穗数，最终取2次重复的平均值为该家系每穗结实小穗数。成熟期分区收获并清理籽粒样本，无穗发芽发生。为了减少误差，将经清理的2个重复的种子等量混合作为最终试验籽粒样本。采用瑞典波通仪器公司(Perten)的单粒谷物特性测定仪(SKCS-4100)测定供试材料的硬度值，两次测定，取均值
采用CTAB法提取基因组DNA，采用中国农业科学院作物科学研究所与中玉金公司合作开发的小麦55K SNP芯片对试验材料进行基因组扫描，利用IciMapping v4.1软件(http://www.isbreeding.net)过滤和去冗余基因型数据。利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，利用MapChart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1的完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)检测与小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值显著相关的QTL，LOD阈值设为4。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的Ense mblPlants数据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。
实验获得1个相对稳定的与小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值相关的位点Q-7DS-YM4(HD/SNS)，增效基因来源于扬麦4号，即提高每穗结实小穗数和籽粒硬度值的基因均来源于扬麦4号，QTL峰值位置在染色体7D短臂上对应标记区间为AX-110194885—AX-110468744(附图1、表1)，位置较精细，LOD值和表型贡献率见表1。
表1 Q-7DS-YM4(HD/SNS)对小麦籽粒硬度值的遗传效应及其侧翼标记
如图1所示，本申请通过QTL作图检测到1个与小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值相关的位点Q-7DS-YM4(HD/SNS)，增效基因来源于扬麦4号，QTL峰值位置在染色体7D短臂上87.90cM—89.00cM范围内，两年对应标记区间均为AX-110194885—AX-110468744，经过与小麦参考基因组比对发现与前人报道的染色体7D长臂上的小麦籽粒硬度值基因完全不一致(7D长臂上有一个硬度基因Pinb-2v1，物理位置是610.76Mb)，也没有在此物理位置附近报道过结实小穗数的基因或者位点。进一步根据小麦660K和55K SNP的芯片侧翼序列从QTL区间中逐步筛选SNP标记，选择区间中特异性高、与小麦籽粒硬度值相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化，确定7DS上56.23Mb处的AX-110194885标记，其侧翼序列是SEQ ID NO:4，利用Polymarker(http://polymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设计，引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终根据侧翼序列的互补序列成功将AX-110194885标记转化为KASP标记QHD-7DS-YM4(HD/SNS)，其对应的变异位点是C/T的互补碱基G/A，即核苷酸序列5-’GATACGTTGGAGACATATCAACAGTCGGGAAATCARCGTGGTAAGACCCTAAACGACCAGCACACCAGAAC–3’(SEQ ID NO.4)自5’端起第36位碱基R存在C/T等位基因(SNP)位点的互补碱基G/A，相对于高硬度强筋小麦育种目标来说，籽粒硬度值高的是优势等位变异，相对于产量高的小麦育种目标来说，每穗结实小穗数高是优势等位变异，扬麦4号携有优势等位变异C(互补碱基G)，携有等位基因C的小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值高于含有等位基因T(互补碱基A)的小麦。
本实施例针对该SNP位点设计Q-7DS-YM4引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的共用上游引物5’-tggagacatatcaacagtcggg–3’，和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgtcgtttagggtcttaccacgG–3’，和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgtcgtttagggtcttaccacgA-3’。上游引物保证了PCR扩增的7D染色体特异性，下游引物的3’末端为标记AX-110194885的等位变异碱基C/T的互补序列G/A。
KASP标记引物工作液的制备：
取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)30μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。
PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；
PCR反应程序：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、64–57℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。
取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA(参考文献：Stacey J,Isaac PG.Isolation of DNA from plants.Methods Mol.Biol.1994,28:9–15.)
以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000TMThermal Cycler PCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAstar Plus,BMG LABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定小麦每穗结实小穗数和籽粒硬度值高低同时相关位点连锁的SNP标记AX-110194885的基因型。
151份“扬麦4号×偃展1号的重组自交系”连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记AX-110194885侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.5)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为C；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为T；附图2中左下角显示为黑色的样本为空白对照。
籽粒硬度相关实验：
经过已有硬度基因检测，发现扬麦4号和偃展4号都具有Pinb-D1b，因此后代的硬度值都是大于40的，151个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2018年和2019年两年的籽粒硬度平均值结果如表2、表3：
表2部分RIL家系和亲本的籽粒硬度值和KASP分型结果
由表2可见，从统计学角度看，含有等位基因C的小麦籽粒硬度值高于含有等位基因T的小麦。
表3携带AX-110194885不同基因型的RIL家系的籽粒硬度值T测验结果
表3所示利用Excel 2019的双样本T测验部分RIL家系的基因型和表型，结果表明：扬麦4号基因型为C，偃展1号基因型为T，基因型为C的家系比基因型为T的家系籽粒硬度值提高8.42％，t值是6.24，在p<0.01水平上有极显著差异，说明上述KASP标记Q-7DS-YM4(HD/SNS)的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦籽粒硬度值分子标记辅助育种中。
每穗结实小穗数相关实验：
151个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2018年和2019年两年的每穗结实小穗数平均值结果如表4、表5
表4部分RIL家系和亲本的每穗结实小穗数和KASP分型结果
/>
由表4可见，从统计学角度看，含有等位基因C的小麦每穗结实小穗数高于含有等位基因T的小麦。
表5携带AX-110194885不同基因型的家系每穗结实小穗数T测验结果
表5所示利用Excel 2019的双样本T测验部分RIL家系的基因型和表型，结果表明：扬麦4号基因型为C，偃展1号基因型为T，基因型为C的家系比基因型为T的家系平均小穗数提高4.34％，t值是4.78，在p<0.01水平上有极显著差异，说明上述KASP标记Q-7DS-YM4(HD/SNS)的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦每穗结实小穗数分子标记辅助育种中。
附图2显示材料分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。
实施例2 KASP引物组效应验证及育种应用
田间试验：本实施例以来源于全国66个小麦品种(系)于2019年种植于江苏里下河地区农科所湾头实验基地的小麦鉴定圃，采用随机区组设计，每个品种(系)种植3行，每行30粒，行长2.0m，行距0.23m，两次重复，按照常规大田管理方式除草和防病防虫。生长期间没受到自然灾害，正常成熟，2020年按3行区收获脱粒。每穗结实小穗数和籽粒硬度值的测定参考上述151份来源于“扬麦4号×偃展1号”的重组自交系(F10)的测定方法。
利用实施例1获得的KASP引物组对江苏里下河地区农科所2019年种植于湾头实验基地小麦鉴定圃的全国66个小麦品种(系)进行基因分型，2020年测定的每穗结实小穗数和籽粒硬度值的平均值以及KASP检测结果如表6和附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号相同，即证明这些小麦品系在分子标记AX-110194885的基因型为C；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为T。附图3显示材料分型结果良好。
表6 66份小麦品种(系)的每穗结实小穗数和籽粒硬度值和基因型检测结果(不排除Pina-D1b和Pinb-D1b)
籽粒硬度相关分析：
为了全面分析Q-7DS-YM4(HD/SNS)位点对小麦籽粒硬度值的影响，我们利用小麦籽粒硬度的主效基因Pina-D1和Pinb-D1对这66份小麦品种(系)进行了分子检测，明确了这些材料5D上主效硬度基因的高硬度基因型Pina-D1b和Pinb-D1b的分布，结果如表7。
表7 66份小麦品种(系)的主效基因Pina-D1和Pinb-D1分布情况
我们进行两方面分析，第一方面我们不考虑主效抗病基因Pina-D1和Pinb-D1的效应，如表7所示，直接分析66个小麦品种(系)在Q-7DS-YM4(HD/SNS)位点不同基因型下的表型值，利用Excel 2019的双样本T测验结果如表8
表8携带Q-7DS-YM4(HD/SNS)不同基因型的供试品种(系)的籽粒硬度值T测验结果(不排除Pina-D1b和Pinb-D1b)
结果表明：基因型为C的品种比基因型为T的品种(系)籽粒硬度值高89.59％，T测验结果t＝6.30，在p<0.01水平上有极显著差异；表明含有等位基因C的小麦籽粒硬度值高于含有等位基因T的小麦。同时说明上述KASP标记Q-7DS-YM4的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦籽粒硬度值的分子标记辅助选择育种中。
第二方面我们考虑主效抗病基因Pina-D1和Pinb-D1的效应，在66个小麦品种(系)中剔除携有主效基因Pina-D1和Pinb-D1高硬度等位变异的材料，利用剩余不携有任何主效硬度基因的材料进行不同Q-7DS-YM4(HD/SNS)位点基因型下表型值的双样本T测验结果如表9和表10
表9携带Q-7DS-YM4(HD/SNS)不同基因型的供试品种(系)的籽粒硬度值T测验结果(排除Pina-D1b和Pinb-D1b)
表10携带QHD-7DS-YM4(HD/SNS)不同基因型供试品种(系)的籽粒硬度值T测验结果(排除Pina-D1b和Pinb-D1b)
结果表明：基因型为C的品种比基因型为T的品种(系)籽粒硬度值高102.38％，T测验结果t＝5.35，在p<0.01水平上有极显著差异；表明含有等位基因C的小麦籽粒硬度值显著高于含有等位基因T的小麦。两方面的实验结果共同说明上述KASP标记Q-7DS-YM4(HD/SNS)的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦籽粒硬度值的分子标记辅助选择育种中。
每穗结实小穗数相关分析：
表6所示，同时我们进行66个小麦品种(系)在不同Q-7DS-YM4(HD/SNS)位点基因型下的每穗结实小穗数的表型值分析，利用Excel 2019的双样本T测验结果如表11
表11携带Q-7DS-YM4不同基因型的供试品种(系)的每穗结实小穗数T测验结果
结果表明：基因型为C的品种比基因型为T的品种(系)平均每穗结实小穗数高4.24％，T测验结果t＝3.12，在p<0.05水平上有极显著差异；表明含有等位基因C的小麦平均每穗结实小穗数显著高于含有等位基因T的小麦。上述实验结果说明KASP标记Q-7DS-YM4的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦平均每穗结实小穗数的分子标记辅助选择育种中。
附图3显示材料分型结果良好。
由上述实验结果可以得出：通过本发明的引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦4号的每穗结实粒数和/或籽粒硬度值高的基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用该分子标记进行筛选可以大大提高分子标记辅助选择每穗结实粒数和/或籽粒硬度值高低的小麦育种工作效率，为小麦品质和产量育种奠定基础。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏里下河地区农业科学研究所
<120> 小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关分子标记及应用
<130> 2021
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
tggagacata tcaacagtcg gg 22
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tgtcgtttag ggtcttacca cgg 43
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tgtcgtttag ggtcttacca cga 43
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> R为碱基C或T
<400> 4
gatacgttgg agacatatca acagtcggga aatcarcgtg gtaagaccct aaacgaccag 60
cacaccagaa c 71

Claims (9)

1. 一种检测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度相关分子标记的物质，其特征在于，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体7D短臂上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC、TT或CT的成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒，所述成套引物为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子和SEQID No.3的第22-43位所示的单链DNA分子组成的成套引物。
2.根据权利要求1所述的物质，其特征在于，
所述成套引物中含有一条上游引物和两条下游引物；
所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的上游序列进行设计；
所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其下游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为G，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为A。
3. 根据权利要求1所述的物质，其特征在于，所述SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端还连接有特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.3的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端还连接有特异荧光标签序列B。
4.根据权利要求3所述的物质，其特征在于，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
5. 根据权利要求1所述的物质，其特征在于，所述成套引物为：上游引物的序列如SEQID No.1所示，下游引物的序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。
6.权利要求1-5所述的物质在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为检测试剂或检测试剂盒。
8.如下任一方法：
方法B：一种比较待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度的方法，包括如下步骤：
(B1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(B2)按照如下确定所述待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度：基因组中染色体7D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体则所述待测小麦结实小穗数和/或籽粒硬度高于基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体或者是T和C的杂合体的所述待测小麦；
方法C：一种选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(C1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(C2)选择基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的小麦，最终获得结实小穗数和/或籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
方法D：一种选育或筛选结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(D1)检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(D2)选择基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7D上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的小麦，最终获得结实小穗数和/或籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法B、所述方法C和所述方法D，所述检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T的方法为方法A：
一种检测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)直接测序；
(A2)用权利要求4所述的物质对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C或T：
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体7D上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是C和T的杂合体。
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